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J. Mex. Chem. Soc. 2013 , 57

(3) , 198-204 Artículo 198 J. Mex. Chem. Soc. 2013 , 57 (3) Mariana Poggi et al.      
© 2013, Sociedad Química de México
ISSN 1870-249X

Nuevos complejos de isoniazida, agentes prometedores

contra Mycobacterium tuberculosis
Mariana Poggi, 1 Rafael Barroso, 2 Antonio José Costa-Filho, 2 Heloisa Barbosa de
Barros, 3Fernando Pavan, 3 Clarice Queico Leite, 3 Dinorah Gambino, * 1 y María Helvecia Torre * 1
1 Cátedra de Química Inorgánica, Facultad de Química, Universidad de la República, Gral Flores 2124, CC 1157, 11800
Montevideo, Uruguay
2 Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14040-901, Ribeirão Preto (SP),
Brasil
3 Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidade Estadual Paulista, UNESP,
Rodovia Araraquara Jaú Km, 01, 14801-902 Araraquara, SP,
Brasil mtorre@fq.edu.uy, dgambino@fq.edu.uy

Recibido el 27 de febrero de 2013; Aceptado el 5 de junio de 2013.

Abstracto. La tuberculosis (TB) es una enfermedad de salud pública
que produce varios millones de muertes anualmente en todo el
mundo. Debido a esta situación crítica y la aparición de cepas
microbianas resistentes a los medicamentos , la innovación en el
descubrimiento de fármacos contra la tuberculosis es una prioridad de
investigación. En este trabajo, la síntesis y caracterización por análisis
elemental, termogravimetría, mediciones con- ductométricas y
espectroscopías UV-Vis, IR y EPR de [Cu (INH) (H 2 O)]
SO 4 ⋅ 2H 2 O (Cu-INH) y [CoCl (INH) 2 (H 2 O)]
Cl ⋅ 2.5H 2 O (Co-INH)complejos con isoniazida (INH) se
informan. Además, la lipofilia, la actividad contra Mycobacterium
tubérculo
culosis (MIC Cu-INH = 0,78 μ g / ml y MIC Co-INH = 0,19 μ g / ml) y
la citotoxicidad (IC 50 = 48,8 y 625 μ g / ml para el cobre y co-
balt complexes, respectivamente) y se calculó el índice de
selectividad (62.5 para Cu-INH y 3205 para Co-INH) . Estos
resultados indican que estos complejos son buenos candidatos para
futuros estudios. Palabras clave: complejos de cobre y cobalto,
isoniazida, actividad antimicobacteriana, tuberculosis, espectroscopia.
Introducción
La tuberculosis (TB) es una enfermedad de salud pública que
produce varios millones de muertes anualmente en todo el
mundo [1]. En los países en desarrollo es una de las principales
causas de mortalidad. Hoy en día, el número de infecciones está
creciendo también en los países desarrollados, especialmente en
pacientes inmunocomprometidos, como los coinfectados con el
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y en individuos
que reciben terapia antitumoral o diabéticos [2-4].
Un gran problema asociado es el aumento alarmante de
cepas microbianas resistentes a los
medicamentos (MDR-TB)que dificulta el control efectivo de la
enfermedad. Además, para complicar aún más el asunto, se
observan las interacciones medicamentosas entre los
medicamentos antituberculosos y los tratamientos contra el VIH
u otros medicamentos para enfermedades crónicas, como los
que se usan en los diabéticos [2].
Debido a esta situación crítica, la innovación en el
descubrimiento de medicamentos antituberculosos y la
evolución de las estrategias para atraer nuevos agentes con el
mejor desempeño es una prioridad de salud actual.
Una estrategia para obtener nuevos fármacos
antimicobacterianos es el desarrollo de nuevas moléculas
mediante la reingeniería de fármacos viejos con el objetivo de
mejorar la actividad antimicobacteriana y obtener mejores
perfiles de resistencia, biodisponibilidad y tolerabilidad, entre
otros [3]. En particular, la coordinación de cationes metálicos
con
Resumen. La tuberculosis (TB) es una enfermedad pública que produce
varios millones de muertes en todo el mundo. Debido a esta crítica situación
ya la aparición de las drogas resistentes a los fármacos usuales, la
investigación de nuevas moléculas para el tratamiento de la TB se ha vuelto a
priorizar. En este trabajo se reporta la síntesis y caracterización por análisis
elemental, termogravimetría, medidas conductimétricas y
espectroscopías UV-Vis, IR y EPR de los complejos [Cu (INH) (H 2 O)]
SO 4 ⋅ 2H 2 O (Cu -INH) y [CoCl (INH) 2 (H 2 O)] Cl ⋅ 2,5
H 2 O (Co-INH)con isoniacida (INH). Por parte otra, se determinó la
Actividad anti- Mycobacteriumtuberculosis (CIM Cu-INH = 0,78 g / ml
y CIM Co-INH = 0,19 g / ml) y la citotoxicidad de los Complejos (IC 50 = 48,8 y
625 μ g / ml para los complejos de cobre y cobalto) y se calculó el índice de
selectividad (62.5 para Cu-INH y 3205 para Co-INH). Estos resultados
indican que estos complejos son buenos candidatos para continuar estudios
futuros.
Palabras clave: complejos de cobre y cobalto, isoniacida, actividad
antimicobacteria, tuberculosis, espectroscopía.
medicamentos orgánicos es una estrategia prometedora que ha
tenido éxito en muchos casos con diferentes actividades
farmacológicas [5-7]. En particular, en la investigación de
nuevos compuestos antimicobacterianos con la mejor actividad
y / o menores efectos de resistencia, se informaron varios
complejos metálicos en la literatura. Por ejemplo, los complejos
de plata con ácidos α- hidroxicarboxílicos han demostrado ser
compuestos antimicobacterianos eficaces, candidatos
potenciales para productos antisépticos o desinfectantes [8]. Por
otro lado, se desarrollaron varias series de compuestos
homolépticos y hetero- lepticicos de hierro, cobre y rutenio
siendo más activos que los ligandos libres contra Mycobacteria
tuberculosis (M. tuberculosis) [9-14] .
Teniendo en cuenta estos antecedentes y como parte de
nuestro trabajo en la investigación de nuevas moléculas
antimicrobianas [15 - 19], en este artículo se informa el
desarrollo de nuevos complejos Cu (II) y Co (II) con isoniazida
(INH). la actividad contra M. tuberculosis es evaluada. Además,
se determinó la citotoxicidad en células de mamífero y se
calculó el índice de selectividad.
La isoniazida (Figura 1), el primer fármaco efectivo
descubierto para el tratamiento de la tuberculosis [20], se
incluye en el grupo de los fármacos antimicobacterianos
de primera línea utilizados en la prevención y el tratamiento de
la tuberculosis. Sin embargo, poco después de su
descubrimiento,

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Nuevos complejos de isoniazida, agentes prometedores contra Mycobacterium tuberculosis 199

De acuerdo con informes anteriores, las conductividades

Fig. 1. Estructura de la isoniazida.
INH resistentes cepas de M. tuberculosis se informó
[21]. Aunque esto, la INH es una de las drogas más usadas en la
actualidad.
INH es capaz de coordinar con cationes metálicos a través
de diferentes grupos químicos: nitrógeno heterocíclico del anillo
de piridina y / o átomos de O y N carbonílicos del grupo
hidrazida. Para esta versatilidad, también es un ligando
interesante desde el punto de vista químico.
Resultados y discusión
Resultados analíticos
Los análisis elementales de los complejos fueron: [Cu (INH)
(H 2 O)] SO 4 ⋅ 2H 2 O (Código Cu-INH), Anal C
21,2%, N 11,9%, H 3,4%, calculado para C 6 N 3 H 13 O 8 SCU,
C 21.5%, N 12,0%, H 3,7%; rendimiento: 70%, 135 mg.
[CoCl (INH) 2 (H 2 O)] Cl ⋅ 2,5H 2 O
(Código Co-INH), Anal C 31,33%, N17.21%, H 4,69%, Cl
15,40%, calculado para
C _ { 12} N _ { 6} H _ { 21} O 5.5 CoCl _ { 2 } , C 30.82%, N
17.98%, H 4.49%, Cl 15.20%; rendimiento: 76%, 196 mg.
Estos resultados concuerdan con las estequiometrías propuestas. Tabla 2. Conductividad ( μ S) en DMSO a 25 ° C.
Mediciones termogravimétricas y conductimétricas
obtenidas para ambos complejos están de acuerdo con la
fórmula asignada para un tipo de electrolito 1: 1 en
DMSO [22-23] .
Además, la conductividad se midió en las mismas
soluciones después de 48 hs y no se observaron cambios
importantes que mostraran la estabilidad de los complejos en
DMSO.
Mediciones espectroscópicas
Espectros infrarrojos
Los espectros IR de los complejos se compararon con los de los
ligandos libres y los complejos informados
previamente [24 - 27].
La Tabla 3 muestra las asignaciones tentativas de las bandas
principales de isoniazida libre y los complejos metálicos.
Análisis del espectro Cu-INH
Según los informes bibliográficos [24, 25], el INH SPEC- Trum
presenta dos bandas a 3300 y 3209 cm - 1 correspondientes a asimétrica
y simétrica estiramiento de NH 2 grupo. Después de la complejación
del cobre, el ν a (NH 2 ) se desplazó a frecuencias más
bajas, mientras que el ν s (NH 2 ) no se identificó debido a las bandas
anchas en la región [26]. Además, la banda asignada
comoν (NH) no cambia en el complejo, lo que muestra que este grupo
no participa en la coordinación. Por otro lado, el espectro INH muestra
una banda a 1667 cm - 1 asignado como ν (C = O). En el complejo
Complejo Λ DMSO ( μ S) a 25 ° C
35.3
Cu-INH

Los resultados termogravimétricos se muestran en la Tabla 1. Co-INH 52.0

Las pérdidas de masa experimentales concuerdan con los
valores calculados para Tabla 3. Bandas principales de IR y su asignación para Cu-INH y
los dos complejos Co-INH.
El proceso térmico correspondiente al Cu-INH muestra en
INH Cu-INH Co-INH Asignación
primer lugar la liberación de dos moléculas de agua de
hidratación a 58.5 ° C, mientras que la liberación de la molécula - 3409 (br) 3378 (br) ν (OH) agua
de agua coordinada tuvo lugar a 112.9 ° C, como se 3300 (m),  3247 (m, br.),  3209 (s),  ν (NH 2 )
esperaba. La descomposición del resto orgánico comienza por 3209 (m) - 3176 (s)
encima de 140 ºC formando el óxido de cobre al final de la 3114 (s) 3114 (s) 3114 (s) ν (NH)
calcinación. De manera similar, el termograma 1667 (vs) 1655 (vs) 1650 (vs) ν (C = O)
de Co-INH indica que el complejo tiene 2.5 moléculas de agua 1635 (s),  1648 (sh),  1637 (sh),  ν (CN) py
de hidratación y una molécula coordinada. 1557 (vs) 1543 (vs) 1550 (s)
Los resultados de las mediciones conductimétricas en 1492 (m) 1498 (m) 1500 (s) δ (CNH)
soluciones de dimetilsulfóxido (DMSO) se muestran en la Tabla
1334 (s) 1370 (m) 1333 (m) ν (CN) amida
2.
1142 (s) 1148 (s) 1140 (m) ν (NN)
888 (m) 864 (m) | 898 (m) δ (CNC) py
Tabla 1. Datos térmicos para los complejos metal-INH . 504 (m) 570 (m) 535 (m) δ (CCC) py
Complejo Temperatura DrTGA Masa Remoto - 1118 (s) - ν (SO)
rango (ºC) mínimos pérdida (%) grupo - 610 (s) - δ (SO)
(ºC) Encontrado / Calc.
- 281 (w) 279 (m) ν (MN)
Cu-INH 20-80 58.5 10.6 / 10.3 2H2O
s = fuerte, vs = muy fuerte, m = medio, w = débil, sh = hombro, br =
80-140 112.9 4.6 / 5.1 H2O ancho.
Co-INH 20-80 40.4 9.2 / 9.6 2.5 H 2 O
80-130 100.3 3.9 / 3.8 H2O

200      J. Mex. Chem. Soc. 2013 , 57 (3) Mariana Poggi y cols.

esta banda cambió a 1655 cm - 1 y remarcó la coordinación de Espectros electrónicos

cobre a través de este grupo. Se observaron cambios similares en Los complejos de cobre (II) de menor número de coordinación
los complejos donde el metal se coordina a través pueden existir en una amplia gama de estereoquímicas, algunas
del grupo -C = O [27, 28]. Este comportamiento permite al de ellas distorsionadas, lo que dificulta el uso de la
proponen que INH actúa como un ligando bidentado de espectroscopía electrónica para identificar estructuras [30]. En
coordinación a través de la -NH 2 y el C = O grupos. el caso de Cu-INH, el espectro electrónico en una suspensión
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Con respecto a las bandas ν (CN) amida y ν (NN) , la
coordinación afecta solo a la primera. Una explicación plausible
sea que la coordinación a través del grupo C = O debilita
el enlace CO y consecuentemente refuerza el NH , cambiando
la amida ν (CN) a una frecuencia más alta.
Tras la formación compleja, los cambios de las vibraciones
de piridina en la región de alta frecuencia suelen ser pequeños,
mientras que los correspondientes a flexiones son más evidentes
y se desplazan a frecuencias más altas [26]. Como muestra la
Tabla 3, en la región de alta frecuencia , la banda
correspondiente a ν a (CN) py (1635 cm - 1 ),
ν s (CN) py (1557 cm - 1 ) y δ (CNC) py (888 cm - 1 ) muestran
cambios menores (13-24 cm - 1 ) a frecuencias más altas o más
bajas. Sobre el
al contrario, la región de baja frecuencia evidencia más
claramente la coordinación a través del átomo de nitrógeno
heterocíclico. Especialmente la banda a 504 cm - 1 asignada
como anillo CCC doblado [29] se movió a permitidas por la interacción entre el momento magnético del
570 cm - 1 ,confirmando la coordinación a través de
piridina. Debido al hecho de que el anillo de piridina aromática
es rígido, la coordinación a través del átomo de N heterocíclico
debería darse con otro ion de cobre diferente al coordinado con
el grupo hidroxamina, en una estructura dimérica o polimérica.
Con respecto a las bandas metal-ligando , solo se observó
una banda a 281 cm - 1 y se asignó como ν (Cu-O) teniendo
en cuenta el trabajo previo [26, 29].
Los sulfatos inorgánicos presentan solo una banda de
estiramiento que generalmente se encuentra en el
rango 1140-1080 cm - 1 . Además, los enlaces sulfato pueden
curvarse dando lugar a una o dos bandas en
el rango de 680-610 cm - 1 , más nítidas que las bandas de
estiramiento [26]. En el caso de Cu-INH, las bandas a 1118 y
610 cm - 1 confirman la presencia de un contraión sulfato.
Además, la banda ancha a 3409 cm - 1 confirma la presencia
de moléculas de agua en el complejo.
Análisis del espectro Co-INH
TheCo-INHspectrumshowstheshiftsofν un (NH 2 ) andν s (NH 2 ) a
las frecuencias más bajas (véase la Tabla 3), de acuerdo con el cobalto
co- ordenación a través de este grupo [26]. Además, el ν (C =
O) cambia a frecuencias más bajas en un comportamiento similar al
observado en
Espectro Cu-INH . El ν (NH) no cambia en el complejo que
muestra que este grupo no participa en la
coordinación. Teniendo en cuenta este análisis, podemos
proponer que la isoniazida actúa como un ligando bidentado.
A diferencia del caso del Cu-INH, en el espectro Co-INHno
se observaron cambios significativos en las vibraciones de
piridina. Esto descartaría la coordinación a través del átomo de
nitrógeno heterocíclico.
Por otro lado, solo se observó una banda a 279 cm - 1 y se
asignó como ν (Co-O) teniendo en cuenta
los informes anteriores [26, 29].
Además, la banda ancha a 3378 cm - 1 confirma la presencia
de moléculas de agua en el complejo.
Nuevos complejos de isoniazida, agentes prometedores contra Mycobacterium tuberculosis
También vale la pena señalar la ausencia de resonancias
adicionales para los campos bajo (por debajo de 275 mT) y alto
(por encima de 375 mT) y también de la llamada transición
de medio campo , que es típica de los pares de cobre [37]. En
conjunto, estas características sugieren que los iones de cobre
en Cu-INH están dispuestos como una estructura polimérica en
estado sólido, como se muestra en la Figura 3.
Como resultado de los datos analíticos experimentales y los
estudios espectroscópicos (IR, UV-Vis y EPR), las estructuras
propuestas para los complejos se muestran en la Figura 3.
Lipophilicity y solubilidad
Antes del estudio de la lipofilia, se determinó la estabilidad de
los complejos en la solución fisiológica. Se realizó una
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nujol muestra una banda ancha mal definida a 600 nm casi
solapada por bandas de ligando. Este resultado concuerda con el
informe de complejos similares con un
cromógeno de CuN 2 O 2[30].
Por otro lado, el Co-INH es un polvo rosa pálido,
típicamente de complejos octaédricos [31]. Se sabe que los
complejos de cobalto (II) de alto spin y seis coordenada (s)
generalmente muestran, en una región visible, una banda
estructurada múltiple asignada a 4 T 1g (F) → 4 T 1g (P) [30]. En
el espectro de reflectancia de Co-INH se observan tres bandas a
606, 695 y 725 nm, y un hombro a 668 nm.
Espectros EPR
El espectro EPR de una muestra policristalina
de Cu-INH en la banda X se muestra en la Figura 2.
Este espectro muestra dos resonancias principales centradas
alrededor de 290 y 325 mT y que se atribuyen a las transiciones
electrón desapareado y el campo magnético del espectrómetro
(interacción Zeeman). Esas dos resonancias son características
de un centro paramagnético axialmente simétrico con
componentes principales del tensor g dados por g ⊥ = 2.023
yg //= 2.236 calculados directamente a partir de las posiciones de
resonancia (en unidades de campo magnético) y de la frecuencia
de radiación de microondas utilizada en el experimento. La
relación g // > g ⊥ indica que el electrón desapareado está en
a d x 2 -y 2 orbital de estado fundamental Los iones de cobre
tienen un spin nuclear de 3/2 que daría lugar a líneas de
resonancia adicionales en su espectro (interacción
hiperfina). Sin embargo, no se observan tales líneas en la Figura
2, que es una situación usualmente encontrada en los casos
donde se observan interacciones cobre-cobre [32-36].
Fig. 2. Espectro EPR de banda X de una muestra policristalina de Cu-
INH.
201
Anti-M. actividad de la tuberculosis y citotoxicidad en células
de mamíferos
La concentración mínima inhibitoria (MIC) valora contra M.
tuberculosis , el IC 50 y el índice de selectividad de los
complejos metal-INH y el ligando libre se presentan en la Tabla
5. Ninguno de los diluciones de sal metálica (CuSO 4 y CoCl 2 ),
utilizado como control, inhibió el crecimiento de
mycobacterium. En el caso del Cu-INH, el peso molecular del
complejo monomérico se utilizó para calcular la CIM, debido a
la incertidumbre de conocer el peso molecular en solución. Si
existen estructuras poliméricas en solución, los valores MIC
calculados expresados en μ M serán más bajos.
Como muestra la tabla 5, ambos complejos fueron activos
contra M. tuberculosis . Los valores MIC son inferiores a los de
3/7
15/11/2017 Su documento está listo
cromatografía de capa fina utilizando las condiciones los agentes antimicobacterianos eth-ambutol (MIC = 5.62
experimentales presentadas en 3.4. Las soluciones analizadas μg / mL, 27.5 μM) y p-aminosalicílico (MIC = 1.25 μg / mL,
fueron: solución saturada de Cu-INH en suero fisiológico, 8.16 μM) en uso clínico.
solución saturada de Cu-INH en agua, solución saturada Además, el complejo Cu-INH (MIC = 2.2 μM) es
de Co-INH en suero fisiológico y solución saturada menos activo que la isoniazida (MIC = 0.063μg / mL, 0.46
de Co-INH en agua. Después del experimento, se observó un μM) mientras que Co-INH (MIC = 0.41 μM) tiene actividad
único punto en cada Co-INH cro- matogram y el R f eran 0,73 similar pero ambos complejos presentaron valores de MIC
en ambas soluciones, que muestra que la presencia de Cl -no bien por debajo de 25 μ g / ml, considerado como un límite para
afecta a la especie en la solución fisiológica. El mismo continuar los estudios antimicobacterianos , de acuerdo con la
comportamiento se observó en el caso de Cu-INH pero el Rf fue tubería de Pavan et al. [38].
casi 0 según la baja solubilidad del complejo en metanol. Una cosa a tener en cuenta es que Co-INH fue más activo
Con el objetivo de determinar el carácter lipofílico de los que Cu-INH y más lipofílico. Sin embargo, la isoniazida era
complejos que pueden correlacionarse con propiedades menos lipófila que los complejos pero era la más activa. INH es
biológicas como el paso por barreras lipofílicas, se determinaron un profármaco que es activo después de la transformación, por
los coeficientes de distribución (D) entre el n-octanol y las una peroxidasa, en ácido isonicotínico que inhibe la síntesis del
soluciones fisiológicas. Además, se estimó la solubilidad en ácido micólico requerido para la biosíntesis de la pared celular
agua y DMSO. Estos resultados se presentan en la Tabla 4. micobacteriana [9]. INH ingresa a la célula mediante transporte
Los valores D obtenidos para los complejos son más altos pasivo [39] [40]. A pesar de su polaridad, esta molécula es una
que los del ligando libre. De acuerdo con los resultados droga muy poderosa. En el caso de nuestros complejos, dos
mostrados en la Tabla 4, el compuesto más soluble en agua mecanismos serían posibles:
(isoniazida) fue el menos lipofílico mientras que ambos
complejos presentaron una solubilidad menor y fueron más
lipófilos que la isoniazida, como se esperaba. Tabla 4. Coeficientes de distribución (D) entre n-octanol y soluciones
fisiológicas, y solubilidad estimada (S) de los complejos.
Las solubilidades en DMSO son más altas que los valores
Complejo D / logD * S (mg / 100 ml) S (mg / 100 ml)
obtenidos en solución acuosa. Por esta razón, este disolvente se
agua) DMSO)
usó en los ensayos microbiológicos.
INH 0.07 / - 1.2 1667 815
Cu-INH 0.16 / - 0.79 ** 3.0 5.8
Co-INH 0.33 / - 0.48 ** 75 150

* fuerza de fuerza = 0.15 M, 25 ºC.

** pH = 4.98 (para Cu-INH) y 4.38 (para Co-INH).

Tabla 5. CIM (mg / ml), CI 50 e índice de selectividad

para Cu-INH,Co-INH.
Compuesto MIC * MIC * IC 50 (g / ml) / IC 50 (M) SI**
( μ g / mL) ( μ M)
VERO J774A.1
Cu-INH 0.78 2.2 62.5 / 178 58.6 / 167 80.1
Co-INH 0.19 0.41 > 500/1070 > 500/1070 2631.6
* Los valores MIC obtenidos fueron los mismos en los ensayos
triplicados ** El índice de selectividad (SI) se calculó por la
Fig. 3. Estructuras propuestas para Cu-INH (A) y Co (INH) (B). relación entre VERO / MIC.

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los complejos pasarían a través de la pared celular por un
mecanismo diferente al de la isoniacida o actuarían a través de
un mecanismo de acción diferente. Debido al hecho de que el
modo de acción de la isoniazida requiere la biotransformación
del ácido isonicotínico, la coordinación estable con un centro de
metal bloquearía todo el proceso y conduciría a la inactivación
de la isoniazida. En nuestro caso, ambos complejos metálicos
nuevos son activos, lo que permite concluir que el modo de
acción de los complejos podría ser completamente diferente al
de la isoniacida libre. Si esta hipótesis pudiera verificarse
mediante estudios adicionales, estos compuestos serían buenos
candidatos a fármacos.
Otro aspecto interesante de estos complejos es la
citotoxicidad que se muestra en dos linajes de células de
mamíferos diferentes. Los modelos elegidos fueron las células
VERO (ATCC CCL81) y J774.A1 (ATCC TIB-67) . Las células
VERO se consideran células normales y no representan ninguna
enfermedad. Estas células se usan en gran medida como cribado
fenotípico en el descubrimiento de fármacos en respuesta a la
citotoxicidad de los compuestos. J774A.1 son células de
macrófagos, que representan las primeras de la respuesta
inmunológica. Además, las micobacterias tienen la capacidad de
sobrevivir dentro de ellas. Todos los complejos mostraron una
citotoxicidad moderada en estas líneas celulares y buenos
índices de selectividad (Tabla 5).
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cipitation con BaCl 2 y cloruro se cuantificó a través de un
método potenciométrico usando AgNO 3 .
Mediciones termogravimétricas y conductimétricas
Las mediciones termogravimétricas se realizaron con una
termobalanza Shi- madzu TGA 50, con una célula de platino,
trabajando con aire circulante (50 ml min - 1 ) y con una
velocidad de calentamiento de 0,5 ° C min - 1 hasta 80 ºC
y mín de 1 ° C - 1 por encima de 80 ºC.
Las mediciones conductimétricas usando un medidor de
conductividad 4310 Jenway se realizaron a 25 ° C en una
solución de DMSO  (10 - 4 M), disolvente utilizado en los
ensayos microbiológicos. La estabilidad de los complejos en este
solvente fue seguida por la medición de la conductividad de
estas soluciones durante 48 h de la disolución y se comparó con
la conductividad inicial.
Mediciones espectroscópicas
Los espectros de IR, en el rango entre 4000 y 200 cm - 1 , se
registraron en un espectrofotómetro Bomem M 102 FTIR
usando la técnica de gránulos de KBr.
Los espectros electrónicos de los complejos en una
suspensión Nujol se registraron en
4/7
15/11/2017 Su documento está listo
Como conclusión, se informa la síntesis y caracterización
de dos nuevos complejos de isoniazida. De acuerdo con el
análisis espectroscópico, el complejo de cobre presenta una
estructura polimérica donde la isoniazida actúa como un puente
entre dos iones de cobre diferentes, que se coordinan a través
del nitrógeno heterocíclico, los grupos amina y carbonilo.
El complejo de cobalto presenta una geometría octaédrica
donde la isoniacida es un ligando bidentado. Estos dos ejemplos
muestran la versatilidad de la isoniacida como ligando.
Ambos complejos eran activos contra M.
tuberculosismostró valores de MIC muy por debajo de 25 μ g /
ml considerado como un límite para continuar los estudios
antimycobacterium. Además, mostraron baja citotoxicidad en
diferentes líneas celulares de mamíferos y, en consecuencia,
presentaron altos índices de selectividad.
Debido a estos resultados, Cu-INH y Co-INH son
candidatos interesantes para futuros estudios.
Experimental
Todos los materiales de partida fueron productos químicos de
grado de investigación comercialmente disponibles y se
utilizaron sin más purificación.
Síntesis
Los complejos de cobre y cobalto se sintetizaron mezclando
soluciones acuosas de CuSO 4 . 5H 2 O (0,55 mmol, 137 mg)
o CoCl 2 .6H 2 O (0,55 mmol, 130 mg) e isoniazida (1,10 mmol,
150 mg) con agitación continua durante 30 min. Los
precipitados verdes o rosas resultantes correspondientes a
complejos de cobre o cobalto respectivamente se filtraron, se
lavaron con pequeñas porciones de agua y se secaron a
temperatura ambiente.
El análisis elemental se realizó con un analizador elemental
Carlo Erba EA1108. El sulfato fue identificado por pre
Nuevos complejos de isoniazida, agentes prometedores contra Mycobacterium tuberculosis
La solubilidad a 37 ° C en agua y DMSO también se
estimó.
Actividad anti- M. tuberculosis
La actividad anti-MTB de los compuestos se determinó
mediante el método REMA (Resazurin Microtiter Assay) según
Palomino et al , 2002 [43]. Las soluciones madre de los
compuestos ensayados se prepararon en dimetilsulfóxido
(DMSO) y se diluyeron en caldo Middlebrook 7H9 (Difco)
suplementado con ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa
(enriquecimiento OADC - BBL / Becton-Dickinson), para
obtener los rangos finales de concentración de fármaco
de 0.09-25 μg / mL. La isoniazida se disolvió en agua destilada
y se usó como fármaco estándar. Se cultivó una suspensión de
MTB H 37 Rv ATCC 27294 en caldo Middlebrook 7H9
suplementado con OADC y Tween 80 al 0,05%. El cultivo se
congeló a -80ºC.ºC en alícuotas. Después de dos días se llevaron
a cabo las UFC / ml de una alícuota. La concentración se ajustó
en 5x10 5CFU / ml y se añadieron 100 μL del inóculo a cada
pocillo de una microplaca de 96 pocillos junto con 100 μL de
los compuestos. Las muestras se configuraron por triplicado. La
placa se incubó durante 7 días a 37 ° C. Después de 24 h, se
añadieron 30 μl de rezurin al 0,01% (solubilizado en agua). La
fluorescencia de los pocillos se leyó después de 24 h en un
TECAN Spectrafluor ® . La CIM se definió como la
concentración más baja que da como resultado una inhibición
del 90% del crecimiento de MTB.
Citotoxicidad en células de mamíferos
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un espectrofotómetro Shimadzu UV-1603 .
Las mediciones de EPR a temperatura ambiente del
complejo de cobre se llevaron a cabo en muestras policristalinas
usando un espectrómetro JEOL JES-FA200 . Los parámetros
experimentales fueron: frecuencia de microondas, 9,4
GHz; potencia de microondas, 10 mW; modulación de campo,
Las mediciones de EPR del complejo de cobre se llevaron a
cabo en muestras policristalinas usando un espectrómetro Varian
E109 de banda X. Los parámetros experimentales fueron
frecuencia de microondas: 9.4 GHz, potencia de microondas: 10
mW, modulación de campo: 100 kHz, amplitud de modulación:
0.2 mT, constante de tiempo: 0.03 s, tiempo de exploración: 2
min. Los parámetros fueron optimizados para evitar saturación y
/ o distorsiones
Cromatografía de capa fina
Con el objetivo de estudiar la estabilidad de los complejos en
solución fisiológica y en agua, se realizó una cromatografía
en capa fina con una solución saturada de complejos en
ambos solventes. Un gel de sílice G, 250 m placa y un
CH 3 OH: NH 3 se utilizaron solución como fase móvil: (1.5
100). Se sembraron 10 μl de cada solución (solución saturada
de Cu-INH y Co-INH en solución fisiológica, y soluciones
saturadas de Cu-INH y Co-INH en agua) en la placa. Después
de la cromatografía, las manchas se detectaron con lámpara UV
[41].
Prueba de lipofilicidad y solubilidad
Las pruebas de lipofilicidad a 25 ºC se realizaron determinando
el coeficiente de partición (P) entre el n-octanol y la solución
fisiológica [42]. La concentración de los compuestos en la
solución fisiológica antes y después del contacto
con n-octanolse determinó mediante espectroscopia UV a 260
nm. Esta banda de isoniazida no cambia con la complejación.
203
Índice de selectividad
El índice de selectividad (SI) se calculó dividiendo
IC 50 para las células VERO por la MIC para el patógeno; si
el SI es ≥10, el compuesto se investiga más a fondo.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen a CYTED network (209RT0380),
FAPESP (proceso 2009 / 06499-1 y 2011 / 11593-7), ANII por
la beca de Mariana Poggi (BE_INI_2010_1851) y al Dr. Jorge
Castiglioni por la colaboración en el campo termogravimétrico -
dice.
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5/7
15/11/2017 Su documento está listo
En in vitro los ensayos de citotoxicidad (IC 50 ) se realizaron
primero en las células epiteliales VERO (ATCC CCL81). Los
compuestos con baja citotoxicidad se investigaron en la línea
celular de ratón J774A.1 (ATCC TIB-67) . Ambos estudios
recomendados por Pavan et al. 2010 [44]. Las células se
mantuvieron rutinariamente en medio completo (DMEM para
VERO y RPMI-1640 (VitroCell ® ) para J774A.1) suplementado
con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS) más
gentamicina (50 mg / L) y anfotericin B ( 2 mg / L), a 37 ° C, en
una atmósfera humidificada con 5% de
CO 2 atmósfera. Después de alcanzar la confluencia, las células
se separaron y se contaron. Para el ensayo de citotoxicidad, 1 ×
10 5Se sembraron células / ml en 200 μl de medio completo
en placas de 96 pocillos (NUNC tm ). Las placas se incubaron en
las mismas condiciones durante 24 h, para permitir la adhesión
celular antes de la prueba de drogas. Los compuestos se
disolvieron en DMSO (5%) y se sometieron a una dilución en
serie doble de
1250 a 3.9 μg / mL. Las células se expusieron a los
compuestos a diversas concentraciones durante 24 h. Luego se
añadió la solución de resazurina a los cultivos celulares y se
incubó durante 6 h. La respiración celular, como un indicador de
la viabilidad celular, se detectó mediante la reducción de
resazurina a resorufina, cuyo color rosa y fluorescencia indica la
viabilidad celular. Un color azul persistente de resazurin es un
signo de muerte celular. Las medidas de fluorescencia (filtro de
excitación de 530 nm y filtro de emisión de 590 nm) se
realizaron en un microfluorímetro Tecan Spectrafluor Plus. El
IC 50 valor se definió como la concentración más alta de drogas
al cual el 50% de las células son viables con relación al
control. Cada prueba se configuró por triplicado.
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