Práá cticás de Biologíáá Moleculár – Semestre 2019-II

Practica No. 10

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

La mayoría de macromoléculas, pueden adoptar una carga eléctrica específica

dependiendo del pH de la solución. En el caso de las proteínas ellas se cargan
(+) por debajo de su punto isoeléctrico y tienen carga (-) por encima de este
valor.

Esta propiedad se utiliza para establecer las pautas de la cromatografía de

intercambio iónico.

Una resina intercambiadora de iones es aquella que posee un grupo químico

asociado, el cuál puede adoptar la carga (+) como en el caso de los sistemas
que tienen el grupo DEAE o Dietilaminoetil celulosa, (-) si más bien poseen el
grupo CM o Carboximetil celulosa. En estas condiciones la proteína colocada a
un pH específico puede interactuar o no con el sistema cromatográfico
dependiendo de la regla: cargas contrarias se atraen y cargas iguales se
repelen.

El trabajo consiste entonces en preparar y/o seleccionar una resina adecuada,

colocar la proteína problema a un pH distante de su PI y lograr atrapar a la
macromolécula en el sistema. Luego se le puede recuperar variando el pH, la
molaridad del buffer o incrementando la concentración de iones cloro o sodio
en la solución.

OBJETIVOS:
1. Conocer el procedimiento para preparar una columna de intercambio
iónico.
2. Ensayar el comportamiento de una proteína previamente determinada
en el sistema cromatográfico.

MATERIALES:
- Columna de vidrio ( 10 x 1,1 cm ).
- CM-Sephadex C-50
- Lysozima (4 mg/ml) PM= 14,30 kDa pI= 11
- Albúmina sérica bovina (4 mg/ml) PM= 66 kDa pI= 4, 8
- Buffer acetato de amonio 0.05M pH 6,0
- Buffer acetato de amonio 0.05M pH 6,0 co n cloruro de sodio 0,35M
- 50 tubos de ensayo 13 x 100 mm
- Pipeta de vidrio 1 ml
- Papel milimetrado
- Regla milimetrada
- Tapones de jebe, mangueras finas y agujas descartables No. 19 y 20.
- Plumón para escribir sobre vidrio.
- Calculadora

PROCEDIMIENTO:

1. Colocar en la columna de vidrio el gel de CM-Sephadex C-50,

previamente hidratado y equilibrado con el eluente.
2. Una vez empacada la columna, colocar 0,6 de la mezcla de proteínas
(0,3 ml de cada una) e iniciar la colección de las fracciones en los tubos
en volúmenes de 1 ml.
3. Cada vez que se tenga 1 ml en el tubo cambiarlo por otro, tomando el
tiempo en que se obtuvo ese volumen. El contenido de cada tubo será
denominado fracción.
4. En caso de observar que la proteína no eluye del sistema, agregar
cloruro de sodio 0,35M disuelto en el buffer de elución y seguir
colectando las fracciones.
5. Luego de colectadas las 30 fracciones se adicionará a cada fracción 1
ml de agua destilada y se procederá a medir la absorbancia de cada
tubo a 280 nm.
6. Hacer los cálculos cromatográficos para la proteína problema.
Determine en que volumen eluyó y establezca sus características
químicas.
7. Graficar en papel milimetrado No. Fracción vs absorbancia a 280 nm.

PROBLEMAS:

1. Por una columna de intercambio aniónico se pasa una mezcla de

proteínas y se obtiene inicialmente dos picos y luego de establecer una
gradiente lineal de NaCl se obtienen tres picos más. Determine lo
siguiente:
a) ¿Cuál es la naturaleza ácido-base de los dos primeros picos?
b) ¿De qué naturaleza es el último pico en ser eluído?
2. Tres proteínas A,B y C tienen PI de 10, 4 y 8 respectivamente.
Determine lo siguiente:
a) ¿Qué patrón cromatográfico se obtendrá si esta mezcla de proteínas
se pasa por una columna de intercambio catiónico a pH 4?
b) ¿Qué cambios de pH haría para separar ordenadamente las
proteínas que hubieran interactuado con el gel?
3. Cuatro proteínas A,B,C y D cuyos PI son 8, 7, 11 y 3 respectivamente
se pasan por una columna de intercambio aniónico a pH 8. Determine:
a) ¿Qué patrón se obtendrá, si la mezcla de proteínas se hace pasar
por una columna de intercambio aniónico a pH 6 ?
b) ¿Qué resultado se obtendría en cada caso?. Señale que cambios de
pH haría para eluír las proteínas que interactúan con el gel?

FLM