UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL

CARACTERIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS: PRUEBAS CUALITATIVAS PARA DETECCIÓN

(BENEDICT, SELLIWANOFF, BARFOED Y BIAL), DIFERENCIACIÓN CROMATOGRÁFICA EN
CAPA FINA Y CUANTIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE CARBOHIDRATOS:
CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA (MÉTODO ENZIMÁTICO DE GLUCOSA OXIDASA).

INTRODUCCIÓN

Cuando hablamos de los Carbohidratos (CH) nos referimos a otro grupo de moléculas que están relacionadas con
el ciclo energético de la vida. Los CH son compuestos que tienen la formula estequiométrica (CH2O)n o son
derivados de dichos compuestos. Son las biomoléculas más abundantes de la tierra como por ejemplo: en cada
año las fotosíntesis convierte más de 100.000 millones de toneladas métricas de CO2 y H2O en celulosa y
productos vegetales (Lehninger, D. et al. 2005).

Los CH son polihidroxialdehidos o cetonas, la expresión más sencilla de los CH son los monosacáridos, que
comprenden azucares simples como la glucosa o fructosa, consisten en una cadena de carbonos sin ramificar, en
donde todos los átomos están unidos por enlaces sencillos, además presentan dos o más grupos hidroxilo y
carbonilo como aldehído (CHO), el cual se encuentra en el extremo de la cadena carbonada y cetona (CO) sí el
grupo carbonilo se encuentra en otra posición de la cadena. Pueden clasificarse de acuerdo al número de carbonos
como triosas, tetrosas, pentosas, hexosas o heptosas; en la tabla 1 se mencionan algunos ejemplos de los
monosacáridos más importantes en el metabolismo. Las estructuras cíclicas de los monosacáridos de denominan
piranosas compuesto por un anillo de 6 miembros, 5 átomos de carbono y uno de oxígeno y furanosas formado
por un anillo de 5 miembros, con 4 átomos de carbono y uno de oxígeno (figura 1.). Los monosacáridos pueden
ser oxidados por agentes oxidantes leves como el ión cúprico Cu 2+, oxidando el grupo carbonilo a grupo
carboxilo. A los azúcares que son capaces de reducir los iones cúpricos se denominan azúcares reductores, los
cuales tienen importancia clínica para la detección de enfermedades como la galactosemia.

Tabla 1. Clasificación de azúcares. (Modificado de Murray, R et al. (2013)

Triosa (C3H6O3)
Tetrosas (C4H8O4)
Pentosas (C5H10O5)
Hexosas (C6H12O6)
Heptosas (C7H14O7)
Aldosa Cetosa
Glicerosa (gliceraldehido) Dihidroxiacetona
Eritrosa, treosa. Eritrulosa
Ribosa, xilosa, lixosa, Arabinosa. Ribulosa, xilulosa.
Glucosa, Alosa, Altrosas, Manosa y Fructosa, Sorbosa, Tagatosa.
Talosa.
----- Sedoheptulosa

Figura 1. Formas cíclicas pirano 5 carbonos y furano 4 carbonos

Cuando se habla de disacáridos se tienen moléculas homogéneas o heterogéneas donde dos monosacáridos están
unidos de manera covalente por un enlace glucosídico. Los enlaces glucosídicos se hidrolizan con facilidad por
acción de ácidos, pero son resistentes a hidrólisis básica, los disacáridos se nombran indicando el lugar de
formación del enlace glucosídico, el tipo de configuración cíclica y el nombre de los azúcares que intervienen. Por
ejemplo, la lactosa es la 1-D-galactopiranosil-4-D-glucopiranosa, entre los disacáridos más importantes tenemos a
la maltosa, sacarosa, gentibiosa, lactosa.

Figura 2. 1-D-galactopiranosil-4-D-glucopiranosa

Los oligosacáridos son productos de condensación de 3 a 10 monosacáridos. Los polímeros como el almidón,
dextrinas, inulina, celulosa, quitina y el glucógeno, están conformados por miles de unidades monoméricas y son
denominados polisacáridos. Sobre estos últimos existen una gran diversidad de compuestos, algunos de ellos son
polímeros complejos formados por muchos tipos de monómeros de azúcar. El glucógeno y el almidón son
glúcidos de almacenamiento en amínales y plantas respectivamente, la inulina es un polisacárido de fructosa,
mientras que las dextrinas son intermediarios en la hidrólisis del almidón, mientras que la celulosa es el principal
constituyente de las paredes celulares vegetales y por último, la quitina es un polisacárido estructural del
exoesqueleto de insectos y crustáceos.

Los CH poseen funciones en todos los seres vivos, prácticamente se puede señalar cuatro participaciones
fundamentales de los CH en el mundo bioquímico. En primer lugar, los CH sirven como almacenes de energía,
combustibles e intermediarios metabólicos. El almidón de las plantas y el glucógeno de los animales son dos
polisacáridos que rápidamente pueden movilizarse para liberar glucosa, el combustible primordial para generar
energía. El ATP, la unidad biológica de energía libre, es un derivado de azúcar fosforilado, como también lo son
muchas coenzimas. En segundo lugar, los azúcares ribosa y desoxirribosa forman parte de la trama estructural del
RNA y el DNA. La flexibilidad conformacional de los anillos de estos azúcares es importante en el
almacenamiento y expresión de la información genética. En tercer lugar, los polisacáridos son los elementos
estructurales de las paredes celulares de bacterias y plantas y del exoesqueleto de los artrópodos. De hecho, la
celulosa, el principal componente de las paredes celulares de las plantas, es el compuesto orgánico más abundante
de la biosfera. En cuarto lugar, los CH están unidos a muchas proteínas y lípidos. Así, por ejemplo, las unidades
de azúcar de la Glicoforina, una proteína intrínseca de membrana, confieren a los hematíes una envoltura aniónica
altamente polar.
 EJEMPLOS DE PRESENCIA Y FUNCIONES BIOQUÍMICAS DE CARBOHIDRATOS

N
NOMBRE T UM PRESENCIA NATURAL FUNCIÓN FISIOLÓGICA
C
El 3-fosfato es un intermediario
Gliceraldehido M 3 - Generalizada (como fosfato)
de la glucólisis.
Dihidroxiaceton El 1-fosfato es un intermediario
M 3 - Generalizada (como fosfato)
a de la glucólisis.
El 4-fosfato es un intermediario
D-Eritrosa M 4 - Generalizada
del metabolismo de los CH.
Algunas plantas, bacilos de la Glucósidos vegetales, paredes
D-Arabinosa M 5 -
tuberculosis. Goma arabiga celulares.
Componente de paredes
Distribución general en plantas,
L-Arabinosa M 5 - celulares, glucoproteínas
paredes celulares bacterianas
vegetales
Generalizada, en todos los Componente del ácido
D-Ribosa M 5 -
organismos ribonucleico
Generalizada, en todos los Componente del DNA.
2-Desoxirribosa M 5 -
organismos
Componentes de los
D-Xilosa M 5 - Sustancias leñosas
polisacáridos de las plantas
Ciclo del ácido urónico,
L-Xilulosa M 5 - Generalizada.
precursor de ácido ascórbico.**
Leche (formando parte de la
D-Galactosa
M 6 - Generalizada lactosa), polisacáridos
(GL)
estructurales
L-Galactosa M 6 - Agar, otros polisacáridos Estructuras de polisacáridos.
Energía metabólica. Papel
D-Glucosa (G) M 6 - Generalizada
estructural en la celulosa.
Polisacáridos de las plantas,
D-Manosa (M) M 6 - Estructuras de polisacáridos
glucoproteínas animales
Un importante azúcar de las
Intermediario de la glucólisis
D-Fructosa (F) M 6 - plantas; forman parte de la
(esteres fosfato)
sacarosa
D- Intermediario en el ciclo de
M 7 - Muchas Plantas.
Sedoheptulosa Calvin de la fotosíntesis.
D-Glicerol –D-
M 8 - Aguacates Desconocido.
mano-octulosa
Frutos, semillas, raíces y en la Producto de fotosíntesis, Fuente
Sacarosa (G-F) 0 - 2
miel. de energía en organismos.
Fuente de energía fundamental en
Lactosa (GL-G) 0 - 2 Leche y algunos vegetales.
mamíferos periodo de lactancia.
Azúcar circulatoria en insectos,
Trehalosa (G-G) 0 - 2 Levaduras y sangre de insectos.
su fuente de energía.
Plantas (almidón) y animales
Maltosa (G-G) 0 - 2 Dímeros de estos polisacáridos.
(glucógeno)
Celobiosa (G-
0 - 2 Plantas (celulosa) Dímeros de este polisacárido.
G)
Rafinosa Azúcar de la remolacha no
0 - 3 Procesada: Fuente energética.
(GL-G-F) refinada.
 Almidón. Tubérculos, cereales como Arroz,
P - >10 Reserva energética en plantas.
(G) Maíz y trigo.
Polisacárido de reserva en
Glucógeno.
P - >10 animales, almacenado en hígado Reserva energética en animales.
(G)
y músculo.
Algunas herbáceas como la
Inulina Polisacárido de reserva
P - >10 Achicoria y Bulbos de
(F)-99% energética en plantas.
cebolla/Ajo.
Compuesto mas abundante en la Resistencia a las formas celulares
Celulosa
P - >10 biosfera, pared celular en vegetales, fuente energía
(G)
plantas. herbívoros.
Quitina.
Exoesqueleto de insectos y
(N-acetil-D-G- P - >10 Confiere resistencia.
Crustáceos.
Amina)

T: Tipo de CH: M: Monosacárido O: Oligosacárido P: Polisacárido

NC: Numero de carbonos (solamente para monosacáridos)
UM: Unidades de monómeros que constituyen el CH (solamente para Oligosacáridos y
polisacáridos)
** En primates no hay síntesis de áscorbato ó vitamina C.

PRUEBAS CUALITATIVAS PARA CARBOHIDRATOS (MONOSACARIDOS)

Para detectar la presencia de los azucares: Fructosa, Galactosa, Pentosa o Glucosa, se utiliza la prueba de
Benedict o de azucares reductores en cualquier tipo de muestra, libre de proteínas preferiblemente. La fructosa
también se puede identificar mediante la reacción de Selliwanoff, la galactosa mediante una tira comercial que se
conoce como Galatostix, basándose en la reacción con la Galactosa Oxidasa. Finalmente, la glucosa se puede
detectar en fase sólida, por medio de la reacción especifica de la Glucosa Oxidasa.

ENFOQUE BIOQUÍMICO DE ESTUDIO DE CARBOHIDRATOS EN FORMA CUALITATIVA

RESULTADOS DE LAS DIFERENTES PRUEBAS

AZUCAR BENEDICT GLUCOSA OXIDASA SELIWANOFF GALACTOSA BIAL BARFOED
GLUCOSA + +    +
GALACTOSA +   +  +
FRUCTOSA +  +   +
PENTOSAS +    + +
SACAROSA      
LACTOSA +     

** OBSERVACIÓN: Si el investigador sospecha la presencia de un Oligosacárido o Polisacárido debe realizar

una hidrólisis ácida de una alícuota de la muestra y realizar todo el perfil anterior.

a. PRUEBA DE BENEDICT.
FUNDAMENTO

Los grupos reductores aldehídos de algunos azucares, en medio fuertemente alcalino y bajo la acción del calor,
reducen los iones de Cobre a Oxido Cuproso. La reacción produce un cambio en el color desde azul, pasando por
verde, anaranjado hasta rojo, dependiendo de la cantidad de sustancias reductoras en la muestra. Los grupos
reductores aldehídos identificados están presentes en los azucares: Glucosa, Lactosa, Fructosa, Galactosa,
Maltosa, Ribosa, Xilulosa, Arabinosa y Xilosa, entre otros (revisar tabla de carbohidratos).

MUESTRA

Cualquier espécimen o sobrenadante libre de proteínas es adecuado para el estudio. En caso de necesitarse el
análisis en muestras que contengan proteínas se puede aislar por precipitación ácida y centrifugación. Mantener la
muestra congelada o refrigerada hasta el momento de su análisis (Congelada es estable indefinidamente).

PROCEDIMIENTO

CONTROL CONTROL
MUESTRA
NEGATIVO POSITIVO
REACTIVO DE
200 uL 200 uL 200 uL
BENEDICT
MUESTRA ------ 20 uL ------
CONTROL POS/NEG 20 uL ------ 20 uL
Colocar en ebullición durante 5 minutos

Control: Positivo: Fructosa: 200 mg/dl en agua destilada.

Control: Negativo: Agua Destilada

INTERPRETACIÓN

Azul claro : Negativo

Verde pálido : Trazas
Verde Amarillo naranja o rojo : Positivo

Este procedimiento es muy sensible y puede ser capaz de detectar azucares reductores en concentraciones hasta
10 mg/dl.

b. PRUEBA DE SELIWANOFF.

FUNDAMENTO.

Las cetosas (Fructosa), en presencia de calor y en un medio ácido, forman un derivado furfural el cual se
combina con el resorcinol formando un compuesto de color rojo.

MUESTRA.
Cualquier espécimen o sobrenadante libre de proteínas es adecuado para el estudio. En caso de necesitarse el
análisis en muestras que contenga proteínas se puede aislar por precipitación ácida y centrifugación. Mantener la
muestra congelada o refrigerada hasta el momento de su análisis (Congelada es estable indefinidamente).

PROCEDIMIENTO

CONTROL CONTROL
MUESTRA
NEGATIVO POSITIVO
REACTIVO DE
200 uL 200 uL 200 uL
SELIWANOFF
MUESTRA ------ 20 uL ------
CONTROL POS/NEG 20 uL ------ 20 uL
Colocar en ebullición durante 5 minutos

Control: Positivo: Fructosa: 200 mg/dl en agua destilada.

Control: Negativo: Agua Destilada

INTERPRETACIÓN

Un resultado es Positivo cuando se observa color rojo brillante que contrasta con la ausencia de color en las
pruebas negativas

Este procedimiento es muy sensible y puede detectar Fructosa en concentraciones hasta 10 mg/dl.

c. PRUEBA DE BARFOED

FUNDAMENTO

El reactivo de Barfoed se comporta como un ácido débil y puede sufrir un proceso de reducción por acción de
monosacáridos. El resultado de la prueba es positivo cuando se presenta una reacción de color rojizo, que se
produce por la formación de oxido cuproso.

MUESTRA

Cualquier espécimen o sobrenadante libre de proteínas es adecuado para el estudio. En caso de necesitarse el
análisis en muestras que contenga proteínas se puede aislar por precipitación ácida y centrifugación. Mantener la
muestra congelada o refrigerada hasta el momento de su análisis (Congelada es estable indefinidamente).

PROCEDIMIENTO

CONTROL CONTROL
MUESTRA
NEGATIVO POSITIVO
REACTIVO DE
200 uL 200 uL 200 uL
BARFOED
MUESTRA ------ 200 uL ------
CONTROL POS/NEG 200 uL ------ 200 uL
Colocar en ebullición durante 10 minutos

Control: Positivo: Fructosa: 200 mg/dl en agua destilada.

Control: Negativo: Agua Destilada
INTERPRETACIÓN

Un resultado es Positivo cuando se observa color rojo ladrillo que contrasta con la ausencia de color en las
pruebas negativas.
Este procedimiento es el de menor sensibilidad de los utilizados en las pruebas cualitativas, su límite de detección
es de 150 mg/dl.

d. PRUEBA DE BIAL

FUNDAMENTO

Cuando en un extracto o muestra se sospecha de la presencia de pentosas se somete el especimen a calentamiento

con HCL concentrado, formándose un derivado furfural que se condensa con orcinol en presencia de iones
férricos para ofrecer una coloración verde-azulosa.

MUESTRA.

Cualquier espécimen o sobrenadante libre de proteínas es adecuado para el estudio. En caso de necesitarse el
análisis en muestras que contenga proteínas se puede aislar por precipitación ácida y centrifugación. Mantener la
muestra congelada o refrigerada hasta el momento de su análisis (Congelada es estable indefinidamente).

PROCEDIMIENTO

CONTROL CONTROL
MUESTRA
NEGATIVO POSITIVO
REACTIVO DE
200 uL 200 uL 200 uL
BIAL
MUESTRA ------ 100 uL ------
CONTROL
100 uL ------ 100 uL
POS/NEG
Colocar en ebullición durante 10 minutos

Control: Positivo: Xilosa: 200 mg/dl en agua destilada.

Control: Negativo: Agua Destilada

INTERPRETACIÓN

Un resultado Positivo muestra un color verde azuloso contrastante con la ausencia de color frente agua destilada o
la coloración marrón inespecífica dada por hexosas u otros azucares.

Este procedimiento es muy sensible y puede detectar Pentosas en concentraciones hasta 100 mg/dl.

3. TÉCNICA CROMATOGRAFICA EN CAPA FINA PARA IDENTIFICACIÓN DE

CARBOHIDRATOS
FUNDAMENTO

El método cromatográfico para separación de CH permite identificar azucares (monosacáridos y oligosacáridos

hasta con tres unidades monoméricas). Es de vital importancia en los procedimientos de estudio porque detecta e
identifica azucares que no son encontrados por las pruebas antes mencionadas, con el beneficio adicional que
permite descartar falsos positivos y negativos que con alguna frecuencia puedan presentarse en estos estudios. Los
CH son separados de acuerdo a su carga eléctrica, peso molecular y solubilidad entre otros factores, utilizando
para tal fin una mezcla de solventes de diferentes polaridades. La identificación final se lleva a cabo con el
reactivo de Naftalenodiol que produce coloración diferencial dependiendo del tipo de azúcar (Fig. 2).

Figura 2. Cromatografía en Capa Fina para Carbohidratos. Se observan Estándares (STD) y muestras (D).

MUESTRA

Cualquier espécimen o sobrenadante libre de proteínas es adecuado para el estudio. En caso de necesitarse el
análisis en muestras que contenga proteínas se puede aislar por precipitación ácida y centrifugación. Mantener la
muestra congelada o refrigerada hasta el momento de su análisis (Congelada es estable indefinidamente).

REACTIVOS

Solvente Cromatográfico: Butanol: Acido Acético: Agua (10:5:5ml)

Naftalenodiol (1,3-Naftalenodiol Merck Art.6252): Disolver 0.2 g de Naftalenodiol en 47.5 mL de etanol (grado
analítico). Inmediatamente antes de realizar la coloración agregar a esta solución 2.5 ml de H 2SO4 concentrado
(preparar antes de usar).

Cromatoplacas de silicagel: 20X20cm (Merck art. 5553).

Soluciones patrón (En agua destilada): Glucosa, Fructosa, Lactosa, Galactosa, Sacarosa y Xilosa, cada uno en
una concentración de 1mg/ ml. Pueden prepararse otros azúcares de acuerdo al origen de la muestra

PROCEDIMIENTO
 Sembrar con el equipo de cromatografía 4 ul de muestra o solución patrón. En franjas de 1.5 cm. Dejar entre
cada muestra, control normal y estándar un espacio mínimo de 1 centímetro, y 1.5 entre estas y el fondo
inferior de la placa.
 Depositar la placa en la cámara para cromatografía y permitir que el cromatograma se desarrolle hasta el final
de la placa (8.5 cm. Aproximadamente 1 hora)
 Secar totalmente la placa en horno a 80º C durante 5 minutos
 Agregar sobre la placa la solución de Naftalenodiol y dejarla en reacción por 10 minutos.
 Llevar a revelado por calentamiento a 100º C durante 10 minutos

INTERPRETACIÓN

Los azucares de las muestras problema se identifican mediante su Rf (averigüe en la literatura en que consiste) y
por comparación con patrones de pureza conocida (Fig. 2). El límite de detección es de 2 mg/dL de carbohidrato.

4. CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA: METODO ENZIMÁTICO

FUNDAMENTO

Los procedimientos más usados para el análisis de glucosa emplean enzimas como reactivos para aumentar la
especificidad analítica. Estas son las reacciones con Glucosa Oxidasa y con Hexoquinasa; los dos procedimientos
han sido automatizados obteniéndose una especificidad y precisión elevadas. El método de Glucosa Oxidasa
(más sencillo en ejecución), por ser una reacción enzimática, muestra la siguiente reacción:

Glucosa + O2 ------ ácido glucónico + H2O2

H2O2 + Cromógeno----- Compuesto Coloreado. (Máximo de absorción a 500 nm)

MUESTRA.

Cualquier espécimen o sobrenadante contenga o no proteínas es adecuado para este estudio. En caso que la
muestra a estudiar sea tomada inicialmente en sangre total debe separarse el suero o plasma en un tiempo no
mayor a 20 minutos debido a que los glóbulos rojos consumen la glucosa de la muestra y durante la determinación
cuantitativa se pueden encontrar niveles muy bajos de este compuesto.

REACTIVO
Se puede trabajar cualquier método enzimático de Glucosa oxidasa disponible en el mercado.

PROCEDIMIENTO
 MUESTRA Ó
BLANCO ESTÁNDAR
CONTROL
REACTIVO DE GLUCOSA
1000 uL 1000 uL 1000 uL
OXIDASA
H20/Estándar/Muestra 10 uL H20 10 uL 10 uL
Incubar 15 minutos a 37 º C
Leer a 500 nm

CÁLCULOS:

Determinar la concentración de glucosa por medio de una curva de calibración (50/100/200 mg/dL). Obtener
absorbancias, determinar el factor y calcular los desconocidos.

5. PROCESO EXPERIMENTAL

a. La práctica da inicio con el estudio de tres muestras por los métodos cualitativos para monosacáridos
(Benedict (BE), Selliwanoff (SE), Barfoed (BA) y Bial (BI), se sugiere hacer el montaje de todas las pruebas
y llevarlas al tiempo a ebullición (Pueden colocarse todas durante diez minutos). Registrar resultados en la
tabla que el monitor entregará al grupo.

b. Durante el proceso cualitativo se llamará a cada estudiante a realizar la siembra cromatográfica, que
desarrollará la migración y separación durante el curso de la práctica. La coloración o revelado se hace al
final por medio de aspersión en cámara de gases.

c. Mientras migra la placa cromatográfica cada grupo hará la determinación de glucosa en suero (de dos
estudiantes) junto con una muestra control. Cada espécimen se analizará por duplicado. (Realizar las lecturas
en el espectrofotómetro.

d. Escriba los resultados obtenidos en las pruebas cualitativas y la determinación de glucosa en la hoja que le
proporcionará el monitor.

7. BIBLIOGRAFÍA

1. HERRERA E. Elementos de Bioquímica. McGraw-Hill- Interamericana p. 309 -341. 1993

2. KAPLAN L.A., PESCE A. Clinical chemistry theory, analysis and correlation. The C.V. Mosby Co. St.
Louis, p. 924-926.1984.
3. PESCE A., KAPLAN LA. Química Clínica-Métodos. Editorial Médica Panamericana. P. 170-174. 1990
4. MATHEWS C., VAN HOLDE K.E. Bioquímica. Segunda Edición, Editorial McGraw-Hill- Interamericana
p. 308-339. 1998
5. MURRAY R., MAVES P., GRANNER D., RODWELL V. Bioquímica de Harper, Editorial el Manual
Moderno. P. 175-185. 2001