Integrantes: Loren Sophie Salamanca Rocha, Jaime Alejandro Quintana Fuentes, Felipe Conde.

LA MICROBIOTA INTESTINAL DE RATONES CON DEFICIENCIA DE NLRP3 MEJORA LOS COMPORTAMIENTOS DEPRESIVOS
AL REGULAR LA DISFUNCIÓN DE LOS ASTROCITOS A TRAVÉS DE CIRCHIPK2

RESUMEN:Se ha encontrado que los inflamalamomas interactúan con la microbiota intestinal, y este efecto está asociado con la
depresión, también conocida como criopirina , es una proteína que en los humanos está codificada por el gen NLRP3 [5] ubicado en el
brazo largo del cromosoma se expresa predominantemente en macrófagos y como componente del inflamasoma . El análisis
bioinformático de todo el genoma reveló que el ARN circular (circRNA) HIPK2 ( circHIPK2 , el formato para humanos es circHIPK2 y
para ratones es circHipk2 , en ambos casos por simplicidad derivado del exón 2 de el gen HIPK2. circHIPK2 está involucrado en la
activación de astrocitos sigue siendo en gran parte desconocido, y se requiere un estudio más extenso.

ANTECEDENTES:El trastorno depresivo mayor, que se caracteriza por la disfunción emocional, es uno de los trastornos psiquiátricos
más prevalentes en todo el mundo, surge de una combinación de factores genéticos y ambientales,siendo el estrés un factor de riesgo
ambiental importante, [1]. La evidencia creciente sugiere que la microbiota intestinal es un factor ambiental que puede moldear el cerebro
a través del eje microbiota-intestino-cerebro,Los ratones con una microbiota alterada a menudo muestran comportamientos relacionados
con la depresión. Al trasplantar la microbiota intestinal de pacientes depresivos a ratas sometidas a tratamiento con antibióticos también
replicó el comportamiento depresivo.. Sin embargo, no se han determinado los mecanismos detallados por los cuales la microbiota afecta
los comportamientos depresivos.

[2].De acuerdo con la hipótesis de la depresión inflamatoria, las vías neuroinflamatorias juegan un papel en Los niveles de ARNm de
caspasa-1 y NLRP3 aumentan en las células sanguíneas de pacientes deprimidos, lo que sugiere que los inflamasomas son un mediador
clave en el desarrollo de la depresión.La evidencia reciente también sugiere que NLRP3 es un mediador común en el desarrollo de la
depresión y en NLRP3 se ha encontrado que se activa en pacientes con depresión. La disfunción de los astrocitos desempeña un papel
fundamental en la depresión y esta se ve afectada por factores producidos dentro y fuera del sistema nervioso central (SNC). Un estudio
anterior demostró que los metabolitos microbianos activan la señalización del receptor de hidrocarburos de arilo en los astrocitos y
suprimen la inflamación del SNC. La ausencia de una microbiota huésped compleja también conduce a defectos en la maduración,
diferenciación y función microglial, lo que demuestra que la microbiota intestinal promueve el mantenimiento de la microglía en
condiciones de estado estacionario. Sin embargo, se desconoce en gran medida si el trasplante de microbiota fecal (FMT) afecta la
función de los astrocitoS.Los ARN circulares (circRNA) se expresan altamente en el cerebro y están involucrados en la regulación de los
procesos fisiológicos y fisiopatológicos. Nuestro estudio anterior indicó que el ARN circular HIPK2 (circHIPK2) inhibía la activación de
astrocitos. Dada la disfunción de los astrocitos en la depresión y el papel de circHIPK2 en la activación de los astrocitos, es tentador
especular que los cambios en la microbiota podrían alterar parcialmente el comportamiento a través de la función de astrocitos regulada
por circHIPK2 en el contexto de la depresión.

Métodos y materiales:

Animales: Se compraron ratones NLRP3 KO (C57BL / 6J machos, 6-8 semanas) en el Centro de Investigación de Animales Modelo de
la Universidad de Nanjing (Nanjing, China).Tratamiento antibiótico: Los ratones fueron tratados con antibióticos de (1 g / l, Meryer),
vancomicina (500 mg / l), ciprofloxacina (200 mg / l) imipenem más cilastatina (250 mg / l) Y metronidazol (1 g / l, Aladdin,). Las botellas
de agua con antibióticos se invirtieron todos los días, y la solución de antibióticos se cambió cada 2-3 días.

FMT:Los trasplantes fecales se agruparon de ratones donantes WT y NLRP3 KO. Los ratones tratados con antibióticos se expusieron
por vía oral con 300 μl de trasplantes fecales (aproximadamente 2 x 10 8 bacterias probióticas viables disueltas).

Tratamiento CUS: Se utilizó para explorar comportamientos depresivos en ratones los ratones fueron expuestos a varios factores
estresantes sociales y ambientales de baja intensidad, programados al azar, 2-3 veces al día durante 4 semanas.

Pruebas de comportamiento: Se realizaron pruebas de comportamiento después del tratamiento con CUS. El comportamiento fue
monitoreado a través de una cámara de video colocada frente a los aparatos, y las imágenes fueron luego analizadas con un sistema
de soluciones de investigación Plexon (Plexon Inc, Dallas, TX, EUA) por un investigador experimentado que no conocía la opción de
tratamiento de los animales. probado Los animales completaron el SPT, FST, TST y OFT como se describe en los resultados.

Western blotting (WB) y otros experimentos: WB se realizó junto al PCR en tiempo real, la hibridación fluorescente in situ (FISH) en
combinación con inmunotinción.Análisis estadístico: se realizó mediante la prueba t de Student, la prueba de Mann-Whitney.

Reactivos:El lentivirus siRNA-GFP circ-control y el lentivirus siRNA-GFP circHIPK2 basados en la secuencia 5'-
UACCGGUAUGGCCUCACAUTT-3 'se adquirieron de HANBIO (Shanghai, China). El AAV shRNA-eGFP circ-control y el AAV
shRNA-eGFP circHIPK2 basados en la secuencia 5'-UACCGGUAUGGCCUCACAUTT-3 'se obtuvieron de OBIO (Shanghai, China).
El reactivo TRIzol® se adquirió de TAKARA BIO INC (9109, Kusatsu, Shiga, Japón. Los cebadores de oligonucleótidos para la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real fueron sintetizados por Invitrogen (Shanghai, China).

RESULTADOS .Se compararon los comportamientos de los compañeros de camada WT y NLRP3 KO. El comportamiento similar a la
depresión se evaluó en la prueba de preferencia de sacarosa (SPT), prueba de natación forzada (FST) y prueba de suspensión de la
cola (TST). La actividad locomotora y el comportamiento similar a la ansiedad se evaluaron en la prueba de campo abierto (OFT). La
actividad locomotora de los ratones NLRP3 KO fue significativamente mayor que la de los compañeros de camada WT, excepto por la
preferencia de sacarosa, hubo diferencias significativas en el comportamiento entre los dos grupos. Sin embargo, el tratamiento, estos
fueron inhibidos por la deficiencia de inflamasoma NLRP3,también se observaron para el comportamiento del tiempo y la distancia
dedicados a explorar la región central en la OFT. A continuación, abordamos si las alteraciones de la microbiota de ratón NLRP3 KO
subyacen directamente a estos diferentes comportamientos. Combinamos ratones WT y NLRP3 KO en una proporción 1: 1 desde el
destete hasta la edad adulta para intercambiar su microbiota. Descubrimos que la cohousing previno los efectos de la deficiencia de
inflamasoma NLRP3 en la actividad locomotora redujo las diferencias significativas en los comportamientos depresivos y similares a la
ansiedad entre los compañeros de camada WT y NLRP3 KO.Para investigar si había una diferencia entre las comunidades microbianas
intestinales de WT y NLRP3 KO littermates, empleamos la secuenciación del gen 16S ribosomal RNA (16S rRNA). El análisis UniFrac
no ponderado, que se centra en el grado de similitud filogenética microbiana, se utilizó para determinar el grado en que la microbiota
intestinal en el grupo NLRP3 KO difería de la del grupo WT. El análisis de coordenadas principal. La deficiencia de inflamasoma de
NLRP3 afectó la composición de la microbiota intestinal. Un PCoA tridimensional de distancias UniFrac no ponderadas mostró diferencias
obvias en la composición de la microbiota intestinal entre ratones WT y NLRP3 KO, la asignación taxonómica se proporciona a la
derecha del mapa de calor. b Abundancias relativas de géneros significativamente alterados por la deficiencia de inflamasoma NLRP3
en la microbiota intestinal. N = 14 ratones / grupo. ** p <0.01 y p <0.001 vs. el grupo WT usando la prueba de Mann-Whitney.

Para investigar si los cambios en la microbiota intestinal contribuyen a la alteración de los comportamientos en ratones NLRP3 KO,
realizamos experimentos de FMT. Curiosamente, los ratones receptores de microbiota NLRP3 KO evitaron los efectos de NLRP3 KO en
la actividad locomotora al inicio del estudio, los ratones receptores de microbiota WT mostraron una disminución de la preferencia de
sacarosa en el SPT y un mayor tiempo de inmovilidad en el FST y TST después del tratamiento con CUS, y estos efectos se aliviaron
en los ratones receptores de microbiota NLRP3 KO (Fig. No.1).

Para determinar si las diferencias en la microbiota intestinal entre los ratones WT y NLRP3 KO se mantuvieron en los ratones receptores,
las comunidades microbianas en las heces ciegas recolectadas de los ratones receptores tratados con o sin CUS se sometieron a
secuenciación del gen 16S rRNA a las 4 semanas después, se observaron similitudes entre los ratones donantes y receptores
correspondientes. Sin embargo, después del trasplante y el tratamiento con CUS, la microbiota intestinal de cada grupo mostró una
separación entre los ratones receptores de microbiota WT y NLRP3 KO con o sin tratamiento con CUS A nivel de phylum, 61 OTU fueron
responsables de discriminar la microbiota intestinal en ratones receptores de WT tratados con CUS. El tratamiento con CUS aumentó
los niveles de 8 OTU que pertenecían a las familias S24-7, Bacteroidaceae , Rikenellaceae y Porphyromonadaceae del filo Bacteroidetes.

Conclusiones:

.el tratamiento con CUS dio como resultado una disfunción de astrocitos, que se inhibió en los compañeros de camadaNLRP3KO.

. La disfunción de astrocitos inducida por CUS también se encontró en ratones receptores de microbiota WT, mientras que la
colonización con la microbiota NLRP3 KO atenuó la disfunción de astrocitos inducida por CUS.

. CUS disminuyó el número de células positivas para la difusión y la ramificación de astrocitos, que se caracterizó por una
disminución significativa.

.La actividad locomotora de los ratones NLRP3 KO fue significativamente mayor que la de sus compañeros de camada WT, mientras
que el cohousing y el trasplante de la microbiota intestinal NLRP3 KO evitan los efectos de NLRP3 KO en la actividad locomotora
en general.

.el trasplante de la microbiota NLRP3 KO alivió los comportamientos depresivos inducidos por CUS. Las composiciones de la
microbiota intestinal en ratones NLRP3 KO y ratones WT fueron significativamente diferentes en términos de la abundancia relativa
de Firmicutes , Proteobacteria y Bacteroidetes.

TEXTO CITADO: [1].Collins PY, Patel V, Joestl SS, March D, Insel TR, Daar AS, et al. Grandes desafíos en la salud mental global.
Naturaleza. 2011; 475: 27-30.

[2].Whiteford HA, Degenhardt L, Rehm J, Baxter AJ, Ferrari AJ, Erskine HE, et al. Carga global de la enfermedad atribuible a los
trastornos mentales y del uso de sustancias: hallazgos del Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 2013; 382: 1575–86.