Isabel Fariñas

Departamento de Biología Celular

CIBERNED, RETIC Terapia Celular
Universidad de Valencia

M
O
M
VO
SI
LU
C
EX

LA VÍA NOTCH EN
SO
U

CARCINOGÉNESIS
MASTER EN ONCOLOGÍA MOLECULAR VII EDICIÓN 2012 – 2014.
MÓDULO I: BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DEL CÁNCER
La vía Notch en carcinogénesis

 La vía de Notch

M
O
 Señalización

M
 Función

VO
 Relación de Notch con la patología
GUIÓN DE LA CLASE

 Enfermedades hereditarias por falta de función

SI
 Notch y cáncer: ganancia de función

LU
 Notch y carcinogénesis
 C
Relación entre desarrollo y cáncer
EX
 Notch como oncogén
 Cooperación de Notch con la progresión tumoral
SO

 Notch como supresor de tumores

U

 Notch en angiogénesis
 Notch y terapia anti-tumoral
 Estrategias terapéuticas
 Ensayos clínicos
 Notch: un gen del desarrollo

M
T. H. Morgan (1920´s) describió una
mutación en Drosophila a la que

O
denominó Notch porque se

M
caracterizaba por la presencia de
muescas en los márgenes del ala.

VO
Tenían además alteraciones en el
número de quetas.

SI
LU
C
EX
Wild-type Notch mutant
La identificación de la molécula se
consiguió en los años 1980, por los
SO

grupos de Spyros Artavanis-Tsakonas y

Michael W. Young independientemente.
U

Las peculiaridades del sistema se descubrieron en Drosophila

 M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO

Señalización de la vía Notch

U

Notch es peculiar a nivel bioquímico

 Notch: un receptor de membrana con función nuclear

M
 El gen Notch codifica un receptor de Unión del ligando a
Notch en trans

O
membrana de 300-kD con un único paso

M
transmembrana. Sus ligandos son también
proteínas transmembrana. Por tanto,

VO
señalización célula-célula entre células

SI
adyacentes. Proteólisis que induce la
Jagged

LU
liberación del NICD
Notch
 La unión ligando-receptor induce la
C
liberación por proteólisis regulada del dominio
EX
intracelular de Notch. Este dominio NICD (Notch
intracellular domain) interacciona con un factor NICD
SO

de transcripción para activar la expresión de

genes específicos: Receptor de membrana con
U

función nuclear. NICD

CSL Las señales se traducen
en cambios de
expresión génica por
 No hay cascada de amplificación de la señal. interacción de NICD con
La dosis es muy importante. el factor de
transcripción CSL
 Ligandos de Notch: familia DSL
 Proteínas transmembrana. Todas tienen el dominio

M
proteico DSL y muchas repeticiones del dominio EGF.

O
M
VO
 En mamíferos dos tipos de ligando dependiendo de a
qué ligando de Drosophila se parecen:

SI
LU
 “Delta-like”: 1 (DLL1), 3 (DLL3), 4 (DLL4)‫‏‬
 C
Parecidos a “Serrate”: Jagged-1 (JAG1) and Jagged-2
EX
(JAG2).
SO

 Expresión diferencial en distintas células.

U
 Notch: diversidad

M
Proteínas transmembrana de un único paso con

O


múltiples dominios. 300–350 kD (ca. 2700

M
aminoácidos).

VO
SI
 En mamíferos, cuatro isoformas: Notch1, 2, 3, 4.

LU
 C
Expresión diferencial en distintas células.
EX
SO
U
Señalización: procesamiento de Notch

M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO
U
 Señalización: procesamiento de Notch

Complejo presenilina-γ-
Metaloproteinasa

M
DEPENDIENTE DE LIGANDO

secretasa
TACE/ADAM

O
(en la membrana)
(en la membrana)

M
VO
NEXT (Notch extracellular truncation) NICD (Notch intracellular domain)
PROTEOLISIS REGULADA

SI
LU
C
EX
INDEPENDIENTE DE LIGANDO

SO

NEC (extracellular Notch) NTM (transmembrane Notch)

U

Furina
(en el aparato de Golgi)

Subunidades con unión

estable no covalente
From Kovall and Blacklow, 2011
 Señalización: transcripción

 El NICD liberado se trasloca al núcleo.

M
O
M
 Allí, interacciona con el factor de transcripción CSL (CBF1 en mamíferos, Su(H) en
Drosophila, LAG1 en C. elegans).

VO
SI
 NICD desplaza co-represores de CSL, que lo mantienen inactivo (ej.: N-CoR) y recluta

LU
co-activadores (ej.: Mastermind).

C
 Se inicia la transcripción de los genes dependientes de Notch.
EX
SO

 CSL (en mamíferos CBF1 o RBPjκ) es el efector nuclear de la vía de Notch y un factor de
transcripción.
U

CSL NICD

From D’Souza et al., 2011

 FAMILIA HES/FAMILIA HEY:

- REPRESORES TRANSCRIPCIONALES
DE TIPO bHLH

M
O
M
VO
SI
LU
C GENES DIANA:
EX

- CICLINA D1
SO

- MYC
- BCL-2
U

- NOTCH
- LIGANDOS NOTCH

- FAMILIA HES
- FAMILIA HEY
 M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO

The Notch “field”

U

Notch es una vía del desarrollo muy especial

 La vía Notch en Drosophila

M
O
M
Delta

VO
Su(H)‫‏‬

SI
E(Spl)‫‏‬

LU
Notch

C
EX
SO

Activación del receptor Expresión de genes

que codifican factores
U

Ligandos y conduce a la activación

receptor del factor de de transcripción de
transmembrana transcripción Su(H): tipo bHLH, como
Suppressor of hairy E(Spl): Enhancer of
split
 The Notch “field”: Notch es una vía del desarrollo muy peculiar

M
 Notch es pleiotrópico y participa en la regulación de múltiples procesos celulares

O
(supervivencia, proliferación,…).

M
VO
 Sin embargo, lo más característico es que la vía constituye un mecanismo conservado
evolutivamente utilizado por los metazoos para controlar destino celular a través de

SI
interacciones locales célula-célula.

LU
¿cómo deciden dos
C
EX
células hermanas
destinos diferentes
para su
SO

diferenciación?
U

El caso de la neurogénesis en Drosophila

 The Notch “field”: Notch es una vía del desarrollo implicada
en diversificación celular

Notch

M
silvestre

O
M
VO
mutante

SI
LU
“Bristle”
C silvestre mutante
EX
Tallo
“socket”
(cuenco)
SO
U

Célula glial Receptores sensoriales mecánicos de Drosophila: quetas

“Sheath”
(Célula glial Las quetas de Drosophila se desarrollan siguiendo un
de envuelta) neurona patrón fijo y estereotipado
1. ESPECIFICACIÓN DEL SISTEMA NERVIOSO
EPIDERMIS

M
O
MESODERMO

M
NEUROBLASTOS

VO
SI
NEUROECTODERMO

LU
C NEUROBLASTO
EX
NEUROECTODERMO
SO
U

NEUROBLASTOS EPIDERMIS

NEUROBLASTO

EPIDERMIS
 1. ESPECIFICACIÓN DE LOS COMPONENTES DEL RECEPTOR SENSORIAL

M
O
M
Linaje de las células del receptor mecánico

VO
SOP

SI
Sensory organ precursor

LU
Tallo
SpIIa C
SpIIb Célula cuenco
EX
SO
U

Célula
Célula cuenco Tallo glial

Glía de la
envuelta Célula glial
Glía de la Neurona
Neurona
envuelta
1) Determinación del clúster
proneural
2) Elección de la célula
precursora del órgano
sensorial (SOP)

M
O
Expresión de genes SOP

M
proneurales: Especificación del
Ej.: Achaete-Scute clúster proneural

VO
CLUSTER (Ac-Sc)
PRO-NEURAL

SI
NEUROECTODERMO

LU
C Determinación
del neuroblasto (SOP)
Expresión de genes
neurogénicos:
EX
NEUROBLASTO
Ej.: Notch
SO
U

SOP: sensory organ precursor

NEUROBLASTOS NEUROBLASTO (célula madre sensorial)

EPIDERMIS
 inhibición lateral Delta

M
Notch

O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO

Los genes de tipo bHLH Achaete y Scute se expresan en las regiones del ectodermo que se especifican a
neuroblastos. Pero la expresión de Achaete y de Scute es transitoria y sólo una minoría de las células
U

que inicialmente expresan estos genes neurales lo seguirán haciendo, mientras que las otras se
convertirán en células epidérmicas normales.

Las células proneurales tienen instrucciones de tomar la vía de diferenciación neurosensorial, pero
cuáles de ellas lo hacen finalmente, depende de interacciones competitivas entre ellas, mediadas por la
vía de Notch: inhibición lateral.
 M
O
M
NOTCH

VO
Programa
E(Spl)

SI
epidérmico

LU
Ach/Sc C
EX
Programa
neurogénico
SO

- estabilizado
Delta
U

- El ligando Delta está bajo el control transcripcional de Achaete-scute. Diferencias en la actividad de

Achaete-scute se traducirán en diferencias en Delta.
- La vía de Notch antagoniza a Achaete-scute al inducir la transcripción de Enhancer-of-split (un bHLH
represor). Por tanto, Notch antagoniza a la vez el programa proneural y la producción de Delta.
 Divisiones asimétricas: conducen a una señalización Notch diferencial entre las dos células hijas.

M


El distinto nivel de Notch en cada célula determina el destino celular (fate).

O


M
VO
SI
LU
C
EX
NUMB
SO
U

Complejo Par
Miranda, Prospero, Brat
NUMB
The Notch logic: Notch liga el destino de una célula al
de su vecina y constituye el sistema más frecuente de
diversificación celular.

M
O
SOP
SOP Numb

M
VO
Tallo
Notch SpIIb
SpIIa Célula cuenco

SI
LU
C
EX
Célula
Célula cuenco Tallo glial
SO

Notch
Glía de la
U

envuelta Célula glial

Glía de la Neurona
Neurona
envuelta
Sólo una de las células hijas recibe Numb.

Numb antagoniza la vía de Notch. La célula que hereda Numb producirá más Delta, inhibirá a su hermana, y será
neural.
 M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO

Notch y patología
U

Mutaciones de pérdida de función: enfermedades hereditarias

Mutaciones somáticas de ganancia de función: cáncer
Notch y patología: pérdida de función

M
Síndromes hereditarios ligados a la pérdida de función de Notch o
sus ligandos:

O
M
 CADASIL (Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with

VO
Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy) es una
enfermedad hereditaria caracterizada por leucodistrofia y

SI
alteraciones vasculares, y presenta migrañas y episodios

LU
isquémicos transitorios. Se asocia a mutaciones
inactivadoras de Notch 3.
C
EX
 Síndrome de Alagille: Desarrollo anormal de una serie de
órganos, especialmente corazón e hígado, causadas por
SO

mutaciones en Jagged1 o Notch2.

U

 Algunas mutaciones en Jagged2 se asocian a la Tetralogía de

Fallon.
 Leucemias linfoblásticas agudas de células
T (T-ALL). Representan el 10%–15% de
todos los casos de ALL en niños y el 25% de
Notch & cáncer los casos en adultos.

M
O
M
VO
SI
LU
 Notch1 de mamíferos fue, de hecho, descubierto en 1991 por el laboratorio de Sklar (Ellisen et al.,
C
1991) a través del análisis de leucemias linfoblásticas agudas de células T (T-ALL).
EX

 Encontraron la mutación TAN1 (Translocation-Associated Notch1 homolog): translocación (7;9) con

SO

puntos de rotura en los loci de NOTCH1 (cromosoma 9) y del receptor β de células T (TCRβ)
(cromosoma 7), dando lugar a la fusión del extremo 3´ de NOTCH1 con elementos del promotor de
U

TCRβ.

 El producto de la mutación es una proteína truncada Notch1 constitutivamente activa (independiente

del ligando) en células T.

La mutación TAN1 es la primera evidencia de la relación entre Notch y cáncer.

 Notch & cáncer
 La translocación t(7;9) en T-ALL es rara (<1%), pero más del 50% de todos los pacientes con T-ALL

M
tienen mutaciones activadoras de NOTCH1 (Weng, A.P. et al. (2004) Activating mutations of NOTCH1 in

O
human T cell acute lymphoblastic leukemia. Science 306, 269–271).

M
VO
SI
LU
C
EX
SO
U
 Notch & cáncer: regulación de Notch

M
La mayoría de las mutaciones se localizan

O
en los dominios HD y PEST de la molécula cleavage sites

M
Notch1: proteolisis independiente de

VO
ligando o mayor estabilidad de NICD

SI
LU
C
EX
SO

Dominio extracelular Dominio intracelular

U

HD (Heterodimerization Domain): PEST (prolina, glutamina, serina,

mantiene la asociación no y treonina): señal para
covalente de las dos subunidades degradación por el proteasoma.
de Notch después del corte por
furina en S1‫‏‬.

From Kovall and Blacklow, 2011

 Notch & células T

M
O
M
VO
SI
LU
 La sobre-expresión de Notch en ratones induce la aparición de linfomas de células T, salvo si se
expresan en ratones con alteraciones genéticas que impiden el desarrollo de los linfocitos T.
C
EX
 Capobianco, A.J. et al. (1997) Neoplastic transformation by truncated alleles of human NOTCH1/TAN1 and NOTCH2.
Mol. Cell. Biol. 17, 6265–6273
 Pear, W.S. et al. (1996) Exclusive development of T cell neoplasms in mice transplanted with bone marrow expressing
SO

activated Notch alleles. J. Exp. Med. 183, 2283–2291

U

 Notch1 es necesario y suficiente para el desarrollo de las células T a partir de células madre
hematopoyéticas, por lo que el efecto de transformación debe estar relacionado con la función
normal de Notch en estas células.

 No está claro todavía a través de qué genes se produce el efecto (supervivencia, proliferación,…).
Notch & cáncer: regulación de Notch

M
 La T-ALL es una enfermedad heterogénea en la que múltiples

O
aberraciones genéticas cooperan para desregular la proliferación, la

M
diferenciación y la supervivencia de los timocitos inmaduros.

VO
SI
 Más de la mitad de los pacientes presentan mutaciones activadoras en el

LU
gen Notch1.
C
EX
 El papel oncogénico de Notch1 en la T-ALL es un reflejo de su función
SO

fisiológica de las células T normales durante su desarrollo. Notch1 es un

regulador del linaje de las células T.
U

 Si la vía de Notch1 no está adecuadamente regulada y no se apaga en el

momento adecuado del desarrollo de los timocitos, se convierte en
oncogénica.
Notch en tumores sólidos

M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO
U
 M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO

Notch en tumores sólidos

U

 Células madre y cáncer.

 Función de Notch en células madre.
 Relación entre activación de Notch y tumorigénesis en tumores sólidos.
 Implicación indirecta de Notch en carcinogénesis.
 Células madre adultas y
renovación tisular

M
Células madre-células nicho: una
unidad interactiva organizada para

O
facilitar las decisiones de destino

M
celular en el adecuado ambiente
espacio-temporal. Participan las vías

VO
de señalización de EGF, FGF, Wnt,
Hedgehog, Notch, BMP/TGFβ, como

SI
en el desarrollo.

LU
C
EX
Ciertos subtipos de
células madre
SO

permanecen en algunos
tejidos y aseguran el
U

mantenimiento de los
mismos.
 Células madre cancerosas (“Cancer stem cells”; CSC) o células
iniciadoras de tumor (“tumour-initiating cells” ; TIC)

M
O
1. Muchos tumores son

M
heterogéneos a nivel

VO
histológico.

SI
2. Aunque está establecido el
carácter clonal de la mayoría de

LU
tumores malignos, es necesario
trasplantar 1x106 células
C tumorales para producir un
EX
tumor. Dos posibles modelos.
SO
U

Además, la mayoría de los tumores son heterogéneos a nivel celular y se organizan de forma jerárquica,
como los tejidos, con células madre progenitoras en la cima de la jerarquía como responsables de
mantener todo el tumor: cancer stem cell hypothesis.
Células madre cancerosas (“Cancer stem cells”; CSC) o células
iniciadoras de tumor (“tumour-initiating cells” ; TIC)

M
 Las células madre (SC) se definen como

O
las células que tienen la capacidad para

M
perpetuarse (auto-renovación) y de
generar células maduras de un tejido

VO
particular a través de la diferenciación. En
la mayoría de los tejidos, las células

SI
madre son raras.

LU
C  Las células madre cancerosas (CSC) son,
en muchos aspectos, similares a las SC
EX
normales; sobre todo, tienen la
capacidad de auto-renovación y
SO

proliferación. Los tumores son

heterogéneos y comprenden una minoría
U

de células iniciadoras de tumor (TICs) y

abundantes células sin esa capacidad.
 “Cancer stem cells” (CSC) or “tumour-initiating cells” (TIC)

TICs

M
O
M
indefinite resistance to
pluripotency
self-replication chemotherapeutics

VO
tumour tumour Recurrences and/or metastasis

SI
growth heterogeneity after remissions

LU
C
EX
Debido a que las células madre tienen
la maquinaria para auto-renovación
SO

ya activada, mantener esta activación

puede ser más sencilla que activarla
U

de nuevo en una célula más

diferenciada = mayor oportunidad
para acumular mutaciones en células
madre que en tipos de células más
maduras
Notch: un “stem cell pathway”

M
La actividad de Notch se asocia a la toma de decisiones de distintos tipos de

O

progenitores durante procesos de diferenciación, sobre todo en las decisiones

M
de tipo binario.

VO
 En combinación con otras vías, Notch influye en procesos de diferenciación,

SI
proliferación, apoptosis, etc.

LU
 Estas acciones se conocen mejor en procesos del desarrollo pero también
C
afectan a la biología de las células madre adultas, con repercusiones en
EX
remodelación de tejidos y en cáncer.
SO

 CONCEPTO: si entendemos la renovación tisular con un proceso

“developmental”, podemos argumentar que el cáncer es como una
U

“developmental disease”. Por tanto, las vías de señalización que tienen efectos
importantes en procesos de diferenciación, proliferación y apoptosis durante el
desarrollo, es esperable que también estén implicadas en carcinogénesis.
 Cáncer mamario en ratones
 La primera evidencia de la implicación de Notch como

M
oncogén se obtuvo en tumores de glándula mamaria en

O
ratones.

M
El virus MMTV (mouse mammary tumour virus) que da lugar

VO

a adenocarcinomas mamarios en ratones mostraba un lugar
preferente de inserción en el genoma. El gen truncado se

SI
denominó INT3 y resultó ser Notch4.

LU

C
Gallahan, D. & Callahan, R. The mouse mammary tumor associated gene INT3 is a
EX
unique member of the NOTCH gene family (NOTCH4). Oncogene 14, 1883–1890 (1997).

La sobre-expresión de Notch4/Int3 gene (N4ICD)

SO


específicamente en glándula mamaria causa
adenocarcinomas mamarios en el 100% de la ratonas.
U

 Gallahan, D. et al. Expression of a truncated Int3 gene in developing secretory

mammary epithelium specifically retards lobular differentiation resulting in
tumorigenesis. Cancer Res. 56, 1775–1785 (1996).

La señalización aberrante de Notch se detecta también

en pacientes con cáncer de mama
 Notch y las células madre mamarias (MSCs)

M
O
M
VO
SI
LU
C
Una glándula mamaria adulta “en reposo” está formada
EX
por un sistema ramificado de conductos excretores
rodeados de tejido adiposo. Los conductos están
SO

revestidos por un epitelio que contiene una

subpoblación de células madre de glándula mamaria.
U

S-SHIP-GFP
 Notch y las células madre mamarias (MSC)
La vía Notch es necesaria para el desarrollo de la glándula mamaria y juega

M
un papel importante en el mantenimiento de las células madre mamarias y

O
en el destino de su progenie. Así, Notch:

M
(1) restringir la expansión de las MSCs

VO
(2) promover la especificación de la progenie de las MSCs (progenitores
multipotenciales, MPP) al linaje luminal a expensas del mioepitelial.

SI
MEP

LU
Notch
C
EX
SO

MSC MPP

LP
U

Notch Notch

Mammary outgrowth derived from mouse mammary stem cells (MSCs) transduced with a
retrovirus expressing a shRNA against the canonical Notch effector Cbf-1. Knockdown of
Cbf-1 led to increased repopulating activity and the formation of ductal trees with
disorganized branching and aberrant end buds that contained excessive basal cells. These
findings provide evidence for Notch signaling playing a role in restricting MSC expansion
during mammary development.
 En cáncer de mama…
 Formas activadas de NOTCH1 y NOTCH4 han sido identificadas en varias líneas celulares

M
de cáncer de mama. Se ha observado activación de NOTCH en líneas celulares de

O
cáncer de mama y en cáncer de mama primario.

M
NOTCH3 desempeña un papel importante en la proliferación de líneas de células de

VO

tumor de mama ErbB2-negativo.

SI
 Se ha detectado una mayor expresión de Notch1 en cuatro tumores mamarios que

LU
sobreexpresan H-Ras sugiriendo que Notch1 es una diana de la activación oncogénica
de H-Ras.
C
EX
 Altos niveles de expresión de JAGGED1 y NOTCH1 correlacionan con mala prognosis.
SO

Sin embargo, la evidencia disponible en humanos sugiere que la actividad aberrante de

U

Notch en tumores mamarios es debida a la actividad de vías que regulan la expresión o

actividad de Notch y no por mutaciones activadoras o amplificadoras de Notch o sus
ligandos.

¿Cómo participa entonces Notch en la transformación?

 Notch y las células madre mamarias cancerosas(MSCs)
 Se han identificado CSCs en tumores de mama (<1%),

M
que se comportan como TICs cuando son

O
transplantadas.

M
VO
 Inmunofenotípicamente son: CD44+/CD24-/low/lin-

SI
 En mamoesferas derivadas de carcinoma ductal in

LU
situ, Notch es necesario para la expansión de las CSCs.
C
EX
 Además, la expresión de NICD en SC mamarias
promueve el destino hacia célula luminal a expensas
SO

del linaje mioepitelial. La sobre-expresión constitutiva

de NICD conduce a la expansión específica de
U

progenitores luminales y tumorigénesis. El cáncer de

mama se origina frecuentemente en el epitelio ductal.
El DCIS o carcinoma ductal in situ (ductal carcinoma
in-situ) y el carcinoma ductal infiltrante constituyen
hasta el 80% de todos los cánceres de mama.
 Notch en tumores sólidos

En estos tumores, no se encuentran mutaciones en genes de la vía.

M


O
 Sin embargo, la activación de Notch por alteraciones en otros

M
reguladores contribuyen a la progresión tumoral.

VO
CÁNCER MAMARIO

SI
Casi 60% ER+ o ER (receptor de

LU
estrógenos)+/PR (receptor de
progesterona)+
C tratables
EX
Cáncer mamario
Casi 30% Her2 (ErB2)+
SO
U

Casi 20% “triple negative” (TN)

 Las evidencias sugieren que Notch se activa en células en las que se ha silenciado la señalización
dependiente de Her2 y ER.
 Notch como diana terapéutica atractiva para los tumores de células basales TN-.
Notch en tumores sólidos
 Notch puede actuar también como supresor de tumores.

M
O
M
TUMORES CUTÁNEOS

VO
SI
LU
C
EX
SO
U
 Melanomas arise from the
transformation of melanocytes,
Notch & which reside in the basal layer of
the epidermis
tumores cutáneos

common acquired and

M
dysplastic nevi with congenital nevi without

O
structural and dysplastic changes: hyper-

M
architectural atypia plastic melanocytic lesion

VO
SI
LU
radial-growth phase (RGP)
melanoma: first recognizable
Expresión elevada de C malignant stage
EX
Notch1 y 2 y de sus
ligandos en estas
SO

fases comparado con

normal melanocitos.
vertical-growth phase (VGP) melanoma
U

metastatic melanoma
Notch en tumores cutáneos

M
En ratones:

O
M
 La inhibición de Notch induce apoptosis en las células de melanoma. Notch es
necesario para su supervivencia.

VO
La activación constitutiva de Notch promueve el crecimiento de los

SI

melanomas.

LU
C
EX
En líneas celulares humanas de melanoma:
SO

 La sobreexpresión de Notch favorece el desarrollo del melanoma. Sin

embargo, no se observan efectos en la transformación de melanocitos
U

primarios.
Células madre epidérmicas: dos poblaciones

M
A proliferative unipotential resident

O
stem cell population in the basal layer of

M
the epidermis, the melanocyte stem cell
(MSC): as these cells commit to terminal
differentiation, they become

VO
melanoblasts, detach and migrate
outward while differentiating.

SI
LU
C A distinct population of multipotential
EX
stem cells in the bulge region of the hair
follicle. These cells are typically
quiescent but can enter a proliferative
SO

state in response to traumatic injury or

during the normal course of the hair
U

cycle.

Las MSCs requieren Notch para su mantenimiento en la protuberancia.

 Melanocyte-lineage specific ablation of RBP-J
results in severe dilution of hair pigmentation
due to apoptotic elimination of melanoblasts
Notch y MSCs during development. To test whether Notch
signaling plays a role in melanocyte stem cells,
the first hairs were shaved to induce the second
hair cycling (B, circled area).

M
O
M
Moriyama et al., 2006

VO
Schouwey et al., 2007

SI
LU
Inactivation of Notch1 in the skin
C
EX
Conditional inactivation of Notch1 in basal
epidermal layers leads to spontaneous skin
SO

cancer with a basal cell carcinoma (BCC)-like Demehri et al., 2009

histology. In addition, when exposed to
U

chemical carcinogens, the mice display an

increased incidence of tumors

Notch como supresor de tumores

Notch en tumores sólidos
 Notch puede actuar de manera indirecta en la carcinogénesis.

M
O
M
TUMORES CUTÁNEOS

VO
SI
LU
C
EX
SO
U
 Efectos no autónomo celulares

M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO

Demehri et al., 2009

U

4-hydroxytamoxifen (4-OHT)-induced deletion

in Msx2-Cre; Notch1flox/flox (Msx2-N1CKO)‫‏‬

CAMBIOS EN EL ESTROMA
 Otros efectos indirectos
Jagged1 y Delta-like4 o Notch1 son necesarios para la correcta

M
formación de la vasculatura. En humanos, CADASIL.

O
M
VO
SI
LU
C
EX
El factor pro-
angiogénico
VEGF activa a
SO

Notch para
U

promover el
crecimiento de
los vasos.
FUNCIONES DE NOTCH

U
Notch rationales

SO
EX
C
LU
SI
VO
M
O
M
 La relación de Notch con la carcinogénesis depende del contexto celular

M
NOTCH ACTIVO INACTIVO INACTIVO ACTIVO

O
M
VO
SI
progenitor Célula diferenciada progenitor Célula diferenciada

LU
ACTIVACIÓN CONSTITUTIVA PÉRDIDA DE ACTIVIDAD
Bloquea diferenciación Bloquea diferenciación
Promueve supervivencia C Promueve supervivencia
EX
Incrementa proliferación Incrementa proliferación
SO

Ej.: T-ALL, CÁNCER DE MAMA MURINO Ej.: CÁNCER CUTÁNEO MURINO

U

 Las consecuencias de la señalización de Notch dependen en gran medida del contexto

celular. Uno de los principales objetivos en el futuro será obtener más información
sobre:
 Genes regulados por Notch.
 Relación entre Notch y otras vías de señalización.
 M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO

Notch y terapia anti-tumoral

U

 Estrategias terapéuticas
 Ensayos clínicos
Notch & terapia anti-tumoral

M
Es necesario determinar:

O
M
VO
 Qué cánceres dependen de una activación de Notch y qué elementos
específicos están activados (Notch1 vs. Notch2 por ejemplo).

SI
LU
 Qué otras vías de señalización (wnt, Shh,…) cooperan con Notch.
C
EX
SO
U

La falta de una actividad enzimática hace preciso el empleo de

estrategias poco obvias
 Notch y estrategias terapéuticas inhibidoras

M
Anticuerpos bloqueantes de

O

receptores y ligandos Notch

M
específicos.

VO
 Anticuerpos que enmascaran
el sitio S2 para bloquear la

SI
proteolisis por ADAM/TACE.

LU
Distintas formas de inhibidores

de la γ-secretasa (GSI). C
EX

 Péptidos bloqueantes de la
SO

formación del complejo

transcripcional NICD–MAML.
U

From Koch and Radtke, 2011

 Notch y anticuerpos bloqueantes

M
O
M
Ejemplo: Anticuerpos inhibidores de Dll4

VO
SI
LU
Phase 1 clinical trials of the use of
two different anti-DLL4 human C
EX
monoclonal antibodies in treatment
of solid tumors are currently in
progress (A multiple-ascending-dose
SO

study of the safety and tolerability of

REGN421 in patients with advanced
solid malignancies,
U

http://clinicaltrials.gov/ct2/show/
NCT00871559. A Phase 1 dose
escalation study of OMP-21M18 in
subjects with solid tumors:
http://clinicaltrials.gov/ct2/show/
NCT00744562
 GSI: gamma-secretase specific inhibitors

M
1. Notch

O
+ wnt Stem cell
The -secretase complex

M
VO
Proliferative
progenitor

SI
LU
2. Notch
C Dll
Math1 Hes1
EX
Secretory Absorptive
Problemas: Efectos secundarios progenitor progenitor
SO

gastrointestinales: transformación de células

proliferativas de las criptas en caliciformes. En
U

modelos animales también afecta la

maduración B/T de los linfocitos causando
inmunosupresión Globet cell Enterocyte

The Notch inhibitor MK-0752 is currently under a phase I clinical trial for the treatment of T-ALL and
advanced breast cancer (Clinical Trials ID: NCT00106145).
 Un GSI (Compound E) y dexametasona (un
glucocorticoide comúnmente utilizado para tratar
el T-ALL) juntos tienen cierta actividad en algunos
Estrategias combinadas tumores primarios de T-ALL resistentes a
glucocorticoides. Los glucocorticoides pueden
proteger el intestino dela inhibición de Notch.

M
O
M
VO
gut

SI
LU
C
EX

T-ALL cells
SO
U

Real et al. (2009). Nat. Med. 15, 50–58

Notch y péptidos bloqueantes

M
O
Un péptido helicoidal

M
mimético que compite con
NICD por la unión a MAM.

VO
Traslación a la clínica?

SI
LU
C
EX
SO
U

From Koch and Radtke, 2011

 Ensayos clínicos para Notch en cáncer

M
O
Inhibidores de Notch y de gamma-secretasa

M
VO
Compound Company Phase No. Trials Clinical Trials

SI
Solid tumours, breast, colon, CNS, leukemia,

LU
RO4929097 Roche II 36 lymphoma, RCC, GBM, melanoma, lung, myeloma,
prostate, pancreatic, gliomas
MK0752 Merck I/II 9 C Advanced cancer, breast, pancreatic, CNS, ALL
EX
BMS906024 BMS I 2 Solid tumours, leukemia
SO

PF03084014 Pfizer I 1 Advanced cancer/leukemia

U
 La vía Notch en carcinogénesis

M
 Aunque los componentes centrales de la vía Notch son estereotipados, las

O
consecuencias de su señalización dependen, en gran medida, del contexto celular.

M
 No ha sido claramente definido hasta ahora si la activación de Notch es la causa o el

VO
efecto en tumores sólidos y si es sólo un factor esencial para el crecimiento de tumor
tras la transformación. Un verdadero papel causal de Notch en carcinogénesis

SI
humana hasta ahora sólo ha sido demostrado en casos de T-ALL.
RESUMEN

LU
 Sin embargo, las actuaciones sobre Notch en cáncer tienen claro potencial
terapéutico, ya sea por inducir agotamiento de CSCs, reducir la angiogénesis, inducir
C
EX
la diferenciación e, incluso, porvocar apoptosis.
 La eficacia de los tratamientos varía según los tipos de cáncer; incluso dentro del
SO

mismo cáncer, Notch pueden provocar diferentes efectos en subpoblaciones de

tumor. La pleiotropia de la señalización de Notch, en última instancia, dependerá de
U

los genes diana activados por la vía.

 Es esencial entender que aspectos son comunes al desarrollo fetal normal y
renovación tisular en el adulto y al desarrollo de un tumor. En este contexto, las vías
de señalización clásicamente del desarrollo están demostrando ser centrales en
nuestra compresión del crecimiento tumoral y de su tratamiento.
 M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO
U

LA VÍA NOTCH
Anexo: Información bioquímica adicional
Notch ligands:
membrane molecules of the DSL family

M
O
M
 Also cell surface type I transmembrane proteins
with numerous EGF-like repeats (ELRs) within

VO
their extracellular domains.

SI
 Dynamically expressed by limited numbers of cells

LU
during development.

 C
Delta and Serrate from Drosophila and Lag-2 from
EX
C. elegans. Jagged 1 and Jagged 2 in mammals.
SO

 All possess conserved extracellular domains that

include an N-terminal “DSL domain,” named
based on its common occurrence in Delta, Serrate,
U

and Lag-2, followed by a tandem array of ELRs.

 Because both the receptors and their ligands are

transmembrane proteins, Notch signals rely on
cell–cell contact.
 Notch ligands in mammals
Human Jagged1

M
 Canonical Notch ligands in mammals fall DSL and EGF 1-3

O
into two general classes, depending on
whether they are homologous to the

M
Drosophila prototypes Delta and Serrate:

VO
SI
 Three Delta-like proteins: Delta-like 1

LU
(DLL1), Delta-like 3 (DLL3), Delta-like 4
(DLL4)‫‏‬
C
EX
 Two homologues of Serrate: Jagged-1
(JAG1) and Jagged-2 (JAG2).
SO
U

From Kovall and Blacklow, 2011

Structure of ligand Jagged 1
also a modular multidomain protein

M
O
M
VO
SI
LU
Extracellular domain:
C TM domain:
EX
- MNNL (Module at N-terminus of Notch single transmembrane spanning
Ligands) segment
SO

- DSL (Delta/Serrate/LAG-2)‫‏‬
- DOS (Delta and OSM-11-like)‫‏‬
- EGF-like repeats
U

- membrane-proximal cysteine-rich domain

From Kovall and Blacklow, 2011

Red stars denote sites of potential ubiquitination of Jagged1

Structure of DSL canonical ligands

M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO
U

From D’Souza et al., 2011

 Notch: a receptor
Human Notch1

M
EGF 11-13

O
M
VO
 Notch receptors are large transmembrane
proteins that normally communicate signals
upon binding to transmembrane ligands

SI
expressed on adjacent cells.

LU
 The extracellular domains of Notch proteins
C
contain tandem arrays of epidermal growth
EX
factor (EGF)-like repeats, ranging from 36 in
Drosophila to as few as 11 in C. elegans
SO

 Evolutionary divergence of invertebrates and

vertebrates has been accompanied by at least
U

two rounds of gene duplication: flies possess a

single Notch gene, worms two (GLP-1 and LIN-
12), and mammals four (NOTCH1-4)

From Kovall and Blacklow, 2011

 Intracellular domains:

- RAM (RBP-J Associated Molecule) and

Structure of Notch
300–350 kD (ca. 2700 amino acids in length ) type I
ANK (ankyrin repeats) for interaction
with CSL
- NLS (nuclear localization signals)‫‏‬
- TAD for transcriptional activation
- PEST (proline, glutamate, serine, and
threonine) signal for degradation

M
single-pass transmembrane glycoproteins with
multiple modular domains

O
cleavage sites

M
VO
SI
LU
C
EX
TM domain:
SO

Extracellular domain: single transmembrane spanning

segment
U

- multiple EGF-like repeats

- NRR, composed of the LNR
(Lin12-Notch Repeats) and the HD From Kovall and Blacklow, 2011
(Heterodimerization Domain)‫‏‬

EGF-like repeats that are modified by the glycotransferases Fringe and Rumi are denoted with
black and red arrows, respectively
 Production of Notch

M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO
U

Aster et al., J Pathol 2011; 223: 262–273

Canonical Notch signalling. Notch receptors are processed in the ER/Golgi compartment by furin-like
proteases at site S1 during trafficking to the cell surface, producing heterodimeric surface receptors.

Glycosilation events also take place in the Golgi apparatus by molecules such as Fringe and modulate
selectivity for ligands.
Transduction of Notch signal
 During maturation and trafficking to the cell surface, the Notch receptor is

M
processed by a furin-like protease at the S1 site to produce an intramolecular

O
heterodimer formed by two non-covalently associated subunits that

M
predisposes Notch to proteolytic activation by ligand.

VO
 The resulting two associated subunits, termed extracellular Notch (NEC) and

SI
transmembrane Notch (NTM), constitute the mature heterodimeric form of the
protein present at the cell surface.

LU
C
Notch receptors are maintained in proteolytically resistant conformation on the
EX

cell surface, but ligand binding initiates a proteolytic cascade that releases the
intracellular portion of the receptor (ICN) from the membrane.
SO
U

furin

NEC NTM
From Kovall and Blacklow, 2011
Transduction of Notch signal
 Interactions with ligand cells result in an extracellular juxtamembrane cleavage

M
in Notch catalyzed by metalloproteases of the A-Disintegrin And-

O
Metalloprotease (ADAM) family at a site called S2 immediately external (12-12
aminoacids) to the plasma membrane: ADAM10 and ADAM17.

M
VO
 This truncated receptor, named NEXT (for Notch extracellular truncation), is
cleaved at site S3 and additional sites by gamma secretase, a multiprotein

SI
enzyme complex, to release the Notch intracellular domain (NICD) from the

LU
membrane.

C
EX
SO

ADAM -secretase
U

NEXT NICD

NEC NTM
From Kovall and Blacklow, 2011
 M
O
M
 The juxtamembrane region of Notch receptors is a negative regulatory

VO
region (NRR) controlling signaling:

SI
LNR repeats prevent metalloprotease cleavage of mammalian Notch

LU

receptors in the absence of ligand
C
EX
 HD domain is sufficient to maintain the non-covalent association of the two
Notch subunits after division by furin cleavage at S1
SO

 the vast majority of the activating mutations in human T-ALLs alter

U

residues in the HD domain, further highlighting the importance of this

region of Notch receptors as a critical regulatory switch.
Tumorigenic mutations in T-ALL patients

A large proportion of both human and murine T-ALLs have genetic

M
lesions that lead to ligand-independent Notch1 activation, albeit

O
through different mechanisms

M
VO
SI
 Activating mutations of the NOTCH1 heterodimerization domain or
juxtamembrane extracellular region induce ligand-independent activation of

LU
the receptor.
C
EX
 Truncating mutations of the COOH-terminal PEST domain of the intracellular
region, on the other hand, extend NOTCH1 signaling by preventing the
proteasome-mediated degradation of the intracellular domains of the
SO

receptor.
U
Notch & T-LL

M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO
U

Mechanisms of ligand-independent Notch1 activation in T-LL. In human T-LL, the Notch

negative regulatory region (NRR) is often disrupted by point mutations or less frequently
by chromosomal translocations, whereas in murine T-LL the NRR is most commonly
disrupted by 5′ deletions (most RAG mediated) followed by retroviral insertions. Examples
of dissociative (red), destabilizing (blue), and insertional (green) Notch1 NRR mutations
found in human T-LL are listed
From Aster et al., 2011
 The gamma-secretase complex

Nicastrin: a 130-kDa type-I

M
transmembrane glycoprotein of can affect Psen catalytic activity
by an unknown mechanism

O
unclear function. It may act by
stabilizing the complex.

M
VO
SI
LU
C
EX

Necessary for the endoproteolysis

SO

and subsequent activation and

stabilization of Psen in the complex,
U

Presenilins (Psen-1 and Psen-2): by a yet unknown mechanism .

the catalytic subunit of the
gamma-secretase complex

4 different combinations
From Jorissen and De Strooper, 2011
Transduction of Notch signal

NICD translocates to the nucleus

M

where it functions directly in signal

O
transduction through complexing

M
with the CSL (CBF1, Su(H), LAG1)
DNA binding protein and

VO
transcriptional coactivators.

SI
This switches on expression of

LU

Notch target genes.
C
EX
SO

NICD
U

From D’Souza et al., 2011

 Notch “cis” signalling
 In addition to the well-characterized role for
the activation of Notch signaling through cell–

M
cell interactions (trans-interactions), ligands

O
can also interact with Notch cell autonomously

M
(cis-interactions) leading to inhibition of Notch
signaling.

VO
 cis-interactions between ligands and receptors

SI
would mutually inhibit the potential of ligands
to signal as well as restrict Notch activation to

LU
the receiving cell.
C
EX
 Even though both cis-and trans-interactions
with Notch appear to involve overlapping
binding sites, only trans-ligand interactions
SO

activate Notch.
U

 Ligand cis-interactions with Notch seem to

prevent proteolytic activation From D’Souza et al.,
2011
 A competitive mechanism for ligand–Notch
interactions that ultimately results in either
trans-activation or cis-inhibition of Notch
signaling has been proposed.
Structure of CSL (CBF1/RBP-J, Su(H), Lag1)‫‏‬

M
CSL: nuclear effector of the Notch pathway and a DNA binding transcription factor

O
M
VO
SI
NTD, BTD, and CTD. The NTD and CTD are
structurally similar to RHR-N and RHR-C (Rel-

LU
homology region) domains

C
EX

CSL is a DNA-binding protein that regulates the transcription

SO

of genes that are responsive to Notch signaling.

U

The capacity of CSL to act as either an activator or a

repressor is dependent upon whether it is bound by
transcriptional coactivator or corepressor proteins,
respectively.

From Kovall and Blacklow, 2011

 Activation of CSL

M
O
M
VO
CSL functions as a repressor by directly interacting with

SI
transcriptional co-repressor proteins.

LU
C
EX
The binding of NICD to CSL is thought to displace co-repressors from CSL and allows for
recruitment of the transcriptional coactivator Mastermind (MAM) to the CSL–NICD binary
SO

complex.
U

Formation of the CSL–NICD–MAM ternary complex results in the activation of

transcription from Notch target genes.
Structure of coactivator Mastermind

M
MAM: transcriptional co-activator

O
M
VO
SI
- short NTD (dnMAM) required to form a complex

LU
with CSL and Notch
- CTDs required for interaction with the general

C transcription factor CBP/p300 and the cyclin-

dependent kinase CycC/CDK8.
EX
SO
U

MAM proteins are generally about 1000

residues in length, in which only a short
NTD of ~60 amino acids is required to bind
CSL–NICD

From Kovall and Blacklow, 2011

Co-repressors

RBP-J was also shown to interact with co-repressors, such as SMRT

M

(silencing mediator for retinoid and thyroid receptor)/N-CoR (nuclear

O
receptor co-repressor) and MINT (Msx2-interacting nuclear target protein,

M
also known as Sharp/SPEN), which, like Drosophila Hairless, interact with C-
terminal binding protein (CtBP) or other global co-repressor complexes, and

VO
recruit histone deacetylases to suppress the transcription of RBP-J’s target
genes.

SI
A number of co-repressor proteins have been identified and shown

LU

biochemically to interact with CSL: Hairless in flies and SMRT, SKIP, CIR,
KyoT2, ETO(MTG8), MTG16 and MINT/SHARP in mammals.
C
EX
 At the primary sequence level these co-repressors are unrelated, but
functionally are thought, in general, to link CSL to the HDAC machinery
SO

within the nucleus.

U

 The model: NICD binding to CSL displaces, or outcompetes, co-repressors

from CSL.
Notch target genes
 The best-characterized Notch targets are the bHLH genes of the HES/ HEY
families, exemplified by the E(spl) genes in Drosophila and HES1 in mouse

M
and humans:

O
M
 RBP-J/Su(H) binding sequence was identified in the promoter region of a
target gene of Notch signaling, enhancer of split (E(spl)) m8; transcriptional

VO
activation of m8.

The intracellular domain of Notch can transactivate the promoter of HES1,

SI

the mammalian homologue of Hairy and E(spl), which also contains RBP-J-

LU
binding sites

 C
HES/HEY have now been shown to function downstream of Notch in many
EX
critical processes and to contribute to oncogenesis.

All HES/HEY proteins appear to function as transcriptional repressors.

SO

Apart from the HESR genes, so far there are relatively few genes that have
U


been found to be Notch regulated.

The classic Notch targets are HLH transcription factors in both vertebrates and
invertebrates [HESR, Hey, and E(spl)-related family], but the inventory of Notch targets
has begun to expand
 Notch target genes

M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO
U

Notch has been found to directly regulate genes involved in proliferation and apoptosis.
For example, the myc gene is a direct target of Notch in several types of cancer cells.
Knock-down of myc in these contexts compromise the extent of proliferation, arguing
that myc is an important intermediate in the proliferative response to Notch activation.
Other direct targets involved in promoting proliferation include Cyclin D, string/CDC25
and CDK5.
Notch and endocytosis

M
Endocytosis and endosomal trafficking have been shown to play an

O

important role in the activation and regulation of Notch signaling.

M
VO
 Endocytosis is required for ligand-dependent Notch activation in both signal-
sending and signal-receiving cells.

SI
In both signal-sending and receiving cells, the vesicle trafficking routes not

LU

only activate Notch signaling but also fine tune the signal output.
C
EX
SO
U
 Notch and endocytosis: sending cell

From Yamamoto et al., 2011

M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
Endocytosis and trafficking of DSL ligands in the signal-sending cell. DLS ligands are synthesized in
the ER and traffic to the cell surface through the secretory pathway. Endocytosis is required in the
SO

signal-sending cell for activation of the canonical Notch signaling pathway.

“Ligand Activation” theory: DSL proteins that reach the cell surface are still inactive but they are
U

endocytosed and sorted into a unique endocytic compartment where they become “activated.” The
activated ligands return to the cell surface via the recycling pathway where they interact with and
activate the Notch receptor.
“Pulling force” theory: when DSL ligands and Notch receptor interact, endocytosis in the signal-
sending cell generates a mechanical force that leads to a conformational change in the Notch
receptor that allows the S2 cleavage.
 Notch and endocytosis: receiving cell

From Yamamoto et al., 2011

M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
SO

Two possible models are shown as dashed lines:

U

(A) S3 cleavage takes place on the cell surface and does not require endocytosis. Instead,
endocytosis might play a negative tuning role since γ-secretase prefers the generation of
unstable form of NICD in endosomal compartments.
(B) Endocytosis is required for S3 cleavage. Dynamin and two early endosomal proteins, Rab5
and Avl, are important in internalization and endocytic trafficking of NEXT fragment. Rbcn-3A,
Rbcn-3B, and V-ATPase function in acidification of endosomal compartments where γ-
secretase is more active and S3 cleavage is thus more efficient.
 Notch and endocytosis: receiving cell

From Yamamoto et al., 2011

M
O
M
VO
SI
LU
C
EX
Full-length Notch receptors are firstly monoubiquitinated by E3 ligase Deltex, Su(dx), or DNedd4 for
internalization. With the help of Rab5 and Avl, Notch receptors enter into the early endosome,
SO

from which they can recycle back to the cell surface or further progress into MVB/late endosomes.
Sorting of Notch receptors into intraluminal vesicles is mediated by Hrs and ESCRT complexes (I, II,
U

and III). Lgd, a C2-containing phospholipid binding protein, is placed between Hrs and ESCRT
complexes based on epistatic analysis results. HOPS and AP-3 complexes are involved in endocytic
trafficking/fusion between late endosome and lysosome. They are required for Dx-dependent
Notch signaling activation. When endocytic trafficking of full-length Notch receptor for lysosomal
degradation is disrupted, Notch receptor can undergo proteolytic cleavages in a ligand-
independent manner (dashed line), which leads to ectopic activation of Notch signaling.
Notch and endocytosis

M
O
M
 Endocytosis and vesicle trafficking mediate the activation of
DSL ligands through the recycling pathway, generate a pulling

VO
force to promote the S2 cleavage of Notch upon ligand–

SI
receptor interaction, may regulate the S3 cleavage to release

LU
the active NICD fragment, promote degradation of inactive
C
Notch, and control ligand-independent activation of the
EX
pathway
SO
U