Protocolo

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA
ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA
GUÍA COMPONENTE PRÁCTICO
401542 – CROMATOGRAFÍA
MARCELA A. ZAMBRANO
Directora Nacional
BOGOTÁ
Julio de 2019
1
1. ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO
El componente práctico del curso de Cromatografía fue diseñado

en 2012 por MSc. Gloria María Doria Herrera, el cual presentó
modificaciones en el 2014 y 2015 conforme a las necesidades del curso.
Esta es la sexta actualización de la guía realizada en 2019, se enfoca a
dar respuesta a los objetivos planteados en el curso, con la finalidad de
garantizar en el estudiante su cumplimiento y aprendizaje autónomo, en
concordancia con los materiales que dispone la universidad como
infraestructura, recursos tangibles e intangibles.
Las modificaciones realizadas a la presente guía se enfocaron a

dar respuesta al proceso de aprendizaje del estudiante, según la
evolución del curso y las competencias a cumplir; dando un
acercamiento al análisis y aplicación de técnicas cromatográficas con el
desarrollo de laboratorios in-situ y por simuladores.
La revisión y acreditación de la guía del componente práctico del

curso de Cromatografía, se realizó con el apoyo y el trabajo realizado
del por la PhD. Nahury Yamile Castellanos Blanco, quien se desempeña
docente ocasional de la unidad académica de Ciencias Básicas de la
Universidad Nacional Abierta y a Distancia.
Este documento se puede copiar, distribuir y comunicar

públicamente bajo las siguientes condiciones:
• Reconocimiento. Debe reconocer los créditos de la obra de la manera
especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que
sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra).
• No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales.
• Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una
obra derivada a partir de esta obra.
• Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los términos
de la licencia de esta obra.
• Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el
permiso del titular de los derechos de autor.
• Nada en esta menoscaba o restringe los derechos morales del autor.
2
2. CONTENIDO
Pág.
1. ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO 2
2. CONTENIDO 3
3. CARACTERÍSTICAS GENERALES 4
4. DESCRIPCIÓN DE LAS PRÁCTICAS 5
PRACTICA No. 01 – Determinación del coeficiente de distribución del
ácido acético. 5
PRACTICA No. 02 – Preparación de la fase móvil e identificación del
adsorbente de la fase estacionaria en cromatografía de capa fina. 9
PRACTICA No. 03 – Aislamiento de cafeína y caracterización por
cromatografía en capa fina. 17
PRACTICA No. 04 – Separación de colorantes artificiales y pigmentos
naturales por cromatografía de papel. 26
PRACTICA No. 05 – Separación de colorantes por cromatografía de
columna. 33
5. FUENTES DOCUMENTALES 41
3
3. CARACTERÍSTICAS GENERALES
Introducción El laboratorio de Cromatografía busca afianzar los
conceptos aprendidos por parte de los estudiantes, con el
desarrollo de las diferentes Unidades, por tratarse de un
curso de carácter metodológico, que tiene como finalidad
afianzar destrezas y generar competencias en los
estudiantes del programa de Ingeniería de Alimentos.
Las prácticas descritas en este documento están
planeadas con la finalidad de apoyar y complementar el
avance teórico del curso.
Justificación En el desarrollo del aprendizaje de la Química, los
componentes prácticos permiten adquirir las
competencias necesarias para poder aplicar de manera
pertinente lo aprendido en la parte teórica.
La Cromatografía tiene un gran impacto a nivel práctico,
en donde se le brindará al estudiante las herramientas
para fortalecer los aprendizajes requeridos en el área de
campo.
La Cromatografía al ser una ciencia teórico-práctica,
requiere como complemento, el desarrollo de prácticas
de laboratorio que garanticen el cumplimiento de los
objetivos del curso, siendo evaluados con la presentación
de informes y cuestionarios por cada práctica, los cuales
serán responsabilidad y trabajo autónomo del estudiante,
junto con la preparación de cada una de las prácticas, a
partir de la realización de preinformes de laboratorio.
Competencia El estudiante aplica protocolos experimentales para la
separación e identificación de analitos con potencial
aplicación en la industria de alimentos, a través de
cromatografía plana y en columna.
No. de horas 18
Porcentaje 25%
Puntaje 125
4
4. DESCRIPCIÓN DE LAS PRÁCTICAS
PRACTICA No. 01 – Determinación del coeficiente de distribución

del ácido acético.
Tipo de práctica Presencial

Temáticas de la
Factor de retención
práctica
Fundamentación Teórica
La mezcla que se realiza de un soluto con dos solventes inmiscibles
hace que el soluto se logre distribuir en los dos solventes bajo
diferentes proporciones, generándose de esta manera una
transferencia de soluto. Toda vez que se determine la cantidad
disuelta de soluto en cada solvente se puede determinar el factor de
retención (k’), y por tanto la concentración del sistema. Cuando k’
presenta valores menores a 1, significa que la elución es tan rápida
que no se puede determinar el tiempo de retención (tR), mientras que,
si el factor de retención es mayor a 10, la elución es muy lenta.
Cuando k’ es igual a 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido
entre las dos fases.
Descripción de la practica
En esta práctica de laboratorio se determinará el coeficiente de
distribución del ácido acético, mediante la estandarización de
hidróxido de sodio como agente titulante y con la mezcla de un soluto
en dos solventes inmiscibles.
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Materiales y Equipos Reactivos

− Erlenmeyer. − Ácido acético (0,5 M,
− Bureta. 0,25 M y 0,125 M).
− Pipeta graduada de 25 y 50 mL. − Pentanol.
− Embudo de separación. − Ftalato ácido de potasio.
5
− Soporte universal. − Fenolftaleína.
− Pinza para bureta. − Hidróxido de sodio (0,5 M)
− Aro.
− Probetas.
Seguridad Industrial
Guantes de nitrilo, bata manga larga, botas de caucho si la ubicación
de la toma de muestra lo requiere, gafas de seguridad traslúcidas,
tapa bocas.
Metodología
El estudiante deberá desarrollar paso a paso los siguientes puntos:
PARTE I
Estandarización del agente titulante
1. Prepare una solución de hidróxido de sodio 0,5 M.
2. Seque aproximadamente 3,5 g de fatalato de potasio a 110 °C por

30 minutos y posteriormente déjelo enfriar en un desecador.
3. Pese 0,2, 0,4 y 0,6, 0,8 y 1,0 g de ftalato de potasio y dispóngalos

en erlenmeyer por separado.
4. Adicione a cada Erlenmeyer 25 mL de agua destilada y

posteriormente agregue dos gotas de fenolftaleína.
5. Titule las muestras preparadas con la solución de hidróxido de sodio

previamente preparada, hasta que note un viraje de color a rosa
pálido. Cada grupo puede realizar una titulación según la
disponibilidad de materiales.
6. Determine la concentración de hidróxido de sodio, la cual se

empleará para la valoración del ácido acético (C1).
6
PARTE II
Preparación de la mezcla
1. Adicione en diferentes embudos de separación 100 mL de ácido

acético de concentración 0,5 M, 0,25 M y 0,125 M (Estas
disoluciones deberán ser preparadas en el laboratorio, de acuerdo a
las instrucciones del tutor de práctica).
2. A cada embudo de separación agregue 100 mL de pentanol.
3. Agite vigorosamente la mezcla, teniendo cuidado de dar apertura a

la llave del embudo de separación, dejando escapar los gases que
se puedan generar durante la agitación. Deje en reposo la mezcla
por 30 minutos.
4. Del proceso realizado en el punto anterior, identifique y separe la

fase orgánica de la inorgánica (tener cuidadoso control sobre la
llave del embudo cuando se vaya acercando la división entre ambas
capas).
PARTE III
Titulación
1. Tome 25 mL (V1) de cada producto de separación realizado

anteriormente y agregue cada muestra (fase) en un erlenmeyer por
separado.
2. Adicione fenolftaleína y realice la titulación con el hidróxido de sodio

previamente estandarizado. Anote el volumen gastado del agente
titulante (V2)
3. Realice triplicado de la titulación.
4. Calcule la concentración de cada fase empleando la siguiente

expresión:
7
𝐶 × 𝑉2 𝐶 × 𝑉2
𝐶𝑓𝑎𝑠𝑒 1 = 𝐶𝑓𝑎𝑠𝑒 2 =
𝑉1 𝑉1
5. Determine el coeficiente de distribución:

𝐶𝑓𝑎𝑠𝑒 1
𝑘′ =
𝐶𝑓𝑎𝑠𝑒 2
Sistema de Evaluación
El tutor asignado al componente práctico evaluará el laboratorio de
acuerdo con los aspectos de la rúbrica de evaluación.
Se debe entregar por práctica un informe y un preinforme de
laboratorio, y por cada sesión se debe presentar un quiz.
Informe o productos a entregar
PREINFORME
Los pre-informes se realizan antes del desarrollo de la práctica de
laboratorio. En el entorno de aprendizaje práctico del curso,
encontrará las directrices y el formato para su elaboración.
INFORME DE LABORATORIO
Los informes se realizan después de finalizar la práctica de laboratorio,
y su elaboración será en los grupos colaborativos que se establezcan
en el laboratorio. En el entorno de aprendizaje práctico del curso,
Retroalimentación
El tutor asignado al componente práctico hará la correspondiente
retroalimentación 15 días después de realizada la práctica o en el
siguiente encuentro de laboratorio.
8
PRACTICA No. 02 – Preparación de la fase móvil e identificación
del adsorbente de la fase estacionaria en cromatografía de capa
fina.

Temáticas de la
Fase móvil y fase estacionaria
práctica
En cromatografía, la separación de mezclas se logra gracias a su
exposición en un sistema de dos fases (una móvil y la otra
estacionaria), la cual puede presentarse como líquido–líquido, gas–
líquido, gas–sólido y líquido–sólido. Por su parte, en cromatografía en
capa fina se emplea como fase estacionaria alúmina (Al2O3) o gel de
sílice (ácido silícico, SiO2·H2O) en diferentes soportes y una fase móvil
orgánica; la alúmina y el gel de sílice actúan del mismo modo, ya que
su función es generar la separación por la retención de los diferentes
componentes de una mezcla en su superficie por la combinación e
intensidad con la que actúan los ácidos y bases de Lewis.
El tamaño de la alúmina y el gel de sílice incide en la separación de

mezclas; si el adsorbente es muy grande se generará una separación
más rápida, pero hará que el contacto de la fase móvil sea menor, por
lo que se presentarán menos puntos de contacto, impidiendo que se
presente un equilibrio en las fuerzas que efectúan la separación y se
disminuya su eficacia. También es importante considerar el tamaño de
la placa (fase estacionaria), el cual es proporcional al área de contacto
que tenga con las fuerzas que actúan en la separación de cada
componente de la mezcla, por lo que, a mayor longitud de la placa, se
presentará una mejor separación de los componentes de una mezcla.
En cuanto a la fase móvil que corresponde por lo general a solventes

orgánicos, su efectividad radica en la elución que se presente en la
fase estacionaria, a los adsorbentes y a las polaridades, por lo que los
compuestos de la mezcla más polares serán lo que más firmemente se
unan a la fase estacionaria y su acción dependerá del nivel de
polaridad de la fase móvil.
9
El orden de elución de compuestos es inverso a la capacidad que estos
tengan para unirse con el adsorbente, por lo que se debe tener en
cuenta la disminución en la fuerza de unión: sales > ácidos orgánicos
> aminas > alcoholes > compuestos carboxílicos > arenos > haluros
de alquilo > éteres > alquenos > alcanos. Por su parte, el poder
eluyente es otro de los aspectos a tener en cuenta al momento de
realizar una separación: ácido acético > agua > alcohol etílico >
acetona > acetato de etilo > dietiléter > diclorometano > cloroformo
> tolueno > benceno > hexano > pentano.
Algunas de las ventajas de realizar ensayos por cromatografía de capa

fina es que los resultados se pueden aplicar para análisis en
cromatografía de columna; también se destaca el corto tiempo que se
requiere para un ensayo, el cual oscila entre los 10 y 30 minutos; y la
mejor resolución que se logra versus la técnica de cromatografía de
columna.
La cromatografía de capa fina requiere de materiales como: placas

cromatográficas (fase estacionaria), aplicador capilar, disolvente o
mezcla de disolventes (fase móvil), cámara para el desarrollo de la
placa, cámara de revelado (físico: lámpara de UV; o químico: cámara
de yodo o ácido sulfúrico).
En esta práctica de laboratorio se realizarán diferentes preparaciones
de la fase móvil e identificación de la fase estacionaria para la
separación de diferentes compuestos.

− Placas de gel de sílice. − Tolueno.
− Aplicador capilar (Tubo capilar). − Diclorometano.
− Mechero. − Éter etílico.
− Cámara cromatográfica (también − Pentano, heptano
puede emplear un vaso de hexano.
precipitados y un vidrio de reloj). − Vainilla.
10
− Cámara de revelado con Yodo. − Benzaldehído.
− Lápiz de grafito. − Anilina o cloroanilina.
− 3 probetas de 10 mL. − Cristales de Yodo.
− Erlenmeyer 25 mL.
− Lámpara de luz UV.
− Regla.
− Tijeras.
− Corcho.
− Pinzas.
− Papel filtro.
− 5 vasos de precipitado de 10 mL.
− 4 vasos de precipitado de 25 mL.
− Gotero.
− 3 pipetas aforadas de 10 mL.
− Pipeteador.
− Plancha de calentamiento.
tapa bocas.
Metodología
El estudiante deberá desarrollar las siguientes instrucciones:
PARTE I
Preparación de placas y capilares
1. Corte las placas de gel de sílice según el tamaño de la cámara

cromatográfica. Marque a 0.5 cm del borde inferior una línea base y
a 1.0 cm del borde superior el frente de disolvente.
2. Tome un capilar y caliéntelo en el mechero en la sección intermedia

del capilar hasta que se torne maleable.
3. Retire el capilar del mechero y estírelo firmemente de cada

extremo, hasta obtener dos capilares muy finos.
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Nota: Cuando manipule el capilar y el mechero asegúrese de emplear
las gafas de seguridad y mantenerse a una distancia prudente del
mechero. Para este proceso no emplee los guantes.
PARTE II
Preparación de la fase móvil
1. Rotule 6 vasos de precipitado de 25 mL como: Ensayo 1, Ensayo

2, Ensayo 3, Ensayo 4, Ensayo 5 y Ensayo 6.
2. En cada vaso de precipitado, prepare las siguientes mezclas de

disolventes:
Tabla 1 Mezcla de disolventes

Ensa Ensa Ensa Ensa Ensa Ensa
yo 1 yo 2 yo 3 yo 4 yo 5 yo 6
Tolueno (mL) 20 10 5 15
Diclorometano 10 2 10
(mL)
Éter etílico (mL) 18 10 15 5
3. Cubra la cámara cromatográfica con papel filtro para alcanzar un

equilibrio en la atmósfera de disolventes.
4. Agregue hasta cubrir el fondo (máximo a 0.5 cm de altura) con la

mezcla de disolventes preparada y tape inmediatamente. Realice
este procedimiento por separado para cada ensayo.
PARTE III
Preparación de las muestras
1. Pese 4 mg, en tubos de ensayo y por separado, las siguientes

sustancias: vainilla y benzaldehído. Agregue a cada tubo de
ensayo 2 gotas de diclorometano.
12
NOTA: si en el laboratorio no hay disponibilidad de las sustancias
mencionadas, puede sustituirlas por otras con similitud de polaridad.
2. Prepare la siguiente muestra problema: mida 0,5 mL de hexano o

heptano y dispóngalos en un erlenmeyer y tápelo con un corcho.
Posteriormente, agregue 0,5 mL de diclorometano, agite
suavemente y tape nuevamente el erlenmeyer.
PARTE IV
Aplicación de las muestras
1. Tome los capilares y sumérjalos por separado y en cada tubo de

ensayo donde se prepararon las muestras.
2. Aplique la muestra con el capilar en la línea base de la placa

cromatográfica en el siguiente orden de izquierda a derecha:
vainilla, benzaldehído y muestra problema (esta última será
proporcionada por el tutor de práctica). Cuando aplique la muestra,
asegúrese de tocar ligeramente el adsorbente.
3. Deje evaporar la mayor parte del disolvente de la placa

cromatográfica.
PARTE V
Cámara cromatográfica
1. Retire la tapa de la cámara cromatográfica, introduzca la placa en

forma vertical y tápela inmediatamente.
2. Cuando la mezcla de solventes haya alcanzado la línea de frente de

disolvente, retire la placa cromatográfica.
3. Deje secar el exceso de disolvente.
13
PARTE VI
Revelado
1. La determinación de la ubicación de las muestras en las placas las

podrá realizar por el método físico o el método químico, según la
disposición de material que tenga el laboratorio:
● Método físico:
Ubique la placa en un lugar con poca luz y acerque una lámpara de luz
UV a una distancia aproximada de 10 cm. Cuando la lámpara irradie la
placa, todos los compuestos orgánicos adsorbidos y que tengan un
cromóforo aparecerán con un color oscuro. Cuando realice este
procedimiento, marque con el lápiz la posición de las muestras en la
placa.
● Método químico (realizar bajo campana de extracción):

Prepare una cámara de revelado introduciendo en un recipiente con
tapa cristales de Yodo; tape el recipiente y espere a que se haga
visible un vapor coloreado encima de los cristales.
Destape el recipiente, introduzca las placas y tape inmediatamente;
retire la placa del recipiente cuando observe la coloración oscura de
las muestras en la placa y vuelva a tapar inmediatamente el
recipiente. Marque con el lápiz la posición de las muestras.
PARTE VII
Determinación del factor de retardo (Rf)
1. Después de marcar la posición de las muestras en la placa

cromatográfica, mida con una regla la distancia recorrida de cada
muestra desde la línea base (DRM) y la distancia recorrida por la
fase móvil desde la línea base hasta el frente de disolvente (DRD).
2. Aplique la siguiente ecuación:
𝑑𝑟𝑚
𝑅𝑓=
𝑑𝑟𝑑
14
En donde DRM corresponde a la distancia recorrida por la muestra y
DRD a la distancia recorrida por el disolvente.
3. Determine el factor de retardo en cada ensayo. Tenga en cuenta

que el mejor Rf se encontrará en el rango de 0.3 a 0.7
Cuestionario
− Explique: ¿cuáles son los factores se deben tener en cuenta para
tener una separación cromatográfica exitosa?
− ¿Qué es un cromóforo?
− ¿cuáles son sistemas los cromóforos más importantes y mencione
ejemplos de colorantes sintéticos empleados en la industria
alimenticia?
− ¿Por qué la cámara cromatográfica se debe cubrir con papel filtro?
− ¿Qué es polaridad y qué relación tiene con los ensayos de
cromatografía de capa fina?
− Clasifique las muestras analizadas de la más polar a la menos polar.
acuerdo a los aspectos de la rúbrica de evaluación.
PREINFORME
Retroalimentación
15
16
PRACTICA No. 03 – Aislamiento de cafeína y caracterización por
cromatografía en capa fina.

Temáticas de la Fase móvil, fase estacionaria, cromatografía de
práctica capa fina

exposición en un sistema de dos fases (una fase móvil y una fase
estacionaria), la cual puede presentarse como líquido–líquido, gas–
líquido, gas–sólido y líquido–sólido. Por su parte, en cromatografía en
capa fina se emplea como fase estacionaria alúmina (Al2O3) o gel de
sílice (ácido silícico, SiO2·H2O) en diferentes soportes y una fase móvil
orgánica; la alúmina y el gel de sílice actúan del mismo modo, ya que
su función es generar la separación por la retención de los diferentes
componentes de una mezcla en su superficie por la combinación e
intensidad con la que actúan los ácidos y bases de Lewis.

presentará una mejor separación.

17

columna.
La cromatografía de capa fina requiere de pocos materiales como:

placas (fase estacionaria), aplicador capilar, disolvente o mezcla de
disolventes (fase móvil), cámara para el desarrollo de la placa, cámara
de revelado (físico: lámpara de UV; o químico: cámara de yodo o
ácido sulfúrico).
En esta práctica de laboratorio se aplicará una técnica cromatográfica:
capa fina.
Materiales:
− Placas de gel de sílice.
− Aplicador capilar (Tubo capilar).
− Mechero.
− Cámara cromatográfica (también puede emplear un vaso de
precipitados y un vidrio de reloj).
− Cámara de revelado con Yodo.
− Lápiz de grafito.
− Lámpara de luz UV.
− Regla.
18
− Pinzas.
− Tijeras.
− Bolsas de té comercial.
− Papel filtro.
− Plancha de calentamiento.
− Vasos de precipitado.
− Termómetro.
− Hielo.
− Embudo de separación.
− Erlenmeyer.
− Corcho.
− Papel aluminio.
− Embudo.
− Montaje de destilación.
− Montaje de filtración al vacío.
− Tubo de Thiele.
− Alambre de cobre.
− Desecador.
− Vial de vidrio.
Reactivos:
− Carbonato de calcio.
− Diclorometano o triclorometano.
− Aceite mineral.
− Etanol.
− Metanol
− Acetato de etilo.
− Éter etílico.
− Hidróxido de potasio.
− Cristales de Yodo.
− Patrón de cafeína.
tapa bocas.
19
Metodología
PARTE I
Extracción de cafeína
1. En un vaso de precipitado de 500 mL, disponga 100 mL de agua

destilada y 10 g de café o hojas de té.
2. Lleve el vaso a una plancha de calentamiento por 15 min a una

temperatura de 90°C.
3. Deje enfriar.
4. Si trabajó con hojas de té, exprímalas con ayuda de unas pinzas,

retírelas del vaso y adicione 5 g de carbonato de calcio. En caso de
trabajar con café, adicione 5 g de carbonato de calcio a la mezcla.
5. Lleve nuevamente a calentamiento por 5 minutos.
PARTE II
Filtración y recristalización
1. Filtre la mezcla y deje enfriar el filtrado a temperatura ambiente.
2. Lleve el producto filtrado a un embudo de separación y adicione 30

mL de diclorometano.
3. Agite suavemente, liberando los gases producidos por efecto de la

agitación, mediante apertura de la llave del embudo (tenga cuidado
de no regar el contenido del embudo) y deje separar las fases.
Retire el tapón del embudo y separe la fase orgánica inferior de la
fase acuosa superior. . Tener cuidadoso control sobre la llave del
embudo cuando se vaya acercando la división entre ambas capas.
4. Tome la fase acuosa y repita la extracción dos veces más,

adicionando para cada extracción 30 mL de diclorometano.
20
5. Calcule el rendimiento.
PARTE III
Punto de fusión (opcional)
1. Tome un capilar y séllelo por un extremo utilizando el mechero.

Asegúrese de usar las gafas de seguridad y acercarse al mechero
sin guantes.
2. Tome una porción de la muestra e introdúzcala por el capilar, fíjelo

al termómetro con un alambre de cobre.
3. Tome un tubo de Thiele y llénelo hasta ¾ partes con aceite

mineral.
4. Introduzca el termómetro y el capilar hasta que quede cubierto ¾

partes por aceite mineral.
5. Inicie el calentamiento del sistema evitando el sobrecalentamiento.
6. Registre la temperatura cuando la muestra esté fundida.
7. Compare el valor teórico con el valor experimental y calcule el

error relativo.
8. Repita este proceso.
PARTE IV
Preparación de placas y capilares
1. Corte las placas de gel de sílice según el tamaño de la cámara

cromatográfica. Marque a 0.5 cm del borde inferior una línea base
y a 1.0 cm del borde superior el frente de disolvente.
21
2. Tome un capilar y caliéntelo en el mechero en la sección
intermedia del capilar hasta que se torne maleable.
3. Retire el capilar del mechero y estírelo firmemente de cada

extremo, hasta obtener dos capilares muy finos.
Nota: Cuando manipule el capilar y el mechero asegúrese de emplear

las gafas de seguridad y mantenerse a una distancia prudente del
mechero. Para este proceso no emplee los guantes.
PARTE V
Preparación de la fase móvil
1. Rotule 6 vasos de precipitado de 25 mL como: Ensayo 1, Ensayo

2, Ensayo 3, Ensayo 4, Ensayo 5 y Ensayo 6.
2. En cada vaso de precipitado, prepare las siguientes mezclas de

disolventes:
Tabla 3 Mezcla de disolventes

Ensa Ensa Ensa Ensa Ensa Ensa
yo 1 yo 2 yo 3 yo 4 yo 5 yo 6
Metanol (mL) 10 5 2.5 7.5
Acetato de etilo 5 2.5 5
(mL)
Éter etílico (mL) 7.5 5 7.5 2.5
3. Cubra la cámara cromatográfica con papel filtro para alcanzar un

equilibrio en la atmósfera de disolventes.
4. Agregue hasta cubrir el fondo (máximo a 0.5 cm de altura) con la

mezcla de disolventes preparada y tape inmediatamente. Realice
este procedimiento por separado para cada ensayo.
22
PARTE VI
Preparación de la muestra
1. Agregue una pequeña cantidad del producto de la extracción y

adicione unas gotas de diclorometano o etanol.
2. Disponga esa mezcla en un vial de vidrio.
PARTE VII
Aplicación de las muestras
1. Tome un capilar y sumérjalo en el vial donde se encuentra la

muestra.
2. Aplique la muestra con el capilar en la línea base de la placa

cromatográfica. Cuando aplique la muestra, asegúrese de tocar
ligeramente el adsorbente.
3. Deje evaporar la mayor parte del disolvente de la placa

cromatográfica.
4. Realice este procedimiento por cada mezcla de solventes de la fase

móvil.
PARTE VIII
Cámara cromatográfica
1. Retire la tapa de la cámara cromatográfica, introduzca la placa en

forma vertical y tápela inmediatamente.
2. Cuando la mezcla de solventes haya alcanzado la línea de frente

de disolvente, retire la placa cromatográfica.
3. Deje secar el exceso de disolvente, puede emplear una plancha de

calentamiento o esperar que el proceso ocurra.
23
PARTE IX
Revelado
1. La determinación de la ubicación de las muestras en las placas las

podrá realizar por el método físico o el método químico, según la
disposición de material que tenga el laboratorio:
● Método físico:
Ubique la placa en un lugar con poca luz y acerque una lámpara de luz
UV a una distancia aproximada de 10 cm. Cuando la lámpara irradie la
placa, todos los compuestos orgánicos adsorbidos y que tengan un
cromóforo aparecerán con un color oscuro. Cuando realice este
procedimiento, marque con el lápiz la posición de las muestras.
● Método químico (realizar en campana de extracción):

Prepare una cámara de revelado introduciendo en un recipiente con
tapa cristales de Yodo; tape el recipiente y espere a que se haga
visible un vapor coloreado encima de los cristales.
Destape el recipiente, introduzca las placas y tape inmediatamente;
retire la placa del recipiente cuando observe la coloración oscura de
las muestras en la placa y vuelva a tapar inmediatamente el
recipiente. Marque con el lápiz la posición de las muestras.
PARTE X

𝑑𝑟𝑚
𝑅𝑓=
𝑑𝑟𝑑
24
Cuestionario
- Explique: ¿cuáles son los factores se deben tener en cuenta para
tener una separación cromatográfica exitosa?
- ¿Cuál es la fórmula química de la cafeína?, consulte sus usos y
aplicaciones.
- ¿Qué relación tiene con los ensayos de cromatografía de capa fina?
acuerdo a los aspectos de la rúbrica de evaluación. La valoración de la
práctica se dará en puntaje, donde 14 corresponde a la mayor
puntuación y cero a la menor puntuación.
laboratorio. Por cada práctica se realizará un cuestionario en el
laboratorio.
PREINFORME
Retroalimentación
25
PRACTICA No. 04 – Separación de colorantes artificiales y
pigmentos naturales por cromatografía de papel.

Temáticas de la Fase móvil, fase estacionaria, pigmentos,
práctica colorantes, cromatografía de papel

exposición en un sistema de dos fases (generalmente una es móvil y
la otra estacionaria), la cual puede presentarse como líquido – líquido,
gas – líquido, gas – sólido y líquido – sólido. Por su parte, en
cromatografía en capa fina se emplea como fase estacionaria alúmina
(Al2O3) o gel de sílice (ácido silícico, SiO2·H2O) en diferentes soportes
y una fase móvil orgánica; la alúmina y el gel de sílice actúan del
mismo modo, ya que su función es generar la separación por la
retención de los diferentes componentes de una mezcla en su
superficie por la combinación e intensidad con la que actúan los ácidos
y bases de Lewis.


26


columna.
La cromatografía de capa fina requiere de pocos materiales como:

placas (fase estacionaria), aplicador capilar, disolvente o mezcla de
disolventes (fase móvil), cámara para el desarrollo de la placa, cámara
de revelado (físico: lámpara de UV; o químico: cámara de yodo o
ácido sulfúrico)
papel.

− Papel filtro. − Butanol.
− Aplicador capilar (Tubo − Acetona.
capilar). − Éter de petróleo.
− Mechero. − Cloruro de calcio.
− Pinzas. − Agua destilada.
− Tijeras. − Ácido acético.
27
− Pipeta aforada de 5 y 10
mL.
− Pipeta graduada de 1 mL.
− Pipeteador
− Probeta de 50 mL.
− Mortero.
− Embudo.
− Erlenmeyer.
− Tubos de ensayo.
− Gradilla.
− Espinaca.
− Acelga.
− Flan de chocolate en polvo.
− Papel filtro.
− Aplicador capilar (Tubo
capilar).
− Mechero.
− Pinzas.
− Tijeras.
− Pipeta aforada de 5 y 10
mL.
− Pipeta graduada de 1 mL.
− Pipeteador
− Mortero.
− Embudo.
− Erlenmeyer.
− Gradilla.
− Espinaca.
− Acelga.
− Flan de chocolate en polvo.
28
tapa bocas.
Metodología
PARTE I
Separación de colorantes artificiales
1. Pese 5 g del flan de chocolate en polvo y adiciónelo en un vaso de

precipitado con 10 mL de butanol – ácido acético – agua, relación
60:40:20.
2. Agite vigorosamente hasta disolver la mezcla y se obtenga un color

rojo.
3. Deje reposar 5 minutos.
4. Corte el papel filtro para formar un rectángulo de 4 x 8 cm y a 1.5

cm del bode inferior, dibuje una línea base.
5. Tome un capilar y sumérjalo en el vaso donde se encuentra la

muestra.
6. Aplique la muestra con el capilar en la línea base del papel filtro.
7. Deje evaporar y repita el numeral 6 y 7, cinco veces.
8. En un vaso de precipitado adicione 6 mL de la mezcla butanol –

ácido acético – agua (60:40:20).
9. Introduzca el papel filtro y déjelo máximo 10 minutos, según la

separación de colores que observe en el papel filtro, por la afinidad
con la mezcla de solventes.
29
PARTE II
Separación de pigmentos naturales
1. Macere hojas de espinaca en un mortero y adicione etanol. Macere

hasta que las hojas pierdan su color y el solvente tome un color
verde intenso.
2. Filtre el solvente.
3. Recoja 3 mL del filtrado en un tubo de ensayo.
4. Adicione 4 lentejas de cloruro de calcio.
5. Deje reposar 10 minutos.
6. Corte el papel filtro para formar un rectángulo de 4 x 10 cm y a 2

cm del bode inferior, dibuje una línea base.
7. Tome un capilar y sumérjalo en el tubo de ensayo donde se

encuentra la muestra.
8. Aplique la muestra con el capilar en la línea base del papel filtro.
9. Deje evaporar y repita el numeral 7 y 8, seis veces.
10. En dos vasos de precipitado adicione 5 mL de éter de petróleo o

tome dos vasos de precipitado y adicione por separado 6 mL de
etanol y 6 mL de acetona, en el primero disponga la muestra con
la siembra de espinaca y en la segunda, la muestra con la siembra
de acelga.
11. Introduzca el papel filtro y déjelo máximo 10 minutos, según la

separación de colores que observe en el papel filtro, por la afinidad
con el solvente.
12. Identifique los pigmentos según las bandas que aparezcan en el

papel filtro.
30
13. Repita los pasos 1 al 12 empleando acelga con acetona.
PARTE III

𝑑𝑟𝑚
𝑅𝑓=
𝑑𝑟𝑑


Cuestionario
− ¿Cuáles son las ventajas de la Cromatografía de papel?
− ¿Los experimentos realizados, se pueden replicar para
cromatografía de columna y de capa fina? Justifique su respuesta.
31
PREINFORME
Retroalimentación
32
PRACTICA No. 05 – Separación de colorantes por cromatografía
de columna.

Temáticas de la Fase móvil, colorantes, separación, cromatografía
práctica de columna
Fundamentación teórica
exposición en un sistema de dos fases (generalmente una es móvil y
la otra estacionaria), la cual puede presentarse como líquido – líquido,
gas – líquido, gas – sólido y líquido – sólido. Por su parte, en
cromatografía en capa fina se emplea como fase estacionaria alúmina
(Al2O3) o gel de sílice (ácido silícico, SiO2·H2O) en diferentes soportes
y una fase móvil orgánica; la alúmina y el gel de sílice actúan del
mismo modo, ya que su función es generar la separación por la
retención de los diferentes componentes de una mezcla en su
superficie por la combinación e intensidad con la que actúan los ácidos
y bases de Lewis.


33
columna.

− Espinaca. − Alúmina (polar)
− Acelga. − Acetona.
− Colorantes − Éter de petróleo.
− Columna cromatográfica de
vidrio.
− Balanza analítica.
− Espátula.
− Mortero.
− Pinzas.
− Embudo.
− Papel filtro.
− Pipeta aforada de 5 y 10 mL.
− Pipeteador
− Erlenmeyer.
− Gradilla.
− Algodón.
− Carbón activado.
34
tapa bocas.
Metodología
PARTE I
Extracción de pigmentos naturales
1. Pese 5 g de espinaca.
2. Macere la espinaca en un mortero.
3. Adicione 10 mL de éter de petróleo y acetona en relación 8:2.
4. Continúe macerando hasta que las hojas pierdan su color y la

mezcla de solventes tomen un color verde intenso.
5. Filtre el solvente.
6. Recoja el filtrado en un tubo de ensayo.
7. Repita el procedimiento empleando acelga.
PARTE II
Columna cromatográfica para pigmentos naturales
1. Adicione 5 mL de éter de petróleo en un vaso de precipitado.
2. Coloque la columna en un soporte universal. Ubique el vaso debajo

de la columna.
3. Abra la llave de la columna cromatográfica y humedezca un pedazo

de algodón con éter de petróleo e introdúzcalo en la columna, hasta
que cubra aproximadamente 1.5 cm de la punta de la columna,
35
dejando la parte más delgada de la columna libre, con el fin de
evitar obstruir su funcionamiento y el paso del eluyente.
4. Adicione en la columna arena de mar hasta que se tenga una capa

aproximada de 1 cm o menos. Procure que la arena mar cubra
desde el ensanchamiento de la columna a la parte de mayor
diámetro. Cierre la llave de la columna cromatográfica.
5. Mezcle en un vaso de precipitado 20 g de alúmina con 30 mL de

éter de petróleo. Agite la mezcla hasta que se obtenga una
suspensión.
6. Lleve la mezcla del numeral 5 a la columna con ayuda de un

embudo y varilla de agitación, evitando la formación de espacios de
aire, con el fin de tener una buena empaquetadura.
7. Abra la llave de la columna cromatográfica y recoja el exceso de

éter de petróleo a medida que atraviesa la columna. Enrase la
columna con el disolvente (éter de petróleo) y páselo nuevamente
con el fin de limpiar las paredes. El nivel de la fase móvil debe
estar siempre por encima de la empaquetadura de la
columna.
NOTA: evite que la fase estacionaria de la columna quede seca cuando

se recoja el exceso de éter de petróleo, ya que la empaquetadura se
puede obstruir por acción del aire.
8. Adicione en la columna arena de mar hasta que se tenga una capa

aproximada de 1 cm o menos (Figura 1).
9. Asegúrese que el éter de petróleo esté por encima de la última capa

que se adicionó de arena de mar y cierre la llave de la columna
cromatográfica.
36
Figura 1. Separación de colorantes naturales (Zambrano, M. 2018)
PARTE III
Separación cromatográfica de pigmentos naturales
1. Adicione la muestra (extracto de espinaca) a la columna, abra la

llave y observe el desplazamiento de los pigmentos a través de la
columna.
1. Cuando el primer pigmento (carotenos) atraviese la primera capa

de arena de mar que se empaquetó en la columna, adicione éter de
petróleo hasta observar una separación completa.
2. Recoja en tubos de ensayo el pigmento separado

(aproximadamente 10 mL por tubo).
3. Adicione acetona y espere que se presente la separación de las

clorofilas (A y B).
37
4. Cuando el segundo pigmento atraviese la primera capa de arena de
mar que se empaquetó en la columna, adicione acetona hasta
observar una separación completa.
5. Repita el experimento, empleando el extracto de acelga.
PARTE IV
Separación de colorantes
1. Realice una mezcla de colorantes empleados en la industria de

alimentos o de azul de metileno y naranja de metilo (1 gota por
cada uno).
2. Disponga la mezcla den la columna previamente preparada,

siguiendo el procedimiento descrito en la Parte II de esta práctica,
teniendo en cuenta que la suspensión espesa del adsorbente
(alúmina) debe prepararse pensando 30 g de alúmina los cuales se
deben suspender en una solución 3:1 de agua – etanol hasta
completar un volumen de 200 mL.
3. Cuando adicione el colorante, evite el contacto directo con el lecho

de la columna, por lo que se recomienda hacerlo por sus paredes.
4. Recoja en tubos de ensayo los colorantes obtenidos (Figura 2).
38
Figura 2. Separación de colorantes naturales (Zambrano, M. 2018)
Cuestionario:
- ¿Qué características debe tener la fase móvil y la fase estacionaria
para que se presente una correcta elución?
- ¿Cómo se puede aplicar la cromatografía de columna en la industria
alimentaria actual?
- ¿Los experimentos realizados, se pueden replicar para cromatografía
de capa fina y de papel? Justifique su respuesta
39
PREINFORME
Retroalimentación
40
5. FUENTES DOCUMENTALES
Abott, D., & Andrews, R. (1966). Introducción a la Cromatografía.

Madrid: Alhambra, S.A.
Armitage, B. (1999). A GC Instrument Simulator. J. Chem. Educ. 76(2)

p.221.
Boswell P., Stoll D., Carr P., Nagel, M., Vitha, M., Mabbott G. (2013).
An Advanced, Interactive, High-Performance Liquid
Chromatography Simulator and Instructor. J. Chem. Educ. 90 (2),
p. 198–202.
Berkelman T., Stenstedt T. 2-D Electrophoresis using immobilized pH

gradients. Principles & methods. Amersham Pharmacia Biotech
Inc. 1998.
Chávez Torres , J., Rios Chavez, P., & Mendoza Olivera, S. (2011).
Manual del Laboratorio de Bioquimica. España: Universidad
Michoacana de San Nicolas de Hidalgo.
Guías Laboratorio. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular.

Islas Canarias: Universidad de la laguna. Consultado en Febrero
24 del 2013 en:
http://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/6.pdf
Mancilla, C., Rosas, T., Perez, S., Castrejón, C., & Blanco, E. (2008).
Extracción y separación de lípidos terpenicos carotenos. Mexico
DF: Universidad del Valle de Mexico.
Peña, E. M., Sacristán San Cristóbal., M., Borja Alarcón, A., Córdoba.,
C., & Legaz González, M. (2011). Prácticas de laboratorio y
cuestiones teórico-prácticas. Madrid: Serie Técnicas y Métodos.
Perez de Marquez, O. (2004). Guía de Análisis Químico Cualitativo.

Bogota: Universidad de los Andes.
41

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA

GUÍA COMPONENTE PRÁCTICO

El componente práctico del curso de Cromatografía fue diseñado

Las modificaciones realizadas a la presente guía se enfocaron a

La revisión y acreditación de la guía del componente práctico del

Este documento se puede copiar, distribuir y comunicar

PRACTICA No. 01 – Determinación del coeficiente de distribución

Tipo de práctica Presencial

Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

Materiales y Equipos Reactivos

El estudiante deberá desarrollar paso a paso los siguientes puntos:

1. Prepare una solución de hidróxido de sodio 0,5 M.

2. Seque aproximadamente 3,5 g de fatalato de potasio a 110 °C por

3. Pese 0,2, 0,4 y 0,6, 0,8 y 1,0 g de ftalato de potasio y dispóngalos

4. Adicione a cada Erlenmeyer 25 mL de agua destilada y

5. Titule las muestras preparadas con la solución de hidróxido de sodio

6. Determine la concentración de hidróxido de sodio, la cual se

1. Adicione en diferentes embudos de separación 100 mL de ácido

2. A cada embudo de separación agregue 100 mL de pentanol.

3. Agite vigorosamente la mezcla, teniendo cuidado de dar apertura a

4. Del proceso realizado en el punto anterior, identifique y separe la

1. Tome 25 mL (V1) de cada producto de separación realizado

2. Adicione fenolftaleína y realice la titulación con el hidróxido de sodio

3. Realice triplicado de la titulación.

4. Calcule la concentración de cada fase empleando la siguiente

5. Determine el coeficiente de distribución:

Tipo de práctica Presencial

El tamaño de la alúmina y el gel de sílice incide en la separación de

En cuanto a la fase móvil que corresponde por lo general a solventes

Algunas de las ventajas de realizar ensayos por cromatografía de capa

La cromatografía de capa fina requiere de materiales como: placas

Materiales y Equipos Reactivos

1. Corte las placas de gel de sílice según el tamaño de la cámara

2. Tome un capilar y caliéntelo en el mechero en la sección intermedia

3. Retire el capilar del mechero y estírelo firmemente de cada

1. Rotule 6 vasos de precipitado de 25 mL como: Ensayo 1, Ensayo

2. En cada vaso de precipitado, prepare las siguientes mezclas de

Tabla 1 Mezcla de disolventes

3. Cubra la cámara cromatográfica con papel filtro para alcanzar un

4. Agregue hasta cubrir el fondo (máximo a 0.5 cm de altura) con la

1. Pese 4 mg, en tubos de ensayo y por separado, las siguientes

2. Prepare la siguiente muestra problema: mida 0,5 mL de hexano o

1. Tome los capilares y sumérjalos por separado y en cada tubo de

2. Aplique la muestra con el capilar en la línea base de la placa

3. Deje evaporar la mayor parte del disolvente de la placa

1. Retire la tapa de la cámara cromatográfica, introduzca la placa en

2. Cuando la mezcla de solventes haya alcanzado la línea de frente de

3. Deje secar el exceso de disolvente.

1. La determinación de la ubicación de las muestras en las placas las

● Método químico (realizar bajo campana de extracción):

1. Después de marcar la posición de las muestras en la placa

2. Aplique la siguiente ecuación:

3. Determine el factor de retardo en cada ensayo. Tenga en cuenta

Tipo de práctica Presencial

En cromatografía, la separación de mezclas se logra gracias a su

El tamaño de la alúmina y el gel de sílice incide en la separación de

En cuanto a la fase móvil que corresponde por lo general a solventes

Algunas de las ventajas de realizar ensayos por cromatografía de capa

La cromatografía de capa fina requiere de pocos materiales como:

1. En un vaso de precipitado de 500 mL, disponga 100 mL de agua

2. Lleve el vaso a una plancha de calentamiento por 15 min a una

4. Si trabajó con hojas de té, exprímalas con ayuda de unas pinzas,

5. Lleve nuevamente a calentamiento por 5 minutos.