EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS

ALCALINA
María Alejandra Núñez, Juan Sebastián Santofimio, Sharolt Sierra Pérez
Curso A, Grupo Biología Molecular, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad de Pamplona

1. OBJETIVOS
 GENERAL
 ESPECÍFICO

2. Metodología centrifugación a velocidad máxima durante 5 minutos

a 4 ° C en microcentrífuga. Luego se retiró el
Se recibió un tubo inoculado con una colonia de sobrenadante por aspiración suave como se mencionó
bacterias transformadas, las cuales estaban antes, se agregaron 1 ml de etanol al 70% e invierta el
previamente en agar LB que contenía el antibiótico tubo cerrado varias veces, se recuperó el ADN por
apropiado, el tubo estuvo incubado durante la noche a centrifugación a velocidad máxima durante 2 minutos
37 ° C. Para la preparación de ADN plasmídico por a 4 ° C, nuevamente, se retiró todo el sobrenadante
lisis alcalina con SDS, se vertieron 1,5 ml del cultivo mediante una aspiración suave, se removieron los
en un tubo de microcentrífuga y se centrifugó a restos o cúmulos de etanol que se forman a los lados
velocidad máxima durante 30 segundos a 4 ° C, del tubo. Se dejó el tubo abierto a temperatura
cuando se completó la centrifugación, se retiró el ambiente hasta que el etanol se evaporó y no se
medio por aspiración, dejando el sedimento bacteriano observaba nada en el tubo, se disolvieron los ácidos
lo más seco posible. Luego se resuspendió el nucleicos en 50 ul de TE (pH 8.0) que contenía 20
sedimento bacteriano en 100 ul de solución de lisis ug/ml de DNasa libre de RNasa.
alcalina helada I mediante agitación vigorosa, después
se añadieron 200 µl de solución de lisis alcalina recién 3. Análisis y resultados
preparada II a cada suspensión bacteriana, se cerró el
tubo herméticamente y se mezcló el contenido 5. Conclusiones
invirtiendo el tubo rápidamente cinco veces, se 6. Referencias Bibliográficas
agregaron 150 µl de solución de lisis alcalina helada
III y se cerró el tubo, se dispersó la solución III de lisis
alcalina a través del lisado bacteriano viscoso
invirtiendo repetidas veces el tubo. Luego de esto se
almacenó el tubo en hielo durante 3-5 minutos. Se
centrifugó el lisado bacteriano a máximo velocidad
durante 5 minutos a 4 ° C, se transfirió el sobrenadante
a un tubo nuevo, a este se le agregó un volumen igual
de fenolcloroformo, mezclando las fases orgánicas y
acuosas mediante vortex y luego se centrifugó la
emulsión a velocidad máxima durante 2 minutos a 4 °
C, se transfirió la capa superior acuosa a un tubo
nuevo. Seguido, se precipitaron los ácidos nucleicos
del sobrenadante mediante la adición de 2 volúmenes
de etanol a temperatura ambiente, se mezcló la
solución agitando en vórtex y luego se dejó en reposo
durante 2 minutos a temperatura ambiente, se
recogieron los ácidos nucleicos precipitados por