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La síntesis química del genoma mitocondrial ratón

Artículo    en    Nature Methods · Octubre 2010

DOI: 10.1038 / nmeth.1515 · Fuente: PubMed

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5 autores , incluso:

G Gibson J. C Venter

La genómica sintética J. Craig Venter Institute

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Chuck Merryman

J. Craig Venter Institute

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la síntesis química del
genoma mitocondrial ratón
Daniel G Gibson 1, Hamilton O. Smith 2,
Clyde A Hutchison III 2, J Craig Venter 1,2 y
Chuck Merryman 1
Describimos un solo paso, método de montaje isotérmica para la síntesis de
moléculas de ADN a partir de oligonucleótidos solapantes. los ciclos del método
entre in vitro se alcanza la recombinación y amplificación hasta la longitud deseada.
como una demostración de su simplicidad y robustez, se sintetizaron todo el
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genoma mitocondrial de ratón 16,3 kilobases de 600 superposición de 60-meros.
La síntesis química de secuencias de ADN largas que codifican diversas funciones
genéticas ha mejorado constantemente desde la síntesis del gen de 77 pares de bases
(pb) que codifica un ARN de transferencia alanina levadura 1. Ahora es posible producir
genes 1-kilobases (kb), 30-kb rutas biosintéticas e incluso todo cromosomas 1-Mb de
ADN sintetizado químicamente 2,3. Debido a que uno tiene el control pleta com- sobre la
secuencia de moléculas de ADN de origen químico, componentes genéticos pueden ser
exhaustivamente optimizado. Por ejemplo, un objetivo con productos importantes
medicinalmente es mejorar la expresión heteróloga en huéspedes industriales por
optimización de codones 4,5. Más ampliamente, nuestro objetivo es crear organismos
sintéticos cuya composición genética entera está adaptada para una producción
eficiente 2,3. Independientemente del motivo, amplia reingeniería de la mayoría de los
elementos genéticos se basa en una tecnología que permite que el conjunto de
pequeñas nucleótidos oligo sintéticos. Aquí se describe un solo paso in vitro reacción para
el montaje de oligos de ADN directamente en un vector, que luego puede ser clonado en
Escherichia coli. Este método es esencialmente independiente de la secuencia, rápido,
en gran parte libre de trabajo y se compara favorablemente con los métodos descritos
anteriormente para la síntesis de genes 6,
que requieren pasos adicionales (polimerasa de montaje ciclismo, PCR, purificación
de gel, digestión de restricción y ligación de ADN). Además, no se requieren
procedimientos de corrección de error en este método debido a que sólo pequeños
fragmentos se sintetizan a partir oligos, que asegura que las moléculas libres de
errores se obtienen con una eficiencia razonable 4. Para demostrar estas
características, se sintetizó el genoma mitocondrial ratón, a nuestro knowl- borde del
primer genoma sintético de un orgánulo que se hizo,
1 El Instituto J. Craig Venter, en Rockville, Maryland, EE.UU.. 2 El Instituto J. Craig Venter, San Diego, California, EE.UU.. La correspondencia debe dirigirse a
DGG ( dgibson@jcvi.org ) o CM ( cmerryman@jcvi.org ).
Recibido el 26 de mayo; aceptado 8 de septiembre; publicado en línea el 10 de octubre de 2010; doi: 10.1038 / nMeth.1515
comunicaciones breves
y estimar que un individuo podría reconstruir la totalidad
molécula de 16,3 kb en tan sólo 5 d ( Fig complementario. 1).
Recientemente hemos descrito un solo paso, isotérmica in vitro sistema de
combinación reco- capaz de unirse a moléculas de ADN de doble cadena que se
solapan hasta cientos de kilobases de largo 7. La mezcla de reacción de ensamblaje
en este sistema contiene tres enzimas separadas (exonucleasa T5, Phusion
polimerasa y Taq ligasa) que trabajan en armonía para unir múltiples fragmentos de
ADN. En una reac- ción típica el conjunto se lleva a cabo en tan sólo 15 min. Este
método es robusto y susceptibles de automatización. Por estas razones, se adaptó
para comenzar el montaje a nivel oligo. Hemos optimizado varios parámetros que
incluyen el número de oligos utilizados en una sola reacción, su longitud, la cantidad
de solapamiento, la orientación, la concentración de oligo en la reacción, la reacción
tempera- tura y el tiempo de reacción ( Tablas de apoyo 1 - 9 y
Nota Suplementaria 1) para maximizar la eficiencia de montaje otide oligonucle-
en un pUC19 vector de clonación linealizado. Se sintetizaron todo el genoma
mitocondrial ratón 16299 pb de 600 oligonucleótidos solapantes 60-mer. La
estrategia global de montaje abarca cuatro pasos subconjunto ( Fig. 1, que
complementa la Fig. 2 y 10 cuadros suplementarios y 11).
Hemos comprado 600 oligos de Integrated DNA Technologies. Hemos hecho ningún intento
para seleccionar los oligonucleótidos con características que podrían mejorar la eficiencia de
montaje. Por lo tanto, comenzando en el nucleótido 1, que simplemente pedimos oligos
60-nucleótidos según lo dictado por la secuencia de la Mus musculus genoma mitocondrial
(GenBank número de acceso NC_005089), independientemente de potencial para mispair o
para formar horquillas. Cada oligo superpuesto a su vecino por 20 nucleótidos, y productos
intermedios de montaje solapado por 40 pb. Además, hemos diseñado los oligos para incluir
sitios de restricción y el vector de superposiciones en los límites de la etapa montaje-. El vector
de superposiciones permitido para el montaje directo en un vector o suministra un dominio de
unión a cebador universal de la etapa específica para la amplificación PCR. Los sitios de
restricción (NotI, SbfI, AscI y PmlI) permitidos para la liberación de la inserción del vector o la
secuencia no se solapan antes de la siguiente etapa de montaje. Hemos reunido directamente
oligonucleótidos en el vector pUC19 en grupos de ocho ( Figura 1). Esto produjo 75
subconjuntos se solapan y que hemos secuenciado antes de unirse jerárquicamente ellos para
producir el producto 16.5 kb deseado ( Figura 1). Debido a la tasa de error inherente de la
síntesis de oligonucleótidos química, secuenciación es necesario si una versión libre de errores
de un gran constructo se ha de obtener a una velocidad apreciable 8. Para reducir el trabajo que
rodea la prepara- ción y secuenciación de los subconjuntos, se agruparon los volúme- nes
iguales de las 75 reacciones de montaje de la primera etapa antes de realizar un solo E. coli transformación.
Automatizado de picking colonia, la preparación plas- mediados de ADN y secuenciación 9 de
los clones resultantes a 8 × redundancia (600 clones) deconvoluted la piscina para que
pudiéramos
métodos de la naturaleza | VOL.7 NO.11 | DE NOVIEMBRE DE 2010 | 901
 comunicaciones breves

montaje isotérmica de un solo paso con T5 exonucleasa, la figura 1 | montaje demostrando esquemática del genoma mitocondrial ratón sintético. Los oligos
norte Phusion polimerasa y ligasa Taq
de 60 bases (líneas rojas) se ensamblaron en grupos de ocho en setenta y cinco casetes de 284
Vector y
norte
oligos pb (flechas rojas). Estos se unieron en grupos de cinco para producir quince conjuntos de 1,2 kb
Oligos N norte norte
norte (flechas azules) y luego de nuevo en grupos de cinco para producir tres conjuntos de 5,6 kb
vector de ADN de doble cadena (flechas verdes). Estos tres fragmentos se recombinan en una completa

genoma 16,5 kb (flecha naranja), que incluye una repetición de 221 pb. sitios de restricción NotI
(N, líneas negras) fueron diseñados para liberar los casetes de 284-pb del vector pUC19 (líneas
grises).

productos de nuevo y se agruparon los tres productos de PCR antes ción Digestión con

Ensamble, el AscI y luego dejar que se unen para formar el genoma mitocondrial completo de ratón sin-
clon y la
tético ( Complementario Fig. 3d, e).
secuencia
284 pb (75) 15 Para producir un clon puro que contiene el genoma, se llevó a cabo la reacción de
reacciones
(600) 75 reacciones
ensamblaje en presencia de un cromosoma artificial bacteriano (BAC) y la transformó
mediante PCR
Ensamble y amplificar 1,2 kb (15) 3 en E. coli. Se obtuvieron aproximadamente 20.000 colonias y se tamiza diez. Cuatro
mediante PCR reacción 60 de base
Ensamble y amplificar
reacciones
de ellos tenían el patrón de restricción esperado, y los secuenciaron en ambas
direcciones con los oligonucleótidos 60-mer utilizados para construir el genoma sin-
5.6 kb (3) 1 de
Montar tético. Uno de ellos contenían la secuencia prevista ( Suplementaria Cuadro 13). El
secuencia vector estaba flanqueado por un sin- tético, repita los 221 pb ( Fig complementario. 2 y
de clon 16,5 kb
Suplementaria Cuadro 10). Por lo tanto, cuando nos liberamos la pieza de inserción
del genoma del vector mediante digestión PmlI, que circularizado él para formar la
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secuencia del genoma mitocondrial natural sin el BAC intervenir ( Fig

complementario. 4).

identificar conjuntos de secuencia perfecta ( Fig. 2a). Para comparación, también
transformados individualmente los 75 conjuntos y secuenciado ocho clones por conjunto ( Fig. amplificación. De conjuntos iniciales confirmado de secuencia en el genoma sintético de
2b). Aunque este último enfoque era más mano de obra, que nos permitió examinar las
curvas de colectores para las dos metodologías, y valida la utilidad del enfoque
combinado. La secuenciación del ADN de la biblioteca de 75 miembros dio como resultado
la recuperación de un producto secuencia verificada para 64 de 75 en el enfoque
combinado ( La Fig. 2a) o 72 de 75 en el enfoque individual ( Fig. 2b y Suplementaria
Cuadro 12) de los subconjuntos de primera etapa. Con pobre lecturas de secuenciación
excluida, la eficiencia global de obtención de un clon correcto de cada reacción de
ensamblaje transformado individualmente era 46,8%, con un rango de 0-86% ( Suplementaria
Cuadro 12). las tasas de error de síntesis generales para cada enfoque que se muestran
en Figura 2 eran idénticos a 0,00308 (1 error por 325 bp). las tasas de error de síntesis
para cada uno de los 75 conjuntos eran 0-0.00880 errores por par de base ( Suplementaria
Cuadro 12).
El uso de PCR para generar los diversos intermedios de montaje era excepcionalmente
rápido y mano de obra reducida. Sin embargo, la PCR puede introducir errores. En la
producción del genoma libre de error descrito anteriormente, había 45 ciclos de
longitud completa, el error de velocidad de síntesis fue 3,78 × 10 -4 errores por par de base (1
error por 2643 pb; rango, 0,0 a 6,14 × 10 -4 errores por par de bases). Estas tasas de error de
explicar por qué sólo uno de los cuatro clones era libre de errores, y los otros tenían seis o
más errores. Resecuenciación después de la síntesis de los fragmentos de 6 kb puede ser
una ruta más apropiada en el futuro. Alternativamente, para evitar errores introducidos por la
PCR, los productos intermedios de montaje se pueden clonar en E. coli.
fragmentos de ADN se sintetizan a partir de oligos imperfectos. Nos basamos en un tiempo
de consumo E. coli clonación de paso para filtrar los errores.
una
Añadir 8 oligos de 75 pozos
15

Piscina
14
Añadir la mezcla de montaje
Número de clones correctos

secuenciación y recuperación de clones libres de errores Después automatizado, se 13

Incubar a 50 ° C durante 1 h
agruparon los conjuntos de 284 pb (340 pb menos dos vector 20-bp se superpone y menos 12

dos sitios NotI 8-PA) en grupos de cinco, noti- ellos digeridos y luego se unieron a ellos Reunir las 75 reacciones de ensamblaje
11

para formar de 1,2 kb intermedios de montaje ( Figura 1 y Fig complementario. 3a). En Una transformación en E. coli 10

lugar de la propagación de los conjuntos en un organismo huésped, que amplificó por PCR
0123456789
Secuencia de 600 clones
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
los productos de montaje ( Complementario Fig. 3b) y se agruparon estos 15 productos de (8 × redundancia)
Segmento
la PCR en grupos de cinco, ellos se digirió con SbfI y luego se unió a ellos para formar
si
8
Añadir 8 oligos de 75 pozos
montaje 5.6-kb interme- ates ( Fig complementario. 3c). Nos amplificado por PCR del 7
Individual

conjunto Añadir la mezcla de montaje 6

Número de clones correctos

5
Incubar a 50 ° C durante 1 h
4

transformar de forma individual E. coli 3

2
la figura 2 | Resumen de los resultados para la obtención de los 75 conjuntos de firststage secuencia
Secuencia de 8 clones de cada
1
verificada. ( a, b) Las 75 reacciones de ocho oligos cada uno se agruparon y se transforman en E. coli ( una) o de las 75 transformaciones
0
transformado de forma individual ( si). Se muestra el número de clones correctos obtenidos para cada 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
Segmento
segmento (1-75).

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Sin embargo, debería ser posible amplificar moléculas individuales, reunidos in vitro que
puede ser secuencia verificada y se utiliza en reacciones de montaje subsiguiente. Los
oligos se sintetizaron a la escala más pequeña posible, sin embargo, sólo se
necesitaban 0,0025% del volumen total de cada suspensión oligo en las reacciones de
ensamblaje. Nuestro método ahora no aborda este uso oligo ineficiente, que
estimamos es 70% de los costes totales de síntesis de ADN. Se discuten las
limitaciones y posibles mejoras del método, incluyendo el uso de sitios de PCR y
restricción en Complementario de las figuras 5
y 6, y Nota complementaria 1.
El genoma mitocondrial ratón ha sido previamente reconstruirse a partir de productos
de PCR, no sintéticos superpuestos 10. Ahora hemos sintetizado el genoma completo
comenzando desde químicamente oligos camente sintetizados, lo que permite para el
diseño comenzando en el nivel de nucleótidos. Tal enfoque de la genómica sintética se
podría utilizar para restaurar la competencia respiratoria para células de mamífero con
deficiencias mitocondriales. Las mutaciones en el ADN mitocondrial se asocian con la
patogénesis de la enfermedad tiva neurodegenerativas, ceguera, sordera, varios tipos de
cáncer, tipo II diabetes y del proceso de envejecimiento 11. Aquí ofrecemos herramientas
poderosas para el diseño y la síntesis de los cromo- somas mitocondriales completos,
que pueden expresarse una vez instalado en la mitocondria. síntesis reiterativo y el
trasplante de muchos diferentes siones ver- de genomas mitocondriales deben ayudar a
acelerar el progreso en la determinación de los defectos genéticos asociados con
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enfermedades mitocondriales ( Nota Suplementaria 1).
La tecnología utilizada para sintetizar DNA está progresando rápidamente. La
automatización de la síntesis de ADN ya ha sido reportado 4,12
y se utiliza comúnmente en la producción comercial. En poco tiempo, la síntesis
de ADN será completamente automatizado que comienza en el nivel de
nucleótidos, y la secuencia digitalizada se convertirá a genes y genomas sin
intervención humana. La simplicidad y la robustez del método descrito aquí deben
ayudar a que esto sea posible. Las mejoras adicionales en oligo- costo de
nucleótidos, la calidad y la escala 13 haría acelera de manera espectacular
progreso eRate en biología sintética ( Nota Suplementaria 1).
Los biólogos sintéticos están sintetizando y expresando genética
comunicaciones breves
elementos para proporcionar un medio sostenible para la producción de productos capaces
deseable como nuevos y mejorados medicamentos, vacunas, biosensores, los biocombustibles,
herramientas de biorremediación, ingredientes alimenticios, cosméticos y compuestos industriales 14.
Aquí proporcionamos procedimientos ampliamente aplicables para la construcción de estos
elementos genéticos de oligonucleótidos de ADN sintéticos.
métodos
Los métodos y las referencias asociadas están disponibles en la versión en línea del
papel en http://www.nature.com/naturemethods/.
Nota: La información complementaria se encuentra disponible en el sitio web de Nature Methods.
expresiones de gratitud
Agradecemos a Synthetic Genomics, Inc. para financiar este trabajo, J. Glass, Y.-H. Rogers,
J. Gill, M. Frazier, E. Eisenstadt y M. Gibson útil para los debates, y
M. y J. Algire Zaveri para la asistencia técnica.
Contribuciones de autor
DGG y CM diseñados investigación, realizaron la investigación, analizaron los datos y escribió el documento.
HOS, CAH III y JCV diseñados investigación y analizaron los datos.
Conflicto de intereses financieros
Los autores declaran que compiten intereses financieros: detalles acompañan a la versión HTML de texto
completo de la ponencia en http://www.nature.com/naturemethods/.
Publicado en línea en http://www.nature.com/naturemethods/. reimpresiones y permisos información
está disponible en línea en http: //npg.nature. com / reprintsandpermissions /.
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métodos de la naturaleza | VOL.7 NO.11 | DE NOVIEMBRE DE 2010 | 903
 métodos en línea
el diseño de oligonucleótidos. Nos rompió el genoma chondrial mito- 16.299 pb, más
221 nucleótidos de la secuencia repetida (16520 pb) en 600 superpuestas oligos 60-base
( Suplementaria Cuadro 10). Hemos diseñado oligos de ADN de cadena simple para
solaparse por 20 bases y conjuntos dsDNA a superponerse por 40 pb. Hemos diseñado
conjuntos de primera etapa para incluir 20 pb de pUC19 secuencia de superposición y
sitios NotI para liberar los insertos. Hemos diseñado conjuntos de segunda etapa para
incluir 40 pb de la secuencia de ping pBR322 se traslapan y sitios AscI para liberar los
insertos. Hemos diseñado conjuntos de tercera etapa para incluir 40 pb de pSMART-VC
(Lucigen) la superposición de secuencia y SbfI sitios para liberar los insertos. Hemos
diseñado el ensamblaje de la etapa final del genoma completo para incluir 40 pb de
pCC1BAC (Epicenter) secuencia de superposición y PmlI sitios para liberar el inserto.
Hemos diseñado todos los solapamientos, incluyendo aquellos a las secuencias del
vector y sitios de restricción, en los 600 oligos ( Suplementaria Cuadro 10). Nuestra inten-
ción original para montar los intermedios respectivos en pBR322 o pSMART-VC y el clon
por E. coli transformación. En lugar de ello, hemos utilizado estas regiones 40-bp como
dominios de unión a cebador universales para la amplificación por PCR.
© 2010 Naturaleza America, Inc. Todos los derechos reservados.
Preparación del conjunto de vectores para la clonación del genoma mitocondrial
o subconjuntos. Se utilizó el plásmido pUC19 para clonar los 75 conjuntos de primera
etapa en E. coli. Se utilizó el vector pCC1BAC para clonar el genoma mitocondrial
ensamblado en E. coli.
Para preparar los vectores de montaje, que linealizado estos plásmidos por digestión de
restricción con BamHI luego los extrae de un gel de agarosa después de la electroforesis.
Nosotros entonces amplificado por PCR los vectores linealizados utilizando de alta
fidelidad de ADN Phusion con polímeros ase (New England Biolabs (NEB)) con cebadores
'puc19Univ- synthesisNONot1For' y 'puc19Univ-synthesisNONot1Rev' ( Suplementaria
Cuadro 14) para la clonación en pUC19 o 'Asamblea pCC1BAC Para' y 'Asamblea
pCC1BAC Rev' ( Suplementaria Cuadro 14) para la clonación en pCC1BAC. Hemos
creado 100- μ l reacciones usando 0,04 ng μ l -1 vector linealizado, 500 nM de cada cebador, 37 ° C.
200 μ M de cada dNTP, 1 × de alta fidelidad (HF) tampón (NEB) con 0,5 mM adi- cional
MgCl 2 y 20 U ml -1 enzima. Los parámetros de ciclación fueron 98 ° C durante 30 s, después La detección de cassettes de longitud completa ensambladas a partir de oligos. Para
30 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 60ºC durante 30 s, y 72 ° C durante 4 min (pUC19) o 7
min (pCC1BAC), seguido de un único 72 ° C de la incubación durante 5 min. Se extrajeron
los productos de PCR a partir de geles de agarosa después de la electroforesis utilizando
el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas.
Se cuantificaron los vectores amplificados por PCR y les diluye a 200 ng μ l -1 con Tris-EDTA plantilla, 500 nM de cada cebador, 200 μ M cada dNTP, 2 μ l 10 x tampón ThermoPol reacción
tampón pH 8,0 (tampón TE).
Preparación de los oligonucleótidos utilizados para sintetizar el genoma
mitocondrial. Hemos comprado los oligos de Integrated DNA Technologies sin modificar
con desalado estándar, en la escala de 10 nmol, y los suspendió a 50 μ M con tampón
TE. Se agruparon volúmenes iguales de cada oligonucleótido en grupos de ocho luego
diluido en tampón TE a una con- centración per-oligo de 180 nM. Para cassettes que se
ensamblaron de manera ineficiente (por ejemplo, los segmentos 24 y 46), se encontró
que los resultados podrían mejorarse por calentamiento de una 5 μ l de muestra de la
piscina oligo a 95 ° C durante 1 min enfriamiento luego lenta a 0,1 ° C s -1 a 4 ° C antes de
añadir 15 μ l de la mezcla de enzima-reactivo (véase a continuación). las concentraciones
óptimas para el montaje de más de ocho oligos a la vez se enumeran en
Tabla Suplementaria 1.
métodos de la naturaleza
montaje de ADN de un solo paso-isotérmica. Hemos reunido los nucleótidos oligo- en pUC19
amplificado por PCR mediante el uso de nuestro protocolo de ensamblaje isotérmica publicado
previamente 7. En resumen, hemos añadido 5 μ l de oligo ADN diluido (180 nM cada uno) a una
descongelaron 15 μ l de muestra de una mezcla de ensamblaje que ya contiene el vector pUC19
amplificado por PCR. A continuación, incuba la reacción a 50 ° C durante 1 h. Nos pre redujimos
la mezcla de vector-enzima-reactivo combinando 320 μ l 5 × isotérmica (ISO) tampón de reacción,
20 μ amplificado por PCR l pUC19 (200 ng
μ l -1), 0.64 μ l de 10 U μ l -1 exo T5 (Epicenter), 20 μ l de 2 U μ l -1
Phusion polimerasa, 160 μ l de 40 U μ l -1 Taq ligasa (NEB) y agua hasta un volumen final
de 1,2 ml. Nos tomaron alícuotas de 15 μ l de esta mezcla de reactivo de enzima y se
almacena las alícuotas a -20 ° C. Preparamos el tampón 5 × reacción ISO mediante la
combinación de 3 ml de 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 150 μ l de 2 M MgCl 2, 60 μ l de mM dGTP
100, 60 μ l de mM dATP 100, 60 μ l de mM dTTP 100, 60 μ l de mM dCTP 100, 300 μ l de
DTT 1 M, 1,5 g de PEG-8000 (United States Biochemical) y 300 μ l de 100 mM β- dinucleótido
adenina micotinamide (NAD). Esto producirá 6 ml, que pueden ser en alícuotas y se
almacenan a -20 ° C.
La clonación de los productos de ensamblaje ADN. Para clonar los productos
ensamblados, transformamos 1- μ L muestras de la Asamblea reacciones ciones en 30 μ l
Epi300 E. coli células (Epicentre) en un 1-mm cubeta (BioRad) a 1.200 V, 25 μ F y 200 Ω utilizando
un Sistema de Gene Pulser XCell electroporación (BioRad). Nos dejó que las células se
recuperen a 37 ° C durante 1,5 h en 1 ml de medio SOC. Hacemos enchapado 100 μ l de
las 75 transformaciones de subconjuntos individuales sobre medio LB con 100 μ g ml -1 carbenicilina.
Para la transformación de los conjuntos agrupados, se plateó 1 ml en una bandeja
Genetix Bioensayo que contiene medio LB con 100 μ g ml -1 carbenicilina. Nos plateó
transformaciones de montaje genoma completo en medio LB con
12.5 μ g ml -1 cloranfenicol. Después de incubación a 37 ° C durante 16 h,
crecimos colonias individuales en 1 ml de medio LB con 100 μ g ml -1 carbenicilina
(pUC19) o 12,5 μ g ml -1 cloranfenicol (pCC1BAC) y les incubó durante la noche a
cribar de longitud completa subconjuntos de primera etapa que no se encuentran inicialmente
por secuenciación de ADN, se realizó la PCR de colonias. Se diluyó una sola colonia en 100 μ l
de agua y después se utiliza esta mezcla como tem- placa en una PCR con los cebadores
M13F y M13R ( Suplementaria Cuadro 14). Establecimos 20 μ l reacciones usando 1 μ l
(NEB) y 0,2 μ l Taq polimerasa (NEB). metros de ciclo para- fueron 95 ° C durante 5 min, luego
30 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 50ºC durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s, seguido de un único
72 ° ción incubación C para 5 min. Se analizaron los productos en 2% E-geles (Invitrogen)
junto a la escalera de ADN de 100 pb (NEB).
Preparación y montaje de casetes 284-bp. Para el montaje del genoma después de 45 ciclos
de PCR, también se usaron las mismas muestras de ADN utilizados para la secuenciación de
ADN para el montaje de ADN. Se agruparon los 20 μ l de cada uno en grupos de cinco y se
digirió con NotI en un 200 μ l de reacción, a 37 ° C, durante 3 h. Se purificaron las reacciones de
15 utilizando el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen) de acuerdo con las ins- trucciones
proporcionadas, excepto que eluyeron productos con 100 μ l tampón TE. Hemos reunido 5 μ l de
este ADN con 15 μ l de la enzima de reactivo
mezclar, como el anterior pero sin el vector pUC19. Para genoma Asam- Bly después de 80
ciclos de PCR, se amplificó por PCR los 75 cassettes utilizando ADN-polimerasa de alta
fidelidad Phusion con pUC19 cebadores'
doi: 10.1038 / nmeth.1515
 Para CPCR' y 'pUC19 CPCR Rev'( Suplementaria Cuadro 14).
Hemos creado 100 μ l reacciones usando 2 μ l plantilla, 500 nM de cada cebador, 200 μ M cada
dNTP, tampón HF 1 × y 20 U ml -1 enzima. Los parámetros de ciclación fueron 98 ° C durante 30
s, luego 30 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s, seguido de
una sola incubación de 72 ° C durante 5 min. Se purificaron los productos de PCR usando la
purificación de PCR QIAquick iluminado como anteriormente. Se cuantificaron cada uno de los
75 fragmentos por espectrofotometría en un ND-1000 NanoDrop (Thermo Scientific) y se
determinó que eran aproximadamente 40 ng
μ l -1. Como anteriormente, se agruparon 20 μ l de cada fragmento, ellos digerido con NotI,
ellos se purificó en columna y luego montado el ADN.
Preparación y montaje de intermedios de 1,2 kb. Nos amplifica productos de montaje de la
segunda etapa Fied con Phusion polimerasa con 'pBR322 CPCR 20 pb-Clone FOR'
cebadores y 'pBR322 CPCR 20 pb-Clone REV' ( Suplementaria Cuadro 14). Hemos creado
100 μ l reacciones usando 2 μ l plantilla, 500 nM de cada cebador, 200 μ M cada dNTP,
tampón HF 1 × y 20 U ml -1 enzima. metros de ciclo para- fueron 98 ° C durante 30 s, a
continuación 25 ciclos (o 30 ciclos para genomas construidos siguientes 80 ciclos de PCR)
de 98 ° C durante 5 s, 60ºC durante 30 s, y 72 ° C durante 20 s, seguido de una sola
incubación de 72 ° C durante 5 min. Se purificaron los productos de PCR utilizando el kit
ficación puri- QIAquick PCR como anteriormente. Se cuantificaron cada uno de los 15
productos de la PCR por NanoDrop espectrofotometría y se determinó que eran
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aproximadamente 10 ng μ l -1 ( 25 ciclos) o 60 ng μ l -1 ( 30 ciclos). Se agruparon los 20 μ l de cada
uno en grupos de cinco y se digirió con AscI en un 200 μ l de reacción, a 37 ° C, durante 3 h.
Se purificaron las tres reacciones utilizando el kit de purificación QIAquick PCR como
anteriormente. Hemos reunido 5 μ l de este ADN con 15 μ l de la mezcla de enzima-reactivo,
como antes.
Preparación y montaje de los intermedios 5.6-kb. Nos amplifica productos de montaje
tercera etapa Fied con Phusion polimerasa con cebadores 'pSMART-VNTI-CPCR-For' y
'pSMART-VNTI- CPCR-Rev' ( Suplementaria Cuadro 14). Nos configuración 100 μ l
reacciones usando 1 μ l plantilla, 500 nM de cada cebador, 200 μ M cada dNTP, tampón HF 1
× y 20 U ml -1 enzima. Los parámetros de ciclación fueron 98 ° C durante 30 s, luego 20 ciclos
de 98 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 1,5 min, seguido de una sola
incubación de 72 ° C durante 5 min. Se agruparon volúmenes iguales de productos de PCR y
luego purificado utilizando el kit de purificación QIAquick PCR como anteriormente.
Digerimos los productos de PCR con SbfI en una sola 200 μ l de reacción, a 37 ° C, durante 3
h. Se purificó la reacción utilizando el kit de purificación QIAquick PCR como anteriormente.
Hemos reunido 50 ng de cada fragmento 5,6 kb y 60 ng del vector pCC1BAC amplificado por
PCR mediante la adición de 15 μ l de la mezcla de enzima-reactivo, como antes.
Notas adicionales sobre el ciclo entre el conjunto de ADN y PCR.
Los resultados podrían ser mejorados por los productos de PCR digerido por restricción de
purificación de gel antes del montaje de ADN. Sin embargo, esto no fue nece- Essary. En su lugar,
se purificó en columna las reacciones. Sin embargo, se encontró que los ITP no necesitan ser
limpiados antes de configurar
doi: 10.1038 / nmeth.1515
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una reacción de ensamblaje. También se encontró que los productos de PCR no necesariamente
tienen que ser digeridos. Esto debería hacer que los futuros esfuerzos de síntesis de ADN más
susceptibles de automatización.
La detección de genomas mitocondriales completos y subconjuntos. Aproximadamente
20.000 colonias fueron producidos por 1- μ reacción de ensamblaje l que
transformados. Aislamos BAC que contiene potencialmente genomas
mitocondriales completos de
E. coli mediante lisis alcalina utilizando el P1, P2 y P3 tampones suministrados por Qiagen
seguido de precipitación isopropanol. Disolvimos sedimentos de ADN en tampón TE que
contenía RNasa. Se analizaron los patrones de restricción después de la digestión con
EcoRI o PmlI. Visualizamos patrones en 0,8% E-geles junto a la escalera de ADN de 1 kb
(NEB).
La purificación de los genomas mitocondriales de E. coli. Los genomas
mitocondriales téticas sin- estaban contenidas en pCC1BAC y se propagan en el
Epi300 E. coli presion. Este sistema de clonación LOS SUPUSTOS inducción a diez
copias o más de estos BAC por célula. Inoculamos las cepas que contienen los
genomas clonados en 150 ml LB más 12,5 μ g ml -1 cloranfenicol y solución 1 ×
inducción (Epicenter) y ellos se incubaron a 37 ° C durante 16 h. Se recogieron los
cultivos y se purificaron los BAC utilizando un kit HiSpeed ​Plasmid Maxi (Qiagen).
Nos eluyó el ADN con 500 μ l de tampón TE y se recuperó ~ 100 μ sol.
Automatización. Hemos presentado una bandeja Genetix ensayo biológico, que contiene ~ 1000
E. coli clones de colonia recogiendo (QPix, Genetix), plas- preparación de ADN mediados (de
purificación de ADN Robotic Workstation, Thermo CRS), la configuración de la reacción de
secuenciación (Biomek FX, Beckman Coulter) y la secuenciación (3730xl analizador de ADN,
Applied Biosystems). Automatizamos cada uno de estos pasos.
análisis de secuenciación de ADN. Hemos secuenciado casetes de primera etapa en una
sola dirección con el cebador M13R. Hemos llevado a cabo reacciones de secuenciación
ard Standards que el anterior. Estamos alineados archivos con las secuencias de referencia
traza ( Suplementaria Cuadro 10) con ClustalW alineación múltiple 15, contenida dentro del
software Bioedit Sequence Alignment Editor. Los datos de secuencia contenía coordenadas
384 pocillos de la placa de plantilla de ADN y E. coli stocks de glicerol de los clones. Hemos
secuenciado los genomas mitocondriales completos sintéticos ( 13 cuadros suplementarios y
15) con 48 de los oligos 60-base utilizados para construir la molécula de ADN ( Suplementaria
Cuadro 10), y 'Seq pCC1BAC Culo Vector Para' y 'Seq pCC1BAC Culo Vector Rev' ( Suplementaria
Cuadro 14). Veinticinco oligos hibridaron a la cadena superior y 25 de ellos hibridaron a la
cadena inferior. Se analizaron secuencia como anteriormente. Determinamos las tasas de
error de síntesis dividiendo el número de errores en los clones inserto completo por el
número total de bases sintetizados.
15. Thompson, JD, Higgins, DG & Gibson, TJ Nucleic Acids Res. 22,
4673-4680 (1994).
métodos de la naturaleza