G.

SALMONELLA

El género Salmonella pertenece a la familia de las enterobacterias y constituye un grupo muy

complejo de microorganismos patógenos para el hombre, pudiendo afectar a diversos animales.
Comprende dos especies: - Salmonella enterica dividida en seis subespecies - Salmonella bongori
Todas ellas se pueden identificar por características fenotípicas fáciles de ver.

Métodos normalizados ISO 6579 Directiva general concerniente a los métodos de investigación de
Salmonella. Este método se basa en las investigación de Salmonella en cuatro etapas sucesivas: .
Preenriquecimiento en medio no selectivo: Siembra de la muestra en agau de peptona tamponada
e incubación a 37º C (35º C) durante 16 – 20 horas . Enriquecimiento en medios selectivos
líquidos: Con el cultivo del preenriquecimiento siembre en verde malaquita con cloruro de
m,agnesio e incubación a 42º C 24 horas, y en caldo selenito cistina e incubación a 37º C 24 horas
y 24 horas suplementarias. . Aislamiento e identificación: A partir de los cultivos anteriores se
siembran dos medios sólidos, agar rojo fenol verde brillante y otro medio selectivo a elección.
Ambos se incuban a 37º C 24 horas y si es necesario 48 horas. . Confirmación: Resiembra de las
presuntas colonias de Salmonella y confirmación en los medios de ensayos bioquímicos y
serológicos apropiados.

V 08-052 Método de rutina para la investigación de Salmonella Este método se basa en las
investigación de Salmonella en cuatro etapas sucesivas: . Preenriquecimiento en medio no
selectivo: Siembra de la muestra en agua de peptona tamponada e incubación a 37º C durante 16
– 20 horas . Enriquecimiento en medios selectivos líquidos: Con el cultivo del preenriquecimiento
siembra en caldo verde malaquita con cloruro de magnesio e incubación a 42º C 24 horas, y en
caldo selenito cistina e incubación a 37º C 18 – 24 horas. . Aislamiento e identificación: A partir de
los cultivos anteriores se siembra en un medio sólido selectivo a elección. Se incuba a 37º C 24
horas y si es necesario 48 horas y se examinan las características de las colonias. . Confirmación:
Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirmación en los medios de ensayos
bioquímicos y serológicos apropiados.

F. STAPHYLOCOCCUS AUREUS Staphylococcus aureus es un microorganismo de distribución en el

medio ambiente muy amplia, se encuentra de forma natural en el hombre, los animales de granja,
el polvo y diversos alimentos y otros productos en los que la contaminación se debe
principalmente a los manipuladores. El principal problema a nivel de la microbiología de los
alimentos es que S. aureus puede producir una enterotoxina termoestable, y otras toxinas. Estas
toxinas actúan sobre receptores intestinales cuyo estímulos alcanzan el centro del vómito del
cerebro, por lo que deberían considerarse como neurotoxinas. El mayor inconveniente de estas
toxinas es su elevada resistencia a los tratamientos térmicos habituales, soportando tratamientos
de pateurización a 72º C / 13 segundos, e incluso 100º C / 30 minutos. Se inactivan a temperaturas
de esterilización de 115º C, resisten la irradiación y las enzimas proteolíticas. Para la producción de
toxinas en un alimento tienen que concurrir los siguientes requisitos: - contaminación del alimento
por Staphylococccus aureus: en origen, por los manipuladores o por falta de higiene en locales o
utensilios - la multiplicación de una cepa enterotoxigénica del microorganismo en el alimento
alcanzando al menos 106 células por gramo. Staphylococcus auerus se multiplica en alimentos
proteicos, soporta concentraciones normales de azúcar e incluso elevadas de sal y el tratamiento
con nitritos.

Métodos normalizados ISO 6888 Directiva general para el recuento de Staphylococcus aureus.
Método mediante enumeración de colonias Este método se basa en la siembra en superficie en un
medio de cultivo sólido, preparando dos series de placas, con una cantidad determinada de la
muestra problema si es lí- quida o una cantidad determinada de la suspensión madre para otros
productos. En las mismas condiciones, siembra de diluciones decimales obtenidas de la muestra o
de la suspensión madre. Incubación de las placas a 35º C durante 24 – 48 horas. Cálculo del
número de Staphylococcus aureus por mililitro o por gramo de muestra a partir del número de
colonias características obtenidas en las placas escogidas a los niveles de dilución que dan un
resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagulasa.

NF V 08-057-1 Método de rutina para la enumeración de estafilococos cuagulasa positivos

mediante recuento de colonias a 37ºC. Técnica de confirmación de las colonias. Este método se
basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo sólido selectivo, repartido en placas de
Petri, con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una cantidad
determinada de la suspensión madre para otros productos. Incubación de las placas a 37º C
durante 24 – 48 horas. Cálculo del número de estefilococoscogulasa positivos por mililitro o por
gramo de muestra a partir del número de colonias características y/o no características obtenidas
en las placas escogidas a los órdenes de dilución que dan un resultado significativo, y confirmadas
mediante la prueba de la coagulasa.

E. ESCHERICHIA COLI Escherichia coli es un coliforme fecal. Los coliformes fecales son un grupo de
microorganismos seleccionados por incubación de los inóculos procedentes de un caldo de
enriquecimiento de coliformes a temperaturas superiores a las normales (44 +/-0,5º C) y son muy
indicativos de una posible contaminación de origen fecal del alimento. Se definen por la
producción de ácido y de gas en caldo EC a 44 – 46º C (44,5 – 45,5º C). Las cepas
enterohemorrágicas de E. coli no crecen a 44,5º C en la formulación convencional de EC, pero lo
hacen cuando el porcentaje de sales biliares se reduce del 0,15 al 0,112%. Sólo unas pocas cepas
son patógenos verdaderos, enteropatógenos; o patógenos oportunistas. Es muy resistente en
suelo y agua. Muere a 60º C en 15 minutos, y con 0,5 p.p.m. de cloro. Vive en el tracto intestinal
del hombre y animales, por eso su presencia en un alimento indica contaminación directa o
indirecta de origen fecal. Es indicador de posibles patógenos entéricos en el agua, moluscos,
productos lácteos,.....

Métodos normalizados ISO 7251 Directiva general para el recuento de Escherichia coli presuntivos.
Técnica del NMP Esta directiva se basa en la siembra de tres tubos de enriquecimiento selectivo de
doble concentración con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una
cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. A continuación se siembran
tres tubos de enriquecimiento selectivo de concentración simple con una cantidad determinada
de la muestra problema si es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre para
otros productos. Después y en las mismas condiciones se siembran tres tubos de enriquecimiento
selectivo de concentración simple con la primera dilución decimal obtenida de la muestra
problema o de la suspensión madre. Los tubos se incuban a 35 – 37º C según acuerdo durante 24 –
48 horas, y se realiza el examen en busca de tubos con gas. A partir de cada tubo que muestra
desprendimiento de gas se inocula un tubo con medio selectivo líquido EC. La reacción es positiva
cuando se produce desprendimiento de gas recogido en la campana de Durham, como
consecuencia de la fermentación de la lactosa en presencia de sales biliares a 45º C. Se hacen las
lecturas a las 24 y 48 horas. A partir del número de tubos positivos en medio selectivo EC se
siembra una nueva serie de tubos con agua de triptona. Incubación a 45º C, 24 – 48 horas y se
examina la producción de indol. A partir de los tubos positivos a la producción de gas en medio
selectivo y a la producción de indol en agua de triptona, se calcula el número más probable de E.
coli por mililitro o gramo de muestra de ensayo.

NF V 08-053 Método de rutina para el recuento de Escherichia coli β-glucuronidasa positivos Este
método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar PTX o PTG, en una placa de Petri
con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una cantidad determinada
de la suspensión madre para otros productos. En las mismas condiciones, siembra de diluciones
decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 44º C
durante 18 – 24 horas. Cálculo del número de Escherichia coli por mililitro o por gramo de muestra
a partir del número de colonias características obtenidas en las placas de Petri.

COLIFORMES TOTALES En conjunto los coliformes están representados por cuatro géneros de la
familia Enterobacteriaceae: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, y Klebsiella. Todos ellos son
fermentadores de la lactosa en 48 horas. Se encuentran en el intestino del hombre y de los
animales, y también en el suelo, las plantas, etc. No son muy buenos como indicadores, pero se
utilizan como indicadores de contaminación fecal y son buenos indicadores de un proceso o de un
estado sanitario poco satisfactorio. En un recuento de coliformes es conveniente determinar la
incidencia de E. coli dado que es la especie más indicativa de una contaminación fecal. Hay que
destacar que el recuento de coliformes tiene sus limitaciones como indicador en ciertos alimentos:
- Productos lácteos: reflejan el estado higiénico del establo y de la planta industrial, no es
indicador de contaminación fecal - Hortalizas congeladas blanqueadas: la presencia de E. coli
puede ser indicativo de que en el proceso existe algún problema. Los coliformes están
habitualmente asociados con la vegetación - Derivados de aves de corral: los coliformes no son
indicadores higiénicos apropiados, las aves pueden tener salmonella antes del sacrificio A pesar de
todo lo anterior, los coliformes tienen un valor acreditado como indicadorres de inocuidad. Su
principal aplicación como integrantes de un programa para la determinación de la inocuidad de los
alimentos la tienen dentro del sistema APPCC. Pueden crecer en presencia de sales biliares, que
inhiben el crecimiento de las bacterias Gram negativas. Son capaces de fermentar la lactosa con
producción de gas, siendo esta característica suficiente para hacer determinaciones presuntivas.
Su facilidad de cultivo y de diferenciación los hace casi ideales como indicadores.

Métodos normalizados I SO 4831 Directiva general para el recuento de coliformes Esta directiva
se basa en la siembra de tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de doble concentración
con una cantidad determinada de la muestra si es líquida, o una cantidad determinada de la
suspensión madre en el caso de otros productos. A continuación, se siembran tres tubos de medio
de enriquecimiento selectivo de concentración simple con una cantidad determinada de la
muestra si es líquida, o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de otros
productos. Después y en las mismas condiciones, se siembran tres tubos con medio de
enriquecimiento selectivo de concentración simple con una cantidad determinada de la primera
dilución decimal obtenida a partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Los tubos se
incuban a 30, 35 ó 37º C durante 24 horas para los de doble concentración, y 24 – 48 horas los de
concentración simple. A partir de cada tubo incubado que presenta desprendimiento de gas en la
campana se inocula con asa un tubo con medio de confirmación (BGBL). La reacción es positiva
cuando se produce desprendimiento de gas recogido en la campana de Duirham, MÉTODOS DE
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE... ANALIZA CALIDAD – Departamento de
Formación 23 como consecuencia de la fermentación de la lactosa en presencia de sales biliares.
Se realizan las lecturas a las 24 – 48 horas. A partir del número de tubos positivos confirmados se
calcula el número más probable de coliformes por mililitro o por gramo de muestra de ensayo.

NF V 08-050 Método de rutina para la enumeración de coliformes mediante el recuento de

colonias a 30º C. Se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta
lactosa, en una placa de Petri, con una cantidad determinada de la muestra si es líquida, o una
cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de otros productos. Se recubre la placa
con una segunda capa del mismo medio. En las mismas condiciones, siembra de diluciones
decimales obtenidas a partir de la muestra o de la suspensión madre. Incubación de las placas a
30º C 24 horas. Cálculo del número de coliformes por mililitro o por gramo de muestra, a partir del
número de colonias características obtenidas en las placas de Petri.

MOHOS Y LEVADURAS Los hongos son organismos eucarióticos, cuya pared celular contiene
quitina y β- glucanos. Son unicelulares o filamentosos, de reproducción sexual o asexual,
saprófitos mutualistas o parásitos. En función de la temperatura de crecimiento se dividen en: -
termófilos: 20 – 50º C (40 – 50º C) - termolatentes: máximo 50º C, mínimo por debajo de 20º C -
mesófilos: 10 – 40º C (20 – 35º C) - psicrófilos: por debajo de 10º C (por debajo de 20º C) Los
hongos engloban los mohos y las levaduras. Los mohos son multicelulares filamentosos cuyo
crecimiento en un alimento se reconoce por su aspecto aterciopelado. Las levaduras crecen en
agregados de células independientes, cuando crecen en los alimentos forman colonias
características. - Mohos habitualmente transmitidos por los alimentos: División: Zygomyceta Clase:
Zygomycetes Orden: Mucorales Familia: Mucoraceae Género: Mucor, Rhizopus, Thamnidium
División: Ascomyceta Clase: Pleitomycetes Orden: Eurotiales Familia: Trichocomaceae Género:
Byssochlamys, Eupnicillium, Emericella, Eurotium División: Deuteromyceta Clase: Coelomycetes
Familia: Coelomycetaceae Género: Colletotrichum Clase:Hypomycetes Orden: Hypomycetales
Familia: Moniliaceae Género: Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Fusarium,
Penicillium,..... - Levaduras habitualmente transmitidos por los alimentos: División: Ascomycotina
Familia: Saccharomycetaceae SubFamilia: Nadsonioideae Género: Hanseniaspora SubFamilia:
Saccharomycotoideae Género: Debaryomyces, Issatchenkia, Kluyveromyces, Saccharomyces,
................ MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE... ANALIZA CALIDAD –
Departamento de Formación 16 SubFamilia: Schizosaccharomycotoideae Género:
Schizosaccharomyces División: Deuteromycotina Familia: Crypteococcaceae Género:
Brettanomyces, Candida, Crytococcus............... El significado de la contaminación fúngica de los
alimentos viene determinado por su capacidad para deteriorar los alimentos, produciendo
defectos en el aspecto modificaciones químicas, alterando el valor nutricional, variando sus
características organolépticas y dificultando su conservación. Algunos mohos pueden producir
infecciones en el hombre e incluso reacciones alérgicas. Además, muchos mohos producen gran
número de toxinas a las que el hombre es susceptible. Las micotoxinas son un grupo de
metabolitos tóxicos, producidos por ciertas cepas de mohos cuando crecen en unas condiciones
determinadas, en una amplia variedad de alimentos. El estudio de los mohos productores de
micotoxinas ha sido bastante completo debido a: - la ubicuidad de sus esporas - que pueden estar
presentes en alimentos organolepticamente aceptables - que los alimentos constituyen un
sustrato orgánico adecuado para su crecimiento. Estos mohos producen micotoxinas que al ser
ingeridas por los animales originan metabolitos tóxicos secundarios, que pasan a la leche, carne o
huevos y son absorbidos indirectamente por el hombre - al riesgo cancerígeno, sobre todo de las
aflatoxinas Toxicológicamente nos interesan más las micotoxinas y los factores que puedan afectar
la capacidad de su producción, que los mohos productores. En la mayoría de los casos las
intoxicaciones son producto de la acción combinada de varias micotoxinas. Rara vez un alimento
es contaminado por una sola especie y cada especie suele producir varias micotoxinas. Los
alimentos que más fácilmente son contaminados por micotoxinas y las micotoxinas más
frecuentes son: 1.- Semillas oleaginosas y alimentos derivados 2.- Aceites vegetales no refinados
3.- Cereales y alimentos derivados 4.- Frutos secos 5.- Zumos de frutas 6.- Legumbres 7.- Bebidas
alcohólicas 8.- Leche y productos lácteos 9.- Carne y productos cárnicos Para la prevención y
control sanitario de las intoxicaciones por micotoxians es necesario: - conocer los factores que
afectan al crecimientos de los mohos y a la producción de las micotoxinas - conocer el periodo
entre la germinación y la producción de micotoxinas, para estimar el potencial tóxico del alimento
- evitar la contaminación - evitar, durante la manipulación, las posibles lesiones de los granos y las
frutas MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE... ANALIZA CALIDAD –
Departamento de Formación 17 - mantener unas condiciones de almacenamiento que eviten en lo
posible el crecimiento de los mohos El recuento de mohos y levaduras es un índice de las
condiciones higiénicas de una materia prima y de las condiciones de manipulación. Su significado
es similar al de los aerobios mesófilos.

Métodos normalizados ISO 7954 Directiva general para el recuento de levaduras y mohos. Técnica
de enumeración de las colonias a 25º C Este método se basa en la siembra en profundidad en un
medio de cultivo selectivo determinado, en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de
muestra si el producto a examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión
madre en el caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones
decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. Incubación de las placas en
aerobiosis a 25º C, durante 3, 4 ó 5 días. Cálculo del número de levaduras y mohos por mililitro o
por gramo de muestra a partir del número de colonias obtenidas en las placas escogidas a los
niveles de dilución que dan un resultado significativo.

NF V 08-059 Método de rutina para el recuento de levaduras y mohos. Técnica de enumeración de

las colonias a 25º C Este método se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo
definido, repartido en placas de Petri, con una cantidad definida de muestra por ensayo si el
producto a examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso
de otros productos. El recuento puede ser igualmente realizado en profundidad. Incubación de las
placas en aerobiosis a 25º C, durante 3, 4 ó 5 días. En el caso de recuento de especies de mohos
supuestos conocidos la temperatura de incubación puede ser diferente de 25º C, buscando
después el acuerdo entre las dos partes (20º C ó 22º C) e indicándolo en el informe del ensayo. A
partir del número de colonias obtenidas en las placas de Petri retenidas, calcular el número de
levaduras y mohos por mililitro o por gramo de muestra

MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS El análisis de los alimentos y piensos para determinar

la existencia, tipo y número de microorganismos es básico para la microbiología de alimentos. Sin
embargo ninguno de los métodos utilizados habitualmente permite determinar el número exacto
de microorganismos que existe en un determinado alimento. Son cuatro los métodos básicos
utilizados para investigar el número “total” de microorganismos: 1.- Recuento en placa (SPC) para
la determinación del número de células viables 2.- Método del número más probable (NMP) de
gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables 3.- Técnicas de reducción de
colorantes para el cálculo del número de células viables con capacidad reductora 4.- Recuento
microscópico directo (DMC) tanto para células viables como para las no viables El recuento en
placa es el método más utilizado para la determinación del número de células viables o unidades
formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento. Los recuentos totales deben hacerse en función de
uno de los siguientes factores: - método de muestreo utilizado - distribución de los
microorganismos en la muestra - naturaleza de la microflora del alimento - naturaleza del
alimento - antecedentes del alimento - adecuación nutricional del medio de cultivo - temperatura
y medio de incubación - pH, aw, potencial de oxidación reducción del medio - tipo de diluyente
utilizado - número relativo de microorganismos en la muestra Los recuentos de microorganismos
viables se basan en el número de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas
con una cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales
determinadas. Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que solo son
susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones
establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la
atmósfera, la composición del medio y el tiempo de incubación. El intervalo de temperaturas en el
que crecen los microorganismos es muy amplio: de – 34º C a > 90º C. En función de esto se
encuadra a los microorganismos en tres grupos: a) los que crecen bien a 7º C o por debajo de esta
temperatura cuya temperatura: psicrótofos 3. PRINCIPALES MÉTODOS DE ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...
ANALIZA CALIDAD – Departamento de Formación 13 b) los que crecen entre 20 – 30º C, con una
temperatura óptima de crecimiento está entre 30 – 40º C: mesófilos c) los que crecen por encima
de los 45º C: termófilos Recuento de aerobios mesófilos En este grupo se incluyen todas las
bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En
este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la
calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la
materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de
patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora
patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables
recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar: - Excesiva contaminación de la materia
prima - Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración - La posibilidad de que existan
patógenos, pues estos son mesófilos - La inmediata alteración del producto El recuento de
mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos.

Métodos normalizados ISO 4833 Directiva general para el recuento de microorganismos. Método
por recuento de colonias a 30º C Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio
de cultivo definido, vertido en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el
producto a examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso
de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de
la muestra o de la suspensión madre. Incubación a 30º C, en aerobiosis durante 72 horas. A partir
del número de colonias obtenidas en las placas de Petri, calcular el número de microorganismos
por mililitro o por gramo de muestra.

AF V 08-01 Método de rutina para el recuento de microorganismos. Método de recuento de las

colonias a 30º C Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo
definido, vertido en una placa de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a
examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de otros
productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la
muestra o de la suspensión madre. El recuento podrá ser realizado utilizando un sembrador
espiral (NF V08-100) Incubación a 30º C, en aerobiosis durante 72 horas. A partir del número de
colonias obtenidas en las placas de Petri escogidas, calcular el número de microorganismos por
mililitro o por gramo de muestra.