UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROMAN

Facultad: FCAG Escuela: ESIA

Titulo: Determinación de proteínas – Método de
biuret
Número de Practica: Nº2
Nombre: Juan Paul Estrella Useca
Profesor(a): Miguel Angel Larrea Cespedes

TACNA – PERU

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 DETERMINACION DE PROTEINAS –METODO DE BIURET

INTRODUCCIÓN

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la

condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoniaco.

Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una

solución de proteína se forma un complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos,
con aparición de una coloración violeta – púrpura, que presenta un máximo de absorción
a 540 nm.

OBJETIVOS

 Aprender el manejo del espectrofotómetro y su aplicación en el análisis de

alimentos.

 Evaluar el empleo de una curva patrón para la determinación de la cantidad de

proteínas en una muestra.

FUNDAMENTO TEORICO

La precipitación salina de las proteínas

Es una técnica en donde se logra la precipitación de una fracción de proteínas
mediante el aumento de la fuerza iónica del medio. Grandes cantidades de una sal
agregada a una solución de proteínas, disminuye la interacción proteínaH2O porque quita
la capa de solvatación, predominando la interacción proteína-proteína y generando la
precipitación de las mismas.

La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para todas

las proteínas, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de
proteínas particulares a partir de mezclas complejas. Comúnmente se usa sulfato de
amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad (760 g de sulfato de
amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20°C) y porque el ion sulfato divalente

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permite alcanzar altas fuerzas iónicas. La adición gradual de ésta sal permite el
fraccionamiento de una mezcla de proteínas, las cuales son precipitadas pero no
desnaturalizadas.

Método de análisis instrumental

En un medio alcalino, iones de cobre forman un color púrpura con las proteínas
complejas. La intensidad del color es proporcional a una cierta gama de concentraciones
de proteína. El contenido de proteína se establece por la intensidad de absorción de luz a
540-560 nm por fotometría. Para calcular la cantidad de proteína en la solución de ensayo,
es necesario el uso de la curva de calibración construida por soluciones de proteína
estándar.

El método se basa en la formación de enlaces peptídicos de colores proteína

complejos violetas con iones cúpricos (sulfato de cobre) en un medio alcalino. La
intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de la solución de
proteína en el suero se determina fotométricamente.

La prueba de Biuret funciona para cualquier compuesto que contenga dos o más de los
siguientes grupos:

Características más importantes de la reacción

La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y
proteínas; su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml. No depende de la composición
de aminoácidos.

Compuestos con enlaces peptídicos producen un cambio de color del azul al

púrpura cuando reaccionan con Cu (II) en medio alcalino. El compuesto más sencillo que
da la reacción es el Biuret, un dímero de la urea que da el nombre al ensayo, de estructura
CONH2-NH-CONH2. El ensayo es bastante específico para proteínas pero poco sensible,
requiriendo de 1 a 10 mg de proteína. Se ha empleado la reacción de Biuret que da una
coloración púrpura cuando los enlaces peptídicos reaccionan con los iones cúpricos a un
pH alcalino y se ha informado que no interfieren pequeñas cantidades de azúcares

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reductores (Mitsuda y Mitsunaga, 1974). El método ha
sido mejorado considerablemente mediante el uso de
propano-2-ol y la aplicación de calor (Noll y cols., 1974).

MATERIALES

 Harina
 Barras magnéticas
 Espectrofotómetro
 Agitadores
 Centrifuga
 Tubos de ensayo y pipetas

Reactivos

 NaCl 0.15ml
 Sulfato de cobre
 Reactivo de biuret
 Albumina de suero bovina

PROCEDIMIENTO
Preparación del reactivo de Biuret

Solución A
 Pesar 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4, 5H2O)
 6,0 g de tartrato de sodio y potasio.
 500 ml de agua destilada.
Solución B
 300 ml de NaOH al 10% (30 g NaOH/300 ml de agua destilada)
 Agregar 1,0 g KI

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 Mezcla
 Mezclar ambas soluciones
 Completar para un litro en balón volumétrico.
 Proteger de la luz. La absorbancia de la mezcla final a 540 nm debe
encontrarse entre 0,095 y 0,105.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

 Pesar 10g de harina

 Preparar suspensiones de 10% en solución de NaCl 0.15 M y agitar por media hora
 Centrifugar y medir el volumen del sobrenadante .Reservar una alícuota para
determinación de nitrógeno total.

 Determinar el contenido de proteínas por el método de Biuret

PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN PADRÓN DE ALBUMINA BOVINA

 Pesar 1000 mg de suero albumina bovina y 0.1 ml de NAOH 1 N

 Disolver con agua destilada y completar para 100 ml (sin mucha agitación)
 Esta concentración equivale a
0,1 g/10 ml o 1,0g/100 ml

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PROCEDIMIENTO DEL MÉTODO EN MUESTRA Y CURVA DE CALIBRACIÓN

A partir del extracto salino obtenido, se toman alícuotas de 0,1 ml (muestra 1) y 0,2
ml (muestra 2). Seguidamente completar a 1,0 ml con agua destilada; adicionar 4,0 ml del
reactivo de Biuret y realizar la lectura después de 30 minutos a 540 nm. Del mismo modo
se prepara una curva padrón a partir de suero albúmina bovina en la concentración de 0,1
g/10 ml

Curva padrón de albumina de suero bovina

N° de Padrón H20 ml Concent R.Biuret Absorbancia Fc = C/A

tubo SAB ml mg/ ml (ml) (540 nm )
2 0.2 0.8 2 4 0.0744 26.8817
4 0.4 0.6 4 4 0.1479 27.0453

6 0.6 0.4 6 4 0.2158 27.8035

8 0.8 0.4 8 4 0.2773 28.8496

10 1.0 0 10 4 0.3421 29.2312

Blanco ----- 1 ---- 4 --- ----

A = 0.02034

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 B = 0.32205
R = 0.9998
Y = A + BX

Y = absorbancia de muestra = 0.3054

Y = A+ BX 0.3054 = 0.02034 + 0.32205 (X)

X = 8.8514 mg

8.8514 mg --------0.5 ml

X --------- 9.5.ml x = 1610.95 mg

1.61095 g -------- 10 g

X --------- 100 g x = 16.10 % de albuminas y globulinas

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CONCLUSIONES
Se logra comprender la razón por el cual la absorbancia de una muestra de proteína
se lea a una longitud de 540 nm en el método de Biuret, se debe al color violeta
característico que se presenta a esa longitud la cual se da por la coordinación de un átomo
de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en la pérdida de protones
de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un
enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxígeno
y de nitrógeno del péptido.

De ésta manera se puede determinar la concentración de proteína en una o varias

muestras problema, que resultan al interpolar los valores de absorbancia en una curva
patrón originada a partir de concentración de proteína conocida (como el suero albumina
bovina).

BIBLIOGRAFÍA

 Torres C. T."Estudio Químico y Anatómico de dos Variedades de Frijol

(Phaseolus vulgaris L,). Cambios Postcosecha."(Tesis). UNIVERSIDAD
AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.