1.

INTRODUCCIÓN

1.1 Extracción del ADN

El presente informe contempla una serie de pasos que describiremos

detalladamente a continuación y la explicación conceptual de cada uno de los

avances que se realizaron en el proceso de extracción. Tras la substracción de

sangre a partir de un tejido humano, se obtuvo la extracción de ADN, esta

requiere un orden de etapas elementales de separación en donde se retira

material que se encuentra alrededor de ADN para lograr su liberación.

La sangre se compone por varios tipos celulares, los más importantes son los

glóbulos rojos y los glóbulos blancos. Los primeros carecen de núcleo pues lo

pierden durante su maduración, por lo tanto, no poseen ADN, los glóbulos

blancos, en cambio, poseen núcleo y por lo tanto ADN. Entonces para obtener

ADN de la muestra de sangre solo son necesarios los leucocitos. Si bien, en

principio se purifican primeros los glóbulos para luego extraer ADN a partir de

ellos, el posterior avance de las técnicas permite hoy en día extraer ADN a partir

de la sangre entera con la misma pureza, sumando rapidez y sencillez. La

extracción de ADN tiene gran importancia en los procesos para el diagnóstico de

enfermedades y los trastornos genéticos.

1.2 Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica empleada en la

biología molecular con el fin de obtener múltiples copias de una región

específica de ADN o molde in vitro (en un tubo de ensayo en lugar de un

organismo).Esta técnica se fundamenta en la propiedad que tiene las DNA

polimerasas para replicarlas hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de

altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién
formadas entre si tras cada fase de replicación y a continuación, dejar que las

polimerasas vuelvan a unirse a los segmentos de ADN para que vuelvan a

duplicarlas. En un principio la técnica era lenta ya que las polimerasas

constantemente se desnaturalizaban en cada cambio de temperatura (95°C) y

había que agregar nuevas polimerasas sin embargo se realizaron

más investigaciones en las que se obtuvieron ADN polimerasas termoestables

extraídas de organismos que toleran estas temperaturas. La ADN polimerasa

que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria

tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus).T. aquaticus vive en

aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es muy

termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los (temperatura a la

que el ADN polimerasa de ser humano o de E. coli no funcionaría). La Taq

polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad térmica. Como

veremos, la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el

molde de ADN o separar sus cadenas. Mediante el uso de la PCR, una secuencia

de ADN se puede amplificar millones o miles de millones de veces y producirá

suficientes copias de ADN para que se analicen mediante otras técnicas. Por

ejemplo, el ADN se puede visualizar por electroforesis en gel, enviar a

secuenciar o digerir con enzimas de restricción y clonar en un plásmido. La PCR

es una técnica cotidiana y normalmente indispensable en laboratorios de

investigación médica y biológica para una variedad de aplicaciones dentro de las

que encontramos la clonación de ADN para su secuenciación, la filogenia basada

en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnostico de trastornos hereditarios,

la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y pruebas de

paternidad), la detección y el diagnóstico de enfermedades infecciosas.

 1.3 Fundamentos de la electroforesis

La electroforesis es una técnica va a permitir la separación de moléculas

como proteínas y ácidos nucleicos a través una matriz (gel), la cual va a

funcionar como un filtro o matriz molecular permitiendo separar moléculas en un

campo eléctrico, de acuerdo al tamaño o peso molecular, la carga neta y la

estructura tridimensional que poseen. Por lo cual, moléculas de ADN de tamaño

diferente van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis; siendo la

distancia recorrida por cada fragmento de ADN inversamente proporcional al

logaritmo de su peso molecular. Los materiales usados como matriz o soporte

son los polímeros como la agarosa, la poliacrilamida, papel (celulosa), almidón

y acetato de celulosa.

Los ácidos nucleicos (ADN, ARN) están cargados negativamente debido

a los grupos fosfatos, por lo cual cuando se aplica una corriente eléctrica a una

matriz de gel que contiene las muestras de ácidos nucleicos que se encuentra

en una solución a pH neutro o básico, entonces los fragmentos de ácidos

nucleicos migrarán hacia el polo positivo o ánodo.

La separación de los fragmentos de ADN por electroforesis se regula a

través de la concentración de agarosa (o poliacrilamida) en el gel y el voltaje

aplicado durante la corrida electroforética; por lo tanto, los fragmentos de menor

tamaño migran más rápido hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño y el

incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de

los fragmentos en el gel.

La poliacrilamida es un soporte muy usado cuando se realiza una

electroforesis de muestras de ácidos nucleicos debido a que es transparente,

elástico, tienen una porosidad controlable y permiten una buena visualización

de las bandas durante un tiempo prolongado. Los geles de poliacrilamida se

forman por polimerización de la acrilamida con la bisacrilamida. Estos geles

suelen emplearse cuando los fragmentos de ADN que van a ser visualizados

son de bajo peso molecular (menos de 1000 pares de base), mientras que para

fragmentos de mayor peso molecular se emplea los geles de agarosa.

El tamaño del poro formado por el gel depende de la concentración de

la acrilamida: a mayor concentración, menor tamaño del poro y se dificulta el

movimiento de los fragmentos a lo largo del gel permitiendo de esta manera

obtener una mayor resolución en los fragmentos pequeño. Una desventaja que

posee la acrilamida sobre la agarosa es que es un compuesto tóxico pero su

poder de resolución es mayor. Todas las moléculas de ADN al tener carga

negativa van a migrar hacia el polo positivo, pero al entrar en los polos del gel,

las moléculas más grandes van a tener un movimiento más lento debido a su

dificultad para pasar entre los poros, mientras las moléculas más pequeñas lo

hacen más rápidamente y llegan antes al polo positivo.

Una electroforesis típica consiste en preparar un gel de agarosa a una

determinada concentración, mezclar las muestras que se van a analizar con un

colorante adecuado que va permitir el frente de corrida de la electroforesis,

colocar las muestras en el gel, realizar la corrida electroforética y, por último,

visualizar los ácidos nucleicos para lo cual se emplea un determinado colorante,

puede ser Sybr Green, Red gel y Bromuro de etidio.

2. OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

2.1 Extracción de ADN.

- Extraer ADN a partir de muestras biológicas.

- Conocer las diferentes técnicas de aislamiento de ADN

- Analizar cada proceso de la técnica de aislamiento de ADN.

2.2 Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

- Conocer los fundamentos en lo que se basa la técnica de PCR

- Conoce la importancia del uso de la técnica de PCR para el diagnóstico de

enfermedades en los seres humanos.

- Explica cómo se genera un fragmento específico de ADN genómico humano

utilizando la técnica de PCR.

2.3 Fundamentos de electroforesis.

- Apreciar la técnica de electroforesis en gel.

- Comprende los conceptos que están involucrados en la separación de ácidos

nucleicos en una corrida electroforética.

- Observa la muestra de ADN aislada de la práctica anterior.

3. MARCO TEÓRICO

3.1 CONCEPTOS BÁSICOS

3.1.1 Tecnología basada en sílica.

El ADN se absorbe específicamente a membranas/esferas/partículas de sílica

en presencia de ciertas sales y a un pH particular. Los contaminantes celulares

son eliminados mediante diferentes pasos de lavado. El ADN es eluído en un

búfer de baja salinidad o búfer de elución. Se utilizan sales caotrópicas para

promover la desnaturalización de proteínas y la extracción del ADN.

3.1.2 Elución.

Desprendimiento del ADN de la sílice.

3.1.3 Electroforesis en gel.

La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente

eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y

carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. (1)

3.1.3. Reacción en cadena PCR.

La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que

amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios

ciclos repetidos en los que la secuencia blanca es copiada fielmente. Para ello,

la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la

capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células.

 3.1.4 Terapia genética.

Consiste en la inserción de elementos funcionales ausentes en el genoma de un

individuo. Se realiza en las células y tejidos con el objetivo de tratar una

enfermedad o realizar un marcaje.

3.1.5 Agarosa.

Es un polisacárido formado por galactosas alfa y beta que se extrae de

las algas de los géneros Gellidium y Gracillaria. Es soluble en agua a

temperaturas superiores a los 65 °C, dependiendo del grado de

sustituciones hidroxietílicas de sus cadenas laterales.

3.1.6 Espectrofotometría.

Cada molécula absorbe la energía radiante a una longitud de onda específica, a

partir de la cual es posible extrapolar la concentración de un soluto en una

solución.
PROCEDIMIENTOS:
PRÁCTICA #9: EXTRACCIÓN DE ADN
Extracción de ADN de sangre Total:

1. A un tubo ependorff, adicionamos una muestra de 50 µl de sangre fresca

2. Transferimos 20 µl de sangre a un tubo que contiene 20 µl proteinasa K.
3. Añadimos 20 µl de RNasa a la muestra. Sometemos a vórtex por 15 segundos
e incubamos a temperatura ambiente durante 2 min.
4. Añadimos 100 µl de Buffer lisis y homogenizar utilizando vórtex por 15
segundos.
5. Incubar a 50 ° C durante 12 min.
6. Añadimos 100 µl de etanol 96%. Mezclar en el vórtex por 15 segundos.
7. Incubamos la lisis por 5 min a temperatura ambiente.

Proceso de purificación:

1. Colocamos la lisis 300ul en la columna de extracción.

2. Centrifugamos la columna a 10 000 rpm por 1 min, descartar el filtrado por la
columna y colocamos la columna en un nuevo tubo de lavado.
3. Lavamos la columna con 200ul de buffer de lavado, centrifugamos a 10 000
rpm por 1 min y eliminar el filtrado.
4. Colocamos la columna en un nuevo tubo de lavado, adicionar 200ul de buffer
de lavado y centrifugamos la columna a velocidad de 10 000 rpm por 3 min para
poder filtrar cualquier residuo del buffer de lavado.
5. Colocamos la columna en un nuevo tubo de recolección (1,5ml).
6. Añadimos 100 µl de Buffer de elución a la columna.
7. Incubamos a temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugamos la columna
a velocidad de 10 000ul por 1 min a temperatura ambiente.
8. Incubamos a temperatura ambiente por 1 min. Centrifugamos a 10 000 rpm
por 1 min
9. El tubo contiene ADN genómico purificado.
10. Almacenamos el ADN purificado a -70ºC para otras aplicaciones.

Cuantificación de Ácidos Nucleicos:

1. Seleccionamos el tipo de muestra a medir en el espectrofotómetro Lambda.

2. Colocamos 2 µl de la muestra de ADN extraída en el sensor del
espectrofotómetro.
3. Anotar los resultados y comparar los resultados.
PRÁCTICA 10: PCR

1. En un tubo de PCR colocar 25 µl de solución de reacción final (mix de PCR)

2. Centrifugamos brevemente para mezclar bien los componentes.

3. Colocamos los eppendor con la solución de mix de PCR en el termociclador,
el cual ya debe tener programado las condiciones de amplificación
DESNATURALIZACIÓN HIBRIDACIÓN ELONGACIÓN N° DE MANTENER
CICLOS A
94° C x 15 seg 58°x30seg 72° Cx15seg 25 94°C

4. Finalizada el proceso de amplificación, retirar los ependorf del termociclador y

guardar las muestras a 20°C.