AÇÃO DO VENENO DE Bothrops jararacussu NA ATIVIDADE

Ca2+-ATPásica E EXPRESSÃO DAS ISOFORMAS SERCA1 E

SERCA2 NO MÚSCULO Extensor digitorum longus: EFEITO DA
HEPARINA

Naiara Schaffazick

Orientadora:
Profª. Drª. Valéria do Monti Nascimento Cunha

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em

Farmacologia e Química medicinal do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção de Mestre em Ciências (Farmacologia).

Rio de Janeiro
Abril / 2009
 ii

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia e
Química Medicinal

AÇÃO DO VENENO DE Bothrops jararacussu NA ATIVIDADE

Ca2+-ATPásica E EXPRESSÃO DAS ISOFORMAS SERCA1 E
SERCA2 NO MÚSCULO Extensor digitorum longus: EFEITO DA
HEPARINA

Naiara Schaffazick

Trabalho realizado no Laboratório de Farmacologia Bioquímica de Órgãos e

Sistemas do Programa de Farmacologia Celular e Molecular do Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a
orientação da
Profª .Drª. Valéria do Monti Nascimento Cunha

Rio de Janeiro
Abril / 2009
 iii

FICHA CATALOGRÁFICA

Schaffazick, N.
AÇÂO DO VENENO DE Bothrops jararacussu NA ATIVIDADE Ca2+-
ATPásica E EXPRESSÃO DAS ISOFORMAS SERCA1 E SERCA2 NO
MÚSCULO Extensor digitorum longus: EFEITO DA HEPARINA
/ Naiara Schaffazick. Rio de Janeiro: UFRJ, ICB – DFBC,
2009.
xiv, 100f.
Orientador: Valéria do Monti Nascimento Cunha
Dissertação (mestrado) – UFRJ, ICB – DFBC
(Farmacologia e Química Medicinal), 2009.
Referências Bibliográficas: f.74 - 100
1. Veneno de Bothrops jararacussu. 2. Heparina. 3.
mionecrose. 4. Bombas de Ca2+. i. Cunha, Valéria do Monti
Nascimento. Ii.Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Departamento de Farmacologia Básica e Clínica. Iii. Título
 iv

Ao meu irmão Jeancarlo que sempre me apoiou

incondicionalmente em todas as etapas de
minha vida.
 v

AGRADECIMENTOS:

Ao meu bom Deus, que sempre trilhou os meus caminhos.

À minha mãe, mesmo estando longe sempre me incentivou a continuar.

À minha Avó Ita, pelo apoio, agradeço a Deus por você existir na minha vida.

Aos meus pimpolhos João Pedro e Isabela, vocês são a minha alegria de
viver.

Ao meu irmão Jean e minha cunhada Cris pelo apoio, incentivo, e por me
mostrar que a vida vale a pena.

Ao André pelo apoio nesses últimos três meses. Muito Obrigada.

À Professora Valéria pelos inúmeros conselhos e incentivos de sempre

continuar e principalmente pela confiança depositada em mim.
Meu eterno agradecimento.

À Professora Lucienne, principalmente pela amizade e dedicação nos

momentos mais difíceis.

Aos amigos de laboratório Humberto, Júlia, Raquel, Luiza, Sabrina, Camila,

Diogo, Marcelle e Douglas, por me agüentarem todo esse tempo e pelo ótimo
ambiente de trabalho.

À amiga Luciana do laboratório de Farmacologia Bioquímica e Molecular pela

colaboração nas preparações.

Aos amigos do laboratório de toxinas ofídicas, obrigada pela amizade de vocês.

 vi

Aos Professores Paulo de Assis Melo e Sabrina Calil-Elias por aceitarem serem
membros da banca examinadora e principalmente pela amizade e incentivo
durante a realização desta dissertação.

Ao Professor Luis Quintas por aceitar ser o revisor, e ser membro da banca
examinadora desta dissertação. Obrigada pelas inúmeras dicas para realização
deste trabalho.

À Professora Jennifer Lowe por gentilmente aceitar ser membro da banca

examinadora desta dissertação. Muito obrigada pela sua amizade.

Ao coordenador de pós-graduação professor François G. Noel.

Aos professores do curso de pós-graduação em Farmacologia e Química

Medicinal, por transmitirem sua experiência acadêmica durante as disciplinas
do curso.

À secretária de pós-graduação Denise.

À Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal e Ensino Superior (CAPES) pela

bolsa concedida por um determinado período do desenvolvimento deste
trabalho

A FAPERJ pelo suporte financeiro para a realização deste trabalho.

 vii

ABREVIATURAS

ADP -Adenosina difosfato

AMPc -AMP cíclico
AT-III -Antitrombina III
ATP -Adenosina trifosfato
ATP2C1 -Gene humano da SPCA
ATPNa2 -Adenosina trifosfato sódica
BthTx-I -Bothropstoxina I
BthTx-II -Bothropstoxina II
CaM -Calmodulina
CaM-BD -Domínio autoinibitório de ligação da CaM na PMCA
CAUAP -Comissão de Avaliação do Uso de Animais em Pesquisa
CK -Creatinocinase
Cont -Grupo controle
D465 -Resíduo Catalítico da PMCA
DTT -Ditiotreitol
E1 -Estado conformacional 1 de alta afinidade pelo Ca2+
E2 -Estado conformacional 2 de baixa afinidade pelo Ca2+
EDL -Músculo Extensor digitorum longus
EDTA -Ácido etilenodiaminotetracético
EGTA -Ácido etileno glicol-bis-(-β-amino-etil éter)N, N,N’,N’ tetracético
EPM -Erro padrão da média
F(ab) -Pequeno fragmento imune
F(ab’)2 -Fragmento imune
GTP -Guanosina trifosfato
HEPES -Àcido(N[2-hidroxietilpiperazino-N-[2-etanosulfônico)
HMWH -Heparina de alto peso molecular
HSR -Preparação pesada de músculo esquelético de contração rápida
 viii

de rato
IgG -Imunoglobulina G
IIa -Trombina
IP3 -Inositol 1,4,5-trifosfato
IP3R -Receptor sensível a IP3
KCl -Cloreto de potássio
LHMW -Heparina de baixo peso molecular
LiCl -Cloreto de lítio
MgCl2 -Cloreto de Magnésio
Ms-Cor -Preparação microssomal de coração de rato
Na+ -Íon sódio
NaCl -Cloreto de sódio
NAD+ -Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NaN3 -Azida sódica
NCK -Trocador Na+/Ca2+
PKA -Proteína Cinase A
PKC -Proteína Cinase C
PLA2 -Fosfolipase A2
PLA2 D49 -Toxina fosfolipase A2 com resíduos ácido aspártico na posição
49 – sem atividade catalítica
PLA2 k49 -Toxina fosfolipase A2 com resíduos de lisina na posição 49 –
com atividade catalítica
PLI -Proteína inibidora de fosfolipases
PLN -Fosfolamban
PMCA -Ca2+-ATPase de membrana plasmática
PMR1 -Bomba de Ca2+ de vias secretórias de leveduras
PMSF -Fenilmetilsulfonil fluoreto
PSS -Solução salina fisiológica
 ix

RE/RS -Retículo endo(sarco)plasmático

ROCs -Canais de Ca2+ sensíveis a receptores
RPM -Rotações por minuto
Rya -Rianodina
RyR -Receptor sensível a rianodina
SAB -Soro antibotrópico
SERCA -Ca2+-ATPase de retículo sarcoplasmático
SIIISPIIA -Isoforma das fosfolipases A2 do veneno Bothrops jararacussu
SIIISPIIB -Isoforma das fosfolipases A2 do veneno Bothrops jararacussu
SIIISPIIIA -Isoforma das fosfolipases A2 do veneno Bothrops jararacussu
SIIISPIIIB -Isoforma das fosfolipases A2 do veneno Bothrops jararacussu
SLP -Sarcolipina
SOCs -Canais de Ca2+ regulados por estoques internos
SPCA -Ca2+-ATPase de vias secretórias
TBS-T -Solução Tris-Salina com Tween
Tg -Tapsigargina
TM -Dominio transmembranar
V+H -Grupo veneno + heparina
Ven -Grupo Veneno
VOCs -Canais de Ca2+ sensíveis a voltagem
Xa -Fator X ativado
 x

Resumo

O Ca2+ é um íon essencial para o desenvolvimento de diversos eventos

celulares, sendo sua concentração citosólica controlada por sistemas de
transporte presentes na membrana plasmática e em diferentes organelas
intracelulares nas células eucarióticas. Os venenos de serpentes contêm
miotoxinas que são capazes de destruir a membrana plasmática das fibras
musculares, promovendo o influxo de íons, principalmente o íon Ca2+, para
o meio intracelular. As miotoxinas são ainda capazes de atravessar a
membrana plasmática lesionada e alterar direta ou indiretamente a
capacidade contrátil das fibras musculares. Dados da literatura mostram que
o músculo de contração rápida, Extensor digitorum longus (EDL), expressa
altos níveis da isoforma da bomba de Ca2+ SERCA1 e, baixos níveis da
isoforma SERCA2, preferencialmente expressa em músculo de contração
lenta. Sabendo-se que a heparina, um polionte sulfatado é capaz de
antagonizar a ação miotóxica de venenos de serpentes e alterar o ciclo
catalítico das bombas de Ca2+ em músculo esquelético, e que alterações de
expressão das bombas de Ca2+ da família SERCA foram observadas após
administração de toxina isolada da serpente australiana, os objetivos deste
trabalho foram: investigar a expressão das isoformas das bombas de Ca2+
SERCA1 e SERCA2 após a indução de necrose pelo veneno de Bothrops
jararacussu e posterior tratamento com heparina, e avaliar a viabilidade
funcional das bombas de Ca2+ durante a regeneração muscular assim como
o efeito direto do veneno na atividade Ca2+-ATPásica. Verificamos que o
veneno promove diminuição da expressão de SERCA1 nos primeiros dias
(aproximadamente 58 %) e que retorna aos níveis controles no decorrer do
processo de regeneração (1 – 21 dias). Já a expressão de SERCA2
aumenta significativamente durante os primeiros dias do processo de
regeneração muscular (600 % no 3º dia) e permanece aumentada até o final
do ciclo de regeneração (207 %). A heparina não foi capaz de antagonizar
as alterações de expressão induzidas pelo veneno de B. jararacussu, nem o
perfil de regeneração de SERCA1 e SERCA2. Nossos dados mostram
também que o veneno inibe diretamente a atividade Ca2+-ATPásica e essa
inibição é concentração-dependente. Ao contrário do que foi observado na
 xi

análise da expressão das bombas SERCA, a heparina foi capaz de reverter

a ação inibitória do veneno de B. jararacussu sobre a atividade Ca2+-
ATPásica a partir do 3o dia de observação. Essas alterações moleculares
sugerem que o veneno pode afetar drasticamente a homeostasia do Ca2+
nas células musculares.

Palavras chaves: veneno de Bothrops jararacussu, heparina, mionecrose,

bombas de Ca2+, SERCA1 e SERCA2
 xii

ABSTRACT

Calcium ion (Ca2+) is essential to many cellular events and its citosolic
concentration is regulated by different transport systems present in separated
organelles of eukaryotic cells. Snake venoms have myotoxins that act by
promoting the influx of ions, especially Ca2+ ions, through plasma membrane to
the intracellular space of muscle fibers. The myotoxins can also pass through
the injured membrane to alter directly or indirectly the contractility of muscle
cells. Data from literature show that the fast-twitch muscle Extensor digitorum
longus (EDL) expresses high levels of the Ca2+ pump SERCA1 isoform, and low
levels of the SERCA2 isoform, preferentially expressed in slow-twitch muscles.
As it is known that heparin, a sulfated polianion is able to antagonize the
myotoxic action of snake venoms and alter the catalytic cycle of skeletal muscle
Ca2+ pumps, and that modifications of the expression of SERCA pumps have
been already observed after administration of the toxin from Australian snake,
the aims of the present work were to investigate the expression of SERCA1 and
SERCA2 isoforms after the induction of necrosis with the venom of Bothrops
jararacussu and subsequent treatment with heparin and to evaluate the
functional viability of Ca2+ pumps during muscle regeneration as well as to
assess the direct effect of venom on the Ca2+-ATPase activity. We found that
the venom promoted the reduction of the expression of SERCA1 in the first
days (approximately 58 %) and that returned to control levels during the
regeneration process. Otherwise the expression of SERCA2 was significantly
increased during the regeneration process (600%) remaining high until the end
of regenerating cycle (207 %). Heparin was not able to antagonize the changes
of expression induced by B. jararacussu venom, neither the regenerating profile
of SERCA1 and SERCA2. Our data also show that the venom directly inhibits
the Ca2+-ATPase activity on a concentration-dependent manner. Contrary to
what was observed in the analysis of expression of SERCA pumps, heparin
was able reverse the inhibitory action of B. jararacussu venom on the Ca2+-
ATPase activity from the third day of observation. These molecular changes
suggest that the venom can drastically affect the homeostasis of Ca2+ in muscle
cells.
 xiii

ÍNDICE

INTRODUÇÃO ................................................................................ 1
1-Importância médica dos venenos de serpentes........................... 2
2-Composição e ações dos venenos ofídicos.................................. 3
3-Degeneração/regeneração do músculo esquelético.....................9
4-Heparina...................................................................................... 10
5-Controle da homeostasia do Ca2+ Intracelular............................13
6-.Ca2+-ATPases..............................................................................19
6.1.Ca2+-ATPase de membrana plasmática ............................... 20
6.2. Ca2+-ATPase de vias secretórias......................................... 23
6.3. Ca2+-ATPase de retículo sarco(endo)plasmático .................24
6.3.1.Reguladores endógenos da bomba. ..........................28
6.3.2.Drogas inibidoras ..................................................... 29
OBJETIVOS .................................................................................. 32
METODOLOGIA ............................................................................ 34
1-Administração do veneno e tratamento com a heparina
(HMWH).......................................................................................... 35
2-Obtenção do homogeneizado do músculo Extensor digitorium
longus (EDL) de camundongo ou rato...........................................37
3-Ensaio de SDS-PAGE & Western Blot.........................................39
4-Medida da atividade Ca2+ ATPásica do EDL de camundongos
tratados com heparina, após a administração do veneno de B.
jararacussu......................................................................................40
5-Medida da atividade (Ca2++ Mg2+) ATPásica de EDL de rato......41
6-Dosagem de proteína...................................................................41
7-Preparo das soluções de Ca2+..................................................... 42
8-Reagentes....................................................................................42
 xiv

9-Tratamento estatístico..................................................................42
RESULTADOS .............................................................................. 43
1-Expressão das isoformas SERCA1 e SERCA2, no músculo EDL,
após a injeção perimuscular do veneno B. jararacussu e posterior
tratamento com a Heparina.............................................................44
2-Efeito do veneno bruto de B. jararacussu na atividade
Ca2+- ATPásica................................................................................57
3-Avaliação da atividade Ca2+- ATPásica durante o processo de
regeneração muscular.....................................................................58
DISCUSSÃO ..................................................................................60
CONCLUSÕES ............................................................................. 70
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................72
INTRODUÇÃO
 2

1. Importância Médica dos Venenos de Serpentes:

Envenenamentos devido a acidentes ofídicos constituem um relevante
problema de saúde em várias regiões do mundo, especialmente em áreas rurais
da África, Ásia e América Latina. A incidência anual global de mordedura de
serpentes é estimada em cerca de 5 milhões, causando 125.000 mortes
(Chippaux, 1998; Chippaux & Goyffon, 1998; da Silva et al., 2007 e Mora et al.,
2008). Muitos destes acidentes não são fatais, porém podem causar lesão
incapacitante devido ao intenso dano dos tecidos, muitas vezes com amputação
do membro atingido (Homma & Tu, 1971; Rosenfeld, 1971; Gutiérrez & Chaves,
1980; Gutiérrez et al., 1980; Arroyo & Gutiérrez, 1981; Watt, 1989; Kerrigan,
1991; Nishioka & Silveira, 1992; Mello et al., 2000).
Na América do Sul e incluindo o nosso país estão presentes
principalmente serpentes do gênero Bothrops, Crotalus, Lachesis e Micrurus
(Rosenfeld, 1971; Melgarejo, 1988). O gênero Crotalus apresenta guisos ou
chocalho, característico das cascáveis e é representado principalmente pela
serpente Crotalus dusissus terrificus. O gênero Lachesis (surucucu) encontramos
na cauda escamas eriçadas e é representada principalmente pela serpente
Lachesis muta muta. Dentre os três gêneros da subfamília Crotalinae, o gênero
Bothrops é o único que não possui característica marcante na cauda (Hoge &
Romano-Hoge, 1978/1979; Jorge & Ribeiro, 1990; Romano-Hoge, 1990). No
Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde, ocorrem entre 19.000 a 22.000
acidentes ofídicos por ano, com letalidade ao redor de 0,45%. Os dados
demonstram que o sexo masculino é o mais acometido e a faixa etária coincide
com a idade onde a força de trabalho no campo é maior. As espécies do gênero
Bothrops são as que têm maior importância médica, já que são responsáveis pela
maioria dos acidentes ofídicos (Figura 1) (Jorge & Ribeiro, 1990; Nishioka &
Silveira, 1992; Ministério da Saúde, 2001).
Segundo Bochner & Struchiner (2003), a epidemiologia dos acidentes
ofídicos no Brasil se manteve inalterada nestes últimos 100 anos.
 3

Bothrops 90,5%
Micrurus 0,4%

Crotalus 7,7%

Lachesis 1,4%

Figura 1. Distribuição dos acidentes ofídicos no Brasil (1990 – 1993), segundo o gênero da
serpente causadora do acidente. (Ministério da Saúde, 2001).

2. Composição e Ações dos Venenos Ofídicos:

A principal função dos venenos ofídicos é promover a imobilização e a
digestão da presa. Entretanto, os venenos de serpentes são uma complexa
mistura de proteínas ativas, que em sua maioria são enzimas e peptídeos com
atividades biológicas diversas. Há variações na composição química entre as
diferentes famílias, gêneros, espécies, idade e distribuição geográfica das
serpentes de onde são extraídos (Hider, et al., 1991; Chippaux et al., 1998; Melo
& Ownby,1999; Boechat et al., 2001).
As principais reações causadas pelas picadas de serpentes foram
classificadas dentro de dois grupos, isto é, sistêmicas e locais (Homma & Tu,
1971). Os pacientes envolvidos nos acidentes apresentam sinais e sintomas, tais
como: (1) locais – dor, edema (por atingir os vasos linfáticos), equimose,
hemorragia, necrose com mionecrose ao redor da picada; (2) Sistêmicas –
neurotoxicidade, falência cardiovascular, sangramento generalizado devido a
distúrbios da hemostasia, hemorragias podendo levar a choque e falência aguda
dos rins. Em casos graves de envenenamento, o efeito local pode levar a perda
tecidual, incapacitar ou amputar o membro atingido (Homma & Tu, 1971; Brazil,
1980; 1984; Harris, 1991; Fletcher et al., 1997; Boechat et al., 2001; Mora et al.,
2008).
 4

As toxinas podem ser:

a) Neurotóxica: consiste principalmente pela inibição da transmissão
neuromuscular, podendo atuar tanto a nível pré-sináptico (β-
neurotoxina) quanto pós-sináptico (α-neurotoxina) (Brazil, 1980;
Chiappinelli, 1991; Endo & Tamiya, 1991);
b) Hemorrágica: promove alterações vasculares induzindo angirrexis
(ruptura do vaso), essa resulta da ação da toxina na membrana basal
dos capilares, vênulas e arteríolas (Rocha e Silva et al., 1949; Ferreira,
et al., 1970; Brazil, 1984; Queiroz, et al., 1985; Ownby, 1990);
c) Pró-coagulante ou anticoagulante: in vivo induz coagulação maciça
de sangue, chegando a torná-lo, após algum tempo, incoagulável pelo
consumo do fribinogênio, devido a ativação do plasminogênio (Ouyang,
et al., 1992; Kamiguti, et al., 1986; Kamiguti & Sano-Martins, 1995).
Também inibem a agregação plaquetária e impedem que este
importante elemento da hemostasia seja ativado (Kamiguti,, et al.,
1986; Zingali, 1990; Fuly, et al., 1997);
d) Citotóxica: em sua grande maioria são compostos de fosfolipases A2
(PLA2) e enzimas proteolíticas que atuam nos componentes da
membrana celular através de interação de cargas (Figura 2) (Mebs &
Ownby, 1990; Harris, 1991; Fletcher, et al., 1997; Fuly, et al.,
2000/2003; Gutiérrez & Ownby, 2003; Melo, et al., 2004).
 5

Figura 2. Ação esquemática mecanismo de ação das miotoxinas (Adaptado de Lomonte et.al.,
2003)

Dentre os vários venenos o de particular interesse para o nosso estudo é o

veneno de Bothrops jararacussu. Esse vem sendo estudado por vários
pesquisadores, que procuraram isolar e caracterizar as toxinas presentes neste
veneno (Rodrigues-Simioni, et al., 1983; Queiroz, et al., 1984; Homsi-
Brandeburgo, et al., 1988; Ward, et al., 1995; Zanganelli, et al., 1996; Pereira, et
al., 1998; Ketelhut, et al., 2003), Outros estudam as ações induzidas pelo veneno,
as suas toxinas, e outros efeitos, como os efeitos nefrotóxicos (Amaral, et al.,
1985) e miotóxico (Melo & Suarez-Kurtz, 1988a, 1988b; Ferreira, et al., 1992;
Melo et al., 1993; Gutierrez et al., 1995; Ribeiro & Jorge, 1997; Fletcher, et al.,
1998; Calil-Elias, et al., 2002a). Outros pesquisadores estudam substâncias que
podem antagonizar o efeito miotóxico deste veneno. (Melo & Suarez-Kurtz,
1988a, 1988b; Melo et al., 1993; Oshima-Franco, et al., 2000, 2001; Calil-Elias, et
al., 2002a; De Oliveira, et al., 2003; Murakami et al., 2005, 2007).
 6

A serpente Bothrops jararacussu pertence à família Viperidae podendo

alcançar tamanho avantajado chegando até 2 m de comprimento, e é capaz de
secretar 4 ml de veneno, o que corresponde a aproximadamente 1 g de veneno
seco (Campbel & Lamar, 1989). Ela habita as florestas tropicais, pântanos e a
beira de rios no Sudeste da Bolívia, Paraguai, nordeste da Argentina e no Brasil,
onde é encontrada desde o sul da Bahia até o noroeste do Rio Grande do Sul
(Milani et al., 1997) (Figura 3).

Figura 3. Bothrops jararacussu e sua distribuição geográfica no Brasil. (Ministério da Saúde,

2001)

Relatos de casos mostram que a mordedura de B. jararacussu é muito

dolorosa e, após algum tempo, pode evoluir para completa degeneração do
músculo, dos tendões, nervos e vasos atingidos (Amaral et al., 1985; Milani et al.,
1997). A mionecrose é uma importante complicação médica do acidente ofídico,
tendo grande repercussão na recuperação do paciente. A necrose tecidual
induzida pela ação local do veneno de B. jararacussu pode ser provocada tanto
pela isquemia tecidual como pelas toxinas que atuam diretamente nas células do
músculo esquelético. Estas toxinas são denominadas miotoxinas e estão
presentes em diversos venenos de serpentes (Harris & Cullen, 1990; Mebs &
Ownby, 1990; Ownby, 1990; Gutiérrez & Ownby, 2003). As miotoxinas ofídicas
podem ser classificadas dentro de três grandes grupos: miotoxinas pequenas, as
cardiotoxinas presentes em alguns venenos de serpentes e as miotoxinas PLA2,
 7

sendo esta última o maior grupo de miotoxinas (Harris & Cullen, 1990; Mebs &
Ownby, 1990; Melo & Ownby, 1999).

Miotoxinas pequenas ou peptídios miotóxicos:

Incluem peptídeos básicos de pequena massa molecular, da ordem de 4
KDa, com 43 a 45 resíduos de aminoácidos, exibindo homologia seqüencial,
ligados por pontes dissulfeto (Fox et al, 1979). A crotamina e a miotoxina a atuam
nos canais de sódio, promovendo maior influxo deste íon para dentro das células
musculares, sem afetar a integridade do sarcolema. No entanto, alteram o
equilíbrio hidroeletrolítico celular, com a dilatação das cisternas do retículo
sarcoplasmático e prejuízo da função da enzima Na+/K+ATPase.
Histologicamente aparecem inúmeros vacúolos entre as miofibrilas, em razão do
desequilíbrio funcional do retículo sarcoplasmático, cujo papel é manter a
homeostasia iônica citossólica juntamente com as mitocôndrias.

Cardiotoxinas:
São proteínas de baixa massa molecular, 6 a 7 KDa, possuem de 60 a 62
resíduos de aminoácidos interligados por 4 pontes dissulfeto. Apresentam uma
variedade de ações em diferentes tipos de células: causam hemólise,
despolarização e contratura nas células musculares esqueléticas com
conseqüente necrose (Harvey, 1985; Fletcher & Lizzo, 1987). Essas miotoxinas
foram inicialmente assim chamadas por sua ação in vivo, sobre o coração,
causando arritmias cardíacas (Condrea, 1974). As cardiotoxinas alteram a função
dos canais de sódio, semelhante à crotamina e à miotoxina a. No entanto, os
efeitos morfológicos não se assemelham aos induzidos por essas toxinas, mas
são similares aos produzidos pelas miotoxinas com e sem atividade PLA2 (Ownby
et al, 1993). As cardiotoxinas são proteínas altamente básicas, com grande
porção da sua superfície carregada positivamente. O sítio real de interação das
cardiotoxinas com as membranas musculares ainda é desconhecido, porém, são
sugeridos: (a) sítios de membrana carregados negativamente, (b) sítios de
ligação de cálcio e (c) proteínas integrais da membrana (Harvey, 1985). Os
 8

possíveis modos de ação das cardiotoxinas incluem: (1) ação direta sobre a
membrana plasmática, promovendo a ruptura da mesma, acompanhada pela
despolarização, (2) ação indireta por meio da ativação das fosfolipases C
endógena do tecido ou (3) uma combinação de dois mecanismos e (4) inibição da
Na+/K+ATPase, seguida pelo aumento da concentração intracelular de Na+ e de
edema celular por influxo passivo de água para célula (Ownby, et al., 1993).

Fosfolipases A2 miotóxicas:
É o maior grupo de miotoxinas e exibe um amplo espectro de atividades
incluindo efeitos miotóxicos, neurotóxicos, cardiotóxicos, anticoagulantes,
agregante paquetário, hipotensivo e inflamatório. Pode ser subdivivida ainda em
duas subfamílias, com base na similaridade seqüencial e estrutural: (1) toxinas
com o resíduo ácido aspártico na posição 49, as miotoxinas PLA2 D49, com
atividade catalítica e (2) toxinas com a lisina na posição 49, as miotoxinas PLA2
K49 desprovida de atividade catalítica (Mebs & Ownby, 1990; Melo & Ownby,
1999; Murakami et al., 2005). A indução de necrose e apoptose pela PLA2 K49
está diretamente associada com o aumento de Ca2+ citosólico, seguindo
perturbação da membrana plasmática, juntamente com envolvimento da
mitocôndria. A resposta de proliferação celular depende de um limite de influxo
de Ca2+ através da membrana plasmática, sendo associado com unidades
funcionais constituída pela Ca2+-ATPase de retículo sarcoplasmático (SERCA),
receptor de ryanodina e mitocôndria, que regulam a oscilação da concentração
de Ca2+ citosólico (Mora et al., 2006).
As PLA2 são enzimas-chave no controle, regulação, produção e liberação
de precursores lipídicos, servindo como mensageiros fundamentais de processos
altamente regulados, como crescimento, adesão, apoptose, secreção,
homeostase e regulação imune.
Estas PLA2 afetam somente fibras musculares sem lesionar outras
estruturas teciduais, tais como tecido conectivo, nervos e vasos, podendo levar a
perda tecidual permanente, lesão incapacitante e morte (Murakami et al., 2005).
Foi isolado do veneno de B. jararacussu por Oliveira et al., 2008 uma proteína
 9

inibidora de fosfolipase (PLI) que neutraliza atividades enzimática, tóxica e

farmacológica de diversos venenos de serpentes gênero Bothrops.
Do veneno de B. jararacussu, foram identificadas e isoladas duas
importantes miotoxinas, a saber: a Bothropstoxina I (BthTX-I ou PLA2 K49 ) e a
Bothropstoxina II (BthTX-II ou PLA2 D49 ) (Homsi-Brandeburgo et al., 1988; Melo
& Ownby, 1999). A BthTX–I possui atividade miotóxica quando administrada
isoladamente, bloqueia a transmissão neuromuscular e possui também
atividades edematogênica e bactericida (Homsi-Brandeburgo et al., 1988;
Heluany et al., 1992; Melo et al., 1993; Rodrigues-Simioni et al., 1995; Andrião-
Escarso et al., 2000; Oshima-Franco et al., 2001; Chioato et al., 2002; De Oliveira
et al., 2003). A BthTX–II também é uma miotoxina e ainda possui atividade
anticoagulante, edematogênica e bactericida (Andrião-Escarso et al., 2000). Há
isoformas das PLA2 do veneno B. jararacussu que são bem caracterizadas
SIIISPIIA, SIIISPIIB e SIIISPIIIA - atividade anticoagulante, SIIISPIIIB - atividade
hemolítica indireta, com exceção SIIISPIIB que inibe a agregação plaquetária.
Todas as outras isoformas são capazes de induzir edema independente do tempo
(Ketelhut et al., 2003).
Observando-se ao microscópio óptico, o aspecto da mionecrose induzida
pelas miotoxinas (PLA2 K49 e PLA2 D49) é muito semelhante (Ownby e Colberg,
1988;), e parece não ser totalmente dependente da atividade enzimática das
diferentes toxinas (Homsi-Branderburgo, et al., 1988; Lomonte & Gutiérrez, 1989;
Krizaj, et al., 1991; Kihara et al., 1992). É interessante ressaltar que após 5 min
de exposição das fibras musculares às miotoxinas, observam-se alterações e
lesões na célula muscular (Melo, et al., 2004).
Sabe-se que o primeiro local a ser lesado pelas miotoxinas é o sarcolema,
com despolarização da célula muscular e influxo de íons cálcio seguido de rápido
efluxo de enzimas citossólicas (Harris & Mackonell, 1981; Harris & Maltin, 1982;
Gopalakrishnakone et al., 1984; Gutiérrez et al., 1986; Ownby, 1990; Heluany et
al., 1992; Johnson & Ownby, 1993; Gutiérrez & Ownby, 2003; Melo et al., 2004).
Uma vez ligadas ao sarcolema as miotoxinas podem promover a lesão
provavelmente de duas formas: perturbação da integridade do sarcolema
 10

independente da hidrólise de fosfolipídios de membrana ou rompimento da

membrana do sarcolema baseado na ação fosfolipásica da miotoxina (Gutiérrez &
Ownby, 2003). A lesão do sarcolema é seguida da contração das fibras
musculares, edema das células, agrupamento das miofibrilas, e aparecimento de
lesões delta (lesões em formato da letra grega delta), lesões características da
síndrome de Duchenne. Ocorrem também alterações nas mitocôndrias e
formação de vacúolos claros e escuros no sarcoplasma. Associa-se a estas
alterações o aparecimento de reação inflamatória aguda associada a dor, edema
e infiltrado de polimorfonucleares (Harris & Maltin, 1982; Gutiérrez et al. 1986;
Ownby & Colberg, 1988; Mebs & Ownby, 1990; Ownby, 1990; Melo et al., 2004).

3. Degeneração/Regeneração do Músculo Esquelético:

Entre dois e três dias após a injeção do veneno, as células atingidas já
estão degeneradas e há o aparecimento de células fagocíticas, os macrófagos.
No terceiro dia após a injeção já se pode observar a formação de células
miogênicas, tendo início o processo de regeneração. Dados da literatura mostram
que este processo de regeneração estará completo antes da quarta semana
(Harris & Mackonell, 1981; Gopalakrishnakone et al.,1984; Ownby & Colberg,
1988; Ownby, 1990; Gutiérrez & Lomonte, 1995; Fletcher et al., 1997).
A inflamação é uma reação característica do envenenamento de serpentes
e o recrutamento de células inflamatórias é importante no processo de
regeneração do músculo esquelético, já que camundongos com depleção de
neutrófilos que receberam injeção do veneno de B. asper demostraram
deficiência no processo de regeneração tecidual, com aumento de tecido
necrosado (Teixeira et al., 2003).
Vários estudos experimentais e clínicos mostram que a regeneração do
músculo esquelético lesado por venenos de serpentes não é completa (Queiroz,
et al., 1984; Gutiérrez, et al., 1986; Ownby & Colberg, 1988; Arce et al., 1991;
Mello et al., 2000). Isto se deve ao fato do veneno conter vários componentes que
não somente afetam as fibras musculares, mas também a microvascularização,
 11

os nervos e a matriz extracelular. A área do tecido necrosado pode ser

completamente reposta por tecido fibrótico formado a partir de fibroblasto, alguns
dias após a lesão. A regeneração só será possível se o veneno e suas miotoxinas
não atigirem as células satélites (Grounds, 1991). O tratamento imediato reduz os
danos teciduais causados pelo veneno.

4. Heparina:
No Brasil o único medicamento oficialmente aprovado pelo Ministério da
Saúde para o tratamento de acidentes ofídicos é o soro antiofídico ou antiveneno,
que é apropriado para cada tipo de serpente. O antiveneno usado no tratamento
do empeçonhamento por serpentes do gênero Bothrops, como o B. jararacussu,
é o soro antibotrópico (SAB). Este é produzido a partir do sangue de cavalos
imunizados com uma mistura de venenos, como por exemplo: B. alternatus, B.
cotiara, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni, B. neuwiedii e B. pradoi. Este
soro não é específico, mas após a coleta num anticoagulante apropriado (citrato
de sódio), é purificado por centrifugação para eliminar elementos celulares,
proteínas não-imunes, especialmente a albumina, sendo descartadas por
precipitação com sulfato de amônio. As imunoglobulinas são digeridas usando
pepsina para produção do fragmento F(ab’)2 ou papaína para a produção do
pequeno fragmento F(ab) e então o soro é embalado para fins comerciais, e mais
raramente liofilizado. A ação dos antivenenos é baseada na formação do
complexo antígeno–anticorpo. A dose recomendada em empeçonhamentos é
baseada na identificação das serpentes, no tempo entre a picada e a
administração do antiveneno, e também na evolução clínica e características do
local onde o veneno foi inoculado (Chippax & Goyffon, 1998). O soro antiofídico
antagoniza os efeitos pró-coagulante e hemorrágico do veneno e previne o óbito,
mas não previne completamente o dano tecidual, como a mionecrose (Dos-
Santos et al.,1992; Johnson & Ownby, 1993; Melo et al., 1993).
Um grupo de substâncias que vem sendo estudado com o objetivo de se
antagonizar os danos causados por venenos de serpentes nos tecidos é a classe
 12

dos polianiontes sulfatados. Vários estudos demonstram que os polianiontes,

como a heparina, antagonizam a atividade de alguns venenos, inclusive a
miotoxicidade dos venenos de serpentes (Higginbotham & Karnella, 1970; Tinoco,
1972; Melo & Suarez-Kurtz, 1988a, 1988b; Melo et al., 1993; Lomonte et al.,1994;
Melo & Ownby, 1999; Boechat et al., 2001; Oshima-Franco et al., 2001; Arruda et
al., 2002; Calil-Elias et al., 2002a; De Oliveira et al., 2003). O uso da heparina
como um tratamento de acidentes com veneno de serpente, foi primeiramente
proposto por Ahuja et al. em 1946 e Ahuja & Singh em 1954 (APUD Boechat et
al., 2001). Outro estudo que demonstrou o antagonismo da heparina por venenos
de serpentes do gênero Bothrops “in vitro” foi realizado por Melo & Suarez-Kurtz
(1988a, b). Eles demonstraram que a heparina quando pré-incubada com o
veneno de B. jararacussu inibe o aumento da taxa de liberação de creatinocinase
(CK) (indicador de lesão do tecido muscular) do músculo Extensor digitorum
longus (EDL) de camundongos e ratos. Foi proposto que este efeito se deve à
formação de complexo ácido-base da miotoxina com a heparina (Melo et al.,
1993). Informações prévias relatam que em hospitais do norte do Estado do Rio
de Janeiro utiliza-se heparina no empeçonhamento por serpentes do gênero
Bothrops (Tinoco, 1972). Calil-Elias et al., (2002a) demonstraram que a heparina
aumenta o número de células e promove uma melhor regeneração do músculo
EDL, após a indução de necrose pelo veneno de B. jararacussu.
A heparina é um polímero linear constituído de unidades repetidas de
dissacarídeos que contém ácido urônico, ácido D-glicurônico ou ácido L-idurônico
e D-glicosamina (Jackson et al., 1991; Tyrrell et al., 1995). É altamente aniônica
com grupos N- e O-sulfatados, e varia na unidade de massa, densidade de carga
e seqüência de açúcares (Figura 4). A heparina é composta de 20,3% - 31,3% de
glucosamina, 19,8% - 43,2% de ácido urônico, 19,0% - 36,7% de sulfato e 8,7% -
16,7% de cátions (Jackson et al., 1991). A heparina é comercialmente
apresentada nas formas de heparina de alto peso molecular ou regular (HMWH)
e heparina de baixo peso molecular (LMWH). A LMWH é constituída de
fragmentos da heparina regular produzida por despolimerização química ou
enzimática da heparina regular (ou não fracionada) (Green et al,1994).
 13

A heparina faz parte da família dos glicosaminoglicanos, polímeros

altamente sulfatados, com peso molecular variável entre 5.000 e 40.000 KDa. As
HMWH são capazes de interagir com a antitrombina III (AT-III), inativando fatores
IIa e Xa, entre outros para produzir o efeito anticoagulante. A LMWH contém,
teoricamente, um único pentassacarídeo que se liga especificamente a AT-III,
inativando o fator Xa apenas (Jordan et al,1982). Na clínica a heparina é usada
pelo seu efeito anticoagulante e antitrombótico, mas uma possível ação
antiflamatória também foi sugerida (Lane & Adams, 1993; Boechat et al., 2001).
Devido a sua natureza fortemente polianiônica, a heparina pode interagir com
várias moléculas que tem sítios catiônicos. Entre as substâncias capazes de
interagir com a heparina, encontram-se proteínas inclusas na matriz extracelular
(fibronectina, laminina, vitronectina), proteínas envolvidas no metabolismo
lipídico, componentes do sistema complemento, inibidores de serina proteases,
quimiocinas pró-inflamatórias (Miller & Krangel, 1992), fatores de crescimento
(Ferrara et al., 1991; Bobik & Campell, 1993; Lyon et al., 1994), proteínas de
matriz extracelular (Kjellén & Lindahl, 1991), canais de Ca2+ do tipo L presentes
no músculo esqueléticos (Knaus et al., 1990), proteases (Redini, et al., 1988;
Kjellén & Lindahl, 1991; Rajiv & Wonhwa 1994), proteínas virais e enzimas, tais
como as PLA2, presentes em muitos venenos de serpente (Boechat et al., 2001).

Figura 4. Estrutura química da heparina. A molécula do polímero contém várias destas cadeias
(JORDAN et al.,1982).
 14

A heparina também possui ação antiinflamatória que é distinta da sua

atividade anticoagulante. Tyrrell et al (1999) descreveram que tanto a HMWH
quanto a de LMWH possuem efeitos benéficos em vários modelos pré-clínicos de
doenças inflamatórias. Em modelos in vivo o uso da heparina de baixo peso
molecular como antiinflamatório pode ser dissociado do seu efeito anticoagulante,
isto é, não necessariamente aumentar o tempo de coagulação. A heparina é um
excelente inibidor da P e L-selectina (Koening et al., 1998; Wang et al., 2002),
sendo que L-selectina expressa no endotélio, é a que promove o “rolamento” dos
leucócitos, e resulta na sua aderência e migração para o local da lesão. Este
processo é fundamental para a resposta inflamatória aguda, sendo esta uma das
propostas de ação antiinflamatória da heparina (Celi et al., 1994; Tyrrell et al.,
1999; Wang et al., 2002). O bloqueio das selectinas promovida pela heparina
parece estar relacionado aos grupos sulfatados presentes na glicosamina (Wang
et al., 2002). Tanto o envenenamento quanto o tratamento medicamentoso, em
particular a heparina, podem afetar a homeostasia do Ca2+ das células afetadas.

5. Controle da homeostasia do Ca2+ intracelular:

A manutenção de baixa concentração de Ca2+ livre intracelular é vital para
o correto funcionamento das células. O íon Ca2+ é um sinalizador intracelular
presente em todos os compartimentos celulares e desempenha um papel
fundamental como segundo mensageiro em células eucarióticas, participando
ativamente em eventos de contração e relaxamento muscular, regulação
metabólica, secreção, fertilização, divisão celular, expressão gênica e até mesmo
processos invasivos por parasitas intracelulares (Figura 5) (Carafoli, 1992;
Yakubu et al., 1994; Bootman & Berridge, 1995; Takuma et al., 1995; Docampo &
Moreno, 1996; Berridge et al., 2000; Berridge et al., 2003; Periasamy e
Kalyanasundaram, 2007). O íon Ca2+ é um íon sinalizador altamente versátil que
pode regular várias funções celulares. Para alcançar esta versatilidade, o sistema
de sinalização pelo Ca2+ opera em vários e diferentes caminhos, que funcionam
em uma dinâmica ampla. Um exemplo clássico, na contração e relaxamento nas
 15

células musculares é o retículo sarcoplasmático que serve para iniciar a

contração muscular por liberar Ca2+ através dos canais/ receptores sensíveis a
rianodina (RyR) para o citosol e promover o relaxamento pela recaptação ativa
deste íon pela bomba de Ca2+ (SERCA) (Berridge et al., 2003; Periasamy e
Kalyanasundaram, 2007).
A concentração intracelular de Ca2+ precisa ser mantida dentro de uma
estreita faixa (faixa submicromolar), enquanto que a concentração extracelular
varia em torno de 1 mM. O controle intracelular de Ca2+ é mantido por um
delicado balanço entre vários sistemas de transporte de Ca2+ (Berridge et al.,
2000). Pequenos aumentos na concentração de íons Ca2+ no citosol disparam
uma variedade de respostas celulares. Entretanto, caso exceda, temporal ou
espacialmente, sua variação normal, este íon pode causar morte celular por
necrose ou apoptose (Berridge et al., 2000).
A homeostasia intracelular de Ca2+ é mantida devido à baixa
permeabilidade da membrana citoplasmática a este íon e pelo seu transporte
ativo constante contra o gradiente eletroquímico. Quando há estímulo celular ou
estímulo elétrico, que pode ser desencadeado por neurotransmissores ou
hormônios (Rasmussen & Barret, 1984; Mauger et al., 1985), ocorre um rápido
aumento do Ca2+ livre citoplasmático, podendo chegar até 1 µM, sendo
denominado Ca2+ transitório ou pico de Ca2+, o que é interpretado como um sinal
intracelular. A resposta celular a esse estímulo dependerá de alguns fatores, tais
como rota de entrada de Ca2+ na célula, do sítio de ação e do padrão de
modulação da amplitude e da freqüência do pico de Ca2+ (Thomas et al.,1996;
Putney, 1998; Chin & Means, 2000).
 16

Figura 5. Sinalização dinâmica e homeostasia do Cálcio. Durante as reações do tipo “on”, o

2+ 2+
estímulo induz a entrada de Ca externo e a formação do segundo mensageiro que libera Ca
2+
dos estoques internos como retículo endo(sarco)plasmático. Uma quantidade de Ca (círculos
vermelhos) fica ligado aos tampões, já que uma pequena proporção é ativada para operar vários
processos celulares, que operam um grande espectro de tempo. Durante as reações do tipo “off”,
2+
o Ca conduz os efetores e tampões e este é removido da célula por vários trocadores e bombas.
+ 2+ 2+ 2+
O trocador Na /Ca (NCX) e Ca ATPase de membrana plasmática (PMCA) que liberam Ca
2+ 2+
para fora da célula, já a Ca ATPase de retículo sarco(endo)plasmático (SERCA) remove o Ca
para dentro do lúmen do retículo, a mitocôndria tem um uniporter que participa da remoção, mas é
2+
bem mais lento que as bombas. A sobrevivência celular é dependente da homeostasia do Ca .
Adaptado de Berridge et al., (2003).
 17

De acordo com o tipo celular, esse Ca2+ é proveniente de diferentes fontes.

O Ca2+ extracelular penetra na célula através da abertura de três tipos de canais,
os quais são caracterizados de acordo com os seus mecanismos de ação. O
primeiro tipo inclui os canais de Ca2+ sensíveis à voltagem (VOCs), presentes em
células excitáveis, e que são subdivididos com base em suas propriedades
cinéticas e farmacológicas (Mori et al., 1993). O segundo tipo são os canais de
Ca2+ acoplados a receptores (ROCs), os quais são modulados pela ligação com
agonistas específicos, usualmente neurotransmissores, tais como o glutamato ou
ATP (Berridge et al, 1999). O último tipo são os canais de Ca2+ regulados pelo
estoque intracelulares (SOCs), os quais são abertos pelo esvaziamento desse
estoque (Berridge et al, 2000).
O Ca2+ presente em reservatórios intracelulares é mobilizado através de
dois tipos de canais: um sensível ao inositol-1,4,5-trifosfato e outro à rianodina.
Esses dois tipos de canais de Ca2+ são sensíveis ao próprio Ca2+, sendo este
evento denominado “liberação de Ca2+ induzida por Ca2+” (“Ca2+-induced Ca2+
release”). Este processo é autocatalítico, pois um pequeno aumento na
concentração de Ca2+ é capaz de promover uma amplificação na liberação deste
íon. Porém, ao alcançar concentrações mais elevadas (na faixa µM), o efeito do
íon Ca2+ sobre os receptores é invertido, ou seja, ocorre uma inibição
promovendo a interrupção na sua própria liberação (Bootmam & Berridge, 1995;
Thomas et al., 1996; Berridge et al., 2000). Foi descrito que o ADP-ribose cíclico
que é sintetizado a partir do NAD+, desempenha um importante papel na
modulação por Ca2+ dos canais sensíveis a rianodina (Galione & White, 1994).
A escolha do íon Ca2+ como mensageiro intracelular durante o processo
evolutivo pode ser explicada por suas características físicas e químicas
apropriadas, tais como o tamanho do raio iônico, o grau de ionização e o número
de coordenação mais flexível, possibilitando uma ligação forte e específica com
proteínas ligadoras de Ca2+ para a mediação da resposta celular (Carafoli &
Penniston, 1985). As proteínas que pertencem à família “E-F-Hand”, da qual
calmodulina (CaM) é a mais estudada, são os principais exemplos de proteínas
ligadoras de Ca2+ envolvidas com o processo de sinalização celular (Chin &
 18

Means, 2000). Além das proteínas ligadoras de Ca2+, diversos tipos de proteínas
cinases Ca2+-dependentes são responsáveis pela propagação do sinal
dependente do Ca2+. (Berridge et al., 2000).
Ao serem associados todos os processos, de acordo com cada tipo celular,
o sinal de Ca2+ pode ser de diferentes formas, sendo as mais freqüentes
denominadas “sparks” (centelhas ou faíscas), “puffs” (sopro) ou “waves” (ondas)
(Figura 6). A resposta celular global ocorrerá em função da extensão da área e
da(s) região(ões) ou organela(s) intracelulares alcançadas por este fluxo
transitório (Bootmam & Berridge, 1995; Chin & Means, 2000).
 19

2+
Figura 6. Tipos de liberação de Ca dos reservatórios intracelulares. a. Os canais sensíveis a
inositol-1,4,5-trifosfato (IP3R) e a rianodina (RyR) são distribuídos pela superfície dos retículos
endo(sarco)plasmático (RE/RS). b. Em resposta a pequenos estímulos ocorre a abertura
2+
individual de canais de Ca , denominadas “Blip” (IP3R) e “Quark” (RyR). c. Estímulos mais
intensos acarretam a modulação de grupos de canais, sendo denominadas “Puff” (IP3R) e “Spark”
(RyR). d. Quando algumas células estão totalmente estimuladas, eventos pontuais descritos em c
levam esta estimulação aos canais vizinhos através do fenômeno de “liberação de Ca2+ induzida
2+ 2+ 2+
por Ca ”, promovendo então as ondas de Ca intracelular. e. Essas ondas de Ca podem
2+
atravessar as junções gap, em alguns tecidos, gerando as ondas de Ca intercelulares. Adaptado
de Berridge et al., (2000).
 20

Cessando o estímulo, o nível de Ca2+ citosólico deve retornar ao normal e

isso requer obrigatoriamente que o Ca2+ seja retirado do meio citoplasmático.
Isso pode ser feito pelo seqüestro do Ca2+ por organelas citoplasmáticas ou pela
e expulsão do mesmo através da membrana plasmática.

6. Ca2+-ATPases:
O término de certos eventos celulares dependentes de Ca2+ está
diretamente relacionado à redução das concentrações de Ca2+ citoplasmático.
Neste processo, o principal mecanismo envolvido é o transporte ativo realizado
pelas bombas de Ca2+. Há três tipos de bombas, uma situada na membrana
plasmática (PMCA), outra no retículo sarco(endo)plasmático (SERCA) e outra
localizada no complexo de Golgi e vias secretórias (SPCA). Essas enzimas são
ATPases do tipo P. Isso significa que formam um intermediário fosforilado
(aspartil fosfato) durante o ciclo catalítico e transportam Ca2+ contra o seu
gradiente eletroquímico com gasto de ATP. As bombas de Ca2+ da família PMCA
permitem a extrusão de Ca2+ do citossol para fora da célula, já as bombas de
Ca2+ da família SERCA transporta o mesmo íon para o lúmen do retículo
sarco(endo)plasmático, e as bombas de Ca2+ do tipo SPCA transportam o Ca2+
para dentro dos estoques intracelulares do complexo de Golgi e vias secretórias
(Schatzmann, 1989; Grover, 1985; Callewaert et al., 2003). É importante
mencionar que as isoformas PMCA apresentam uma homologia de
aproximadamente 30% com a isoforma SERCA, e que seus pesos moleculares,
suas estequiometrias entre Ca2+ transportado e ATP hidrolisado, e suas
regulações, além das localizações celulares, são bem distintos.
 21

6.1 Ca2+-ATPase de membrana plasmática (PMCA):

As isoformas da familia PMCA apresentam 10 domínios
transmembranares, com região C-terminal e N-terminal localizados no citosol. A
porção citosólica da bomba consiste em três regiões maiores: a primeira alça
entre os segmentos transmembranares 2 e 3, uma grande alça (~400 resíduos),
entre os domínios 4 e 5, que inclui a ligação do ATP e o resíduo catalítico (D465)
aspartato e se estende até o final que contém o principal domínio regulatório da
bomba: domínio de ligação com a Calmodulina (CaM) e os sítios de fosforilação
pela PKC e PKA (proteínas cinases C e A) (Carafoli & Brini, 2000).
As bombas de Ca2+ do tipo PMCA possuem peso molecular entre 127 e
136 kDa, e controlam essencialmente a concentração de Ca2+ em células não
musculares. Sua importância em células musculares é aparentemente inferior se
comparada à abundância de bombas SERCA e de trocadores Na+/Ca2+ (Guerini,
1998; Grover & Khan, 1992); As PMCA são atualmente reconhecidas como uma
família de várias isoformas PMCA1, PMCA2, PMCA3 e PMCA4, que são
codificadas por quatro genes, localizados nos cromossomos 12, 3, X e 1 (Carafoli
& Guerini, 1993).
As Ca2+-ATPase transcritas a partir do gene PMCA1 são distribuídas
amplamente, tendo sido descritas no útero, músculo esquelético, coração,
cérebro, pulmão, fígado, baço, músculo liso, mucosa do estômago, aorta,
intestino delgado, intestino grosso e pâncreas. Já a isoforma PMCA2 está
presente principalmente no cérebro e em pouca quantidade no coração, útero,
fígado e rim. A isoforma3 tem sido expressa principalmente no cérebro e em
pequenas quantidades no músculo esquelético, enquanto a isoforma PMCA4
possui baixa expressão em vários tecidos, sendo extensamente expressa no
cérebro (Greeb & Shull, 1989; Grover & Khan, 1992)
A literatura relata que a região C-terminal do domínio citosólico da bomba
PMCA apresenta sítios de ligação para CaM (complexo Ca2+-CaM), considerada
seu principal modulador, e os sítios de fosforilação para proteínas cinases
 22

(O’Donnel & Owen, 1994; Carafoli, 1991; Monteithe & Roufogallis, 1995). A
ativação da bomba PMCA pela CaM aumenta a afinidade pelo Ca2+ e a
velocidade de transporte deste cátion em função de mudanças conformacionais
produzidas na região C-terminal ou no domínio de ligação de CaM - (K0,5 ~ 4-20
µM) para (K0,5 ~ 0,2 – 0,7 µM) (Wang et al., 1992; Carafoli, 1994; Marín et al.,
1999). Quando a CaM está ausente, a porção da bomba que contém o sítio de
ligação para CaM pode interagir com a porção citosólica da própria bomba,
inibindo a atividade ATPásica, então a autoinibição é revertida pela ligação da
CaM. (Figura 7)
Existem moléculas que estimulam a atividade das isoformas PMCA, tais
como: a vitamina D, o hormônio tireoideanos, fosfolipídios ácidos e proteínas
cinases A e C e a calmodulina. Já são conhecidos também inibidores não-
seletivos dessas isoformas, tais como: o ortovanadato, o IP3, fosfolipases, os
clássicos antagonistas de CaM (trifluoperazina, tamoxifeno, calmidazolio) e os
lantanídeos (Roelofsen & Schatzmann, 1977; Popescu et al., 1986; Walters,
1989; Missiaen et al., 1989; Lopes et al., 1990; Falchetto et al., 1991; Carafoli,
1991; Falchetto et al., 1992; Wuytack & Raeymaekers, 1992; Carafoli, 1994;
Monteith & Roufogalis, 1995; Herscher & Rega, 1996, Carafoli e Brini, 2000)
Entretanto, mais recentemente foi descoberto um novo grupo de substâncias que
inibem seletivamente as isoformas da família de bombas de Ca2+ PMCA, as
caloxinas (Szewczyk et al, 2008).
 23

Figura 7. Esquema estrutural e importante domínios funcionais da bomba de Ca2+ PMCA:

Os 10 domínios transmembranares (TM) são simbolizados por cilindros numerados 1 – 10. O
domínio autoinibitório de ligação da Calmodulina (CaM-BD) liga-se ao primeiro sítio receptor
(entre TM2 – TM3) e o segundo (entre TM4 – TM5) “loops” intracelulares da bomba. O A-domínio
contém um sitio alternativo o sitio A. Posição aproximada do (D) aspartato-fosforilado no sitio do
P-domínio e a lisina (K) no sítio de ligação do ATP são mostrados. O sítio C é indicado no C-
terminal CaM-BD. (Adaptado de Di Leva et al, 2008).
 24

6.2 Ca2+-ATPase de vias secretórias (SPCA):

Esta bomba de Ca2+ é uma proteína de cerca de 100 kDa com 10 domínios
transmembranares. A Ca2+-ATPase de vias secretórias (SPCA) (ATP2C1, gene
humano da SPCA), possui característica distintas das bombas de Ca2+
encontradas no retículo e na membrana plasmática e é bastante semelhante à
bomba de Ca2+ de vias secretórias de levedura (PMR1) (Rudolph et al., 1989;
Gunteski-Hamblin et al., 1992; Sorin et al., 1997; Sepúlveda et al., 2007). Esta
bomba de Ca2+ está expressa em muitos tecidos, incluindo o músculo
esquelético, rins, aorta, glândulas mamárias e queratinócitos, sendo que o defeito
no gene (perda de uma copia funcional do gene ATP2C1) que codifica a isoforma
presente neste tecido é responsável pelo desenvolvimento da doença de Hailey-
Hailey, uma enfermidade que acomete a pele, devido à impossibilidade de
adesão de queratinócitos, levando a um acúmulo de Ca2+ no citoplasma dessas
células. Mutações que levam a essa doença são mostradas na Figura 8 (Hu et
al., 2000; Ton et al., 2002; Ton & Rao, 2004). A Ca2+-ATPase de vias secretórias
apresenta várias isoformas SPCA1 (SPCA1a, SPCA1b, SPCA1c e SPCA3) e
SPCA2 codificadas por dois genes (Sepúlveda et al., 2007).

2+ 2+
Figura 8. Mutações em humano da doença de Hailey – Hailey na Ca -Mn ATPase (hSPCA1), o
D350 é sítio catalítico para a formação do intermediário fosforilado. (Adaptado de Ton & Rao,
2004)
 25

6.3 Ca2+-ATPase de Retículo Sarco(endo)plasmático(SERCA):

A bomba de Ca2+ SERCA foi descoberta em 1961, quando frações do
retículo sarcoplasmático mostraram acúmulo de Ca2+ às custas de ATP (APUD
Carafoli & Brini, 2000). Essa descoberta está intimamente associada ao estudo
do mecanismo de contração muscular, no qual a SERCA transporta Ca2+ do
citoplasma da célula para o lúmen do retículo promovendo, assim, o relaxamento
das fibras esqueléticas (Hasselbach & Oetliker, 1983; De Meis, 1991). A SERCA
também é uma ATPase do tipo-P formando durante o seu ciclo catalítico um
intermediário fosforilado. Durante o ciclo de hidrólise de ATP e transporte de
Ca2+, a enzima transita entre duas conformações: E1, de alta afinidade de ligação
pelo Ca2+ e E2, de baixa afinidade de ligação (Figura 9 e 11).

Figura 9. Modelo Cinético da Bomba SERCA: mostrando múltiplos estados conformacionais

2+ 2+
para o transporte do Ca , (E2) – Estado conformacional da enzima de baixa afinidade pelo Ca
2+
(E1) – Estado conformacional da enzima de alta afinidade pelo Ca . (Adaptado Periasamy e
Kalyanasundaram, 2007).
 26

As isoformas da família SERCA são proteínas com 10 domínios

transmembranares, de aproximadamente 110 KDa (Periasamy & Huke, 2001)
(Figura 10). Já foram descritas três isoformas principais que são denominadas
SERCA1, SERCA2 e SERCA3, representando os produtos de diferentes genes.
Estas isoformas apresentam um alto grau de homologia a nível estrutural (75-
85%) e diferem principalmente nos domínios catalíticos e na região C-terminal
(Lytton el al., 1992; Martonosi & Pikula, 2003; Prasad et al., 2004).
Alterações nos genes que codificam as proteínas SERCA provocam
doenças genéticas. Entre elas: a doença de Brody’s, que é uma desordem na
função do músculo esquelético, provocada por mutação no gene que codifica a
proteína SERCA1 e a doença de Darier’s, que é uma mutação no gene da
SERCA2, que provoca uma alteração de pele, caracterizada pela perda de
adesão entre as células epidermais e queratinização anormal (Carafoli & Brini,
2000; Dhitavat et. al., 2003).
O gene da SERCA1 codifica duas isoformas por corte alternativo,
SERCA1a e SERCA1b, que diferem somente em um pequeno número de
aminoácidos na região C-terminal. SERCA1b é expressa no estágio de
desenvolvimento fetal/neonatal do músculo esquelético de contração rápida e é
gradualmente substituída pela isoforma SERCA1a em músculo adulto de
contração rápida. O gene SERCA2 também codifica as isoformas SERCA2a e
SERCA2b. A proteína SERCA2a é a única que termina com 4 aminoácidos e a
SERCA2b tem uma extensa seqüência hidrofóbica com 49 aminoácidos na região
C-terminal. A isoforma SERCA2b é uma proteína onipresente e é encontrada
associada com IP3 ligada ao Ca2+. A SERCA2a é uma isoforma expressa
principalmente no coração, no músculo de contração lenta e em menor
quantidade na musculatura lisa. (Periasamy & Huke, 2001; De Luca et al., 1998).
A SERCA3, tem menor afinidade por Ca2+, e sua função é pouco entendida (Bobe
et al, 2004). Está presente em plaquetas, células endoteliais, linfóides e
mastócitos (De Luca et al., 1998). Naturalmente, todas as isoformas
compartilham de propriedades básicas na reação de transporte, (isto é, afinidade
 27

pelo Ca2+e ATP). A isoforma SERCA2b tem alta afinidade pelo Ca2+ e baixa
velocidade de “turnover” e transporte de Ca2+. A isoforma SERCA3 tem uma
afinidade reduzida pelo Ca2+ e alta afinidade por ortovanadato, as isoformas
SERCA1 e SERCA2a apresentam a mesma sensibilidade. O domínio de ligação
do nucleotídeo parece ser crítico na determinação destas diferenças (Carafoli &
Brini, 2000). Quando a bomba transporta Ca2+ para dentro do retículo, transporta
juntamente H+ para fora por ciclo, provocando alcalinização do lúmen do retículo
(Carafoli & Brini, 2000). As diversas isoformas da SERCA apresentam diferentes
respostas ao pH (Wolosher et al., 1997). Em pH neutro, todas as isoformas da
SERCA possuem praticamente a mesma afinidade pelo Ca2+. Um decréscimo do
pH de 7,0 para 6,0 diminui a afinidade ao Ca2+ em todas as isoformas. Com
SERCA1 este efeito é de 5 a 10 vezes menor do que o observado com todas as
outras isoformas. A acidificação do meio diminui a velocidade máxima de
hidrólise e de captação de Ca2+ nas diferentes isoformas SERCA (Wolosher et
al., 1997). Dependendo da isoforma SERCA, o pH também regula a velocidade
do efluxo passivo de Ca2+. A velocidade do efluxo passivo de Ca2+ ou
extravasamento de Ca2+ através de canais de Ca2+ presentes em vesículas do
músculo esquelético e cardíaco (ou através da própria bomba de Ca2+) é a
mesma em pH 6,0 e 7,0 (Engelender & De Meis, 1996). Em contraste, a
velocidade do efluxo de Ca2+ das vesículas de plaqueta e de cerebelo aumenta
duas vezes devido à acidificação do meio. É proposto que as diferenças cinéticas
entre as isoformas do tipo SERCA devem refletir diferentes adaptações à acidose
celular, como a que ocorre durante a isquemia (Wolosher et al., 1997).
 28

2+ 2+
Figura 10. Modelo de transporte de Ca pela Ca -ATPase de retículo sarcoplasmático
(Adaptado de Martonosi & Pikula, 2003).
 29

6.3.1. Reguladores endógenos da bomba:

Algumas substâncias são capazes de regular as SERCA, entre elas está o
fosfolamban, que interage com a SERCA reversivelmente (Marín et al.,1999)
(Figura 11). A forma desfosforilada do fosfolamban suprime a atividade da
SERCA, enquanto a forma fosforilada do fosfolamban, induzida pela proteína
cinase dependente de AMPc (PKA) ou proteína cinase dependente de
calmodulina (CaM), resulta em alterações na interação com a SERCA, levando à
dissociação e facilitando a transição estrutural da enzima para forma ativa (Koss
& Kranias, 1996). Com isso há aumento da razão do transporte de Ca2+ em duas
ou três vezes. Os resultados fisiológicos da desrepressão da SERCA é que os
íons Ca2+ são seqüestrados mais rapidamente pelo retículo, seguindo-se o
relaxamento rápido do músculo.
In vivo somente a atividade da isoforma SERCA2 é inibida por fosfolamban
não-fosforilado, quando expressa em células COS-1 (in vitro), as atividades
SERCA1, SERCA2a e SERCA2b são afetadas por fosfolamban (Figura 11). A
ausência de sensibilidade da isoforma SERCA1 pelo fosfolamban in vivo não é
devido a diferenças de seqüência de ligação do fosfolamban, mas a ausência de
expressão do gene do fosfolamban no músculo esquelético, onde essa isoforma
é preferencialmente expressa. O sítio de ligação para fosfolamban na isoforma
SERCA3 é muito diferente do que nas outras isoformas SERCA, explicando
porque SERCA3 não é inibida por esse pequeno polipeptídio (Fambrough & Inesi,
1996; Aubier & Viire, 1998). Outra proteína endógena, a sarcolipina, que é
confinada no retículo sarco(endo)plasmático, pode inibir a atividade da bomba
SERCA por diminuir a aparente afinidade do Ca2+ por essa proteína. Quando o
fosfolamban e a sarcolipina são co-expressos in vitro, suas inibições se tornam
sinérgicas, levando assim a uma superinibição. Isso pode ser atribuído a
habilidade da sarcolipina romper os pentâmeros do fosfolamban, aumentando
assim a quantidade de monômeros de fosfolamban disponíveis para a inibição
(Vangheluwe et al., 2005).
 30

6.3.2. Drogas inibidoras:

Existem substâncias capazes de bloquear as SERCA ATPases
especificamente. Os inibidores específicos das Ca2+-ATPases intracelulares
constituem ferramentas úteis no estudo molecular dos mecanismos das ATPases,
bem como nos estudos das funções celulares que são reguladas pelo Ca2+
citosólico (Inesi & Sagara, 1994)
A tapsigargina (Tg), uma lactona sesquiterpênica isolada do extrato da raiz
da Thapsia garganica, é o inibidor potente e específico das isoformas da família
SERCA, cujo mecanismo de ação é bem conhecido. A Tg, na faixa de nanomolar
de concentração, interage estequiometricamente com a conformação da enzima
na ausência de Ca2+ (E2) (Figura 11) e forma um complexo irreversível. Desta
forma, o nível de Ca2+ aumenta na célula (THASTRUP el al., 1987; THASTRUP
et al., 1990), e, em função da permeabilidade passiva (MASON et al., 1991), há
depleção dos estoques intracelulares de Ca2+ (JACKSON et al., 1988), inclusive
de “pools” sensíveis a IP3 e GTP (THASTRUP et al., 1990). Esvaziando os
estoques intracelulares de Ca2+, a Tg estimula a entrada do cátion, por intermédio
de canais na membrana plasmática, do meio extracelular para o citosol,
sustentando o modelo capacitativo de controle de Ca2+ intracelular (Putney, 1986;
Kwan et al., 1990).
Em 1996, Engelender & De Meis mostraram o extravasamento de Ca2+,
através da ATPase em vesículas de músculo esquelético de contração rápida
produzida de acordo com Electric & Inesi 1972 – SERCA1 (efluxo passivo).
Segundo os autores, a taxa deste evento descresce quando ligantes naturais da
bomba, como Ca2+ e Mg2+, estão presentes no meio, bem como Tg.
Existem ainda outros inibidores específicos das bombas da família
SERCA, tais como a tapsigargicina, um análogo químico da Tg retirado da
mesma planta e capaz de produzir efeitos similares da Tg (Inesi & Sagara, 1994),
ácido ciclopiazônico, 2,5-di(t-butil)hidroquinona e a 3’,3”,5’,5”-
tetraiodofenosulfoneftaleína. Todos depletam os estoques de Ca2+ intracelulares
 31

e, posteriormente, aumentam a permeabilidade da membrana plasmática a este

íon, sem que haja elevação dos níveis de IP3 intracelulares (Mason et al., 1991).
O ácido ciclopiazônico é um produto do metabolismo de fungos como
Aspergillus flavus e Penicillium cyclopium (Holzapfel, 1968) e constitui um potente
inibidor da atividade ATPásica e da captação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático
de músculo esquelético rápido de rato, o que é responsável por sua toxicidade
(Goeger et al., 1988).
A 2,5-di(t-butil)hidroquinona é utilizada na indústria como antioxidante e na
síntese de determinados corantes (Murphy et al., 1992). Moore et al (1987)
descreveram um efeito inibitório no transporte de Ca2+ em microssomas de
fígado, mas não na mitocôndria e nem na membrana plasmática.
A 3’,3”,5’,5”- tetraiodofenosulfoneftaleína é um indicador de pH, liga-se à
conformação da enzima complexada ao Ca2+, apresentando uma inibição não-
competitiva para a ativação da enzima pelo mesmo íon (Seino et al., 1994)
A heparina regular (1-10 µg/ml) desaclopa a síntese do ATP do efluxo de
Ca2+ no ciclo reverso da bomba e inibe a fosforilação da SERCA por fosfato
inorgânico (Pi), mas não tem efeito na fosforilação da mesma pelo ATP, no
retículo sarcoplasmático de músculo esquelético, na membrana citoplasmática de
células vermelhas sanguíneas e o sistema tubular denso de plaquetas. O efeito
da heparina nas Ca2+-ATPases de músculo é abolido por KCl e NaCl (100 nM) e
com menor potência por LiCl. As poliaminas espermina e espermidina e o
vermelho de rutênio são capazes de antagonizar o efeito da heparina (De Meis &
Suzano, 1994).

6.3.3. A Ca2+-ATPase no processo de degeneração/regeneração:

Durante o processo de degeneração/regeneração do músculo esquelético
há modificação na expressão das várias isoformas da bomba de Ca2+ da família
SERCA, como foi mostrado por vários autores. A alteração de expressão de
SERCA foi mostrada no processo de regeneração do músculo EDL de rato, após
a indução de necrose pela notexina, toxina essa isolada da serpente Australiana
(Mendler e cols., 1998; Zádor e cols., 1998). No primeiro estudo, foi demonstrada
 32

uma diminuição significativa da expressão de SERCA1, no músculo EDL de rato

(músculo de contração rápida), no decorrer do terceiro, quinto, sétimo e décimo
dia após a indução de necrose pela notexina, retornando aos níveis controles no
vigésimo primeiro e vigésimo oitavo dia. Já para a isoforma SERCA2, foi
demonstrado uma diminuição significativa da sua expressão em 3 dias, e um
aumento significativo de expressão no décimo dia, retornando aos níveis
controles no vigésimo primeiro e vigésimo oitavo dia (Mendler et al., 1998). Num
segundo estudo, utilizando o músculo soleus (músculo de contração lenta), foi
observado um aumento de expressão para ambas as isoformas (SERCA1 e
SERCA2a). Entretanto, ao final da regeneração (4 semanas) a expressão da
SERCA2 é maior, enquanto a isoforma SERCA1 é menor quando comparados
com a fibra controle (Zádor et al, 1998).
Schulte et al. (1994) mostraram um decréscimo da isoforma SERCA2a no
músculo soleus e uma diminuição de SERCA1 no músculo EDL, particularmente
nos últimos pontos de análise (28 dias) após desnervação. Já Germinario et al.
(2002) demonstraram uma troca de expressão no músculo soleus inervado após
indução de degeneração com a administração de bupivacaína. Esses autores
observaram um aumento da isoforma SERCA1 depois do quinto dia de
regeneração, porém, progressivamente, a expressão de SERCA1 foi substituída
por um aumento de expressão da isoforma SERCA2, que preferencialmente está
expressa no músculo de contração lenta normal (Germinario et al, 2002).
 33

Figura 11. Ciclo Enzimático proposto mimetizando os quatros estados fundamentais da

SERCA (E2) – Estado conformacional da enzima de baixa afinidade pelo Ca2+ (E1) – Estado
2+
conformacional da enzima de alta afinidade pelo Ca . PLN (fosfolamban), SLP (sarcolipina) e Tg
são conhecidas por inibir o a comformação E2 como indicada na figura acima (Adaptado de
Traaseth et al, 2008)
 34

OBJETIVOS
 35

Considerando que: 1- as miotoxinas ofídicas causam lesão muscular e que

a heparina é eficaz na regeneração destas lesões musculares (Melo et al,1993
Calil-Elias et al.,2002); 2- que a heparina alto peso molecular (1-10 µg/ml)
desacopla a síntese do ATP do efluxo de Ca2+ e inibe a fosforilação da SERCA
por fosfato inorgânico (Pi) no músculo esquelético (De Meis & Suzano, 1994); 3- e
que já se observou na literatura alterações de expressão das bombas da família
SERCA após administração de toxina extraída da serpente australiana, os
objetivos deste trabalho são:
1. Investigar a expressão das isoformas SERCA1 e SERCA2 no
músculo de contração rápida (Extensor digitorum longus/EDL) após
a indução de lesão com o veneno de B. Jararacussu;
2. Investigar a expressão das isoformas SERCA1 e SERCA2 no
processo de regeneração muscular do músculo EDL, após o
tratamento com a heparina;
3. Avaliar o efeito do veneno B. Jararacussu na atividade
Ca2+-ATPásica presente no músculo EDL;
4. Avaliar a atividade das Ca2+-ATPases no processo de regeneração
do músculo EDL, após a lesão do veneno e tratamento com a
heparina.
 36

METODOLOGIA
 37

1-Administração do Veneno e Tratamento com a Heparina

(HMWH):

Camundongos suíços albinos machos e fêmeas adultos, pesando cerca

de 25.0 ± 5.0g, foram divididos aleatoriamente em 3 grupos (controle, veneno e
veneno + heparina) com 3 animais cada grupo. Todos os animais eram
anestesiados com éter. Nos grupos de animais veneno e veneno + heparina o
veneno bruto (1,0 µg/g em 50 µl de solução salina fisiológica – PSS) era
administrada por injeção perimuscular na pata direita de cada animal. O veneno
era administrado junto à tíbia procurando-se administrar a solução próxima ao
músculo extensor digitorium longus (EDL), de forma que a solução contendo
veneno pudesse banhar o músculo externamente. Desta forma evita-se a lesão
mecânica (através da agulha da seringa) do músculo EDL, que sofria apenas
lesão induzida pela exposição ao veneno que o banhava (Melo & Ownby, 1999).
O grupo veneno + heparina era tratado por via intravenosa, 15 min e 4 h após a
injeção do veneno, com a Heparina de Alto Peso Molecular (10.0 µg/g em 100 µl
de solução salina fisiológica – PSS). A dose de heparina para efeito protetor
miotóxico foi anteriormente determinada por Calil-Elias et al,(2002a). No grupo
controle administra-se somente a injeção da solução salina fisiológica na pata
direita (50 µl). Esquema ilustrativo é representado na figura 12.
 38

Camundongos
suíços
25.0±
±5.0g

Grupo Grupo Grupo

Controle Veneno Veneno + Heparina

Injeção perimuscular Injeção perimuscular Injeção perimuscular

50 µL PSS 1µg/g veneno 1µg/g veneno
em 50 µL PSS em 50 µL PSS

15 min

Heparina I.V.
10µg/g em 100µL PSS
4 horas

Heparina I.V.
10µg/g em 100µL PSS

Após 1, 3, 7 e 21 dias
Dissecação do EDL e
Obtenção do
Homogeneizado Tecidual

Figura 12. Modelo esquemático da administração do veneno e posterior tratamento com a

Heparina.
 39

2-Obtenção do homogeneizado do músculo Extensor digitorium

longus (EDL) de camundongo ou rato:
Em intervalos de 1, 3, 7 e 21 dias após a injeção do veneno os
camundongos foram anestesiados com éter e sacrificados por deslocamento
cervical, de acordo com a Comissão de Avaliação do Uso de Animais em
Pesquisa (CAUAP) do CCS/ UFRJ. Os músculos (EDL) então, foram dissecados,
secos, pesados e cortados com auxílio de uma tesoura e em seguida
homogeneizados em 1,5 ml meio de homogeneização (camundongos) e na
proporção de 1 g tecido para 8 ml de meio de homogeneização (ratos), no qual
contém: sacarose 250 mM; Tris 5 mM; DTT 2 mM; PMSF 0,2 mM; antipaína 2
µg/ml; aprotinina 5µg/ml; EDTA 1 mM, pH 7,3 - 7,4. O processo de
homogeneização foi realizado três vezes durante 30 segundos, com intervalos de
20 segundos cada, em um homogeneizador motorizado (ultraturrax) na
velocidade de 25.000 RPM. Em seguida, o homogeneizado foi ultracentrifugado à
108.000 x g por 1 hora (ultracentrífuga Sorvall). O homogeneizado
ultracentrifugado obtido foi ressuspenso em uma solução contendo: sacarose 250
mM, Tris 5mM, PMSF 0,2 mM, antipaína 2 µg/ml, aprotinina 5 µg/ml, pH 7,3 – 7,4
para posterior armazenamento. O mesmo procedimento foi realizado usando-se
ratos adultos wistar, para realizar os ensaios de atividade Ca2+-ATPásica in vitro.
Os homogeneizados obtidos de camundongos foram armazenados no Freezer (-
20°C) e os homogeneizados obtidos a partir de ratos foram armazenados em
nitrogênio líquido (-196°C). (Figura 13)
 40

Músculo EDL (extensor digitorium longus)

(camundongos ou ratos)

Fracionamento dos tecidos (6 mg ou 1 g)

Meio de homogeneização (1,5 ml ou 8 ml)

(Sacarose 250 mM, Tris 5 mM, DTT 2mM,PMSF 0,2 mM, Antipaína 2 µg/ml,
Aprotinina 5 µg/ml, EDTA 1mM, pH 7,3-7,4)

Homogeneização em ultraturrax (25.000 rpm)

Ultracentrifugação 108.000 x g / 1 h

Ressuspensão
(Meio de ressuspensão: Sacarose 250 mM, Tris 5 mM, PMSF 0,2 mM,
Antipaína 2 µg/ml, Aprotinina 5 µg/ml, pH 7,3-7,4)
Freezer
Camundongos
Dosagem de Proteína (método de Lowry)
N2
Ratos

Figura 13. Esquema de preparação do EDL de rato ou camundongos.

 41

3-Ensaio de SDS-PAGE & Western Blot:

SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida) foi realizada de acordo
com Laemmli (1970). 10 µg de proteína foi aplicada em cada slot, em 2 géis de
poliacrilamida 7,5 % (amperagem constante e voltagem em torno de 80 V, fonte
BioRad) e transferidas para membrana de nitrocelulose por 60 minutos (com
voltagem constante - 50 v). Em seguida as diferentes bandas protéicas aderidas
na membrana de nitrocelulose foram coradas com o reativo Vermelho de
Ponceau. Após a visualização da transferência, as membranas foram incubadas
durante 60 minutos em uma suspensão de leite em pó desnatado 5% em tampão
TBS-T (10 mM Tris; NaCl 68,4 mM e Tween-20 0,1%, pH 7,6), afim de bloquear
os sítios inespecíficos de ligação. Na seqüência foram lavadas com TBS-T e as
membranas para SERCA 1 foram incubadas “overnight” com anticorpo IgG
monoclonal anti-SERCA 1 na diluição 1:4000 e anti-SERCA 2 na diluição 1:1500
(anticorpos primários). Em seguida as duas membranas foram novamente
lavadas com TBS-T e expostas por 60 minutos ao anticorpo contra IgG
monoclocal de camundongo conjugado a peroxidase com diluição de 1:18000-
30000 (anticorpo secundário). Nas etapas de lavagens com TBS-T, foram
realizadas a primeira de 15 minutos e as duas últimas de 5 minutos. A revelação
foi realizada utilizando-se sistema de detecção por quimioluminescência (ECL) e
exposição ao filme fotográfico (Figura 14). E a intensidade das bandas protéicas
imudetectadas foram analisadas pelo programa de imagens Scion. Os controles
utilizados foram a preparação pesada de músculo esquelético de contração
rápida de rato (HSR)-(SERCA 1), preparada de acordo com Electric & Inesi
(1972) e a preparação microssomal de coração de rato (Ms-Cor)-(SERCA 2a),
preparada de acordo com Wibo et al., (1991).
 42
Transferência

Membrana de
Nitrocelulose

bloqueio
lavagens
ac-primário
ac-secundário

Imunomarcação

Figura 14. Modelo esquemático do ensaio de SDS-PAGE e western-blot.

4-Medida da atividade Ca2+- ATPásica do EDL de camundongos

tratados com heparina, após a administração do Veneno de B.
jararacussu:
As preparações enzimáticas Controle, Veneno e Veneno + Heparina (10-20
µg de proteína) foram incubadas a 37ºC por uma hora em 500 µl de meio de
incubação contendo HEPES 50 mM; EGTA 0,3 mM; NaN3 10 mM; MgCl2 4 mM;
KCl 60 mM; ATPNa2 5 mM; pH 7,4; Ca2+ livre 10 µM. A reação foi iniciada pela
adição das respectivas proteínas e finalizada 60 minutos após com a adição de 1
ml de solução de Fiske & Subbarow gelada. Após 20 minutos foi realizada a
 43

leitura da reação colorimétrica no espectrofotômetro, no comprimento de onda de

luz visível (650 nm). A atividade ATPásica foi determinada pela medida do fosfato
inorgânico (Pi) liberado pela hidrólise enzimática do ATP (µmol Pi.mg-1.h-1)(Fiske
& Subbarow, 1925). A atividade ATPásica estimulada pelo Ca2+ na presença de
Mg2+ 4 mM foi calculada subtraindo a atividade ATPásica basal (medida na
ausência de Ca2+ e presença de Mg2+) da atividade ATPásica total (medida na
presença de Ca2+ e Mg2+).

5-Medida da atividade Ca2+-ATPásica de EDL de rato:

A proteína (10-25 µg) foi incubada na presença ou ausência do veneno de B
jararacussu (0,1; 1,0 e 10 µg/ml) a 37ºC por uma hora em 500 µl de um meio de
incubação contendo HEPES 50 mM; EGTA 0,3 mM; NaN3 10 mM; MgCl2 4 mM;
KCl 60 mM; ATPNa2 5 mM pH 7,4; Ca2+ livre 10 µM. A reação foi iniciada pela
adição da proteína e finalizada 60 minutos após com a adição de 1 ml de solução
de Fiske & Subbarow gelada. Após 20 minutos foi realizada a leitura da reação
colorimetrica no espectrofotômetro, no comprimento de onda de luz visível (650
nm). A atividade ATPásica foi determinada pela medida do fosfato inorgânico (Pi)
liberado pela hidrólise enzimática do ATP (µmol Pi.mg-1.h-1)(Fiske & Subbarow,
1925). A atividade ATPásica estimulada pelo Ca2+ foi calculada subtraindo a
atividade ATPásica basal (medida na ausência de Ca2+ e presença de Mg2+) da
atividade ATPásica total (medida na presença de Ca2+ e Mg2+).

6-Dosagem de proteína:
O conteúdo de proteína das preparações de homogeneizado
ultracentrifugado de EDL de camundongos ou ratos foi determinado através do
método de Lowry et al.,(1951), usando-se albumina sérica bovina como padrão.
O teor de proteína das amostras foi estimado pela equação da reta de regressão
linear dos padrões e expresso em mg de proteína.mL-1.
 44

7-Preparo das soluções de Ca2+:

As soluções de Ca2+ utilizadas no ensaio foram preparadas de acordo com a
concentração de Ca2+ livre desejada no meio de incubação, baseando-se no
programa de computador elaborado por Fabiato & Fabiato (1979). Este programa
de computador considera a interação do Ca2+ com determinados compostos
presentes no meio segundo as constantes de associação Orentlincher para
CaEGTA e MgEGTA.

8-Reagentes:
O veneno de Bothrops jararacussu foi gentilmente cedido pelo Instituto Vital
Brazil (Niterói-RJ), enquanto a heparina de alto peso molecular (HMWH - PM
20000-30000 Da, extraída da mucosa intestinal do porco, conforme informação
do fabricante) e o anticorpo primário anti-SERCA2, foram obtidos da Sigma
Chemical Co. St. Louis. E.U.A. O anticorpo primário anti-SERCA1 foi obtida da
Calbiochem, e o anticorpo secundário foi adquirido da Promega. Os sais e
reagentes utilizados foram todos de grau analítico.

9-Tratamento estatístico:
Os dados do ensaio de atividade ATPásica foram apresentados sob a
forma de média ± erro padrão da média (EPM) em valores absolutos. As
comparações estatísticas foram feitas pelo Prism GraphPad (Software, Inc.),
neste caso os dados foram tratados pelo método de variância (“One-way ANOVA,
Tukey’s test”) e a significância p<0,05.
Os dados dos western blotting foram apresentados na forma de média ±
erro padrão da média (EPM) em valores percentuais. As comparações
estatísticas foram realizadas pelo programa SigmaStat 9.0. Neste caso os dados
foram tratados pelo método de análise de variância (“Two-way ANOVA,
Bonferroni t-test”), estudando, assim, duas variáveis: o efeito tempo
(regeneração) e o efeito do tratamento com heparina.
Os resultados foram representados graficamente através do programa de
computador SigmaPlot 9.0.
 45

RESULTADOS
 46

1. Expressão das isoformas SERCA1 e SERCA2, no músculo

EDL, após a injeção perimuscular do
veneno B. jararacussu e posterior tratamento com a heparina

Com a finalidade de estudar a regeneração do músculo EDL, coletamos os

músculos em intervalos de 24h, 3, 7 e 21 dias.

A figura 15 (A e B) ilustra a expressão da isoforma SERCA1, 24h após a

indução de necrose pelo veneno B. jararacussu e posterior tratamento com a
heparina. O painel A mostra o decréscimo da expressão de SERCA1 tanto na
presença somente do Veneno (Ven) quanto após a administração do veneno e
posterior tratamento com a heparina (V + H). Nos grupos (Ven) e no grupo (V +
H) podemos observar bandas inumomarcas com baixo peso molecular indicando
proteólise da isoforma da bomba de Ca2+ SERCA1. Em B pode-se observar uma
diminuição significativa de expressão de SERCA1 por análise densitométrica. A
expressão de SERCA1 é 36,7 ± 5,7% após a administração do veneno e 38,6 ±
10,4% após a administração do Veneno e tratamento com a heparina em relação
ao controle 100% (P < 0,05, n=5 e n=3, respectivamente).
 47

A B
1,5

Unidades Arbitrárias
1,0

0,5
* *

0,0
Veneno
Controle Veneno +
Heparina

Figura 15. Expressão da isoforma SERCA 1, 24h após a indução de necrose pelo veneno B. jararacussu (1µg/g), e
tratamento com HMWH (10 µg/g). O painel A mostra as bandas específicas imunomarcadas, após a adição do
anticorpo primário (anti - SERCA 1 - dil. 1:4000) e do anticorpo secundário (dil. 1:18000), Cont (grupo controle),
Ven (grupo veneno), V+H (grupo veneno + Heparina). O painel B mostra a quantificação por análise densitométrica
da expressão da isoforma SERCA1, * indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05, Two-way ANOVA,
Bonferroni t-test, n ≥ 3).
 48

Já a figura 16 ilustra a expressão de SERCA 1, 3 dias após a indução de

necrose pelo veneno e posterior tratamento com a heparina, O painel A mostra
uma diminuição da expressão da isoforma SERCA1 tanto após o tratamento com
a Heparina (V + H) quanto após a administração somente do veneno (Ven). No
grupo (Ven) e (V + H) podemos observar bandas inumomarcas com baixo peso
molecular indicando a ocorrência de proteólise da bomba SERCA1. Em B,
analisando a densitomentria observa-se uma diminuição estatisticamente
significativa da expressão de SERCA1. A expressão de SERCA1 é 58,5 ± 5,0%
após a administração do veneno e é 47,3 ± 11,7% após a administração do
veneno e tratamento com a heparina em relação ao controle 100% (P < 0,05, n =
4 e n=3, respectivamente).

A B
1,5
Unidades Arbitrárias

1,0

* *
0,5

0,0
Veneno
Controle Veneno +
Heparina

Figura 16. Expressão da isoforma SERCA 1, 3 dias após a indução de necrose pelo veneno B. jararacussu
(1µg/g), e tratamento com HMWH (10 µg/g). O painel A mostra as bandas específicas imunomarcadas, após a
adição do anticorpo primário (Anti -SERCA 1 - dil. 1:4000) e do anticorpo secundário (dil. 1:18000), Cont (grupo
controle), Ven (grupo veneno), V+H (grupo veneno + HMWH). O painel B mostra a quantificação por análise
densitométrica da expressão da isoforma SERCA1, * indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05, Two-
way ANOVA, Bonferroni t-test, n ≥ 3).
 49

A figura 17 mostra a expressão da isoforma SERCA1, 7 dias após a

indução de necrose e posterior tratamento com a heparina. O painel A mostra
que a expressão SERCA1 é semelhante aos níveis controles. No grupo (Ven)
podemos observar uma leve marcação com baixo peso molecular indicando uma
possível proteólise E a análise densitométrica no painel B confirma que as
unidades arbitrárias giram em torno de 100%, após a administração do veneno
93,2 ± 15,1% (P > 0,05, n = 5) ou após a administração do veneno e tratamento
com a heparina 93,3 ± 25,2% (P > 0,05, n = 3), mostrando assim um retorno aos
níveis controles.

A B

1,5
Unidades Arbitrárias

1,0

0,5

0,0
Veneno
Controle Veneno +
Heparina

Figura 17. Expressão da isoforma SERCA 1, 7 dias após a indução de necrose pelo veneno B. jararacussu
(1µg/g), e tratamento com HMWH (10 µg/g). O painel A mostra as bandas específicas imunomarcadas, após a
adição do anticorpo primário (anti -SERCA 1 - dil. 1:4000) e do anticorpo secundário (dil. 1:18000), Cont (grupo
controle), Ven (grupo veneno), V+H (grupo veneno + Heparina). O painel B mostra a quantificação por análise
densitométrica da expressão da isoforma SERCA1.
 50

A figura 18 mostra a expressão de SERCA1, 21dias após a indução de

necrose e posterior tratamento com heparina, o painel A mostra a expressão de
SERCA1, e o painel B mostra os valores de densitometria de 108,7 ± 15,8% (P >
0,05, n = 4), e 98,4 ± 25,2% (P > 0,05, n = 3), para os grupos Veneno e Veneno +
Heparina, respectivamente. Esses valores de unidades arbitrárias são
semelhantes aos controles (100%).

A B
1,5
Unidades Arbitrárias

1,0

0,5

0,0
Veneno
Controle Veneno +
Heparina

Figura 18. Expressão da isoforma SERCA 1, 21 dias após a indução de necrose pelo veneno B. jararacussu
(1µg/g), e tratamento com HMWH (10 µg/g). O painel A mostra as bandas específicas imunomarcadas, após a
adição do anticorpo primário (anti -SERCA 1 - dil. 1:4000) e do anticorpo secundário (dil. 1:18000), Cont (grupo
controle), Ven (grupo veneno), V+H (grupo veneno + Heparina). O painel B mostra a quantificação por análise
densitométrica da expressão da isoforma SERCA1.
 51

A figura 19 mostra a expressão da isoforma SERCA1 nos grupos Veneno

+ Heparina pata direita e veneno + Heparina pata esquerda. Isso foi feito para
averiguar o efeito da heparina na expressão de SERCA1, na pata contralateral
durante o processo de regeneração (24h, 3, 7, 21 dias). Verificamos que não há
diferença estatísticamente significativa entre os grupos Veneno + Heparina (pata
direita) e Veneno + Heparina (pata contralateral) durante todo o período de
regeneração, mas em 1 e 3 dias observa-se uma diminuição significativa dos
níveis de expressão de SERCA1 em relação aos controles (100%). A expressão
de SERCA1 no grupo Veneno + Heparina pata esquerda 44,5 ± 7,0% (P < 0,05, n
= 3) e 48,3 ± 11,5% (P < 0,05, n = 3), em 1 e 3 dias, respectivamente, em relação
aos seus controles.

1,5
Veneno + Heparina (direita)
Veneno + Heparina (esquerda)
Unidades Arbitrárias

1,0 -----------------------------------------------------------------------------------------

# #
0,5
# #

0,0
1 dia 3 dias 7 dias 21 dias

Figura 19. Expressão da isoforma SERCA1, 1, 3, 7, 21 dias nos animais após administração de
veneno de B. jararacussu na pata direita (1µg/g - Injeção perimuscular) e posterior tratamento
com HMWH (10 µg/g – I.V), anticorpo primário (Anti - SERCA 1 - dil. 1:4000) e do anticorpo
secundário (dil. 1:18000), # indica diferença estatisticamente significativa (p<0,05, Two-way
ANOVA, Bonferroni t-test, n ≥ 3) em relação ao grupo controle 1 UA.
 52

A figura 20 ilustra o perfil de expressão da isoforma SERCA1, no decorrer

da regeneração muscular. Em A, observa-se a expressão de SERCA1, após a
administração do veneno e em B, após a administração do veneno e posterior
tratamento com a heparina. Os gráficos mostram perfis semelhantes. O tratamento
com a heparina, um antagonista da atividade miotóxica de muitos venenos de
serpentes, não modifica o perfil de regeneração da isoforma SERCA1, quando
comparado com o grupo de animais que sofreram a administração do veneno
sozinho. Já quando avaliamos o tempo no decorrer da regeneração verificamos
que há influência. Como se observa na figura 20 (A) – Veneno - o tempo 1 dia é
estatisticamente diferente de 7 e 21 dias, já o tempo 3 dias é diferente de 21 dias ,
o tempo 7 dias é diferente de 1 dia, e 21 dias é diferente de 1 dia e 3 dias. Em (B)
– veneno + heparina apresenta o mesmo perfil de regeneração do veneno sozinho
em relação ao fator tempo.

A B
1,5 1,5 Controle
Controle Veneno + Heparina
Veneno
Unidades Arbitrárias
Unidades Arbitrárias

c
1,0 1,0 c
b,c b,c

a,b
0,5 0,5
* a,b
a a
*
* *
0,0 0,0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20

Dias Dias

Figura 20. Curso temporal da isoforma SERCA1 após a indução de necrose pelo veneno B. jararacussu (1µg/g) e
tratamento com HMWH (10 µg/g). (A) veneno e (B) veneno + heparina. * indica diferença estatisticamente
significativa no fator necrose/tratamento (p<0,05, Two-way ANOVA, Bonferroni t-test, n ≥ 3) em relação ao controle;
a,b,c indicam diferença estatisticamente significativa no fator tempo (p<0,05, Two-way ANOVA, Bonferroni t-test, n
≥ 3).
 53

A fim de pesquisar se o músculo de contração rápida o EDL, utilizaria um

mecanismo compensatório, ao decréscimo da isoforma SERCA1, resolvemos
estudar a isoforma de turnover lento SERCA2, presente em menor proporção no
músculo EDL normal. Na figura 21, no primeiro dia após a indução de necrose e
posterior tratamento com a heparina, houve um aumento significativo para 333,3
± 18,9% (P < 0,05, n = 6) e 343,3 ± 63,1% (P < 0,05, n = 5), respectivamente,
nos níveis de expressão de isoforma SERCA2 em relação ao controle (100%).

A B
8

7
Unidades Arbitrárias

4 *
*
3

0
Veneno
Controle Veneno +
Heparina

Figura 21. Expressão da isoforma SERCA 2, 24h após a indução de necrose pelo veneno B. jararacussu (1µg/g), e
tratamento com HMWH (10 µg/g). O painel A mostra as bandas específicas imunomarcadas, após a adição do
anticorpo primário (anti -SERCA 2 - dil. 1:1500) e do anticorpo secundário (dil. 1:18000-30000), Cont (grupo
controle), Ven (grupo veneno), V+H (grupo veneno + HMWH). O painel B mostra a quantificação por análise
densitométrica da expressão da isoforma SERCA2, * indica diferença estatisticamente significativa (p<0,05, Two-
way ANOVA, Bonferroni t-test, n ≥ 3).
 54

A figura 22 ilustra a expressão de SERCA2 no terceiro dia após a

indução de necrose pelo veneno e tratamento com a heparina. Observa-se no
painel A um claro aumento da expressão da isoforma SERCA2,. Em B observa-
se que a expressão é significativamente maior em relação ao controle (100%),
com valores de densidade de 544,1 ± 54,9% (P < 0,05, n = 5) e 636,2 ± 67,9% (P
< 0,05, n = 4) para os grupos veneno e veneno + heparina, respectivamente.

A B

7 *
Unidades Arbitrárias

6 *
5

0
Veneno
Controle Veneno +
Heparina

Figura 22. Expressão da isoforma SERCA 2, 3 dias após a indução de necrose pelo veneno B. jararacussu
(1µg/g), e tratamento com HMWH (10 µg/g). O painel A mostra as bandas específicas imunomarcadas, após a
adição do anticorpo primário (anti -SERCA 2 - dil. 1:1500) e do anticorpo secundário (dil. 1:18000-30000), Cont
(grupo controle), Ven (grupo veneno), V+H (grupo veneno + HMWH). O painel B mostra a quantificação por análise
densitométrica da expressão da isoforma SERCA2, * indica diferença estatisticamente significativa (p<0,05, Two-
way ANOVA, Bonferroni t-test, n ≥ 3).
 55

A figura 23 mostra a expressão da isoforma SERCA2, no sétimo dia após

a indução de necrose pelo veneno e posterior tratamento com a heparina.
Observa-se um aumento de expressão significativo em relação ao controle
(100%), com valores de densidade de 452,3 ± 42,0% (P < 0,05, n = 6) e 474,3 ±
54,6% (P < 0,05, n = 4) nos grupos veneno e veneno + heparina,
respectivamente.

A B

7
Unidades Arbitrárias

5 * *
4

0
Veneno
Controle Veneno +
Heparina

Figura 23. Expressão da isoforma SERCA 2, 7 dias após a indução de necrose pelo veneno B. jararacussu
(1µg/g), e tratamento com HMWH (10 µg/g). O painel A mostra as bandas específicas imunomarcadas, após a
adição do anticorpo primário (anti -SERCA 2 - dil. 1:1500) e do anticorpo secundário (dil. 1:18000-30000), Cont
(grupo controle), Ven (grupo veneno), V+H (grupo veneno + HMWH). O painel da B mostra a quantificação por
análise densitométrica da expressão da isoforma SERCA2, * indica diferença estatisticamente significativa (p<0,05,
Two-way ANOVA, Bonferroni t-test, n ≥ 3).
 56

A figura 24 ilustra também a expressão de SERCA2, mas 21 dias após a

indução e necrose e posterior tratamento com a heparina. O painel B mostra que
os níveis de expressão de SERCA2 são de 173,48 ± 45,40% (n = 3) e 207,34 ±
10,27% (n = 8) para os grupos veneno + heparina e veneno, respectivamente.
Observando-se significância apenas para o grupo onde o veneno foi administrado
sozinho.

A B
8

7
Unidades Arbitrárias

2 *
1

0
Veneno
Controle Veneno +
Heparina

Figura 24: Expressão da isoforma SERCA 2, 21 dias após a indução de necrose pelo veneno B. jararacussu
(1µg/g), e tratamento com HMWH (10 µg/g). O painel A mostra as bandas específicas imunomarcadas, após a
adição do anticorpo primário (anti -SERCA 2 - dil. 1:1500) e do anticorpo secundário (dil. 1:18000-30000), Cont
(grupo controle), Ven (grupo veneno), V+H (grupo veneno + HMWH). O painel B mostra a quantificação por análise
densitométrica da expressão da isoforma SERCA2, a,b indica diferença estatisticamente significativa (p<0,05, Two-
way ANOVA, Bonferroni t-test, n ≥ 3).
 57

Com a finalidade de avaliarmos o efeito da heparina na expressão da

isoforma SERCA2, já que ela é administrada por via intravenosa, coletamos a
pata contralateral (pata esquerda), para verificarmos os níveis de expressão
dessa isoforma, durante o processo de regeneração muscular (24h, 3, 7 e 21
dias). Verificamos diferença estatisticamente significativa nos primeiro, terceiro e
sétimo dias e a quantificação por análise densitométrica é 80,5 ± 15,9%, 131,4 ±
16,1% e 257,1 ± 68,8%, nos dias 1, 3 e 7 dias, respectivamente (P < 0,05, n ≥ 3).
Já no sétimo dia há diferença também em relação ao controle 100% (P < 0,05, n
= 4). Enquanto no vigésimo primeiro dia não apresenta diferença nem em relação
à pata direta e nem o controle 100%.

9 Veneno + Heparina (direita)

Veneno + Heparina (esquerda)
8
#
Unidades Arbitrárias

6
#
5
#
4
*#
3

2
*
*
1 --------------------------------------------------------------------------------------

0
1 dia 3 dias 7 dias 21 dias

Figura 25: Expressão da isoforma SERCA2, 1, 3, 7, 21 dias nos animais após administração
veneno de B. jararacussu na pata direita (1µg/g - Injeção perimuscular) e posterior tratamento
com HMWH (10 µg/g – I.V), Anticorpo primário (Anti - SERCA 1 - dil. 1:4000) e anticorpo
secundário (dil. 1:18000). * indica diferença estatisticamente significativa (p<0,05, Two-way
ANOVA, Bonferroni t-test, n ≥ 3) em relação ao grupo veneno + heparina (direita). # indica
diferença estatisticamente significativa (p<0,05, Two-way ANOVA, Bonferroni t-test, n ≥ 3) em
relação ao grupo controle 1 UA.
 58

A figura 26 ilustra o perfil de regeneração (24h, 3, 7, 21 dias) da

expressão da isoforma SERCA2, no grupo Veneno (A) e no grupo Veneno +
Heparina (B). Observa-se um pico de aumento significativo de expressão de
SERCA2 no terceiro dia após a indução de necrose pelo veneno de B.
jararacussu (A) e após a administração e posterior tratamento com a heparina.
Mais uma vez verifica-se que apesar da heparina ser um antagonista de venenos
de serpentes, ela não alterou o perfil de regeneração para isoforma SERCA2.
Quando considera o fator tempo verifica-se o efeito tempo na regeneração e
influencia na expressão da isoforma SERCA2 em (A) – Veneno - o tempo 24h é
estatisticamente diferente de 3, 7 e 21 dias, já o tempo 3 dias é diferente de 24h
e 21 dias , o tempo 7 dias é diferente de 24h e 21 dias, e 21 dias é diferente de
24h, 3 e 7 dias. Em (B) – veneno + heparina todos os grupos (24h, 3, 7 e 21 dias)
são diferentes entre si.
A B
8 8
Controle Controle
7 Veneno 7 Veneno + Heparina
Unidades Arbitrárias

Unidades Arbitrárias

6 * 6 b
5 b * 5 *
c
4 b 4
*a *
3 3 a

*c *
2 2
d
1 1

0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20

Dias Dias

Figura 26. Curso temporal da isoforma SERCA2 após a indução de necrose pelo veneno B. jararacussu (1µg/g) e
tratamento com HMWH (10 µg/g). (A) veneno e (B) veneno + tratamento com heparina. * indica diferença
estatisticamente significativa no fator necrose/tratamento (p<0,05, Two-way ANOVA, Bonferroni t-test, n ≥ 3) em
relação ao controle; a,b,c indicam diferença estatisticamente significativa no fator tempo (p<0,05, Two-way
ANOVA, Bonferroni t-test, n ≥ 3).
 59

2. Efeito do veneno bruto de B. jararacussu na Atividade

Ca2+- ATPásica
Realizamos ensaios de hidrólise enzimática, com o intuito de observarmos
se o veneno de B. jararacussu era capaz de alterar a atividade Ca2+-ATPásica,
numa preparação de músculo de contração rápida, como o EDL de rato.
Utilizamos três concentrações crescentes de veneno 0,1, 1 e 10 µg/ml. A figura
27 ilustra a atividade Ca2+-estimulada controle é de 4,6 ± 0,7 µmol. Pi. mg-1.h-1. A
adição de concentrações crescentes do veneno de B. jararacussu (Bj) inibiu de
forma concentração dependente e estatisticamente significativa a atividade Ca2+-
ATPásica nestas preparações de rato (P < 0,05, n=6).

6 a,b
a
Atividade Ca2+- ATPásica

5
-1 -1
µmol Pi. mg . h

4
+

2 b,c

1
c
0
Bj Bj Bj
Controle
0,1µ
µg/ml 1µ
µg/ml 10µ
µg/ml

Figura 27. Efeito do Veneno bruto de B. jararacussu (Bj) na atividade Ca2+ -ATPásica, no músculo
de contração rápida Extensor digitorum longus (EDL) de rato. Os valores são a média das
2+
atividades estimuladas pelo Ca ± EMP; a,b,c indica a diferença estatisticamente significativa
(p<0,05, One way ANOVA, Tukey’s test, n = 6).
 60

3. Avaliação da Atividade Ca2+- ATPásica durante o processo de

regeneração muscular

Com o objetivo de verificarmos a viabilidade funcional das bombas de Ca2+

na preparação de EDL de camundongo durante o processo de regeneração
muscular realizamos ensaios de atividade enzimática nos 1, 3, 7 e 21 dias, após
a administração do veneno de B jararacussu e posterior tratamento com a
heparina. A figura 28 mostra que do primeiro ao sétimo dia observa-se uma
diminuição estatisticamente significativa da atividade Ca2+- estimulada no grupo
Veneno (0,15 ± 0,15 µmol Pi. mg-1.h-1, 0,12 ± 0,09 µmol Pi. mg-1.h-1 1,14 ± 0,14
µmol Pi. mg-1.h-1 P < 0,05, n ≥ 3). Entretanto, no grupo Veneno + Heparina
observa-se diminuição estatisticamente significativa na atividade Ca2+-ATPásica
somente 24h após a indução de necrose pelo veneno B. jararacussu e tratamento
com a heparina (0,19 ± 0,12 µmol Pi. mg-1.h-1, P < 0,05, n= 4).
 61

A 5 B
5

Atividade Ca2+- ATPásica

4 4
Atividade Ca2+- ATPásica

µmol Pi. mg-1. h-1

µmol Pi. mg-1. h-1

3 3

2 2

1 1

* * 0
*
0
Controle Veneno Veneno Veneno Veneno
Veneno Controle Veneno
+ + + +
Heparina Heparina Heparina Heparina
(direita) (esquerda) (direita) (esquerda)

C D

5 5
Atividade Ca2+- ATPásica
Atividade Ca2+- ATPásica

4 4
µmol Pi. mg-1. h-1

-1
µmol Pi. mg . h
-1

3 3

2 2

1
* 1

0 0
Veneno Veneno Veneno Veneno
Controle Veneno + + Controle Veneno + +
Heparina Heparina Heparina Heparina
(direita) (esquerda) (direita) (esquerda)

2+
Figura 28. Atividades Ca -ATPásica no músculo de contração rápida Extensor digitorum longus (EDL) de
camundongos, 24h(A), 3 dias (B), 7 dias (C) e 21 dias (D) após a indução de necrose pelo veneno B. jararacussu
(1µg/g), e posterior tratamento com HMWH (10 µg/g). Os valores são a média das atividades ± EMP; * indica a
diferença estatisticamente significativa (p<0,05, One way ANOVA, Tukey’s test, n ≥ 3).
 62

DISCUSSÃO
 63

Um dos grandes problemas dos acidentes ofídicos é a incapacitação

motora parcial ou total do membro atingido. Sabe-se que no Brasil o único
medicamento oficialmente aprovado pelo Ministério da Saúde para o tratamento
do envenenamento provocado por serpentes é o soro antiofídico. Porém, esse
previne a letalidade, mas não previne a mionecrose (Dos-Santos, et al., 1992;
Johnson & Ownby, 1993; Melo, et al, 1993). Para suprir a necessidade de um
tratamento adjuvante que previna a mionecrose foi proposta a heparina por ser
uma molécula carregada negativamente, que neutraliza por interação de cargas,
múltiplos cátions presentes no veneno de várias serpentes, como a B.
jararacussu, sugerindo então um efeito antagonizante ao efeito miotóxico do
veneno (Melo, et al, 1993; Calil-Elias, et al., 2002a). Lomonte et al., (1994)
demostraram que a heparina se liga na alça C-terminal da miotoxina II do veneno
de B. asper. Esta miotoxina é semelhante à Bothropstoxina I presente no veneno
de B. jararacussu.
Segundo Calil-Elias (2002a) a contagem do número de fibras musculares
no primeiro dia após a administração do veneno e posterior tratamento com a
heparina decai de forma semelhante, não sendo a heparina efetiva em preservar
as fibras musculares. Isso parece indicar que uma vez desencadeado o processo
de lesão pelos componentes do veneno, este não pode ser interrompido ou
revertido rapidamente. Já no terceiro dia a heparina passa a ser eficaz em
preservar muitas células musculares. No decorrer da regeneração, no sétimo dia
após a administração do veneno e tratamento com a heparina, a contagem de
fibras musculares é igual ao controle. Além disso, são observadas células
regeneradas, pois os núcleos estão centralizados. Já no vigésimo primeiro dia as
fibras musculares que receberam tratamento com a heparina desenvolvem
hiperplasia (Calil-Elias, et al., 2002a).
Sabe-se também que o primeiro local a ser lesado pelas miotoxinas é o
sarcolema, com a despolarização da célula muscular e influxo de íons Ca2+
seguido de rápido efluxo de enzimas citosólicas (Harris & Mackonell, 1981; Harris
& Maltin, 1982; Gopalakrishnakone et al., 1984; Gutiérrez et al., 1986; Ownby,
1990; Heluany et al., 1992; Johnson & Ownby, 1993; Gutiérrez & Ownby, 2003;
 64

Melo et al., 2004). Para bom funcionamento celular, as concentrações do íon

Ca2+ no interior das celulas devem ser finamente controladas. Em condições
basais, a concentração de Ca2+ no interior de organelas intracelulares e nos
fluidos extracelulares é elevada (na faixa milimolar) em oposição ao citoplasma,
no qual o nível de Ca2+ é baixo (na faixa submicromolar) (Berridge et al, 2000).
No início do nosso trabalho havia uma carência em se verificar como
estaria a homeostasia do Ca2+ intracelular durante o processo de regeneração
muscular. Várias organelas celulares estão envolvidas no controle do equilíbrio
dinâmico do Ca2+ intracelular, dentre elas o retículo sarcoplasmático, que pode
estocar altas concentrações de Ca2+. A função do retículo sarcoplasmático é
iniciar a contração muscular pela liberação de Ca2+ para dentro do citosol através
dos RyR e facilitar o relaxamento muscular pela recaptação ativa desse íon
principalmente pela SERCA (Periasamy e Kalyanasundaram, 2007). Tendo em
vista que as bombas da família SERCA são essenciais para o relaxamento
muscular, por restaurarem os estoques de Ca2+ intracelulares, iniciamos a
pesquisa de expressão das bombas da família SERCA, sabendo que existem
evidências na literatura para a alteração de expressão de SERCA no processo de
regeneração muscular após diferentes estímulos. Schulte et al. (1994)
demonstraram um decréscimo da isoforma SERCA2a no músculo soleus e uma
diminuição de SERCA1 no músculo EDL, particularmente nos últimos pontos de
análise (28 dias) após desnervação. Já Germinario et al. (2002) demonstraram
uma troca de expressão no músculo soleus inervado após indução de
degeneração com a administração de bupivacaína. Esses autores observaram
um aumento da isoforma SERCA1 depois do quinto dia de regeneração, porém,
progressivamente, a expressão de SERCA1 foi substituída por um aumento de
expressão da isoforma SERCA2, que preferencialmente está expressa no
músculo de contração lenta normal (Germinario et al, 2002).
Também já foi observada a alteração de expressão de SERCA no
processo de regeneração do músculo EDL de rato, após a indução de necrose
pela notexina, toxina essa isolada da serpente Australiana (Mendler e cols., 1998;
Zádor e cols., 1998). No primeiro estudo, foi demonstrada uma diminuição
 65

significativa da expressão de SERCA1 no decorrer da regeneração no terceiro,

quinto, sétimo e décimo dia após a indução de necrose pela notexina, retornando
aos níveis controles no vigésimo primeiro e vigésimo oitavo dia. Já para a
isoforma SERCA2, foi demonstrado uma diminuição significativa da sua
expressão em 3 dias, e um aumento significativo de expressão no décimo dia,
retornando aos níveis controles no vigésimo primeiro e vigésimo oitavo dia
(Mendler et al., 1998). Num segundo estudo, utilizando o músculo soleus
(músculo de contração lenta), foi observado um aumento de expressão para
ambas as isoformas (SERCA1 e SERCA2a). Entretanto, ao final da regeneração
(4 semanas) a expressão da SERCA2 é maior, enquanto a isoforma SERCA1 é
menor quando comparados com a fibra controle (Zádor et al, 1998).
A isoforma presente em maior quantidade no músculo de contração
rápida, como o EDL de camundongos é a isoforma SERCA1. A porcentagem de
níveis mRNA da isoforma SERCA1/SERCAtot é de 98,5 ± 4,0 % nesse tecido
(Vangheluwe et al, 2005). Conhecendo a importância da SERCA1 no músculo
esquelético de contração rápida, iniciamos os nossos estudos sobre a expressão
desta isoforma durante o processo de regeneração muscular, após a
administração do veneno de B. jararacussu e posterior tratamento com a
heparina. Verificamos que em 24 horas há uma queda na expressão de SERCA1
estatisticamente significativa, tanto do grupo veneno quanto do grupo veneno +
heparina (35 – 40% em relação ao controle). Isso mostra um efeito do veneno
muito rápido na expressão, e que a heparina não apresenta nenhum efeito
antagonista ao efeito do veneno no tempo de 24 horas. Também percebemos a
presença de uma banda de baixo peso molecular tanto para o grupo Veneno,
quanto para o grupo Veneno + Heparina indicando a ocorrência de proteólise
relacionada à destruição ou fragmentação da bomba SERCA1. Como o músculo
de contração rápida necessita de rápida mobilização e remoção de Ca2+ para os
estoques intracelulares, provavelmente em 24 horas a fisiologia normal do EDL
está comprometida, pois os níveis de expressão de SERCA1 (isoforma com
“turnover” rápido) se encontram diminuído. Três dias após a produção de necrose
o padrão degenerativo sobre SERCA1 foi semelhante ao de 24h, apresentando
 66

uma leve recuperação (figura 20). Nossos dados estão de acordo com o trabalho
de Mendler et al. (1998), onde demonstraram uma diminuição significativa de
SERCA1 nesse mesmo dia do processo necrose/regeneração induzida pela
notexina.
No sétimo dia após a indução de necrose a expressão da isoforma
SERCA1 já retorna aos níveis controles, nos grupos veneno e veneno + heparina,
esse retorno aos níveis controle, neste período, pode ser um retorno da isoforma
SERCA1b já que o anticorpo utilizado não distingue SERCA1a da SERCA1b,
podendo então o músculo voltar aos padrões de genes fetais. Dados da literatura
mostram que o processo de regeneração muscular estará completo antes da
quarta semana, quando são induzidos por venenos de serpentes (Fletcher et al.,
1997). Sabendo disso coletamos os músculos EDL, 21 dias após a indução de
necrose e posterior tratamento intravenoso com heparina, e observamos a
manutenção da expressão de SERCA1 como em 7 dias. Nossos dados estão de
acordo com Bigard et al. (2001) que demonstraram que após a indução de
necrose pela serpente Naja nigricollis, durante o processo de regeneração do
músculo contração rápida plantaris, a expressão de SERCA1 está igual aos
níveis controles na quarta semana após a injúria.
Durante a regeneração do músculo EDL, a expressão da isoforma
SERCA1 é semelhante na ausência ou na presença da heparina, um antagonista
conhecido das ações miotóxicas de venenos de serpentes (Higginbotham &
Karnella, 1970; Tinoco, 1972; Melo & Suarez-Kurtz, 1988a, 1988b; Melo et al.,
1993; Lomonte et al.,1994; Melo & Ownby, 1999; Boechat et al., 2001; Oshima-
Franco et al., 2001; Arruda et al., 2002; Calil-Elias et al., 2002a; De Oliveira et
al., 2003). Em nossos experimentos, a heparina é administrada por via
intravenosa, por isso quaisquer ações desse polianionte sulfatado sobre a
expressão de SERCA1 deveriam aparecer em nossos resultados. Entretanto,
observa-se que a heparina não altera o nível de expressão de SERCA1 durante a
regeneração muscular no período de tempo utilizado.
Os nossos resultados revelam que os níveis de expressão de SERCA1
são regenerados dentro do perfil descrito na literatura (Fletcher et al., 1997)
 67

(figura 20 A). Entretanto, como a técnica de Western-blot utilizada na análise da

expressão das isoformas SERCA mostra somente a presença da proteína, não
revelando nada sobre a atividade da isoforma SERCA1 (trabalho enzimático), não
podemos afirmar com certeza nesse ponto que essa isoforma está
completamente regenerada.
Sabendo que a isoforma SERCA2 também é expressa no músculo de
contração rápida, porém, em menor quantidade (no EDL de camundongos o nível
de mRNA da isoforma SERCA2/SERCAtot é de 2,5 ± 2,4 % (Vangheluwe et al,
2005)), resolvemos avaliar os níveis de expressão de SERCA2 após a indução de
necrose muscular com o objetivo de investigarmos se o músculo EDL utiliza um
mecanismo compensatório ao decréscimo de SERCA1. Verificamos que o
músculo usa desse mecanismo, porque ocorre um aumento de aproximadamente
300% da expressão de SERCA2 em 24h após a administração do veneno e
tratamento com a heparina. Após 3 dias, o aumento de expressão é ainda maior,
cerca de 500 – 600% e se mantém aumentado após 7 dias de indução de
necrose. Após 21 dias o nível de expressão dessa isoforma diminui para cerca de
200%, porém, no grupo veneno continua sendo significativamente maior do que
os níveis de expressão controles.
O aumento de SERCA2, observado nesse trabalho, revela a presença de
um mecanismo compensatório do músculo de contração rápida ao decréscimo de
SERCA1. Provavelmente, o músculo usa da isoforma de “turnover” lento
(SERCA2) para tentar de alguma forma suprir a carência da isoforma de turnover
rápido (SERCA1) (Lytton et al, 1992). Se compararmos os perfis de regeneração
muscular das duas isoformas SERCA1 e SERCA2 obervados nesse trabalho,
verificamos uma diminuição significativa, nos primeiros dias de SERCA1 e um
aumento significativo da isoforma SERCA2 no decorrer da regeneração (figuras
20A e 26A).
Como descrito anteriomente dados na literatura indicam que a isoforma
SERCA1 contribui muito mais para o relaxamento muscular no EDL de
camundongo do que isoforma SERCA2. Os nossos resultados mostram que no 3o
dia após indução de necrose, os níveis de expressão de SERCA2 aumentam
 68

mais do que dimininuem os níveis de expressão de SERCA1. Esse perfil

compensatório já foi reportado anteriormente, onde se descreveu uma diminuição
significativa de expressão nos primeiros dias de SERCA1 em contrapartida um
aumento significativo de expressão SERCA2 (Mendler et al., 1998).
A figura 19 mostra que não há diferença estatisticamente significativa na
expressão de SERCA1 entre os grupos veneno + heparina (pata direita) e veneno
+ heparina (pata esquerda ou contralateral), mas que há diferença
estatisticamente significativa entre os dois grupos em relação ao seu controle em
1 e 3 dias. Provavelmente, o veneno atingiu a corrente sanguínea e por
conseqüência a pata contralateral, diminuindo então a expressão de SERCA1 na
pata esquerda dos camundongos na mesma proporção. Sabe-se que a heparina
altera o funcionamento da bomba SERCA, pois já foi descrito que essa enzima
inibe o transporte de Ca2+ do retículo sarcoplasmático de músculo esquelético,
desacopla a síntese do ATP do efluxo de Ca2+ no ciclo reverso da bomba, e inibe
a fosforilação da Ca2+-ATPase por Pi (De Meis & Suzano, 1994).
Morfologicamente os músculos são completamente distintos, enquanto o músculo
EDL da pata direita está degenerado e o da pata esquerda tem uma aparência
íntegra. Outra hipótese seria que mesmo não tendo sido observado nenhum
efeito da heparina sobre a expressão de SERCA1 pode-se relacionar o efeito da
heparina com a alteração da expressão de SERCA1 na pata esquerda, pois foi
administrada por via intravenosa, supondo então que a pata direita está muito
danificada pelo veneno, e que a heparina não teria ação na pata direita destruída,
mas poderia ter ação na pata contralateral, então o efeito que estamos
observando da pata esquerda poderia ser efeito somente da heparina. Ou o
efeito do veneno observado na pata esquerda poderia ser dependente do tipo de
isoforma, mostrando uma sensibilidade maior da isoforma SERCA1, que mostra
uma diminuição significativa em relação ao controle nos tempos 1 e 3 dias na
pata esquerda como podemos observar na figura 19. Observando também a
figura 25, a expressão de SERCA2 é significativamente diferente entre os grupos
veneno + heparina (pata direita) e veneno + heparina (pata esquerda ou
contralateral) nos tempos 1, 3 e 7 dias. Apesar disso, somente o sétimo dia o
 69

grupo veneno + heparina (pata esquerda) é diferente do controle. Foram

realizados experimentos de expressão de SERCA2 com a contralateral do
veneno (VE), mas não foram conclusivos (dados não mostrados).
A fim de verificarmos se o veneno de B. jararacussu era capaz de alterar a
atividade Ca2+ - ATPásica em músculo de contração rápida, medimos a atividade
enzimática utilizando concentrações crescentes de veneno bruto de B.
jararacussu (0,1, 1 e 10 µg/ml) em preparação de EDL de rato. Verificamos que
houve inibição da atividade Ca2+- ATPásica de maneira concentração-
dependente. Nossos resultados estão de acordo com os dados reportados por
Gutiérrez et al. (1987), que demonstraram que a miotoxina extraida da serpente
Bothrops asper inibe a atividade da Ca2+-ATPase “in vitro”. Segundo Montecucco
et al. (2008), as miotoxinas (Bothropstoxinas I e II, entre outras) promovem um
impedimento da função mitocondrial (aumento da captação de Ca2+ pelo uniporter
e consequente desorganização da crista mitocondrial, formação de cristais de
hidroxiapatita e abertura resultante do poro de permeabilidade transitória). Essas
ações parecem ocasionar diminuição na síntese de ATP pela mitocôndria e
consequente redução da hidrólise de ATP pelas Ca2+ -ATPases, inclusive a
SERCA.
Com a finalidade de verificarmos a viabilidade funcional das bombas de
Ca2+ na preparação de EDL de camundongo durante o processo de regeneração
muscular, realizamos ensaios de atividade enzimática no decorrer do processo de
regeneração (1, 3, 7 e 21 dias), nas mesmas preparações utilizadas para
realizarmos os ensaios de Western blot. Verificarmos um decréscimo
estatisticamente significativo na atividade Ca2+ - ATPásica no grupo veneno nos
dias 1, 3, e 7, e no 21° e essa atividade volta aos níveis controles. No grupo
veneno + heparina, somente no primeiro dia verificamos um decréscimo
estatisticamente significativo da atividade Ca2+-ATPásica. Mostrando um efeito
antagonizante ao efeito do veneno no terceiro e sétimo dia sobre a atividade
Ca2+-ATPásica. Esses dados sugerem que as bombas de Ca2+ retornam aos
níveis de funcionamento controles mais cedo, no decorrer da regeneração
muscular, quando se utiliza o tratamento com a heparina. E como a atividade
 70

Ca2+ - ATPásica medida é total (SERCA1 + SERCA2 + PMCA + SPCA), não

podemos verificar se o efeito protetor da heparina é exclusivo para uma ou outra
isoforma.
Calil-Elias (2004) pesquisou o aspecto funcional dos músculos
regenerados, e observou que o músculo em que foi administrado apenas o
veneno, após 21 dias desenvolveu maior tensão em freqüências de estimulo 0,2
a 20 Hz e tétano, e o tempo de decaimento do abalo foi muito mais rápido que o
músculo controle. Considerando que a medida do tempo de decaimento do abalo
muscular é parâmetro para se avaliar a capacidade de relaxamento, e
conseqüentemente o processo de recaptação do Ca2+ pelo retículo
sarcoplasmático, e que a citoquímica ultraestrutural para detecção de Ca2+
intracelular no grupo em que foi administrado somente o veneno mostrou que o
Ca2+ tem uma distribuição difusa, esse aumento de tensão observado após o
estimulo elétrico pode ser explicado pela maior disponibilidade dos íons Ca2+ em
decorrência ao efeito do veneno. As próprias enzimas (SERCA) poderiam
apresentar localização difusa e heterogênea. Entretanto, o rápido decaimento do
abalo muscular observado no grupo veneno em comparação ao controle não
pode ser explicado pelos nossos achados, uma vez que de acordo com os
nossos resultados, a atividade das Ca2+ - ATPases encontra-se nos níveis
controles após 21 dias da administração do veneno. Mas, podemos supor que já
que a atividade das Ca2+-ATPases está normal no músculo regenerado, talvez
outros componentes celulares responsáveis pela remoção do íon Ca2+ possam
apresentar atividade ou expressão aumentadas (Lytton, 2007). Nos animais que
receberam veneno e posterior tratamento com a heparina, os músculos
regenerados desenvolveram abalos, clônus e tétano semelhantes ao controle,
mostrando assim função normal (Calil-Elias, 2004). Esses últimos dados estão de
acordo com os nossos resultados, que mostram no grupo veneno + heparina, que
a atividade Ca2+-ATPásica está igual ao controle. Da mesma forma, de acordo
com os resultados da citoquímica ultra-estrutural de Ca2+, visualmente esse íon
apresenta localização homogênea, após o tratamento com heparina de baixo
peso molecular (Calil- Elias, 2004).
 71

Montecucco et al. (2008) mostraram que há influxo de ions Ca2+, através

da desestabilização da membrana citoplasmática e entrada das miotoxinas para o
meio intracelular, ocorrendo acúmulo do íon Ca2+ no citoplasma das células e
desencadeando vários processos de injuria celular, dentre eles a apoptose (figura
29). Nossos dados indicam que o veneno bruto B. jararacussu promove
alterações de forma direta na atividade Ca2+ - ATPásica e modifica a expressão
das bombas de Ca2+ do tipo SERCA. Apesar de haver recuperação dos níveis de
expressão da isoforma SERCA1 (a mais importante para o músculo esquelético
rápido) e aumento significativo da expressão de SERCA2 no 7º dia após indução
de necrose pelo veneno, a atividade Ca2+ ATPásica continua inibida pela ação do
veneno. Embora a heparina não modifique a ação do veneno sobre a expressão
das diferentes isoformas SERCA, esse polianionte sulfatado é capaz de reverter
a ação inibitória do veneno de B. jararacussu sobre a atividade Ca2+ - ATPásica.
No contexto do processo de regeneração muscular não podemos descartar a
hipótese de que o impedimento da síntese de ATP pela mitocôndria, observado
pela ação de miotoxinas, comprometa a ação recaptadora de Ca2+ pelas bombas
SERCA presentes na membrana do retículo sarcoplasmático (Montecucco et al,
2008). Entretanto, nossos dados mostram que o veneno de B. jararacussu inibe
diretamente a atividade das bombas de Ca2+ (Figura 29) e devido a essa ação
contribui ainda mais para o acúmulo de Ca2+ no citosol das células, o que pode
agravar os danos celulares e intensificar a morte das células musculares já bem
conhecida na literatura.
 72

Figura 29: Representação esquemática da ação das miotoxinas (Adaptado de Montecucco et al.,
2008).
 73

CONCLUSÕES
 74

Em conjunto, os dados obtidos neste trabalho permitem concluir que:

a) A expressão da isoforma SERCA1 é afetada pelo veneno bruto de
Bothrops jararacussu, ocorrendo uma diminuição nos primeiros dias de
degeneração/regeneração, retornando aos níveis controles a partir do
sétimo dia, como o anticorpo não distingue entre SERCA1a e SERCA1b,
esse retorno pode ser um retorno aos padrões genes fetais;
b) O músculo EDL mostrou um perfil compensatório ao decréscimo de
SERCA1 observado pelo o aumento da expressão da isoforma de
“turnover” lento SERCA2, acreditamos não ser suficiente, pois se
analisarmos a sua contribuição, por mais que tenha aumento de 600% da
isoforma SERCA2, é ainda inferior, quando compararmos com
descréscimo de SERCA1 aos 3 dias de degeneração/regeneração;
c) A heparina parece não modificar o perfil de regeneração das isoformas
SERCA1 e SERCA2;
d) O veneno bruto B. jararacussu apresenta um efeito direto na atividade
Ca2+-ATPásica, pois os ensaios foram in vitro, e mostrou uma inibição e
essa é concentração- dependente;
e) A atividade Ca2+-ATPásica durante o processo de regeneração está
diminuída significativamente nos primeiros dias, retornando aos níveis
controles no vigésimo primeiro dia.
f) A heparina antagoniza a ação do veneno bruto de B. Jararacussu na
atividade Ca2+-ATPásica somente no terceiro e sétimo dias de
necrose/regeneração. No vigésimo dia não se observa mais a diminuição
da atividade Ca2+-ATPásica induzida pelo veneno.
 75

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