TALLER #1.

MICROSCOPÍA

1) GLOSARIO:

Poder de resolución: es la menor distancia entre dos puntos de una imagen en la cual estos
aparecen como puntos distintos con nitidez, en lugar de verse como algo borroso y único, no
diferenciado. Mide la riqueza de detalles que son capaces de ofrecer los sistemas ópticos como
microscopios, telescopios, monitores, o la combinación de lentes y sensor (o película) en una
cámara.

Apertura óptica: es un número adimensional que caracteriza el rango de ángulos para

los cuales el sistema acepta luz. Recíprocamente, también está relacionado con el ángulo
de salida del sistema. es un número adimensional que caracteriza el rango de ángulos
para los cuales el sistema acepta luz. Recíprocamente, también está relacionado con el
ángulo de salida del sistema.

Índice de refracción: se denomina índice de refracción al cociente de la velocidad de la luz

en el vacío y la velocidad de la luz en el medio cuyo índice se calcula.

Preparación fija: es un método que se utiliza para preservar la morfología y la

composición química de las células que componen una preparación microscópica.

Preparación húmeda: es el tipo más común de preparado para el trabajo microscópico.

Los preparados en montaje húmedo se utilizan para ver organismos vivos, así como
sustancias líquidas de toda clase. También son usados para cualquier tipo de muestra
que necesite ser mantenida húmeda.

Fluorescencia: la fluorescencia es un fenómeno por el cual algunas sustancias tienen la

capacidad de absorber luz a una determinada longitud de onda, por lo general en el rango
ultravioleta, y luego emiten luz en una longitud más larga.

Tinciones diferenciales: Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que se usan
para diferenciar de manera más explícita los microorganismos. Estas tinciones utilizan los
colorantes diferenciales, que se componen de más de una sustancia tintórea.
2)
3) TÉCNICA DE CONGELACIÓN FACTURA

• Mediante esta técnica es posible estudiar el M/E estructuras celulares superficiales o puestas al
descubierto por medio de la fractura de una muestra congelada a muy bajas temperaturas, sin
ningún tipo de procesamiento químico que altere la ultraestructura de la misma.

• L a muestra se congela en nitrógeno líquido (-196°C) y se monta en un equipo donde hay un

dispositivo especial dentro de una campana, en la cual se hace un alto vacío. Mediante una
cuchilla se produce un corte que provoca una línea de fractura en la muestra, quedando expuesta
la superficie donde se produjo el corte.

• Esta superficie pierde agua por sublimación y posteriormente se le evaporan el carbón y metales
pesados desde diferentes ángulos, hasta cubrirla en su totalidad, logrando de esta manera, una
réplica o mascarilla de la misma. Por un procedimiento donde se elimina el material biológico, la
réplica se separa de la muestra y se examina, en ella se pueden apreciar las características que
quedaron de la réplica. Sublimación o volatilización: Es el proceso que consiste en cambiar el
estado sólido de una materia al estado gaseoso, sin pasar por el estado líquido.

TÉCNICA DE CONGELACIÓN FACTURA

• Mediante esta técnica es posible estudiar el M/E estructuras celulares superficiales o puestas al
descubierto por medio de la fractura de una muestra congelada a muy bajas temperaturas, sin
ningún tipo de procesamiento químico que altere la ultraestructura de la misma.

• L a muestra se congela en nitrógeno líquido (-196°C) y se monta en un equipo donde hay un

dispositivo especial dentro de una campana, en la cual se hace un alto vacío. Mediante una
cuchilla se produce un corte que provoca una línea de fractura en la muestra, quedando expuesta
la superficie donde se produjo el corte.

• Esta superficie pierde agua por sublimación y posteriormente se le evaporan el carbón y metales
pesados desde diferentes ángulos, hasta cubrirla en su totalidad, logrando de esta manera, una
réplica o mascarilla de la misma. Por un procedimiento donde se elimina el material biológico, la
réplica se separa de la muestra y se examina, en ella se pueden apreciar las características que
quedaron de la réplica. Sublimación o volatilización: Es el proceso que consiste en cambiar el
estado sólido de una materia al estado gaseoso, sin pasar por el estado líquido.
4) MÉTODOS UTILIZADOS EN MICROSCOPÍA

Observación a campo claro. La observación a campo claro es la técnica de microscopia más

simple. En este sistema la luz pasa a través o es reflejada por la muestra, sin ninguna alteración,
más allá de la que provoca la propia muestra.

Toda la luz desde el espécimen y alrededores es colectada por el objetivo para formar una imagen
contra fondo totalmente brillante. Este tipo de observación es la más adecuada para muestras
teñidas o con pigmentos naturales y que resultan altamente contrastadas.

Es muy utilizada en patología e histología vegetal y animal, para la observación de cortes finos de
tejidos, sonde bajo un fondo brillante aparece la muestra contrastada. En cambio, no es
demasiado útil para la observación de células vivas.

Observación a campo oscuro. La técnica de observación a campo oscuro es una técnica de

contraste, sin luz directa, dónde solo la luz difractada desde el espécimen se usa para formar la
imagen.

En esta técnica, las muestras deben ser transparentes y no presentar tinción. Se debe controlar la
luz de la muestra, para que la luz central se bloquee. La iluminación (gracias al condensador)
forma un cono hueco, solo con luz de forma oblicua, la cual refleja en la muestra y alrededores. La
imagen se forma con los rayos de luz dispersados por la muestra y platina, que son capturados por
el objetivo.

Es una técnica adecuada para la observación de células y organismos vivos. Esto es así, porque el
contraste se crea por un organismo brillante sobre fondo oscuro, así revelamos fondos, bordes y
contornos del organismo. Uno de los usos principales es en hematología, sobre células de sangre
vivas.

Observación con contraste de fases. La técnica de contraste de fases, también corresponde a una
técnica de observación por contraste, valga la redundancia. Eso quiere decir que el resultado de la
imagen será el fruto del paso de la luz a través de la muestra, normalmente viva, y los diferentes
índices de refracción que resulten de esto.

La luz desde una lámpara/bombilla de halógeno-tungsteno es dirigida a través de un lente

colectora y enfocada hacia anillos especializados del condensador. Los frentes de onda pasando a
través del anillo iluminan al espécimen y pasan directamente (o difractados) a través de la muestra
y son retardados por los gradientes de fase de la muestra. La luz sin desviar, difractada y colectada
por el objetivo es separada por un plato de fases y enfocada en el plano intermedio de la imagen
para formar la imagen final.

Esta técnica se usa en observación de células vivas o en estudio de materiales con láminas muy
finas.

Observación con fluorescencia. El microscopio de fluorescencia se basa en el que los objetos son
iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado
de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la radiación
primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Es decir, se han excitado. Para dejar
pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del
condensador y encima del objetivo.

Así podríamos determinar esta técnica de observación como indirecta, ya que la observación o
resultado es gracias a la reacción de determinadas moléculas o células sobre un primer tipo de luz
o radiación que han absorbido.

La microscopia de fluorescencia se utiliza para detectar sustancias determinadas como la vitamina

A o sustancias marcadas con fluorocromos. Además, permite determinar la distribución de una
sola especie de molécula, su cantidad y ubicación en el interior de la célula. Es una técnica muy
específica y evolucionada, pero a la vez muy utilizada en el análisis biomolecular.

5) DIFERENCIAS ENTRE MICROSCOPIO ÓPTICO (O DE LUZ) CON MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Microscopio Óptico Microscopio Electrónico

Usa fotones o luz. Usa electrones en lugar de fotones.

Utiliza lentes ópticos. Utiliza lentes electromagnéticas.

Es usado en el campo de la biología. Es usado para investigaciones científicas.

6) APLICACIONES ESPECIALES DEL MICROSCIPIO DE FLUORESCENCIA

● Determinar la distribución de una sola especie de molécula, su cantidad y su ubicación

dentro de una célula.
● La microscopia fluorescente es una técnica clave en el diagnóstico clínico (por ejemplo,
inmunología, patología, microbiología, citogenética)

7) COMPARACIÓN DE LA IMAGEN OBTENIDA ENTRE EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO

Y EL DE TRANSMISIÓN

Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de

veces en cambio el microscopio electrónico de barrido permite la observación y caracterización
superficial de materiales inorgánicos y orgánicos, entregando información morfológica del
material analizado.