Nasopharyngeal Cancer Workshop Biomarkers in NPC

25 – 26 January 2019 Dr Dewi Paramita

NPC is a rare malignancy worldwide, but endemic 
BIOMARKERS IN in few areas
NASOPHARYNGEAL
CARCINOMA
Dewi Kartikawati Paramita

Nasopharyngeal Workshop
Singapore, 25 Januari 2019
Globocan, 2008

Etiology of NPC Type of NPC biomarkers
• EBV is necessary cause of 
undifferentiated type • EBV markers The use of biomarker :
• Diagnosis
• Host markers
• EBV itself is not sufficient to 
cause this malignancy • Prognosis
• Underlying mechanism is  • Monitoring therapy
still unclear
• Targeted therapy : immuno‐ or 
• Environment and genetic 
also the risk factors gene‐therapy

Potential markers/biomarkers 
for NPC 

EBV markers
RT‐PCR,  Immunohisto Serology 
PCR, DISH RISH chemistry T cell reactivity

DNA RNA PROTEIN IMMUNE RESPONSE

EBV MARKERS Data base message action reaction

EBV  = present  EBV = active   EBV = interactive   Host reaction

DOSIS ACTIVITY ACTIVITY to  IMMUNE STATUS
latency type

Page 1
Nasopharyngeal Cancer Workshop Biomarkers in NPC
25 – 26 January 2019 Dr Dewi Paramita

EBV DNA in NP brush and plasma
Stevens et al., 2006 – EBV in nasopharynx 

Stevens et al., 2005 – EBV in blood 

EBV DNA

• By a 213‐bp EBNA1‐based real‐time LightCycler PCR
• Can EBV DNA in NP brushing or blood differentiate NPC from healthy 
controls?

EBV DNA load in nasopharynx Chan et al., 2017
EBV DNA load in blood
Stevens et al., 2006 Stevens et al., 2005

• 100% NP brushing samples from  The 99‐bp LC‐based PCR 
NPC patients (N= 85) were positive  assay significantly quantifies  to investigate whether EBV DNA in plasma samples would be useful to screen 
for EBV DNA  extremely high viral  a higher EBV DNA load than  for early nasopharyngeal carcinoma in asymptomatic persons 
DNA loads the 213‐bp LC‐based PCR 
• Low EBV DNA load found in NP  assay (Wilcoxon’s test, P 
brushing of control 0.0001) 

Lam et al., 2018
N at elrollment ; 20,174
NPC screening using 
IgA‐EBV and EBV 
DNA

Hutajulu et al., in prep

Page 2
Nasopharyngeal Cancer Workshop Biomarkers in NPC
25 – 26 January 2019 Dr Dewi Paramita

EBV Serology
IFA – gold standard immunoblotting

• Simpler and cheaper
Replaced by ELISA
• Better standardised
EBV SEROLOGY • Option for automation
• Suitable for mass 
IgG and/or IgA – EBV in serum/plasma Immunochromatogra
screening test 

• Complicated test phy (rapid test)

• Poorly reproducible
• Unsuitable for mass screening

Ji et al., 2007
Detection of IgA‐VCA using IFA

Ji et al., 2007 • Raised to or sustained EBV antibody above cutoff in serum is the risk 
3093 38955 42048
factor of NPC  39 1 40
Aim : to investigate the relationship between serologic changes and disease  • The mean of window period is 37 +/‐ 28 months 
progression in high‐incidence area Southern China 34 34
• The cumulative NPC incidence of seropositive group was 5.8 times higher 
than the entire study population and seronegative group was 0.5 times 
Methods:
lower
• 15 years cohort study
• Immunofluorescence Assay (IFA) using VCA expressing cells to detect IgA 
antibody  5.81 0.62 1.00

IgA‐[VCA + EBNA1] IgA‐[VCA + EBNA1]
Fachiroh et al., 2006 Hutajulu et al., 2012

• Combined EBNA1 + VCAp18 IgA ELISA provides better  • EBV infection and family history are significant risk factor associated with 
discrimination of NPC and controls compared to single antigen IgA  undifferentiated NPC 
ELISA
• Aberrant IgA‐EBV in healthy individual can be as a predictive of NPC
• Sensitivity and specificity 90%

Page 3
Nasopharyngeal Cancer Workshop Biomarkers in NPC
25 – 26 January 2019 Dr Dewi Paramita

IgA‐[VCA + EBNA1] Hutajulu et al., 2012

Hutajulu et al., 2012

• EBV infection and family history are significant risk factor associated with 
undifferentiated NPC 
• Aberrant IgA‐EBV in healthy individual can be as a predictive of NPC
• elevated EBV IgA seroreactivity among first‐degree relatives of sporadic 
nasopharyngeal carcinoma cases  candidates for further NPC risk 
screening 

Yu et al., 2018 Yu et al., 2018

• A 6 years cohort study
• to evaluate the long‐term diagnostic performance of a new NPC screening 
• 401 high risk and 724 medium risk of 16,712 need to be followed up
scheme (probability of NPC units [logit P], PROB≥0.65), and compare to 
other EBV seromarkers (VCA/Ig A, EBNA1/IgA, VCA/IgA and EBNA1/IgA,  • 53% compliance (after 6 years)  47 NPC patients were diagnosed
and VCA/IgA or EBNA1/IgA) • 44 patients from high and medium risk group
• 3 patients from low risk group
• Based on VCA/IgA and EBNA1/IgA  prediction formula
• high‐risk (PROB≥0.98), medium‐risk (0.98>PROB≥0.65), and low‐risk (PROB <0.65)  The use of combined test of EBV antibodies by ELISA is recommended to 
identify NPC patients  promising as a screening tools

IgG/IgA‐EA Paramita et al., 2018 Paramita et al., 2009 Confirmatory screening

1st test (peptide based)
IgA‐[EBNA1+VCAp18]

Sensitivity/specifity ≈ 90%

Still 10% of healthy EBV 
carrier (+)
Fachiroh et al, 2006
• ELISA using EBV‐EA proteins provides a promising tool for NPC  (Thesis, 2009)
2nd confirmatory test
serodiagnosis 0.35
IgA EA IgA‐EA
0.3
• It may be used as confirmation test to the IgA‐[VCA+EBNA1] as first‐ 0.25
Extract
CoV= 0.22

line screening test in high risk populations 
0.2
Able to “eliminate” false +
0.15
0.1
picked by 1st test
0.05
0
0 5 10 15
Increased specificity ≈ 98%  

Page 4
Nasopharyngeal Cancer Workshop Biomarkers in NPC
25 – 26 January 2019 Dr Dewi Paramita

Paramita et al., in prep Paramita et al., in prep

Rapid test for NPC (NPC Strip G®) Rapid test for NPC (NPC Strip G®)
• Registered product developed by EBV‐NPC team of FMPHN UGM Disease status
• Produced by PT. Swayasa Prakarsa, Yogyakarta, Indonesia TEST NPC Healthy  TOTAL
carrier
• Patent is being processed
+ 93 0 93
• Detect IgG against EBV antigen
‐ 13 100 113
TOTAL 106 100

Performance %
Sensitivity 87.7
Specificity 100

Hutajulu et al., 2011

HOST MARKERS Multiple marker methylation‐specific PCR (MSP) can be 

used as a complementary test for early NPC detection in 
combination with EBV based markers

Wang et al., 2018

OS
DFS

RFS
PROTEIN & miRNA MARKERS High tissue VEGF expression was associated with reduced OS and DFS 
MFS

PFS

Page 5
Nasopharyngeal Cancer Workshop Biomarkers in NPC
25 – 26 January 2019 Dr Dewi Paramita

Tan et al., 2015

Wang et al., 2018 The Role of miRNA in NPC

• miRNA : endogenous, small 
non‐coding ssRNAs of ~22 
Overall Survival nucleotide  negative 
regulators of gene 
expression
Progression Free Survival • Involved in tumorigenesis, 
High serum VEGF level was significantly associated with reduced OS progression of metastasis 
in NPC

Tang et al., 2014 Tang et al., 2014

• Identification of 22 miRNAs using 67 fresh NPC and normal control  • The correlation between expression 

tissue profiles of 5 miRNAs with TNM  
stages were not significant (p>0.05)

miR‐93‐5p, miR‐135b‐5p, miR‐205‐5p, miR‐650 and miR‐183‐
• miR‐650 was upregulated and 
5p were overexpressed in NPC relatives to control normal related to various T stage (p<0.05)
• miR‐93‐5p and miR‐183‐5p were 
upregulated band related to various 
N stage

Tang et al., 2014 Mubarika et al., unpublished

miRNA profiles in NPC and Healthy Controls

• Patients with high expression of  • miR‐21 was upregulated in NPC

miR‐205‐5p (OR: 1.673) and ‐135‐5p  • miR‐29C was upregulated in control 
(OR: 1.212) were at higher risk of  normal
NPC compare to those with low miR
expression
• Potential to differentiate

• ROC curve  miR‐205‐5p (AUC: 
0.838) and ‐135‐5p (AUC: 0.818) 
could differentiate NPC from control

Page 6
Nasopharyngeal Cancer Workshop Biomarkers in NPC
25 – 26 January 2019 Dr Dewi Paramita

Mubarika et al., unpublished Conclusion

The Role of microRNA in the Regulation Pathways in Nasopharyngeal Carcinoma
• EBV biomarkers 
microRNA  Total  Gene Targets Signaling Pathways
hsa‐let‐7b‐5p 9 genes PDGFRA, NRAS, CRKL, MAP2K2, KRAS, CDK6, CCNA1,  cytokine‐cytokine reseptor interaction, ErbB Signaling Pathway, Jak‐STAT signaling  • non‐invasive serology to detect antibodies against EBV and plasma EBV‐DNA  are 
CCND1, dan PTGS2 pathway, MAPK Signaling Pathway, Proliferation, Cell Cycle, AMP signaling pathway, 
Eipsten Barr Virus Infection, Methabolic pathways, TNF signaling pathway
suitable for screening purpose  high predictive value and its cost efficiency 
hsa‐miR‐100‐5p 1 genes FGFR3 EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance dan signaling pathways regulating  • Regular serological follow‐up to observe dynamic fluctuations of anti EBV‐IgA in time 
pluripotency of stem cells
hsa‐miR‐155‐5p 32 genes STAT3, NFKB1, SPI1, CDK4, SMAD2, E2F2, Spi1, APC, WNT5A, Ras signaling pathway, DNA Repair Protein, differentiation, Endocrin resistance,  is recommended for a NPC prevention program 
CDK2, Csf1r, ETS1, SMAD3, EGFR, RHOA, CDKN2A, KRAS,  platinum drug resistance, mTOR signaling pathway, proliferation, Block drugs 
Hif1a, MLH1, SMAD4, CTNNB1, MSH6, CTNNA1, COL4A2,  resistance, and Differentiation
• The use of combination EBV‐based test for NPC screening is recommended
MSH2, RAC1, FGF2, NKX3‐1, CSF1R, FGF7, JUP
• Host biomarkers
hsa‐miR‐15a‐5p 10 genes CHUK, BCL2, JUN, CCND1, MSH2, HSP90B1, WNT3A, CCNE1, Resistance, Apoptosis, cell cycle, FoxO signaling pathway,dan  Angiogenesis. 
VEGFA • Several host protein expression (e.g. VEGF) can be used as diagnostic, prognostic 
hsa‐miR‐19a‐3p 4 genes CCND1, SMAD4, PTEN, dan TGFBR2 cell cycle, FoxO signaling pathway, proliferation, differentiation, and angiogenesis
markers and target therapy
hsa‐miR‐20a‐5p 12 genes E2F1, NRAS, RUNX1, BCL2, CCND1, SMAD4, HIF1A, MYC,  Endocrine resistance, FoxO Signaling pathway, proliferation, and Angiogenesis
CDKN1A, VEGFA, PTEN, dan TGFBR2
• Several epigenetic markers are can be used as candidate for early detection and also 
hsa‐miR‐210 2 genes  APC dan E2F3 mithocondrial carrier and Endocrine resistance when combined with EBV based markers
hsa‐miR‐26a‐5p 6 genes GSK3B, SMAD4, CCNE2, MYC, RB1, dan PTEN Foxo signaling pathway, cell cycle, and Proliferation • miRNA is potential marker for diagnostic markers and also therapy in NPC 
hsa‐miR‐29c‐3p 9 genes  BCL2, CDK6, AKT2, JUN, COL4A2, LAMC1, AKT3, VEGFA, dan  Cell growth and death, cell cycle, EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance, 
COL4A1 angiogenesis, and proliferation 

Acknowledgement
EBV-NPC group FMPHN – Sardjito General EBV-NPC group VUMC Amsterdam
Hospital The Netherlands
• Prof. Sofia Mubarika • Prof. Jaap Middeldorp
• Dr. dr. Bambang Hariwiyanto, Sp. THT-KL • Servi Stevens, Ph.D
• Dr. dr. Sagung Rai Indrasari, Sp.THT-KL
• Dr. dr. Camelia Herdini, Sp.THT-KL
• Jajah Fachiroh, Ph.D
Antony Van Levenhoek
• Prof. Ing Bing Tan THANK YOU
• Susanna Hilda Hutajulu, MD, Ph.D
• Dr. dr. Cita Herawati, Sp.THT-KL
• Tirta Wardana, M.Sc
• Saihas Suhda, M.Sc
• Sumartiningsih

Page 7