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TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
Lara Vázquez José Ángel, Elías Fernández Guillermo, Ordóñez Salanueva César
INTRODUCCIÓN
L
a necesidad de separar un compuesto de otro surgió muy temprano en la historia de la
humanidad como producto de un quehacer cotidiano. Al principio esta necesidad se
enfocaba básicamente en la obtención de alimentos. Pero con el paso del tiempo, y el
avance en todos los aspectos de la vida cultural, esta necesidad fue perfeccionándose al
grado de generar varias técnicas de procesamiento de productos naturales para satisfacer
prácticamente todas las necesidades y actividades humanas. Desde la elaboración de pan,
quesos y diferentes bebidas alcohólicas (destiladas o fermentadas), hasta la producción de armas
metálicas y la obtención de piedras y metales preciosos se emplean diversas técnicas de
separación. En la actualidad las técnicas de separación se utilizan en diversas áreas, a nivel
industrial se emplean grandes cantidades de materia prima y grandes instrumentos de separación
(refinerías); aquí el objetivo es la separación por volumen de los compuestos. Por otro lado, en los
laboratorios de análisis el objetivo es la separación de muestras reducidas para el estudio
cualitativo o cuantitativo de un analito. Particularmente en el trabajo de laboratorio que se realiza
en las áreas biológicas, bioquímicas y biomédicas frecuentemente es necesario el tratamiento de
un extracto o una muestra. El objetivo de este tratamiento puede ser la purificación de enzimas, la
identificación de drogas, la extracción de hormonas, la cuantificación de biomoléculas, etc. Por lo
tanto, el objetivo en las separaciones es dividir una mezcla homogénea o heterogénea en sus
componentes individuales. Hay muchos métodos y técnicas de separación los cuales están
basados en principios físicos y químicos fundamentales. Algunas técnicas de separación son muy
complejas mientras que otros son relativamente simples y requieren poco esfuerzo y recursos. Un
procedimiento de separación puede ser utilizado para purificar, identificar o cuantificar un analito;
dependiendo de la técnica de separación se pueden realizar una o varias de estas operaciones al
mismo tiempo.
La separación puede ser completa o parcial y preparativa o analítica, los principios básicos
de la separación se describen en la figura 9.1. El proceso de separación implica el transporte de
material y la redistribución espacial de los componentes. Hay muchos procedimientos de
separación, algunos de los cuales se han conocido y empleado desde hace mucho (precipitación y
destilación), mientras que otros han sido desarrollados recientemente (cromatografía de gases,
cromatografía de líquidos y electroforesis). En este capítulo se da una introducción general a las
técnicas de separación y sus fundamentos.
Técnicas de separación
Figura 9.1. Principios de separación. En (a) una mezcla de cuatro componentes es separada por completo
de modo que cada componente ocupe una región espacial diferente. En (b) se ilustra una separación
parcial. Aquí A es aislada del resto de los componentes de la mezcla.
Se han realizado diferentes clasificaciones de las técnicas de separación. Éstas incluyen divisiones
de acuerdo al tipo de fuerza involucrada en el proceso, el tipo de equilibrio que se lleva a cabo y la
naturaleza del proceso (mecánica, física o química). Sin embargo debido a la amplia variedad de
propiedades en las cuales están basadas las técnicas de separación es difícil proponer un solo
esquema de clasificación. En el cuadro 9.1 se muestran la mayoría de las técnicas de separación
que existen y el principio básico de su funcionamiento.
TÉCNICA DE PRECIPITACIÓN
Las separaciones por precipitación requieren que existan grandes diferencias de solubilidad entre
el analito y los potenciales interferentes. El tamaño de las partículas de los sólidos formados por
precipitación es muy variable. En un extremo se encuentran las suspensiones coloidales (entre 10 -
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y 10 -4 cm de diámetro), estas partículas no muestran tendencia a sedimentar ni se filtran con
facilidad. En el otro extremo se encuentran las suspensiones cristalinas en donde las partículas
tienen dimensiones del orden de décimas de milímetros o mayores, estas partículas tienden a
sedimentar espontáneamente y se filtran con facilidad. Los precipitados se forman por una serie
de etapas sucesivas las cuales son: supersaturación, saturación, nucleación y crecimiento de
cristales. La supersaturación es un estado en desequilibrio que ocurre cuando una fase de la
disolución contiene más soluto disuelto que el descrito en el estado de equilibrio La saturación de
una disolución ocurre cuando esta disolución contiene la máxima cantidad de soluto que es capaz
de disolver. La supersaturación es la primera etapa del proceso de precipitación, sin embargo,
como este es un estado de no equilibrio es transitorio y el sistema tiende espontáneamente a la
saturación, el paso de la supersaturación a la saturación se denomina nucleación. La nucleación
es un proceso en el cual pequeñas partículas son capaces de crecer espontáneamente formando
pequeños núcleos en donde se adhieren otras partículas. El crecimiento de cristales ocurre una
vez que se ha formado un núcleo, este continua creciendo por la adhesión continua de partículas
precipitadas. Si predomina la nucleación se produce un gran número de partículas pequeñas
(coloides); en cambio, si predomina el crecimiento de partícula se obtiene menor número de
partículas pero de mayor tamaño (cristales).
Técnicas de separación
Cuadro 9.1. Técnicas de Separación.
Técnica de separación Base del técnica
Precipitación Diferencia de solubilidad
Sublimación Diferencia en la presión de vapor
Cristalización Solubilización a bajas temperaturas
Zona de refinamiento Cristalización a elevadas temperaturas
Flotación Diferencias en la densidad entre liquido y sustancia
Filtración Diferencia en el tamaño de partículas
Diálisis Flujo de un sistema a través de una membrana
Intercambio iónico Intercambio de iones
Extracción Diferencia de solubilidad en dos líquidos inmiscibles
Destilación Diferencia de volatilidad
Técnicas cromatográficas
Cromatografía de absorción en Distribución de un soluto entre una fase sólida y
columna una fase líquida en una columna
Cromatografía de partición en Distribución de un soluto entre dos líquidos en una
columna columna
Cromatografía de capa fina Absorción o partición en una hoja de capa fina
(TLC)
Cromatografía en papel Partición en una hoja de papel
Cromatografía de líquidos de Cromatografía liquida en columna bajo condiciones
alta presión de alta presión
Cromatografía de intercambio Intercambio de iones
iónico
Cromatografía de gases Distribución de un soluto gaseoso entre un gas y
una fase liquida o sólida
Electroforesis Diferencia en la velocidad de migración de especies
cargadas en un campo eléctrico
Cromatografía de fluidos super- Diferencias en la temperatura critica
críticos
Electrodeposición Electrolisis en electrodos inertes
Existen varios agentes precipitantes que permiten la separación de iones a partir de sus
diferencias de solubilidad. Estas separaciones requieren un estricto control de la concentración
activa del reactivo a un nivel predeterminado. Para ello regularmente se controla el pH de la
disolución con tampones adecuados. Esta técnica se aplica a reactivos aniónicos en los que el
anión es la base conjugada de un ácido débil. Entre los ejemplos se incluyen el ion sulfuro, el ion
hidróxido y los aniones de varios ácidos inorgánicos débiles. La viabilidad teórica de este tipo de
separación puede determinarse mediante cálculos de solubilidad.
Producto de solubilidad: el producto de solubilidad puede ser empleado para predecir las
condiciones óptimas para la formación y disolución de precipitados. Estas incluyen variables como
temperatura, pH, concentración del agente precipitante, concentración de sales inertes y
composición del solvente. La constante del producto de solubilidad se define como:
Donde los términos en corchetes representan las concentraciones de los iones. Por ejemplo, para
el AgCl el producto de solubilidad se define como:
Ag Cl = Ag+ + Cl-
La coprecipitación: es un proceso en el cual los compuestos que normalmente son solubles son
arrastrados y separados de la disolución por un precipitado. Existen cuatro tipos de
coprecipitación:
Formación de cristales mixtos: en este proceso, uno de los iones de la red cristalina de un
sólido es remplazado por un ion de otro elemento. Para que ocurra el intercambio es necesario
que los dos iones tengan la misma carga y que su tamaño no difiera en más de un 5 %. Los
cristales mixtos pueden formarse tanto en los precipitados coloidales como en los precipitados
cristalinos.
Oclusión: ésta ocurre cuando los cristales de un precipitado crecen con rapidez de manera que
iones extraños, a la capa del cristal que se está formando, quedan atrapados u ocluidos dentro del
cristal en crecimiento.
Atrapamiento mecánico: este proceso es muy semejante al anterior, la diferencia principal radica
en que aquí es la cercanía de los cristales que se están formando, y no la velocidad de formación,
lo que ocasiona la captura de algunas porciones de disolución en pequeños huecos.
Se han desarrollado técnicas de precipitación para muchos aniones y cationes inorgánicos,
así como para especies neutras como el agua, dióxido de azufre, dióxido de carbono y yodo. La
principal aplicación de las técnicas de precipitación de iones y cationes inorgánicos se encuentra en
la industria metalúrgica, en joyería y farmacéutica. También es posible separar con facilidad
diversas sustancias orgánicas a través de esta técnica por ejemplo: proteínas y lactosa en la
industria alimenticia, salicilatos y fenolftaleina en farmacéutica, nicotina en plaguicidas y colesterol
en cereales. La precipitación de proteínas con soluciones salinas es una técnica ampliamente
empleada en todo tipo de laboratorios.
Intercambio iónico: en este proceso se intercambian los iones contenidos en un sólido insoluble
por los iones de una disolución que ha sido puesta en contacto con el sólido. Las propiedades de
intercambio iónico de arcillas y zeolitas han sido conocidas desde hace más de un siglo, aunque
actualmente se utilizan resinas sintéticas de intercambio iónico fabricadas con poliestireno
entrecruzado. Las resinas sintéticas de intercambio iónico son polímeros de alto peso molecular
que contienen un gran número de un grupo funcional iónico por molécula. Las resinas de
Técnicas de separación
intercambio cationico contiene grupos ácidos, mientras que las resinas de intercambio aniónico
contienen grupos básicos. En general, el intercambio iónico se utiliza para eliminar iones tanto
orgánicos como inorgánicos. En muchos laboratorios se utiliza esta técnica para desionizar agua,
inclusive este mismo principio se aplica en los filtros ablandadores de agua domésticos.
TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN
Uno de los campos en donde las técnicas de extracción son más utilizados es en análisis
fitoquímico. Cuando se quiere averiguar la efectividad de alguna planta para determinado
tratamiento, generalmente es preciso seguir cuatro etapas básicas: La primera etapa es obtener
una muestra representativa del material a evaluar; la segunda etapa consiste en separar o aislar
cada una de las sustancias que lo componen, de tal manera que estas puedan evaluarse
perfectamente; la tercera etapa consiste en la identificación y cuantificación, de cada uno de los
componentes. La cuarta etapa consiste en interpretar los resultados considerando los
procedimientos empleados y de las posibles fuentes de error.
La decisión acerca de qué procedimiento utilizar para obtener los extractos son diversos;
cuál utilizar depende de que compuesto se sospecha sea el principio activo y de las
características físicas y químicas del mismo, sobre todo si tiene alguna afinidad por determinados
solventes.
percolación
- Técnicas en frío
maceración
Reflujo
decocción
- Técnicas en caliente
infusión
arrastre de vapor
- Extracción ácido-base
Destilación simple
- Destilación Destilación al vacío
Destilación fraccionada.
Destilación a presión reducida (ó vació)
La extracción con disolventes es una técnica de separación que se puede aplicar a todo tipo de
mezclas, ya sean éstas sólidas, líquidas o gaseosas. La extracción se basa en la diferencia de
solubilidad de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado. La forma más simple
de realizar una extracción consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demás no. Sin embargo, la técnica de
extracción más empleada consiste en la disolución de la mezcla a separar en un disolvente que
disuelva a todos los componentes. A continuación, se procede a la adición de un segundo
disolvente, no miscible con el primero, de manera que los componentes de la mezcla se
distribuyan entre los dos disolventes según su coeficiente de reparto, que está directamente
relacionado con la solubilidad de cada compuesto. Si algún componente de la mezcla es muy
soluble en uno de los disolventes y muy poco en el otro quedará prácticamente todo en el que es
soluble, mientras que los otros componentes de la mezcla quedarán en el otro disolvente. La
separación de los dos disolventes y su evaporación suministrará residuos enriquecidos en los
componentes más solubles.
Por otra parte la extracción selectiva se emplea para separar mezclas de compuestos
orgánicos, en función de la acidez, de la basicidad o de la neutralidad de éstos, como por ejemplo,
muchos compuestos orgánicos que poseen carácter ácido no son solubles en agua y sí en
disolventes orgánicos; en cambio, en sus sales metálicas, el comportamiento es inverso, son
solubles en agua e insolubles en disolventes orgánicos. Si se convierte un ácido en su sal sódica,
se puede hacerlo soluble en agua y extraerlo así del disolvente orgánico en el que se encuentra.
a) Maceración en frío
Consiste en sumergir el producto a macerar en un recipiente con la menor cantidad de agua posible,
sólo lo suficiente como para cubrir totalmente lo que se desea macerar. Esto se hace por un lapso
más o menos largo, dependiendo de lo que se vaya a macerar.
La ventaja de la maceración en frío consiste en que al realizarse sólo con agua se logran
extraer todas las propiedades de lo que se macera, es decir, toda su esencia sin alterarla.
Decocción o cocimiento: se pone en contacto el material del cual se quiere extraer un soluto con
el disolvente (agua), se lleva hasta la temperatura de ebullición manteniéndola durante 15 a 30
minutos. Una vez enfriado, se filtra y se exprime el residuo. Hay que tomar en cuenta las
características del material a estudiar, pues el tiempo de decocción depende de ello, siendo menor
para hojas, flores etc. Y mayor para materiales más duros como cortezas, semillas etc. Además
depende de los principios activos que se deseen extraer.
La decocción se aplica sobre todo a material vegetal duro en la que resulta difícil el
contacto entre los principios activos y el disolvente debido a sus características histológicas y a
vegetales con principios activos difíciles de disolver que precisan de una temperatura elevada y un
tiempo elevado para su disolución.
Habrá que tomar en cuenta la poca estabilidad en el tiempo de los extractos acuosos
obtenidos, por lo que se recomienda preparar la decocción en el momento que se va a utilizar.
Arrastre de vapor: esta técnica es quizá la principal técnica de obtención de los “aceites
esenciales”; fragancias naturales muy apreciadas que se encuentran en las plantas, tales como el
mentol, el eucaliptol, etc.
La destilación por arrastre de vapor es una técnica aplicada en la separación de sustancias
poco solubles en agua. Se emplea para separar una sustancia de una mezcla que posee un punto
de ebullición muy alto y que se descomponen al destilar. También se emplea para purificar
sustancias contaminadas por grandes cantidades de impurezas resinosas y para separar
disolventes de alto punto de ebullición de sólidos que no se arrastran.
En esta técnica se lleva a cabo la vaporización selectiva del componente volátil de una
mezcla formada por éste y otros "no volátiles". Lo anterior se logra por medio de la inyección de
vapor de agua directamente en el seno de la mezcla, denominándose este "vapor de arrastre",
pero en realidad su función no es la de "arrastrar" el componente volátil, sino condensarse en el
matraz formando otra fase inmiscible que cederá su calor latente a la mezcla a destilar para lograr
su evaporación. En este caso se tendrán la presencia de dos fases insolubles a lo largo de la
destilación (orgánica y acuosa), por lo tanto, cada líquido se comportará como si el otro no
Técnicas de separación
estuviera presente. Es decir, cada uno de ellos ejercerá su propia presión de vapor y
corresponderá a la de un líquido puro a una temperatura de referencia.
En la destilación por arrastre es posible utilizar gas inerte para el arrastre. Sin embargo, el
empleo de vapores o gases diferentes al agua implica problemas adicionales en la condensación y
recuperación del destilado o gas.
El comportamiento que tendrá la temperatura a lo largo de la destilación será constante, ya
que no existen cambios en la presión de vapor o en la composición de los vapores de la mezcla,
es decir que el punto de ebullición permanecerá constante mientras ambos líquidos estén
presentes en la fase líquida. En el momento que uno de los líquidos se elimine por la propia
ebullición de la mezcla, la temperatura ascenderá bruscamente.
La destilación con arrastre de vapor permite separar sustancias que son insolubles en
agua y ligeramente volátiles de otras que no lo son.
Existe una gran diferencia entre una destilación por arrastre y una simple, ya que en la
primera no se presenta un equilibrio de fases líquido-vapor entre los dos componentes a destilar
como se da en la destilación simple, por lo tanto no es posible realizar diagramas de equilibrio ya
que en el vapor nunca estará presente el componente "no volátil" mientras este destilando el
volátil. Además de que en la destilación por arrastre de vapor el destilado obtenido será puro en
relación al componente no volátil (aunque requiera de un decantación para ser separado del
agua), algo que no sucede en la destilación simple donde el destilado sigue presentando ambos
componentes aunque más enriquecido en alguno de ellos.
Además si este tipo de mezclas con aceites de alto peso molecular fueran destiladas sin la
adición del vapor se requeriría de gran cantidad de energía para calentarla y emplearía mayor
tiempo, pudiéndose descomponer si se trata de un aceite esencial.
Destilación simple: es una técnica utilizada en la purificación de líquidos cuyo punto de ebullición
es menor de 150 ºC a la presión atmosférica y sirve para eliminar impurezas no volátiles. Esta
técnica también se emplea para separar dos líquidos cuyos puntos de ebullición difieran al menos
en 25 ºC.
La destilación simple se usa cuando la diferencia entre los puntos de ebullición de los
componentes es grande, mayor de 80 ºC, o cuando las impurezas son sólidos disueltos en el
líquido a purificar. En este tipo de destilación el líquido se calienta, a presión atmosférica, en un
recipiente cerrado que contiene una salida hacia un tubo refrigerado donde se condensan los
vapores. Con esta sencilla operación podemos purificar un disolvente, pero no podemos separar
completamente dos o más líquidos volátiles.
Técnicas de separación
En este tipo de destilación, el material vegetal disgregado, y que le realizaremos una
destilación simple, se coloca en un matraz con muy poca agua. Se calienta, entonces la diferencia
de presión entre el vapor de agua y los componentes a extraer, hace que estos últimos se
separen, posteriormente, los vapores recibidos, se condensan y se recoge en un matraz.
El procedimiento para destilar es el siguiente (Figura 9.2):
Ventajas
Buena conservación, sobre todo en las que el disolvente es antiséptico (alcohol, glicerina,
propilenglicol).
Fácil empleo y prescripción.
Posibilidad de estandarizar los productos obtenidos, esto es, posibilidad de ajustar la
concentración del principio activo.
Técnicas de separación
Posibilidad de eliminar componentes indeseables.
Desventajas
Baja estabilidad de las soluciones extractivas acuosas.
Dilución de los principios activos, pudiendo ocasionar una disminución en su eficacia.
Variación del “contexto natural” de los compuestos activos, pues hay asociación de
componentes que pueden alterarse al realizar una extracción.
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Figura 9.3 (a). Diagrama que muestra la separación de una mezcla de componentes A y B por
cromatografía de elusión en columna. (b) La señal del detector en las distintas etapas de elusión.
A (móvil) = A (estacionaria)
Donde (a A)S es la actividad del soluto A en la fase estacionaria y (a A)M es la actividad del soluto en
la fase móvil. A menudo se sustituye la actividad del soluto A por su concentración molar en
ambas fases, por lo tanto la ecuación 4 se escribe como:
Kc = c S_
cM (3)
Cromatografía de partición: aquí las moléculas del soluto están en equilibrio a través de una
capa interfacial que se produce entre la fase móvil y la fase estacionaria. El soluto se distribuye a
Técnicas de separación
través de la fase estacionaria dentro de ésta, y no solo en la superficie como en la adsorción. En
este caso la fase estacionaria siempre es liquida por lo tanto, la solubilidad entre ambas fases es
una parte importante de este proceso. Algunas propiedades generales y específicas las cuales
tienen influencia en la solubilidad son parámetros importantes en la cromatografía de partición.
Las principales fuerzas que interfieren en la solubilidad entre ambas fases son los enlaces
hidrógeno, interacciones dipolo-dipolo y procesos de transferencia de carga entre el solvente y las
moléculas del soluto. En este tipo de cromatografía al coeficiente de distribución se le llama
coeficiente de partición y se define por la ecuación:
Kp = CS_
CM (4)
En las técnicas cromatográficas planas la retención de los solutos, por partición o adsorción, se
describe por su migración relativa en relación a la fase móvil. Esta proporción se simboliza como:
Rf y RR, en donde Rf es para el flujo lineal en una dirección y RR es para el flujo lineal en una
dirección radial. Ambos son definidos como:
Cromatografía en columna: la cromatografía en columna utiliza fase móvil liquida o fase móvil
gaseosa por adsorción o partición. El intercambio iónico y la exclusión también son posibles en
cromatografía de columna. Las columnas son hechas de vidrio o algunos materiales químicos
inertes y se encuentran en diferentes formas tamaños y diseños. Su principal objetivo es contener la
fase estacionaria y permitir el control del flujo del solvente.
Técnicas de separación
Adsorción o partición: ambas técnicas tienen ventajas y limitaciones en su aplicación. En
general, la cromatografía de adsorción en columna es menos difícil de realizar que la de partición.
Sin embargo, se debe de considerar otros factores antes de elegir entre uno u otro, básicamente
se refieren al tipo de compuestos que se quieren separar y al objetivo de la separación.
Cuadro 9.4. Enlista diferentes tipos de adsorventes para cromatografía en columna de menor a
mayor poder de adsorción.
Adsorventes para Cromatografía en Columna
Sacarosa
Celulosa
Almidón
Carbonato de calcio
Sulfato de calcio
Fosfato de calcio
Carbonato de magnesio
Oxido de calcio
Acido silisico (sílica gel)
Charcoal
Oxido de magnesio
Oxido de aluminio
Técnicas de separación
La alúmina (Al 2O3) está disponible en muchas formas. Dependiendo del grado de secado y la
preparación ésta puede tener los siguientes sitios activos, Ald+, Al-OH, AlO-H y Al-O-, los cuales
son responsables de la adsorción. La alúmina es activada calentándola en un horno a 200 oC o a
400 oC durante 3 hrs. Estos procedimientos de secado proveen dos diferentes formas de
activación de alúmina. Ninguno de estos dos tipos es completamente anidro, de hecho la alúmina
anidra es poco adsorvente. La alúmina también puede ser graduada como ácida, básica o neutral
de acuerdo al tipo de lavado.
La sílica gel (SiO2) es activada calentando las placas a 160 °C durante 3 horas. Por medio de
éste proceso no se remueve toda el agua y los sitios activos son semejantes a los de la alúmina,
además en estas placas también existe silicón. Al igual que con la alúmina la sílica gel es
compatible con el agua y la mayoría de solventes orgánicos. Sin embargo, ésta tiende a
expandirse, el grado de expansión depende del tipo de solvente.
Existe un factor de polaridad que puede ser empleado para relacionar solventes como fases de
elusión en la cromatografía de adsorción. El grado de adsorción de un solvente puede ser
cualitativamente predecible dependiendo de los grupos funcionales presentes (Cuadro 9.5).
Cuadro 9.5. Serie eluotrópica de solventes comunes el poder de elusión aumenta de arriba
hacia abajo.
Éter de petróleo
Ciclohexano
Tetracloruro de carbono
Tolueno
Benceno
Cloroforma
Éter etílico
Acetato de etilo
Acetona
n-propanol
Etanol
Metanol
Agua
Piridina
Ácidos orgánicos
Ácidos y bases inorgánicos
El mismo tipo de sílica gel que se utiliza para adsorción es utilizado para partición, sin embargo,
esta debe ser desactivada impregnándola con agua o algún otro solvente polar.
Fase móvil en cromatografía de partición: en general las moléculas que son más solubles en la
fase móvil se mueven más rápido que aquellas menos solubles. Además, mientras más soluble
sea la molécula en la fase estacionaria más lenta será su elución. Por tanto, en la partición se
deben elegir dos líquidos, uno que actúe como fase estacionaria y otro que actué como fase móvil.
Es difícil predecir la combinación óptima entre estas fases porque el sistema de partición puede
involucrar mezclas de solventes, soluciones salinas, buffers o agentes complejos. Otra
complicación radica en que las dos fases deben estar en equilibrio durante la cromatografía y si un
tercer componente es introducido se pierde la condición de equilibrio. El cuadro 9.7 enlista
diversos sistemas de partición para cromatografía en columna convencional y en fase reversa.
Cromatografía plana: entre las técnicas de cromatografía plana figuran la cromatografía de capa
fina (TLC), la cromatografía en papel (PC) y la electrocromatografía. Cada uno de ellos utiliza una
capa plana y relativamente fina de material que se sostiene por sí misma o se aplica como
recubrimiento sobre una superficie de vidrio, plástico o metal. La fase móvil avanza a través de la
fase estacionaria por capilaridad, ayudada en ocasiones por la acción de la gravedad o de un
potencial eléctrico.
Cromatografía en papel: de manera muy simple la cromatografía en papel puede describirse como
el paso de una fase móvil líquida a través de la estructura porosa de un papel que contiene una fase
estacionaria líquida. El desarrollo (elusión de la cromatografía) es detenido antes de que la fase
Técnicas de separación
móvil alcance el borde del papel, de esta manera, las zonas se distribuyen a lo largo de éste.
Probablemente las principales limitaciones de la cromatografía en papel en comparación con la
cromatografía de capa fina son: tiempos de desarrollo más prolongados, la exactitud en el análisis
cuantitativos bajo, las zonas no siempre están bien definidas y algunas veces las condiciones de
desarrollo son difíciles de reproducir.
En general el papel está compuesto por fibras de celulosa; ésta es una red polimérica de
carbohidratos que posee características hidrofílicas y está entrecruzada por un sistema de
puentes de H estable. El agua u otros solventes muy polares son fuertemente compatibles con el
sistema hidrofílico de la celulosa. Si el papel está acetilado (grupos hidróxido son convertidos a
grupos acetilo) entonces toma propiedades hidrofóbicas; por lo tanto, tiende a retener solventes
hidrofóbicos en vez de solventes hidrofílicos como fase estacionaria. A este tipo de aplicación se
le refiere como fase reversa en la cromatografía en papel. El papel también se puede hacer
hidrofóbico por tratamientos con silicón o impregnándolo con polímetros orgánicos no polares e
inertes.
La cromatografía en papel se da esencialmente por partición y existe una amplia variedad
de combinaciones entre fase estacionaria y fase móvil. No es necesario que los dos sistemas
sean inmiscibles. Los tipos de fase estacionaria que se utilizan se pueden clasificar como
sistemas: acuosos, hidrofílicos e hidrofóbicos.
Fase estacionaria acuosa: el agua es fácilmente sostenida por el papel. Por lo tanto, se puede
conseguir equilibrar la humedad del papel suspendiéndolo en una cámara cerrada cuya atmósfera
está saturada con agua. Si se desea impregnar el papel con una solución salina o buffers, se rocía
el papel con la respectiva solución y después se expone a la cámara con atmósfera saturada de
agua. Este tipo de sistema es particularmente útil para la separación de mezclas moderadamente
polares de mezclas muy polares.
Fase estacionaria hidrofílica: se puede utilizar un solvente orgánico para la fase estacionaria
hidrofílica. Si el solvente es suficientemente volátil, se puede equilibrar el papel en una cámara
que esté saturada con el solvente deseado. Alternativamente, el solvente de la fase estacionaria
se diluye en otro solvente muy volátil y el papel es sumergido en la solución, posteriormente el
papel es secado con aire y el solvente volátil se evapora dejando la fase estacionaria liquida
uniformemente distribuida a través del papel. Algunos de los solventes hidrofílicos más
comúnmente empleados son: metanol, formamida, glicoles y glicerol.
Fase estacionaria hidrofóbica: como se describió previamente, el papel debe ser modificado
antes de que empiece a mostrar una tendencia para retener una fase móvil hidrofóbica. Para
equilibrar el papel, se tiene que exponer a los vapores del solvente elegido o sumergirse en una
solución con un solvente más volátil. Los solventes más empleados son: dimetil-formamida,
queroseno, hidrocarburos aromáticos y alifáticos, así como algunos solventes oxigenados.
Fase móvil: hay una gran combinación de fases móviles posibles. Mezclas de dos, tres o más
solventes son frecuentemente empleadas en la cromatografía en papel. También pueden utilizarse
soluciones salinas o soluciones buffers. Se pueden utilizar ciertos parámetros para predecir las
condiciones de elución, por ejemplo, las características de los componentes en la mezcla y el tipo
de fase estacionaria. El cuadro 9.8 enlista diez fases móviles básicas para la cromatografía en
papel. Las mezclas de A a C se utilizan para la separación de substancias hidrofílicas, las mezclas
de A a G son para substancias medianamente hidrofílicas y las mezclas H a J, son para
sustancias hidrofóbicas. Es posible utilizar diferentes proporciones de estas mezclas para
conseguir un mayor poder de partición en la cromatografía.
Cuadro 9.8. Diez fases móviles básicas para cromatografía en papel. Las proporciones de cada
solvente se indican en paréntesis, cuando no se indican la proporción es de uno por cada
componente.
a. Isopropanol-amonio-agua (9:1:2)
b. n- Butanol-ácido acetico-agua (4:1:5)
c. Agua-fenol
d. Formamida-cloroformo
Técnicas de separación
e. Formamida-cloroformo-benceno
f. Formamida-benceno
g. Formamida-benceno-coclohexano
h. Dimetilformamida-ciclohexano
i. Keroseno-isopropanol 70 %
j. Parafina-dimetilformamida-metanol-agua
BIBLIOGRAFÍA
APÉNDICE A
Técnicas de separación
Técnicas de separación