UNIVERSIDAD DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS

PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
16162-A1 LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Actividad Enzimática

Gamboa, J.P 18331002. Rojas, J.D 18331015 & Villamizar, M.C 18332002
Universidad de Santander, Bucaramanga, Colombia, 26 de septiembre 2019
Microbiología Z

RESUMEN
En la práctica de laboratorio se llevó a cabo
la extracción y ensayo de la actividad
enzimática de levadura de panadería, las
enzimas son moléculas de naturaleza
proteica y estructural, que catalizan
reacciones químicas, las enzimas actúan
azúcares reductores formados (D-glucosa +
D-fructosa, expresadas como equivalentes
de glucosa) producida por unidad de tiempo
y la actividad enzimática se expresará como
actividad específica, de tal manera la
cantidad de proteína presente en el extracto
enzimático se analizará por el método de
Bradford.
sobre sustratos dando como resultado
productos. En esta práctica se utilizó una
levadura la cual ya se tenía lista en una caja
de Petri, la velocidad de reacción se
determinará analizando la cantidad de
En estas reacciones, las enzimas actúan
sobre unas moléculas denominadas
sustratos, las cuales se convierten en
moléculas diferentes denominadas
productos. Casi todos los procesos en las
células necesitan enzimas para que ocurran
a unas tasas significativas. A las reacciones
mediadas por enzimas se las denomina
reacciones enzimáticas.

Como todos los catalizadores, las enzimas

PALABRAS CLAVES
Enzimas, Proteínas, Sustratos, Levadura S.
cerevisiae, Glucosa, pH, Temperatura.
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son moléculas de naturaleza
proteica y estructural que catalizan
reacciones químicas, siempre que sean
termodinámicamente posibles: una enzima
hace que una reacción química tenga la
capacidad de transcurrir a una velocidad
muy baja, sea cinéticamente favorable, es
decir, transcurra a una velocidad muy alta
respecto a la ausencia de la enzima
funcionan disminuyendo la energía de
activación (ΔG‡) de una reacción, de forma
que se acelera sustancialmente la tasa de
reacción. Las enzimas no alteran el balance
energético de las reacciones en que
intervienen, ni modifican, por lo tanto, el
equilibrio de la reacción, pero consiguen
acelerar el proceso incluso millones de
veces. Una reacción que se produce bajo el
control de una enzima, o de un catalizador
en general, alcanza el equilibrio mucho más
deprisa que la correspondiente reacción no
catalizada.
Al igual que ocurre con otros catalizadores,
las enzimas no son consumidas por las
reacciones que catalizan, ni alteran su
equilibrio químico. Sin embargo, difieren de
otros catalizadores por ser más específicas.
Las enzimas catalizan alrededor de 4.000
reacciones bioquímicas distintas. No todos
los catalizadores bioquímicos son proteínas,
pues algunas moléculas de ARN son
capaces de catalizar reacciones (como la
subunidad 16S de los ribosomas en la que
reside la actividad peptidil transferasa).
También cabe nombrar unas moléculas
sintéticas denominadas enzimas artificiales
capaces de catalizar reacciones químicas
como las enzimas clásicas.
La actividad enzimática puede ser afectada
por otras moléculas. Los inhibidores
enzimáticos son moléculas que disminuyen
o impiden la actividad de las enzimas,
mientras que los activadores son moléculas
que incrementan dicha actividad. Muchas
drogas o fármacos son moléculas
inhibidoras. Igualmente, la actividad es
afectada por la temperatura, el pH, la
concentración de la propia enzima y del
sustrato, y otros factores físico-químicos.
Dentro del género Saccharomyces, la
especie cerevisiae constituye la levadura y
el microorganismo eucariota más estudiado,
Este organismo se conoce también como la
levadura de panadería, ya que es necesario
agregarla a la masa que se utiliza para
preparar el pan para que este esponje o
levante de hecho, el término levadura
proviene del latín levare, que significa
levantar.
En 1897, los hermanos Hans y Edward
Buchner obtuvieron extractos libres de
células moliendo levadura para pan con
granos de arena, a los cuales adicionaron
grandes cantidades de azúcar de caña para
evitar su posible contaminación. Este
descubrimiento atrajo la atención de los
bioquímicos, que decidieron analizar cada
uno de los pasos que conducían a la
producción de etanol y bióxido de carbono a
partir de la glucosa. Este trabajo implicó el
esfuerzo de muchos científicos y dio como
resultado el descubrimiento y descripción del
metabolismo del carbono; algunas de las vías
metabólicas que conocemos actualmente,
llevan los nombres de los científicos que
participaron en este trabajo, como Embden
Meyerhof.
Para realizar uno de los procedimientos de la
práctica se requiere un agar YPD el cual
cumple la función de permitir el crecimiento
de levaduras debido a que es un medio
complejo. Contiene peptona, extracto de
levadura y glucosa.
Con esta práctica se busca comprender de
alguna u otra forma la actividad enzimática
sobre la glucosa en un extracto de proteínas
de levadura y así mismo conocer el efecto del
pH y la temperatura sobre dicha actividad.
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Entender el efecto del pH y la temperatura y
cómo influye cada uno de estos sobre la
actividad enzimática, para especificar dicha
actividad sobre la glucosa de un extracto de
levadura S. cerevisiae, para ello comprender
los principios del análisis cinético
enzimático.
MATERIALES Y MÉTODOS
 Levadura S. cerevisiae
proporcionada por el laboratorio
microbiológico de la Universidad de
Santander.
 Asas microbiológicas de argolla
 Cortes de papel Kraft.
 Micropipetas de 1-10, 10-100 y 100
a 1000 uL.
 Puntas estériles de amarillas y
azules para las micropipetas
anteriores.
 Tubos de vidrio de 5 ml.
 Tubos tapa rosca de 18x125
 estériles.
 Cubetas para espectrofotómetro.
 Espectrofotómetro.
 Balanza.
Reactivos
 Agar YPD
 Agua destilada estéril.
 Solución salina 0.89%
 Etanol 70 %
 Solución de glucosa 150mg/mL en
solución salina.
 Solución de HCl 10mM.
 Solución de NaOH 1mM.
Preparación del extracto crudo de
levadura Saccharomyces cerevisiae.
Con la ayuda del laboratorio de
microbiología de la universidad de
Santander, se nos proporcionó la cepa de
Saccharomyces cerevisiae (levadura)
adicionando agua estéril a las cajas de
Petri y con un asa de argolla se
desprendió las colonias, se lavó y se
transfirió a la siguiente caja en la cual se
repitió el mismo proceso. Posteriormente
con una pipeta se transfirió a un tubo de
ensayo.
Fig. 1. Preparación del extracto de
levadura
Se tomaron 10 µL de la suspensión de la
placa del agar YPD. Seguidamente se le
adicionaron 20 µL de SDS al 20 % y 10 µL
de la solución de liticasa la cual cumple
una función de ruptura en las paredes
celulares, posterior a esto se agito bien
hasta homogenizar la muestra de manera
correcta, luego de esto se adicionaron 10
µL a la placa del agar YPD.
Y por último se realizó un proceso de
incubación de 37°C por 20 minutos, al
haber a travesado este proceso se
tomaron 10 µL para inocular en el agar
YPD en otra región. (observar la maya de
la fig. 1).
Se cuantifico la cantidad de proteínas que
se encontraba en el extracto con el
reactivo de Bradford. Para realizar esto,
se tomaron 20 µL del extracto y se le
adiciono 1 mL del reactivo de Bradford,
haciendo uso del tubo patrón de 1mg/mL
de BSA para determinar la concentración
del extracto.
Efecto de la temperatura en la actividad
enzimática.
La velocidad de las reacciones
enzimáticas aumenta, por lo general, con
la temperatura, dentro del intervalo en que
la enzima es estable y activa. La velocidad
por lo general se duplica por cada 10°C de
aumento térmico. Para este
procedimiento se tomaron 3 tubos de
ensayo con un mL de glucosa, luego se le
adicionaron 50 µL del extracto crudo de
levadura de Saccharomyces cerevisiae
junto con 50 µL de agua destilada esteril
cada uno de estos tubos se marcaron
como 7, 8 y 9 se agitaron correctamente
durante 2 minutos aproximadamente y se
llevaron a incubar a temperaturas
diferentes 4°C, 37°C y 50°C
respectivamente. Posteriormente a otros
tres tubos se les adiciono 500 µL del
reactivo de glucosa oxidasa
adicionalmente con respecto a los tubos 7,
 8 y 9 se le adicionaron 10 µL a los tubos
con glucosa oxidasa se dejó a Tabla 2. Cuantificación de la cantidad
temperatura ambiente con el fin de que se
de proteínas en el extracto de levadura
estabilizara la reacción durante 15
minutos, luego se le adicionaron 500 µL con el reactivo de Bradford.
de agua destilada y se leyó la absorbancia
a 500 nm Grupo Tubos Absor
bancia
RESULTADOS 500 nm
Profesora Blanco 0
Profesora Patrón (Glucosa) 0,383
Debido a que las enzimas son Grupo #1 Extracto 0,472
extremadamente selectivas con sus Grupo #1 T7 0,960
sustratos y su velocidad crece solo con Grupo #1 T8 0,919
algunas reacciones, el conjunto (set) de Grupo #2 Extracto 0,240
enzimas sintetizadas en una célula Grupo #2 T7 0,138
determina el tipo de metabolismo que tendrá Grupo #2 T8 0,081
cada célula. A su vez, esta síntesis depende Grupo #3 Extracto 0,471
de la regulación de la expresión génica. Grupo #3 T7 0,328
Grupo #3 T8 0,243
Grupo #4 Extracto 0,047
Grupo #4 T8 0,319
Grupo #4 T9 0,113
Grupo #5 Extracto 0,658
Grupo #5 T8 0,661
Grupo #5 T9 0,708
La velocidad de las reacciones enzimáticas
aumenta, por lo general, con la temperatura,
dentro del intervalo en que la enzima es
estable y activa. La velocidad por lo general
se duplica por cada 10°C de aumento
térmico. La actividad enzimática máxima se
alcanza a una temperatura óptima, luego la
Fig. 2. Malla para la inoculación de la levadura actividad decrece y finalmente cesa por
en el medio agar YPD. completo a causa de la desnaturalización
progresiva de la enzima por acción de la
temperatura.
Tabla 1. Absorbancia a 595 nm de las A bajas temperaturas, las reacciones
concentraciones de SDS y Solución de disminuyen mucho o se detienen porque
Liticasa. decrece la cinética molecular, pero la acción
# Albumina Solución de catalítica reaparece cuando la temperatura
Grupo SDS Liticasa se eleva a valores normales para la enzima.
No olvidar que una enzima humana típica
1 2,426 nm 0,860 nm
posee su óptimo a 37 º C, en cambio otros
2 2,654 nm 0,485 nm
organismos como, por ejemplo, las bacterias
3 2,235 nm 1,129 nm
termófilas resistentes a altas temperaturas
4 2.363 nm 0,479 nm tienen su óptimo de actividad cercano a los
5 2,155 nm 0,323 nm 80º C (Figura 2).
DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 WILSON, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical

Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press.

 Glibota, G. S., Garro, O. A., & Judis, M. A. (2000). Comparación de distintos

métodos para medir la actividad enzimática del látex de Carica papaya.
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas, 0–3.

 Ortiz-Moreno, M. L., & Uribe-Velez, D. (2011). Nuevo método para la cuantificación

de la actividadendoglucanasa basado en el complejo celulosa-rojo congo.
Orinoquia, 15(1), 7–15.

 Bioquímica. (2004). Devlin, T. M. 4ª edición. Reverté, Barcelona. Bioquímica 3ª

Edición. (2002) C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern. Pearson Educación S.A.

 Bioquímica Médica. (2009) Pacheco Leal D. Limusa. Bioquímica de los procesos

metabólicos 2ª Edición (2006) V. Melo, O Cuamatzi. Reverté.

ANEXOS