UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIRIQUÍ INHIBICIÓN ENZIMÁTICA DE LA

DESHIDROGENASA SUCCINÍCA DEL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y
HÍGADO
EXACTAS
Resumen
ESCUELA DE QUÍMICA Esta experiencia se realizó con la finalidad de
determinar la capacidad inhibidora que
presentan los diferentes tipos de inhibidores, en
este caso se utilizó malonato de sodio, azida de
sodio y cianuro de sodio. La enzima en estudio
INFORME DE LABORATORIO fue la deshidrogenasa succínica, es una enzima
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA DE LA que se encuentra asociado a la membrana
DESHIDROGENASA SUCCINÍCA DEL interna de la mitocondria; en este laboratorio la
HÍGADO fuente de mitocondrias fue el hígado de pollo. El
sustrato en este caso es el succinato de sodio
0.2M. Se dispusieron de seis tubos de ensayo
en los cuales se agregó la misma cantidad de
homogenizado (enzima), amortiguador y azul de
metileno variando entonces sustrato, agua
PRESENTADO POR
destilada agregada y los inhibidores de azida,
SHARON CUBAS malonato y cianuro de sodio. En los tubos que
contenían los inhibidores de malonato, azida y
(4-782-2072)
cianuro de sodio se obtuvo un tiempo de
decoloración de 15.00, 15.18 y >15.30 minutos
respectivamente y para los tubos que no
ESTEBAN ARJONA
contenía sustrato, y que contenían el
(4-779-2316) homogenizado a temperatura ambiente y a 52°C
se obtuvo que en el primer caso no se observó
cambios en la coloración; en el segundo caso se
observó una decoloración a los 11.25 minutos y
por último en el caso del homogenizado a 52°C
se obtuvo un tiempo de 10.58 minutos. Con los
PROFESORA resultados se infiere que el inhibidor que
Mgtra. ALBERTINA MONTENEGRO presentó mejor inhibición de la actividad
enzimática experimentalmente fue el malonato,
sin embargo teóricamente se sabe que el
cianuro es un inhibidor altamente efectivo. Por
otro lado se observó el efecto que ejerce la
temperatura sobre la actividad enzimática,
debido que se observó una mayor disminución
de la actividad al someter el homogenizado a
23 DE MAYO DE 2017 una temperatura de 52°C comparado al
homogenizado que se encontraba a temperatura
ambiente. Podemos concluir que la activad
enzimática puede verse afectada en una
disminución de sus funciones enzimáticas,
debido al efecto de pH, temperatura y también
podrá verse afecta por la presencia de
inhibidores.
Objetivos
Analizar la importancia de los inhibidores
enzimáticos.
Resaltar el mecanismo de inhibición enzimática
sobre la deshidrogenasa succínica.
Explicar el mecanismo de acción de los
inhibidores empleados.
Introducción
Una oxidorreductasa es una enzima que cataliza
la transferencia de electrones desde una
molécula donante (el agente reductor) a otra
aceptora (el agente oxidante). Según
(González, 2010) nos dice que las enzimas
oxidorreductasas catalizan reacciones de
oxidorreducción, es decir, transferencia de
hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a
otro, según la reacción general:
Figura 1. Reacción general para de óxido reducción
de la succinato deshidrogenasa.
De acuerdo con (Sierra, 2013) dice que las
células de la gran mayorías de los organismos
vivos llevan a cabo un conjunto de reacciones
de óxido reducción mediante la cual la gran
cantidad de energía liberada a través de la
degradación de moléculas orgánicas es
almacenada en moléculas de alto nivel
energético (ATP). La succinato deshidrogenasa
es una enzima clasificada dentro del grupo de
las oxidorreductasas, cataliza una reacción muy
importante en el metabolismo oxidativo de la
célula: la conversión del succinato en fumarato.
Esta enzima se localiza en eucariontes en la
membrana mitocondrial interna. El H2 cedido
por el succinato puede ser transferido del
FADH2 a un colorante susceptible como el azul
de metileno que al cambiar su estado redox pasa
de coloreado a incoloro o viceversa. (González,
2010) explica que la coloración de la oxidación y
reducción del azul de metileno al cambiar su
estado redox.
Acción de los inhibidores
Los inhibidores son sustancias que impiden la
actividad de las enzimas por combinarse con
radicales indispensables para el funcionamiento
enzimático o por ser agentes desnaturalizantes.
El inhibidor posee una estructura similar a la del
sustrato y compite por situarse en el sitio del
sustrato para formar un complejo enzima-
inhibidor, disociable, dificultando la formación
del complejo enzima-sustrato y por lo tanto la
actividad enzimática. La enzima no tiene acción
sobre el inhibidor, ni el inhibidor competitivo
desnaturaliza a la enzima; sólo impide su
función. (Alvarado, 2013).
Ejemplo de ello es la Deshidrogenasa succínica
en presencia de succinato y de un aceptor de
hidrógenos adecuado, convierte el succinato en
fumarato y reduce simultáneamente el aceptor
de H.
Factores que afectan a la actividad enzimática
Diferentes factores ambientales pueden afectar
a la actividad enzimática. Como lo son el pH, la
temperatura y la presencia de inhibidores.
Materiales y reactivos
Solución amortiguadora de fosfato monobásico
de sodio 0.1M de pH 7.4, agua destilada,
malonato de sodio 0.1M, succinato de sodio
0.2M, azida de sodio 0.1M, cianuro de sodio
0.1M, hígado fresco, acetona, gradillas, tubos de
ensayo, licuadora, vasos químicos (100-250ml),
varillas de vidrio, micropipetas Labmate de
100/1000 µL, baño termostático.
Procedimiento
I. Se cortó una porción de 50 g de hígado fresco
en trozos pequeños y se homogenizó en una
licuadora con 100 mL de agua destilada.
II. Se midió 40 mL del homogenizado y se diluyó
hasta 200mL de agua destilada. Se agitó la
mezcla vigorosamente.
III. Se dispusieron de 6 tubos de ensayo en los oxidorreductasas, cataliza una reacción muy
cuales se les añadió las siguientes cantidades importante en el metabolismo oxidativo de la
de reactivos en mL, como se muestra a célula: la conversión del succinato en fumarato.
continuación: Esta enzima se localiza en eucariontes en la
Tubo 1 2 3 4 5 6 membrana mitocondrial interna. El H2 cedido por
Amortiguador 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
el succinato puede ser transferido del FADH2 a
Sustrato 0.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua un colorante susceptible como el azul de
1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 0.0 metileno que al cambiar su estado redox pasa
destilada
Azul de de coloreado a incoloro o viceversa.
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
metileno
Malonato de
- - - 0.5 - -
sodio
Azida de sodio - - - - 0.5 -
Cianuro de
- - - - - 0.5
sodio
homogenizado 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

IV. El homogenizado se agregó de último. El

homogenizado correspondiente al tubo 3 se
calentó previamente a una temperatura de 52°C
por 15 minutos.
V. Todos los tubos se agitaron y se les adicionó
5 gotas de aceite mineral a cada uno (para evitar
interferencia ocasiona por el oxígeno del aire).
VI. Se pusieron posteriormente los tubos en un
baño de agua a temperatura de 36°C, se
observaron los cambios en los diferentes tubos
y se registró el tiempo en que se decoloraban.
Resultados y discusión
Cuadro 1. Datos obtenidos en el tiempo de
decoloración de cada tubo de ensayo.
Figura 2. Decoloración de la enzima deshidrogenasa
succínica, por efecto de temperatura e inhibidores.
La succinato deshidrogenasa es una enzima
clasificada dentro del grupo de las
Figura 3. Reacción entre la succinato
deshidrogenasa y el azul de metileno.
En los resultado del tubo 1 como podemos
observar no hubo reacción ya que no contenía
sustrato además de que era nuestra sustancia
blanco por lo tanto no hubo inhibición. Por lo
tanto no pudo realizar su conversión de
succinato a fumarato.
En el tubo 2 podemos observar una
decoloración el cual nos indica que hubo
inhibición la cual se dio al cabo 11.25min, los
que nos señala que succinato deshidrogenada
pudo realizar la conversión de succinato a
fumarato. Según (Walla, 2000). esto se logra
removiendo 2H+ y 2 electrones del succinato
para formar fumarato y la coenzima reducida
(FADH2), en este caso la enzima
deshidrogenada succínica reduce al azul de
metileno, ya que este actúa como aceptor y el
azul de metileno reducido es incoloro.
En el tubo 3 podemos observar una
decoloración por lo tanto nos asegura que hubo
inhibición la cual se dio al cabo de 10.58
minutos, cabe señalar que esta reacción fue la
más rápida debido a que se le agrega calor
calentándolo previamente a temperatura de
520C lo cual un aumento de la temperatura
provoca un aumento en la velocidad de
reacción. Se utiliza azul de metileno porque es
un indicador redox apropiado para estas
funcione. Se trata de una sustancia de color azul
en su forma oxidada, que al aparecer átomos de
hidrógenos del sustrato originan la forma leuco,
la cual es incolora (Marks, 2006).
En el tubo 4 hubo inhibición debido a que hubo
una decoloración al cabo de 15 min. El malonato
es un inhibidor de la respiración celular, porque
se une al sitio activo de la succinato
deshidrogenasa en el ciclo del ácido cítrico, pero
no reacciona, compitiendo con el succinato. En
la reacción de fosforilación oxidativa, el
malonato es un inhibidor del complejo II que,
nuevamente, contiene succinato
deshidrogenasa. El malonato es un inhibidor
competitivo de la deshidrogenasa succínica, de
tal manera que la presencia de malonato detiene
el ciclo de Krebs. La reacción que cataliza la
enzima es la de deshidrogenar al succinato para
producir fumarato y FADH2. Detener el ciclo de
Krebs implica parar la cadena respiratoria y por
lo tanto la maquinaria de producción de ATP.
Cuando ocurre la inhibición de una enzima que
se encuentra dentro de una determinada vía
metabólica, el sustrato de la enzima tiende a
acumularse, ya que no puede ser transformado
en un producto, (Gonzales, 2010).
En el tubo 5 se observa una decoloración al cabo
de 15.18 min lo cual no indica que hubo reacción
o inhibición. Las azidas afectan a la cadena
respiratoria. Son substancias que se enlazan a
alguno de los componentes de la cadena de
transporte de electrones bloqueando su
capacidad para cambiar de una forma reversible
desde la forma oxidada a la forma reducida y
viceversa.
Esta inhibición resulta en una acumulación de
los componentes en sus formas reducidas antes
del punto de inhibición, y la presencia de las
formas oxidadas de los componentes de la
Cadena de Transporte de Electrones después
del punto de inhibición.
Y por último en el tubo 6 se observó que no hubo
una decoloración por lo tanto no hubo actividad
inhibidora en el tiempo estipulado. Sin embargo
el cianuro es un inhibidor más efectivo según
(Stryer, 2003). Se puede deducir que no hubo
una actividad inhibidora debido a que no se le
dejo reaccionar por más tiempo. La función del
cianuro como inhibidor es actuar sobre el Hemo
a3 de la citocromooxidasa impidiendo su
interacción con el oxígeno.
Conclusiones:
 Por medio de la reacción de oxidación
producida entre la deshidrogenasa y el azul
de metileno, que es un indicador redox
apropiado para homogenizados de tejidos,
se pudo evidenciar la actividad enzimática
que presenta la deshidrogenasa succínica
frente al efecto de la temperatura y a la
presencia de sustancias inhibidoras como el
malonato, azida y cianuro de sodio.
 Podemos concluir que la actividad
enzimática es de gran importancia debido a
que estudia la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas. Por lo que nos
proporcionan información directa acerca del
mecanismo de la reacción catalítica y de la
especificidad del enzima.
 Inferimos que la velocidad de reacción
observada en la reacción de oxidación del
azul de metileno y la deshidrogenasa
succínica es la velocidad máxima de
reacción, es decir, la velocidad en que se da
la aparición de los productos o la
desaparición de los reactivos.
 A través de los mecanismo de la acción
enzimática se puede aceleran la obtención
del equilibrio en un tiempo menor como
también la reacción ocurre de acuerdo al
número de moléculas con suficiente energía
cinética y adecuada orientación para
sobrepasar la energía de activación de la
reacción.
Bibliografía:
-Alvarado, S. (2013). Bioquímica II. Recuperado
el 21 de mayo de 2017 de
http://quimicosfarmacobiologos.bligoo.com.mx/
media/users/10/523320/files/51871/Ma.
-González, J. (2010). Clasificación de las
enzimas. Recuperado el 21 de mayo de 2017 de:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz1
3.htm#c1
-González, M. (2010). Química. Indicador redox.
Recuperado el 07 de noviembre de 2015 de:
http://quimica.laguia2000.com/conceptos-
basicos/indicador-redox.
-Marks, R., Collen S. & Lieberman, M. (2006).
BIOQUIMICA BASICA. Un enfoque clínico.
España: Mcgraw-hills. Interamericana.
-Sierra, K. (2013). Actividad enzimática.
Recuperado el 21 de mayo de 2017 de
http://www.medicina.uat.edu.mx/bioquimica/enz
imas/Enzimas_y_coenzimas2.html
-Stryer, L. (2003). Bioquímica. México: Ed.
Reverté.
-Walla, M. Marchuk, D. (2000). Activated
enzymatic: Identificacion de alfa-amilasa salival.
2aed. España: Lancet.