1.

Establecer un protocolo de laboratorio para el aislamiento (derivación) de

células a partir de una biopsia de piel de un animal.

Aislamiento de hepatocitos humanos a partir de biopsias hepáticas quirúrgicas y de

órganos o lóbulos enteros.

La obtención de hepatocitos a partir de biopsias se realiza mediante perfunsión enzimática del

tejido hepática. El aislamiento de hepatocitos a partir de órganos o lóbulos enteros se realiza
mediante la adaptación del procedimiento utilizado para biopsias hepáticas de pequeño tamaño.

Procedimiento

Los hepatocitos se siembran en placas recubiertas de una mezcla de fibronectina y colágeno

(fibronectina 1 mg/100mL, colágeno 3 mg/100 mL y BSA 10 MG /100Ml en medio DMEM), a una
densidad de 8 x10^4 células viables/cm^2. El medio a utilizar es Ham’s F-12/Wil-liams (1:1)
(Gibco BRL, Paisley, UK) complementado con un 2% de suero de ternera (Gibco BRL, Paisley,
UK), penicilina 50 mU/mL, estreptomicina 50 µg/mL, 0,2% de albúmina bovina sérica, insulina
10–8 M, transferrina 25 µg/mL, etanolamina 65,5 mM, ácido linoléico 7,2 mM, glucosa 17,5 mM,
ácido ascórbico, 6,14 mM, y N-omega-nitro-L-arginina etiléster 0,64 mM.

A partir de las 24 horas los cultivos se mantienen en un medio sin suero complementado con hor-
A. e insulina.

Protocolo para la diferenciación hepatogénica de las células madre mesenquimales de

tejido adiposo (ADSC)

Procedimiento

Para conseguir la transdiferenciación de las células mesenquimales a linaje hepático se

desarrolla un protocolo basado en un acondicionamiento de las células mediante el cultivo
durante dos días con medio base (DMEM sin suero y gentamicina) complementado con

EGF 20 ng/mL (Sigma, Madrid, España), FGFb y FGF4 10 ng/ml (LifeTechnologies, Barcelona,
España) y BMP2 y BMP4 50 ng/ml (Sigma,Madrid, España).

A continuación las células se mantienen durante siete días en el medio base pero
complementado con HGF 20 ng/ml(PeproTech EC, Londres, UK), FGFs 10 ng/ml y nicotinamida
4,9 mM (Sigma, Madrid, España).

Y, finalmente (Etapa 2), las células se cultivan entre 7-14 días en medio base complementado
con OSM 20 ng/ml, dexametasona 1 mM.

2. ¿Buscar por qué es necesario el EDTA (Tripsina-EDTA) para subcultivar las

células adheridas a mono capa?
El EDTA -ácido etilendiaminotetraacético es un quelante el cual capta iónes calcio la tripsina es
una enzima peptidasa, que rompe los enlaces peptídicos de las proteínas debido a esto se
produce el desprendimiento de las células adheridas a las placas o entre ellas(células) además
cuenta con una actividad proteolítica lo que permite romper las uniones entre células. Una vez
rotas las uniones celulare basta con centrifugar o agitar la muestra para obtener una suspensión
celular.

3. Describir cómo realizaría una curva de crecimiento celular a partir de un cultivo

de células adherentes.

Para elaborar la curva tomamos en cuenta las células que se encuentran vivas

Para realizar la curva de crecimiento se debe realizar un conteo celular (recuento celular) esto es
útil para saber el crecimiento del cultivo el recuento se realiza en la cámara de Neubauer la cual
tiene cierto parecido con un portaobjeto con base en la cantidad de células contadas, conociendo
el volumen de líquido que admite el campo del retículo, se calcula la concentración de células
por unidad de volumen de la muestra inicial.

Además de lo anterior es necesario tener en cuenta otras consideraciones como fase de

proliferación en la que se encuentran las células medios utilizados etc.

4. Indicar las medidas de bioseguridad que deben operar en un laboratorio de

cultivo de células de mamífero.

Artículo 106.Los cultivos celulares son el resultado del crecimiento “in vitro” de células obtenidas
de organismos pluricelulares. Tienen la categoría de agentes biológicos refiriéndose en este
caso, tanto a los cultivos celulares primarios, como a los de líneas continuas celulares o cepas
celulares bien definidas. Los cultivos celulares no contaminados generalmente no presentan un
riesgo significativo, y aun la inoculación dérmica origina sólo una inflamación local. Sin embargo,
estos cultivos pueden contribuir sustancialmente al riesgo de exposición a agentes biológicos ya
que pueden actuar como la base o ayudar a la supervivencia y/o la replicación de agentes
oportunistas, o ser origen de otros riesgos potenciales. Los agentes oportunistas más
característicos son los virus y entre los otros riesgos pueden citarse la contaminación por
micoplasmas, o productos celulares que pueden ser moléculas biológicamente activas con
propiedades farmacológicas, de inmunomodulación o sensibilizantes.

Artículo 107. Evaluación del riesgo. El nivel de riesgo que presenta el trabajo con cultivos
celulares es variado. Por un lado se debe considerar si las cepas o líneas celulares utilizadas
tienen una procedencia lo suficientemente documentada para garantizar y evitar la problemática
asociada con la contaminación cruzada de la línea celular original por otro tipo de células.
Respecto a los cultivos celulares habrá que considerar asimismo tanto su origen anatómico
como el de la especie, ya que está directamente relacionado con su potencial infeccioso por
virus u otros agentes patógenos en humanos. En ningún caso el trabajador que realice los
cultivos celulares podrá utilizar sus propias células para el desarrollo “in vitro”. Las células
humanas para cultivo deberán obtenerse solamente de individuos que no tengan relación con el
trabajo experimental. Los cultivos celulares de mayor riesgo son los que proceden de primates y
humanos, especialmente si derivan de sangre periférica, tejido linfoide y nervioso. Cuando se
sospeche la infección del cultivo celular por un agente patógeno para el hombre, dichos cultivos
deberán ser manejados en un nivel de contención adecuado al agente en cuestión. La elección
del nivel de contención, según el origen del cultivo celular, se muestra en la siguiente Tabla:

Artículo 108. Riesgos en los procedimientos de cultivos celulares En la manipulación de cultivos

celulares deberán minimizarse todas las tareas que contribuyan a la formación de aerosoles o
salpicaduras: trasvases, derrames, pipeteos continuados y rápidos. Las agujas no deberán
utilizarse si existe una alternativa razonable. Como en todo trabajo con material infeccioso o
potencialmente infeccioso, deberán utilizarse cabinas de seguridad biológica, las cuales estarán
correctamente instaladas y regularmente mantenidas y comprobadas. Algunos productos
celulares pueden ser alergénicos por lo que en estos casos se requerirán unos estrictos niveles
de contención primaria y/o protección personal de los trabajadores para prevenir la inhalación o
el contacto con las mucosas.

Artículo 109. Contención. Como se indicó en la Tabla anterior, cuando hay evidencia o
sospecha de la presencia de patógenos (por ejemplo: Herpesvirus simiae en tejidos de simios o
VIH en células blancas de sangre periférica), los cultivos celulares se manipularán en el nivel de
contención requerido para el patógeno en cuestión. Todos los procedimientos implicados en la
propagación de cultivos celulares que estén contaminados deberían llevarse a cabo como
mínimo en el nivel de contención 2, en la realización de las manipu1aciones. Cuando se utilice
sólo un pequeño número de células con un bajo riesgo de infección y no se encuentren en fase
proliferativa podrá no ser necesaria la cabina de seguridad. Por el contrario, donde el volumen y
número de células es alto (procesos a gran escala) o donde el nivel de exposición va
aumentando por la inevitable producción de aerosoles, los niveles de contención y planes de
contingencia deberán ser más estrictos.

Artículo 110. Desinfección y desecho de residuos. Es necesaria la existencia de normas efectivas

para la descontaminación de todos los materiales utilizados en relación con los cultivos celulares
y fluidos de desecho. Los procedimientos de descontaminación deberán ser capaces de
inactivar virus y otros agentes contaminantes aun en presencia de fluidos con una elevada carga
de material orgánico. La descontaminación química es por esta causa menos efectiva que la que
se obtiene por calor. El riesgo de infección en las sucesivas etapas necesarias para el
tratamiento de los desechos deberá ser valorado, tomando las medidas adecuadas en cada
caso.

Artículo 111. Conclusiones. Para el manejo seguro de los cultivos celulares es necesaria una
valoración adecuada de los riesgos, una buena organización del trabajo y la aplicación de los
principios de las buenas prácticas en el laboratorio. Es importante adoptar procedimientos de
separación que prevengan la transmisión accidental de agentes infecciosos de un cultivo a otro.
Para evitar dichas transmisión así como la contaminación cruzada entre células, sólo deberá
manipularse una celular cada vez, utilizando métodos adecuados de descontaminación,
especialmente en las operaciones desarrolladas entre diferentes tipos de células. Es
recomendable que los cultivos celulares que están infectados se manipulen al final del período
de trabajo o preferiblemente en un laboratorio diferente de los que se reconocen como libres de
infección.
 5. En el supuesto que Ud. tiene que sembrar 500.000 células en una placa de
cultivo de 100 mm de diámetro con 10 ml de medio de cultivo y dispone de 4.5
ml de una suspensión celular de 25 x106/ml. ¿Qué volumen de esta
suspensión debe colocar en la placa para alcanzar la concentración deseada y
cuál es el número máximo de placas que podría sembrar?. Adicionalmente, Ud.
debe suplementar esta placa de cultivo con 5mM de L-glutamina. ¿Qué
volumen de glutamina debe añadir al medio de cultivo de esta placa si Ud.
prepara una solución pesando 2,5 gr. de glutamina y la disuelve en 50 ml de
PBS? (Nota: PM glut =146,15).

A. ¿Qué volumen de esta suspensión debe colocar en la placa para alcanzar la concentración
deseada y cuál es el número máximo de placas que podría sembrar?

25x106/ml = 25.000.000 cel x ml.

25.000.000 x 4.5 = 112.500.000 cel. en 4,5 ml.

500.000 x 4,5 = 2.250.000 / 112.500.000 = 0,02 ml. (por placa)

4,5 ml / 0,02 ml = 225 placas.

Conclusión:

- Para alcanzar la concentración de 500.000 células por placa es necesario agregar 0,02ml de la
suspensión celular de 4.5 ml 25 x106/ml

-Con la suspensión celular de 4.5 25 x106/ml es posible sembrar 225 placas.

B. Adicionalmente, Ud. debe suplementar esta placa de cultivo con 5mM de L-glutamina. ¿Qué
volumen de glutamina debe añadir al medio de cultivo de esta placa si Ud. prepara una solución
pesando 2,5 gr. de glutamina y la disuelve en 50 ml de PBS? (Nota: PM glut =146,15).