Citometría de Flujo:

Introducción, Aplicaciones, Clínica,

Investigación y Cáncer
T.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.
Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.
Laboratorio de Citometría de Flujo
Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.
Concepción, 16 de Agosto de 2004
¿Qué es la Citometría de Flujo?

Aplicaciones
 Flow Cytometry Publications/year 3,483

3,479

1999: 4.256 2002: 5.323 2003: 5.588 3345

1998: 3.889 2001: 5.025

1997: 3.613 2000: 4.771 2004: 3.205 (*)
2899

2,713
Papers
2,445
2700

2,332
2400

2100 1,855

1800
1,494

1500 1,232
1,078
1200 940
811

900 611
480
600
223
113
300
300 79
0 13 28

00

1976 1977 1978 1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996
YE A RS
(*) Data taken from Medline search using the keywords: “flow Cytometry”
(Agost 15th: 20:30 hrs)
¿QUE ES LA CITO / METRIA
DE FLUJO?

La Citometría de Flujo es una

tecnología que permite la
“medición simultánea de
múltiples características físicas y
químicas de células en
suspensión”
 ¿QUE INFORMACION ENTREGA UN
CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA
CELULA?

1.- Su tamaño.
2.- Su granularidad o complejidad
interna.
3.- Evaluación de características químicas:
• Fluorocromos
• Anticuerpos conjugados con fluorocromos

FACS: Fluorescence activated cell sorter

Relative Sizes of Biologicals
1 µm

S.aureus
5-8 µm
15-30 µm
Lymphocyte
Amoeba
 Componentes
• Sistema de Fluidos
• Sistema Optico:
• Fuente de luz
• Separación espectral
• Sistema Electrónico:
• Control mecánico, de luz y detectores
• Colección y análisis de pulsos
• Sistema Informático:
• Análisis y presentación de datos
 Flow Cell

Injector
Sheath Tip
fluid

Fluorescence
signals

Focused laser
beam
 SISTEMAS DE UN CITOMETRO
DE FLUJO
Sistema Optico:
• Consta de uno o varios láseres,
filtros, lentes y fotomultiplicadores.

• El láser produce una luz

monocromática utilizada para la
excitación de los fluorocromos.

Laser
Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
 Flow Cytometry Optics
PMT
4

Dichroic PMT
3
Filters
Flow cell
PMT
2
Bandpass
Filters
PMT
1

Laser
 Lasers
• Argon laser
• He-Ne Laser
 Optical Collection systems
2nd Argon Laser
Argon Laser He-Ne Laser
He-Cd Laser
Elite Cytometer with 4 Lasers
He-Cd laser

Santa clause

Air-cooled argon
laser

Water cooled
argon laser
ANTICUERPOS
MONOCLONALES

• Gran
disponibilidad
comercial
• Gran variedad de
fluorocromos
• Precios accesibles
• Pedidos vía Internet
• Gran Calidad
FLUOROCROMOS
 Fluorescein (FITC)
Excitation Emisson
300 nm 400 nm Wavelength
500 nm 600 nm 700 nm

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Relative Intensity

Protein
 Phycoerytherin (PE)
Excitation Emisson
300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Protein
 Propidium Iodide
Excitation Emisson
300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Relative Intensity

DNA
 Allophycocyanin (APC)
Protein 632.5 nm (HeNe)

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Excitation Emisson
 CITOMETRIA DE FLUJO

PREPARACION
DE LA MUESTRA

OBJETIVO: SUSPENSION CELULAR

 CITOMETRIA DE FLUJO
PREPARACION DE LA MUESTRA

Procedimiento St.:
• 100 µL de sangre total
• 10 µL del Ac. conjugado
• Incubar por 10-15 minutos RT
• Añade el lisador
• Leer en un citómetro de flujo
PROCESO DE ANALISIS DE
UNA MUESTRA

• CALIBRACION
• ADQUISICION
• ANALISIS
 CD45

CD4 CD8
CD8
ID

leu11a
be

CD20
Tu

Mo1

FITC Fluorescence
FORMA DE PRESENTACION
DE DATOS

• Histograma
• Gráfico de Puntos (Dot Plot)
• Gráfico de Contorno (Countour Plot)
• Gráfico Isométrico (3D)
• Gráfico de Densidad (Density Plot)
 Citometría de flujo: mediciones

“GATE”

SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN

G
M
L
 Density Dot Plot Contour Plot

Color of dots can give indication Identify subpopulations

of frequency of events with proper contour lines
 HISTOGRAMA
(Un Parámetro)

counts M1

Autofluorescencia
y/o
control isotipo

0 FL1
One parameter frequency histogram

# of events for
particular
parameter

establish regions and calculate coefficient of variation (cv)

cv = stdev/mean of half peak
 ESTADISTICA DE
CUADRANTES
(Dos Parámetros)

FL2

Autofluorescencia
y/o
control isotipo

0 FL1
 ESTADISTICA DE
CUADRANTES
(Dos Parámetros)
1 2

-,+ +,+
FL2

3 4

-,- +,-

0 FL1
 CITOMETRIA DE FLUJO:
APLICACIONES

• Hematología • Toxicología
• Inmunología • Microbiología
• Patología • Parasitología
• Transplantes • Citogenética
• Farmacología • Virología
• Biología • .........
 EVOLUCION DE LA
CITOMETRIA DE FLUJO
Inmunología Celular

Anticuerpos Aplicaciones en Citometría de

Monoclonales Patología Flujo

CITOMETRIA CLINICA
 CITOMETRIA DE FLUJO:
Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias
• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas
• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular
• Estudio de macrófagos intestinales (EII).
• Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.)
• Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)
• Cuantificación de moléculas
• Estudio de Células Progenitoras (CD34)
• Estudios de Función Plaquetaria
• Estudios de Resistencia a Drogas
• Estudio de Citokinas Intracelulares
 SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS

• Linfocitos T totales :CD3(+)

• Linfocitos T Helper :CD3(+)CD4(+)
• Linfocitos T Sup/Citot :CD3(+)CD8(+)
• Linfocitos B :CD3(-)CD19(+)
• Linfocitos Natural Killer (NK) :CD3(-)CD16(+)CD56(+)
• Relación Linfocitos T CD4/CD8
Infección VIH-SIDA
 File: 111.003
Acquisition Date: 23-Apr-
Gate: G6
Gated Events: 12430
Total Events: 15000

Quad Events % Gated % Total

UL 20 0.16 0.13
UR 1496 12.04 9.97
LL 2028 16.32 13.52
LR 8886 71.49 59.24

RELACION CD4/CD8 = 0.17

File: 111.004
Acquisition Date: 23-Apr-
Gate: G6
Gated Events: 12512
Total Events: 15000

Quad Events % Gated % Total

UL 600 4.80 4.00
UR 8866 70.86 59.11
LL 1499 11.98 9.99
LR 1547 12.36 10.31
 EXAM EN R E SU L T A D O R A N G O R E F E R E N C IA

LE U C O C ITO S TO TA LE S 8.500 x m m 3

LIN FO C ITO S A B SO LU TO S 2.295 x m m 3

LIN FO C ITO S T (C D 3) 1.916 x m m 3

83.50 % 59.4 -84.6 %

LIN FO C ITO S B (C D 19) xm m 3

% 6.4 -22.6 %

LIN FO C ITO S T (C D 4) 12.04 % 28.5 -60.5 %

276 x m m 3

LIN FO C ITO S T C IT/SU P (C D 8) 70.86 % 11.1 -38.3 %

1.626 x m m 3

R E LA C IO N T C D 4 /C D 8 0.17 1.2 -2.1

C E LU LA S LIN FO ID E S N K xm m 3

(N A TU R A L K ILLE R ) %
 INFECCION VIH SIDA

ACTIVACION DE LINFOCITOS T: CD38

• El aumento en la expresión de moléculas CD38 en LT

CD8 es un fuerte indicador pronóstico de progresión
hacia SIDA y muerte.
• Superior a:
• Rto. LT CD4
• Marcadores solubles
• Combinación HLA-DR+ CD38+

J. Acquir Immune Defic Syndr Retrovirol 16:83-92, 1997

Cytometry 26:1-7, 1996
Cytometry 33:115-122, 1998
 INFECCION VIH SIDA

GIORGI et al.

• Carcaterizaron el número de moléculas CD38 en LT CD8:

1.- < 2.470 =======> PROGRESOR LENTO

2.- 2.470 - 3.899====> PROGRESOR BAJO
3.- 3.900 - 7.250====> PROGRESOR ALTO
4.- > 7.250 =======> PROGRESOR RAPIDO

• Basado en la probabilidad de desarrollar SIDA dentro de 3

años
Cytometry 33:123-132, 1998
J. Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 16:83-92, 1997
Copyright Dennis Kunkel
Copyright Dennis Kunkel
 CITOMETRIA DE FLUJO:
Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias
• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas
• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular
• Estudio de macrófagos intestinales (EII).
• Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.)
• Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)
• Cuantificación de moléculas
• Estudio de Células Progenitoras (CD34)
• Estudios de Función Plaquetaria
• Estudios de Resistencia a Drogas
• Estudio de Citokinas Intracelulares
INMUNOFENOTIPIFICACION
DE LEUCEMIAS

“Los distintos tipos de leucemias son un

grupo heterogéneo de patologías
resultantes de una proliferación
descontrolada de una o más tipos
celulares hematopoyeticos tanto en
médula ósea como sangre periférica”
 HEMATOPOYESIS
STEM CELL

CFU-GEMM CFU-ML CFU-L

CFU CFU CFU CFU-GM

ERITROIDE BASOFILO EOSINOFILO LINFOCITO B LINFOCITO T
MEGACARIOCITO

ERITROCITO PLAQUETAS BASOFILO EOSINOFILO NEUTROFILO MONOCITO

RETENCION DE ANTIGENOS

• Células malignas frecuentemente

conservan antígenos asociados con la
célula normal a partir de la cual fueron
derivados
CD19 CD19

Transformación

Maligna
CELULA CELULA
PRE-B NORMAL LEUCEMICA
 CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)

•LLA-B :
-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.
-BII Común : CD10.
-BIII Pre B: clg.
-BIV Madura : slg
•LLA-T :
-TI-proT: CD7
-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8
-TIII-Cortical: CD1a
-IIV-Madura: CD1a y CD3mb
•LMA :
-LMA-M6 : glicoforina A
-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b
-LMA-M3 : HLA-DR(-)
-LMA-M4 : HLA-DR(+)
Características normales
• Paciente sexo masculino
• 43 años
• Dgto. Leucemia Aguda
Leucemia
Linfoblástica
De Línea B
(B-II:Común)
 CITOMETRIA DE FLUJO:
Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias
• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas
• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular
• Estudio de macrófagos intestinales (EII).
• Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.)
• Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)
• Cuantificación de moléculas
• Estudio de Células Progenitoras (CD34)
• Estudios de Función Plaquetaria
• Estudios de Resistencia a Drogas
• Estudio de Citokinas Intracelulares
 Cellular Function
• Phagocytosis
• Killing index of phagocytes
• Intracellular cytokines
• Calcium flux
• Oxidative burst
• Membrane potential
 Human Neutrophil
Phospolipase A2 activity
Leukotrienes

Lipid Peroxidation

OH.
Phagosome

H2O2 O2-
+ H2O + O2
H +
H2O2
Stimulant ? O2 SOD Catalase
(PMA) O2- O2- SOD
PKC
GSSG H2O2

? NADPH
Oxidase GR
GSH
GP

PCB NADPH + H+ H2O

NADP+

HMP

PCB

PCB
(Reduced GSH level)
 DCFH-DA DCFH DCF
2’,7’-dichlorofluorescin diacetate
O O
CH3-C-O O O-C-CH3

Cl Cl 2’,7’-dichlorofluorescin
H
COOH HO O OH
Fluorescent
Cellular Esterases Cl Cl
H 2’,7’-dichlorofluorescein
COOH
Hydrolysis HO O O
H2O2
Cl Cl
H
DCFH-DA Oxidation COOH

Neutrophils

DCFH-
DCFH-DA
Monocytes 80

Control PMA-stimulated PMN

60
DCFH H O

counts
2 2
Lymphocytes 40

DCF 20

0
.1
1log FITC 10
Fluorescence
100 1000
Estallido respiratorio en Granulocitos

• Adulto normal
• No estimulado : 25.86 %
• Estimulado con PMA : 76.98 %

No estimulado

Estimulado
Estallido respiratorio
Caso clínico:
• Paciente de sexo femenino
• 8 años
• Infecciones dérmicas recurrentes por S.aureus.
• Granulomas fríos en cara y piernas
• Déficit parcial de IgA.

• Evaluación de estallido respiratorio en

granulocitos y monocitos.
• Inicio de terapia antibiótica con claritromicina
250 mg/12 hrs por 30 días.
• Evaluación de estallido respiratorio en
granulocitos y monocitos, post terapia.
 Estallido respiratorio en Granulocitos
No estimulado: Estimulado:
33.35 % 42.66 %

DCFA
Después de terapia antibióticaDCFA

No estimulado: Estimulado:
68.97 % 57.48 %

DCFA DCFA
 Estallido respiratorio en Monocitos
No estimulado: Estimulado:
25.97 % 57.06 %

DCFA DCFA
Después de terapia antibiótica

No estimulado: Estimulado:
76.26 % 76.81 %

DCFA DCFA
 CITOMETRIA DE FLUJO:
Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias
• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas
• Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular
• Estudio de macrófagos intestinales (EII).
• Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.)
• Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)
• Cuantificación de moléculas
• Estudio de Células Progenitoras (CD34)
• Estudios de Función Plaquetaria
• Estudios de Resistencia a Drogas
• Estudio de Citokinas Intracelulares
 Diagnóstico Serológico por Citometría de Flujo.

Bacterias: Uso de Microesferas (beads)

Ag *
+ +
*
Anti Ig humana
bead
Suero conjugada
paciente

Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195

J. Clin. Microbiol.. 1998;36:802-806
Cytometry 1994;18:103-108
Aplicaciones en
Microbiología
Aplicaciones en Microbiología clínica

Detección directa:
• Bacterias
• Hongos
• Parásitos
• Virus
 Light Scatter of Bacterial Spores

B.anthracis
SS

B.subtilis

irradiated B.anthracis

FS

Light scatter signals from a mixture of live B.anthracis spores,

live B. subtilis spores and gamma irradiated B. anthracis spores.
 Microbial Identification Using Antibodies
Enumeration & identification of target organisms in
mixed populations

Examples include:
• Legionella spp. in water cooling towers
• Cryptosporidium & Giardia in water reservoirs
• Listeria monocytogenes in milk
• E.coli O157:H7 in contaminated meat
• Bacillus anthracis & Yersinia pestis biowarfare agents
Agentes antibacterianos:
• Microbiología tadicional (18-24 horas)
• Citometría de flujo (pocas horas)
• Evaluación de parámetros metábolicos:
• Potencial de membrana
• Tamaño celular
• Cantidad de ADN
• Pruebas de suceptibilidad:
• Efecto bacteriostático
• Efecto bactericida
Susceptibilidad bacteriana: FSC/SSC
 Universidad de Concepción, Chile
Hospital del Trabajador Concepción, Chile

In vitro STUDIES OF pH EFFECT UPON MEMBRANE COMPONENTS, SHAPE AND

SIZE OF Helicobacter pylori: EPIFLUORESCENCE AND FLOW CYTOMETRY STUDIES.

pH 3 pH 3

pH 7 pH 7

pH 10 pH 10

Strain ATCC43504 Strain 747

LO-Skolen, Helsingør, Denmark, July 4-7, 2002
 Susceptibilidad bacteriana
Combinación de:
• Tamaño (FSC)
• Granularidad (SSC)
• Fluorescencia:
• Fluorocromos para ADN y ARN
• Fluorocromos para ensayos metabólicos:
• Unión a proteínas
• Potencial de membrana

Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195

Cytometry 1997;27:169-178
dep.

pol.
dep.

pol.
dep.

pol.
 • S. aureus

• Depolarización
en 1 hora.

• Potencial
demembrana
permanece
disminuido.

Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834

 CITOMETRIA DE FLUJO:
Gastroenterología y Cáncer

• Inmunología y pólipos de colon.

• Enfermedad Inflamatoria Intestinal.
• Tumores sólidos:
• Ciclo celular y Ploidía de ADN.
• Proteínas del ciclo celular
• Oncogenes
• Cáncer de Esófago
• Linfoma
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL
Espectro de presentación.

Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn

Alteración de la inmunoregulación
de mucosa intestinal

Inflamación persistente y/o recurrente

Congestión ulcerativa Granulomatosa

Cáncer
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn

Estudios celulares de mucosa intestinal (CF):

• Células epiteliales C.P.A.

• Macrófagos Moduladores

• Linfocitos: TCD4 Perpetuación

Induction and Modulation of Gastrointestinal Inflamation

FALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.
COLITIS ULCEROSA ENFERMEDAD DE CROHN
Proceso inflamatorio Afecta a todo el tracto
difuso continuo, limitado digestivo
al colon

Inflamación superficial Proceso transmural y

de la mucosa granulomatoso

Presencia de Compromiso de mucosa

pseudopólipos discontinuo
 C.U.
Colon normal

Crohn
Crohn
 Macrófagos intestinales:

• Están localizados en la región subepitelial de la mucosa.

• Constituyen entre 10 a 20% de las células mononucleares
de la lamina propia.
• Detección de su fenotipo:
• Inmunohistoquímica
• Citometría de Flujo
• Existe diferencia entre las poblaciones de macrófagos
encontrados en mucosa de EII y en personas que no la
presentan

Fiocchi C. Am J Physiol.1997,273:G769-75
Young HE et al. Dev Dyn.1995;202:137-44
Pacientes:

UNIVERSO (n=70)
SOSPECHA CLINICA (+)
ENDOSCOPIA (+) (n = 52) GRUPO
HISTOLOGIA
TESTIGO
EII POR BIOPSIA (n = 18)
NO ESPECIFICA
(n = 14)
(n = 38)
Método

Dgto. de EII:
Clínico, endoscópico
e histológico
Grupo de EII

Controles clínicos
Grupo testigo
regulares

Consentimiento Criterio de
informado Exclusión
Materiales y Métodos

Endoscopía

Biopsia
2 x 2 mm Disgregación
mecánica HLA-DR CD16
CD33 CD33
30` oscuridad

FACSCalibur
Software Cell-Quest
v.3.3
Mínimo de 10000
eventos
 Pacientes según fenotipo HLA-DR en MI y
diagnóstico de EII

Sospecha Clínica
Fenotipo MI
HNC EII-CH Subtotal Testigo Total

HLA-DR(+) 78.94 (30) 100 (14) 84.61 (44) 11.11 (2) 65.71 (46)

HLA-DR(-) 21.06 (8) 0 (0) 15.39 (8) 88.89 (16) 34.29 (24)

Total 100 (38) 100 (14) 100 (52) 100 (18) 100 (70)
p<0.001 p<0.001 p<0.001

HNC: Histología no concluyente

EII-CH: EII con confirmación Histológica

Chi Cuadrado con corrección de Yates p < 0.001

 Pacientes según fenotipo CD16 en MI y
diagnóstico de EII

Sospecha Clínica
Fenotipo MI
HNC EII-CH Subtotal Testigo Total

CD16 (+) 78.94 (30) 85.71 (12) 80.76 (42) 55.55 (10) 74.28 (52)

CD16 (-) 21.06 (8) 14.29 (2) 19.24 (10) 44.45 (8) 25.72 (18)

Total 100 (38) 100 (14) 100 (52) 100 (18) 100 (70)
p<0.05 P>0.05 p<0.05

HNC: Histología no concluyente

EII-CH: EII con confirmación Histológica

Chi Cuadrado con corrección de Yates p < 0.05

 Indices de validación para HLA-DR en EII

Sensibilidad Especificidad VPP VPN VG

Sospecha 84.6 88.9 95.7 66.7 85.7
clínica

HNC 78.9 88.9 93.7 66.6 82.0

EII-CH 100 88.9 87.5 100 93.7

HNC: Histología no concluyente

EII-CH: EII con confirmación Histológica
VPP: Valor predictivo positivo
VPN: Valor predictivo negativo
VG: Valor Global
 Indices de validación para CD16 en EII

Sensibilidad Especificidad VPP VPN VG

Sospecha 80.8 44.4 80.8 44.4 71.4
clínica

HNC 78.9 44.4 75.0 50.0 67.85

EII-CH 85.7 44.4 54.5 80.0 62.5

HNC: Histología no concluyente

EII-CH: EII con confirmación Histológica
VPP: Valor predictivo positivo
VPN: Valor predictivo negativo
VG: Valor Global
 CITOMETRIA DE FLUJO:
Gastroenterología y Cáncer

• Inmunología y pólipos de colon.

• Enfermedad Inflamatoria Intestinal.
• Tumores sólidos:
• Ciclo celular y Ploidía de ADN.
• Proteínas del ciclo celular
• Oncogenes
• Cáncer de Esófago
• Linfoma
ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS

•Tejido fresco o congelado.

•Tejido fijado en formalina -

desparafinado.

Concordancia : 90 %.
 ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS

TEJIDO FRESCO

Ventajas :

- Células enteras ( ADN, Ags. de membrana y citoplasma ).

- Menor debris ( mejor resolución del histograma ).

Desventajas :

- No es posible la localización histológica de áreas

de interés.
- Proceso inmediato o congelación.

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

 ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS

TEJIDO FIJADO EN FORMALINA Y DESPARAFINADO

Ventajas :

- Selección histológica de áreas de interés.

- Permite estudio retrospectivo en individuos de curso clínico
conocido.

Desventajas :

- Núcleos “desnudos”.
- Fijación en formalina o microondas.
- Mayor debris.

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

 ESTUDIO DE PLOIDIA DE
ADN Y CICLO CELULAR
• Se evalúa el contenido relativo de ADN en el
núcleo de una célula normal o neoplásica.
• Se obtiene una estimación de las fases del
ciclo celular.
• Se utilizan sustancias fluorescentes que tiene
afinidad con el ADN (PI, DAPI, BrEt).

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999 J.L.C.N.
 CICLO CELULAR
CICLO DE VIDA DE UNA CELULA (24HRS)
MITOSIS
M
G2(4n) 1 hr
G0 (2n)
4 hr
Post Síntesis DNA

10 hrs

9 hr
Síntesis ADN S G1 (2n) Pre-síntesis ADN

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

 HISTOGRAMA DE ADN
OBSERVADO
NUMERO DE CELULAS
FASES G0G1

FASES G2+M
FASE S

2n 4n
CONTENIDO DE ADN

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

Histograma Diploide o “Normal”
Histograma Aneuploide
 Conferencia de Consensos en Citometría del ADN
Octubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.

La ploidía del ADN se expresa como Indice de ADN ( IA ):

IA = G0G1 población en estudio

G0G1 población de referencia

Población de referencia : tejido normal del cual se

origina el tumor en estudio.

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

 Conferencia de Consensos en Citometría del ADN
Octubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.

IA = 1 ADN diploide.
IA > 1 ADN aneuploide.

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

 ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS

ANEUPLOIDIA

•Grado de malignidad Invasión

Metástasis

•Pronóstico Evolución natural

Respuesta a tratamiento

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS

PROLIFERACION CELULAR

•Tiempo libre de enfermedad.

•Sobrevida.
 Conferencia de Consensos en Citometría del ADN
Octubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.

Proliferación Celular :

Fracción Fase S tiene valor predictivo positivo

S+G2M no debería usarse.

Fracción Fase S específica de células tumorales

es el parámetro citométrico más relevante como
factor pronóstico independiente.

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

 ESTUDIO DE PLOIDIA DE
ADN Y CICLO CELULAR
Aplicaciones:
• Estudio del comportamiento biológico de poblaciones
celulares dentro de un tumor.
• Determinación de Fracción proliferativa (Fases S +
G2M) de una población celular.
• Pronóstico y sobrevida de pacientes afectados de
cáncer.
• Estudios de viabilidad.
• Apoptosis.

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

 MUESTRAS USADAS PARA ANALISIS DE
PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR POR
CITOMETRIA DE FLUJO

I Suspensiones Celulares:
• Líneas Celulares.
• Sangre Periférica
• Médula Osea
• Fluídos con alta celularidad (Liq. ascítico,
peritoneal, etc.)
II Tumores Sólidos:
• Tejido sólido
• Aspirado Celular
III Tejidos Embebidos en Parafina

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

 Resultados en Cáncer Gástrico Avanzado :

PLOIDIA

FASE S

Cuadernos Chilenos de Cirugía N°40, 1996: 166-174

 Fase S
es un factor pronóstico independiente
en Cáncer gástrico Avanzado

Cuadernos Chilenos de Cirugía N°40, 1996: 166-174

 ESOFAGO

• Mucina 1
Carcinoma
• Ciclo celular Marcadores superficial de
• Ploidía de ADN pronósticos células escamosas
• p53

• Endoscopy 2001;33(1):1-7
• Int J Cancer 1999;84(3):251-7
• Cancer 1999:85(11):2322-8
 LINFOMA

• Poblaciones Linfoides T
• Poblaciones Linfoides B:
• Expresión de cadenas livianas tipo kappa
• Expresión de cadenas livianas tipo lambda
• Ausencia de otros marcadores (CD5, CD10, CD34)

MALT Helicobacter pylori

• Hematology 2001
• BMC Gastroenterology 2 (WWW.biomedcentral.com/1471-230x/2/6)
 ¿?

Disponible en:

www.oncoinmun.co.cl
 Citometría de Flujo:
Introducción, Aplicaciones, Clínica,
Investigación y Cáncer
T.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.
Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.
Laboratorio de Citometría de Flujo
Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.
Concepción, 16 de Agosto de 2004