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BIOTECNOLOGÍA

Phaffia Rhodozyma
Producción de Astaxantina

Broggi Guadalupe

Ing. Reynoso José

Ing. Chesta Aldana


BIOTEGNOLOGÍA -2017

Contenido
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................................2
PHAFFIA RHODOZYMA .......................................................................................................................3
Antecedentes históricos de la levadura Ph. rhodozyma. ................................................................4
LA ASTAXANTINA................................................................................................................................5
Aplicaciones de la astaxantina .......................................................................................................7
Función biológica de los carotenoides .........................................................................................10
TECNOLOGÍA DE EXTRACCIÓN DEL PIGMENTO ASTAXANTINA A PARTIR DE PH. RHODOZYMA ......11
La obtención de astaxantina a partir de ph. Rhodozyma presenta algunos inconvenientes, entre
los que destacan los siguientes: ...................................................................................................12
TÉCNICA DE CULTIVO Y BIOPROCESOS .............................................................................................13
Regulación por la luz ....................................................................................................................13
Efecto de la temperatura .............................................................................................................14
Efecto de la fuente de carbono ....................................................................................................14
Efecto de la fuente de nitrógeno ..................................................................................................14
Regulación por fosfato .................................................................................................................15
Efecto de la aireación ...................................................................................................................15
TÉCNICAS PARA LIBERAR EL PIGMENTO DE LA LEVADURA ..............................................................18
Conclusiones ....................................................................................................................................20
PRODUCCIÓN DE ASTAXANTINA POR PHAFFIA RHODOZYMA EN UN CULTIVO POR LOTE
ALIMENTADO UTILIZANDO UN MEDIO DE CULTIVO DE BAJO COSTO. .............................................21
TRABAJO ANEXADO..........................................................................................................................27
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................................28

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INTRODUCCIÓN

Recientemente, se ha encontrado que la distribución natural, el hábitat y la diversidad


genética de levaduras productoras de
astaxantina, son mucho mayores de lo
que se pensaba. P. rhodozyma se explota
biotecnológicamente debido a su
capacidad para producir el pigmento
carotenoide astaxantina y, por lo tanto,
se utiliza como una fuente natural de
este pigmento para la acuicultura. La
adición de cetocarotenoides tales como
la astaxantina ó la cantaxantina a la
alimentación de peces intensifica el color
rojizo de la carne; contribuyendo al
sabor característico del salmón.

La fuente natural de astaxantina utilizada hasta hace algunos años era la harina de
caparazones de crustáceos, aunque este método pronto se abandonó después de
comprobar que la levadura Ph. Rhodozyma acumula de forma natural principalmente este
caroteno y además de forma libre, lo que facilita la preparación del pigmento, siendo éste
el microorganismo en el que de una manera global la producción es más rentable que en
ningún otro, debido a que crece rápido y a que puede cultivarse económicamente a altas
densidades celulares, además es relativamente fácil de modificar genéticamente.

Las levaduras son consideradas una fuente de proteína unicelular de gran aceptación en Ia
dieta de animales.

La astaxantina es un carotenoide que se encuentra en la naturaleza, que es responsable


del color rojo en el salmón, la trucha, el besugo y otros peces. En los entornos naturales,
este carotenoide se obtiene por la dieta de estos animales a base de crustáceos y otros
organismos que contienen astaxantina.

Los peces criados son generalmente pálidos y carecen de los colores en la piel y en la
carne que poseen sus congéneres criados en el entorno natural. Esto se debe a la carencia
de astaxantina en la dieta. La adición de astaxantina a la dieta de los peces es una manera
apropiada de solucionar el problema del color de los peces criados en entornos no
naturales.

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Una de las ventajas de los colorantes naturales es que, generalmente, se autoriza su


utilización más fácilmente que en el caso de los colorantes sintéticos, asumiendo que por
su misma naturaleza son inocuos mientras que los sintéticos sólo se admiten aquellas
formas idénticas a la forma natural y que por su estructura no pueden ser convertidos en
compuestos tóxicos.

PHAFFIA RHODOZYMA

P. rhodozyma es un basidiomiceto tiene una forma anamórfica “no formadora de


basidios” y otra telemórfica “formadora de basidios” Xanthophyllomyces dendrorhous.

(Basidio: estructura microscópica productora de esporas).

Sus características peculiares, incluyen sintetizar astaxantina como principal pigmento


carotenoide y ser una levadura facultativa (puede desarrollarse tanto en presencia como
en ausencia de oxígeno) que produce etanol por fermentación de azúcares.

En condiciones normales de cultivo (pH 4,5 - 5,5; temperatura 22°C y aerobiosis) Phaffía
rhodozyma acumula una serie de precursores de la astaxantina.

Principales características:

a) Falta de ciclo sexual conocido, reproduciéndose vegetativamente por gemación polar


siempre en el mismo sitio, dando origen a una pared celular en multicapas.

b) Formación de clamidosporas luego de 5 a 7 dias de cultivo en extracto de malta.

c) Ocasionalmente las células forman pseudomicelios.

d) Metabolismo fermentativo de ciertos azúcares, por ej. la D-glucosa.

e) El crecimiento es posible en un rango de 0 a 27°C.

f) Esta levadura puede crecer en fermentadores con una alta densidad celular (>50 g/L).

g) Dependiendo de la cepa (mutante) usada, la óptima temperatura máxima para la


producción máxima de astaxantina y el crecimiento suele estar entre 18 y 22 ° C.

h) PH óptimo entre 5 y 6. Valores de la producción de astaxantina y el crecimiento celular.

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La temperatura o el pH óptimo para el crecimiento celular y la producción de astaxantina


no tienen que ser necesariamente los mismos.

La principal limitación que presenta P. rhodozyma es la pequeña acumulación de


astaxantina que se encuentra en su pared celular, así como el grosor, la rigidez de su
pared celular dificulta la extracción.

El contenido en astaxantina de las cepas silvestres varía entre 200 y 400 µg de astaxantina
por gramo de peso seco. Estos niveles tienen que incrementarse entre 10 y 50 veces para
ser competitivos con la astaxantina procedente de síntesis química. Por lo tanto, la
biotecnología tiene un papel esencial para aumentar sus niveles y reducir el elevado coste
de producción.

Existen distintas aproximaciones para mejorar la producción como pueden ser:

Optimización de los medios de cultivo y de los parámetros físicos y químicos de


la fermentación.
Obtención de cepas mejoradas mediante técnicas tradicionales.
Mejora en la extracción de la astaxantina.
Utilización de técnicas de ADN recombinante.

Antecedentes históricos de la levadura Ph. rhodozyma.

La levadura Ph. rhodozyma fue aislada a principios de los años 70 a partir de exudados de
árboles en Japón y Alaska como una levadura de color anaranjado, que era capaz de
fermentar la glucosa siendo denominado el género como Phaffia en honor al Prof. Herman
Jen Phaff. En 1976 Andrewes y colaboradores sugieren una posible ruta biosintética para
la formación de astaxantina en Ph. rhodozyma. En 1977 Johnson y colaboradores estudian
la aplicación de esta levadura para la pigmentación de salmónidos y crustáceos. Los
mismos autores un año más tarde describen un método para la extracción de astaxantina
a partir de la levadura Ph. rhodozyma utilizando los enzimas líticos de B.circularas WL-12.
En 1979 se optimiza la producción de astaxantina a partir de la levadura, estudiando el pH
óptimo, los nutrientes, etc y por fin en 1980 se demuestra que esta levadura es una
excelente fuente de astaxantina para dietas de salmónidos, puesto que el pigmento es
rápidamente asimilado y depositado en la carne de la trucha arco iris, y para pigmentación
de yema de huevo. En 1984 se propone la auto lisis de la levadura en agua destilada o en
tampón citrato como un medio bastante bueno para facilitar la extracción del pigmento.

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En 1989 se obtienen por mutación las primeras nuevas estirpes de Ph. rhodozyma
hiperproductoras del pigmento astaxantina. En 1988 la empresa danesa Danisco-
Bioteknology patenta la obtención de astaxantina a partir de esta levadura para su
utilización en la alimentación de peces y otros animales. La empresa Gist Brocades
(Holanda) ha comercializado esta levadura como fuente de pigmento para salmónidos con
el nombre de "Natupink".

LA ASTAXANTINA

Los carotenoides son pigmentos ampliamente


distribuidos en la naturaleza. La astaxantina representa
entre un 80 a 90% del total de los carotenoides
presentes.

Las fuentes naturales de astaxantina son el kril y las


cáscaras de langosta, algas, flores y levaduras. La
astaxantina extraída de kril y langosta es muy cara. El
rendimiento de astaxantina en algas es alto pero la
producción de algas a gran escala plantea dificultades.
Por lo tanto, se ha orientado la atención a la utilización de levaduras, específicamente
Phaffia rhodozyma para la producción de astaxantina.

La astaxantina es un oxicarotenoide (xantofila) (3,3’-dihidroxi-β, βcaroteno-4,4’-diona)


(C40H52O4) con un peso molecular de 596.86 uma. Sus cristales son de color violeta oscuro,
con punto de fusión de 217- 219°C.

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Debido a su potente actividad antioxidante, superior incluso a la de la vitamina E (1000


veces mayor), se le han asignado aplicaciones en animales, como protector contra la
radiación ultravioleta, en la prevención de cáncer y otras enfermedades degenerativas y
como estimulante de la respuesta inmune.

La astaxantina, a diferencia de algunos carotenoides, no se convierte a vitamina A (retinol)


en el cuerpo humano. El exceso de vitamina A es tóxica para los humanos, pero la
astaxantina no. Sin embargo, es un potente antioxidante; unas 10 veces más que otros
carotenoides.

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Uno de los principales contaminantes de la astaxantina es la 3-hidroxi-3’,4’-dideshidro-


β,ψ-caroten-4-ona (HDCO).

En condiciones aerobias, la cantidad de HDCO es aproximadamente el 0,5-1,5% de la


cantidad de astaxantina. En condiciones microaeófilas, esta cantidad crece hasta
aproximadamente 26 % cantidad demasiado elevada.

La concentración de astaxantina de aproximadamente 650 µg/g de peso seco, divulgada


para las cepas de Phaffia rhodozyma de tipo salvaje es demasiado baja para que el
procedimiento sea interesante desde el punto de vista económico. Por lo tanto, se han
realizado estudios exhaustivos para aumentar el rendimiento de astaxantina.
Las altas cantidades de HDCO, que parece ser que crecen debido a muta génesis, son
inaceptables como adiciones a la dieta animal.

Por lo tanto, claramente existe necesidad de astaxantina obtenida a partir de Phaffia que
tenga un bajo contenido de HDCO.

Aplicaciones de la astaxantina

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De forma natural la astaxantina es producida por unos pocos organismos, de los que solamente el
alga verde Haematococcus pluvialis y el hongo levaduriforme Xanthophyllomyces dendrorhous
(con 30 y 4 mg de astaxantina por gramo de peso seco respectivamente) pueden competir con la
astaxantina sintética.

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Función biológica de los carotenoides

Tradicionalmente asociados a pigmentos vegetales, los carotenoides presentan una


distribución mucho más amplia apareciendo también en animales y microorganismos.

Además de la llamativa coloración que producen y que es familiar a todo el mundo, tiene
un papel esencial en organismos fotosintéticos aerobios. Sin carotenoides, la fotosíntesis y
toda la vida en una atmósfera con oxígeno sería imposible. Asimismo, se han visto que
están implicados en la prevención o protección contra desordenes de la salud como el
cáncer y enfermedades cardiacas.

Una de las funciones más importantes de los carotenoides es proteger los tejidos celulares
contra radicales libres oxigenados que se producen durante la respiración normal o
mediante la interacción del oxígeno con la luz visible o UV, y moléculas fotosensibles
como protoporfirina IX, hemo, bacterioclorofila o clorofila.

En las plantas, los carotenoides son indispensables en la función fotosintética, su ausencia


induce la muerte celular por daño fotoxidativo. En los microorganismos no fotosintéticos,
los carotenoides también protegen a las células contra radicales generados duran durante
la respiración o por daño fotoxidativo. Es decir, la presencia de estos pigmentos en todos
los organismos se puede explicar por su capacidad para desactivar eficientemente los
radicales libres que se producen durante el metabolismo normal de las células.

La regulación de la capacidad antioxidante en las células es de vital importancia, de hecho


la presencia de moléculas antioxidantes en niveles apropiados, determinan el desarrollo
normal y la longevidad de las célula.

En P. rhodozyma se ha sugerido que la astaxantina inactiva al O2 y radicales peróxido


presentes en su habitad natural o debido al metabolismo oxidativo intracelular propio. Se
ha sugerido que la síntesis de astaxantina compensa la falta o la muy disminuida actividad
de otras enzimas antioxidantes, como la superóxido dismutasa y catalasa.

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TECNOLOGÍA DE EXTRACCIÓN DEL PIGMENTO ASTAXANTINA A


PARTIR DE PH. RHODOZYMA

Para la extracción del pigmento es necesario romper la pared de la levadura. Para ello se
pueden utilizar distintos métodos:

i) Ruptura mecánica por tratamiento con un homogeneizador, o bien el paso a


través de una prensa. Estos métodos son laboriosos, requieren un gran aporte de
energía, y, por tanto, son de difícil aplicabilidad a escala industrial.

ii) Ruptura celular química por hidrólisis ácida o alcalina. Este método aunque
efectivo queda totalmente descartado y no se puede utilizar debido a que los
carotenoides son sensibles tanto a ácidos como a bases.

iii) Ruptura enzimática: Consiste en la destrucción de la pared de la levadura por


enzimas líticos de origen microbiano. Los resultados obtenidos mostraron una
elevada actividad lítica, lo cual permitía extraer fácilmente el pigmento. Este
método fue estudiado por Tangeraas y colaboradores en 1989.

El uso de todos estos métodos se traduce en una pérdida de pigmento en cierta medida, a
lo que hay que añadir que son difíciles de aplicar a gran escala, en parte debido a la
sensibilidad de astaxantina a la oxidación.

La extracción a escala industrial con solventes orgánicos es la principal forma de afrontar


este reto.

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La obtención de astaxantina a partir de ph. Rhodozyma presenta algunos


inconvenientes, entre los que destacan los siguientes:

i) La levadura tarda unos 7 días en alcanzar la fase estacionaria de crecimiento,


momento en el cual es acumulada la mayor parte del pigmento;
ii) La astaxantina es producida intracelularmente, asociada fuertemente a
membranas celulares, de modo que los animales alimentados con células
intactas de la levadura no son capaces de asimilar el pigmento debido a que no
pueden digerir la pared de la levadura. Para que la astaxantina pueda ser
asimilada por el animal es necesario añadir la levadura lisada o bien un
extracto del pigmento.
iii) La concentración de pigmento presente en aislados naturales de
Ph.rhodozyma oscila entre los 50 y 300 flg. de astaxantina por gramo de
levadura seca según la cepa. Por tanto, hay que añadir gran cantidad de
levadura a la dieta para proporcionar de 50 a 200 mg de astaxantina por kg de
alimento para lograr una pigmentación adecuada del salmón. Este aporte
relativamente alto de levaduras supone un suplemento excesivo de nutrientes
que podría ser perjudicial pues según se ha encontrado produce un engorde
excesivo del animal. Por esta razón, es preferible la administración tanto del
pigmento aislado como de cepas de levadura hiperproductoras del pigmento
astaxantina en las que la relación pigmento/biomasa de levadura sea más
beneficiosa para la nutrición integral del animal.
iv) La proporción de los diferentes carotenoides producidos por la levadura P.
rhodozyma y la cantidad de astaxantina en las células pueden alterarse por
cambios en la composición del medio de cultivo y por otros factores
ambientales. Concentraciones de OD por arriba de 20% y la reasimilación de
etanol son factores desencadenantes de la síntesis de astaxantina en P.
rhodozyma. Por otro lado, altas concentraciones de algunos componentes del
medio de cultivo como azúcares, fosfatos, sulfato de amonio y cobre tienen un
efecto negativo sobre la producción de astaxantina.

La concentración de carotenoides totales, así como los contenidos de astaxantina y lípidos


en la levadura muchas veces se incrementan a bajas concentraciones de nitrógeno o de
fosfato. En ambos casos, la mayor producción de carotenoides parece ser una respuesta
para canalizar el exceso de carbono y energía, debidos a una limitación del crecimiento y
de síntesis de proteínas, ocasionadas por la deficiencia de estos dos nutrientes. En

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presencia de inhibidores de la cadena respiratoria y en medios deficientes en cobre se


obtiene altas proporciones de astaxantina en el pigmento.

TÉCNICA DE CULTIVO Y BIOPROCESOS

P. rhodozyma tiene una amplia capacidad bioquímica para la asimilación y metabolización


de mono-, di- y polisacáridos, Ácidos orgánicos y alcoholes. También muestra la rápida
utilización de fuentes de nitrógeno simples como Amonio, nitrato, urea o aminoácidos, así
como complejos mezclas tales como levadura, extracto de carne o de malta, peptona, Soja
o triptona.

Una medida útil para reducir los costos de producción es el uso de corrientes de residuos
industriales reproducibles como de los procesos de fabricación del azúcar o de la molienda
húmeda de maíz. Por otro lado, los medios de bajo costo pueden contener inhibidores
desconocidos de la carotenogénesis, inadecuados para un proceso de producción. En la
mayoría de los casos, el medio tiene que ser complementado con componentes
nutricionales esenciales y también puede incluir inductores o precursores de la
carotenogénesis

Fuentes de carbono o nitrógeno, iones, Vitaminas, temperatura, pH, suministro de


oxígeno, Luz; influyen en el crecimiento celular.

Regulación por la luz

La carotenogénesis se ve afectada por la irradiación con luz blanca en muchos organismos


como algas, hongos y bacterias, aunque la intensidad y la exposición depende de cada
microorganismo; En Xanthophyllomyces se ha propuesto que la producción de astaxantina
es fotoinducible: se ha visto que la concentración de astaxantina permanece constante en
células crecidas en oscuridad, pero bajo iluminación intensa los niveles de astaxantina
aumentan. Esta estimulación es transitoria, y cuando los cultivos se incuban de nuevo en
oscuridad, se observa una reducción en el contenido total de carotenoides. La producción
máxima de astaxantina se obtiene cuando los cultivos se iluminan continuamente a
intensidades luminosas moderadas.

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Efecto de la temperatura

La temperatura es otro factor importante que afecta tanto al crecimiento como a la


formación de metabolitos al provocar cambios en muchas de las rutas biosínteticas,
incluyendo la ruta de los carotenoides. Estudios realizados indican que la temperatura
óptima para el crecimiento celular y la formación de pigmentos está entre 20 y 22ºC.

Se ha visto que las bajas temperaturas (4ºC) provocan cambios en la composición y en la


concentración (con un aumento del 50%) de carotenoides totales. Así mismo, una
temperatura de 30º C hace que el patrón de carotenoides cambie.

Efecto de la fuente de carbono

Como sucede con algunos metabolitos secundarios el uso de concentraciones elevadas de


glucosa como fuente de carbono suponen una mínima producción de pigmentos. Así
mismo, la inducción de la carotenogénesis coincide con el agotamiento de azúcar y el
comienzo del consumo de etanol.

Fuentes de carbono no fermentables como el etanol provocan un aumento en la síntesis


de pigmentos.

Efecto de la fuente de nitrógeno

La limitación de nitrógeno es un factor clave para el acúmulo de astaxantina. En diversos


estudios se observó un incremento en la producción de carotenoides relacionado con un
descenso en la concentración de nitrógeno en el medio. El descenso en la concentración
de nitrógeno provoca una reducción en la síntesis de proteínas, lo que hace que
aumenten los niveles de carbono, ATP y NADPH en la célula. Para adecuar estos niveles al
estado normal, se produce un aumento en la síntesis de ácidos grasos y carotenoides.

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Regulación por fosfato

Otro de los elementos que parece afectar a la carotenogénesis es el fosfato; un nutriente


que regula muchos metabolitos secundarios Se ha visto que bajas concentraciones de
fosfato en el medio provocan un aumento en la producción de astaxantina. Ello puede ser
debido también a un descenso en la síntesis de proteínas, provocado por la escasez de
fosfato para la síntesis de ARN. Otra explicación sería que la limitación de fosfato
disminuyese la actividad de la cadena respiratoria. O puede que las bajas concentraciones
de fosfato incrementen la actividad de fosfatasas, como ocurre en otros microorganismos,
y que son necesarias para la síntesis de carotenoides ya que sus precursores se
encuentran fosforilados.

Efecto de la aireación

Un factor importante para la biosíntesis de muchos metabolitos secundarios es la


aireación del medio de cultivo. La carotenogénesis es un proceso aeróbico, de forma que
el flujo de aire en el cultivo es un factor esencial para la asimilación del sustrato así como
para el crecimiento y la producción. La disminución de la disponibilidad de oxígeno reduce
la síntesis de astaxantina, y provoca el acúmulo de carotenos, esto indica que la
oxigenación de los carotenos a través de la activación del oxígeno molecular es un factor
limitante para la síntesis de astaxantina.

La heterogeneidad de composiciones de medio y procesos explican la diversidad de


aislamientos naturales de P. Rhodozyma o cepas mutantes hiperproductoras de
astaxantina usadas. Estas cepas contienen aleatoriamente mutaciones insertadas cuya
naturaleza exacta, el número o las ubicaciones permanecen desconocidos en la mayoría
de los casos, lo que dificulta la comparabilidad. Factores nutricionales y físicos en un
espacio multiparámetro parecen ser diferente para cada cepa mutante.

El oxígeno desempeña un papel fundamental en la biosíntesis de la astaxantina. Ya que la


producción de astaxantina se ve reforzada por la respiración (suficiente suministro de
oxígeno) y reprimidos por fermentación (insuficiente concentración de oxígeno y
producción de etanol). Y el crecimiento es inhibido por una sobreoferta de oxígeno, una
evaluación del consumo individual de oxígeno y las tasas de transferencia de una

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respectiva cepa y equipo utilizados parece razonable. Además de los cambios de agitación
y caudal de aire, el oxígeno transfererido hacia las células se puede mejorar añadiendo
disolventes orgánicos biocompatibles con alta solubilidad en oxígeno como vectores de
oxígeno al medio.

Los procesos de fermentación por lotes parecen inadecuados para la producción de


astaxantina con P. rhodozyma. La concentración de glucosa conduce al desbordamiento
de la vía metabólica y la acumulación de etanol, ácido acético u otros productos
metabólicos en el medio. Tanto el etanol como el ácido acético presentan efectos
positivos sobre la concentración intracelular de astaxantina, pero también resultan en la
inhibición del crecimiento celular.

Aunque no son deseables durante el crecimiento celular exponencial, las concentraciones


de alta fuente de carbono apoyan la acumulación de carotenoides en las fases posteriores
del proceso.

Este antagonismo se puede remediar mediante la aplicación de un proceso alimentado


por lotes con el fin de obtener la máxima productividad a través tanto de un peso seco
alto en células como de altas concentraciones intracelulares de astaxantina.

Empleando un control de proceso apropiado, un proceso de fermentación industrial de


Phaffia típico se divide en dos fases:

una fase de crecimiento celular y


una fase de maduración.

Proporcionando una baja relación C / N (relación entre la fuente de carbono y la


concentración de la fuente de nitrógeno), las células inicialmente muestran un
crecimiento rápido, que disminuye gradualmente a medida que se aproximan a
altas concentraciones celulares.

Durante esta fase, la formación de astaxantina es más lenta que la tasa de crecimiento de
las células. Al cambiar a una relación C / N elevada a medida que las células se aproximan
a la fase estacionaria de crecimiento, la formación de astaxantina finalmente excede la
tasa de crecimiento celular.

El control de alimentación utilizado para alcanzar la máxima productividad del proceso


depende de la cepa (mutante) y del medio utilizado y puede establecerse por varios
medios, como una alimentación exponencial basada en modelos Monod, control de pH,
control de DO o alimentación de impulsos después de la determinación de fuente de

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carbono. Como alternativa al proceso alimentado por lote, pueden considerarse procesos
semicontinuos y continuos. La evaluación de los datos alimentación de pulsos y
alimentación exponencial parecen ser los métodos de alimentación que crean los mayores
rendimientos espacio-tiempo.

Un nutriente adecuado o fuente de los medios para Phaffia rhodozyma incluirían al menos
una fuente de nitrógeno, fosfato, minerales tales como hierro, cobre, zinc, magnesio,
manganeso, calcio, y otros elementos traza y vitaminas (tal como biotina, ácido
pantoténico y tiamina) según se requiera.

Todos los nutrientes añadidos a los fermentadores durante el proceso de fermentación


son esterilizados antes de su uso.

La temperatura de fermentación generalmente debe oscilar desde alrededor de 18 ° C a


aproximadamente 22 ° C y preferiblemente debe ser aproximadamente 20 ° C.

El contenido de oxígeno disuelto en el recipiente de fermentación donde la fermentación


se lleva a cabo de una manera por lotes alimentados puede variar de 10% a
aproximadamente 80% de la saturación y preferiblemente estará en el intervalo desde
aproximadamente 30% a aproximadamente 60% de saturación. El contenido de oxígeno
disuelto en una fermentación continua debe variar de aproximadamente 70% a
aproximadamente 100% de la saturación y preferiblemente estar en el intervalo de
aproximadamente 70% a aproximadamente 80% de saturación. El pH al que las Phaffia
rhodozyma se cultivan células deben variar de aproximadamente 3,0 a aproximadamente
5,5 y, preferiblemente, el pH estará en el intervalo de aproximadamente 4,5 a
aproximadamente 5,4.

Después de que el caldo de fermentación que contiene las células Phaffia rhodozyma ha
alcanzado un contenido de densidad celular o astaxantina deseada, la masa de células
puede ser cosechado. Se prefiere que la cepa lleve a cabo en una fase estacionaria desde
el intervalo de 4 a 24 horas y más preferiblemente en el intervalo de 8 a 12 horas para
aumentar la producción de astaxantina.

Sin embargo, Phaffia rhodozyma no debe mantenerse durante largos períodos de tiempo
en una fase estacionaria porque las células formarán paredes celulares gruesas, que será
perjudicial para la rotura celular.

Después de romper las células y extraer el pigmento, se pueden secar. El secado puede
llevarse a cabo utilizando un secador de lecho fluidizado, el tambor secador, o secador por
pulverización. El secado por pulverización se prefiere actualmente debido al tiempo de

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exposición corto a altas temperaturas que posiblemente podría oxidar el astaxantina


presente.

Después del secado, el producto resultante será un material de levadura en polvo que
puede ser recuperado por cualquier medio adecuado tal como un ciclón, y aún más
manejado para su uso en la alimentación, almacenamiento o envío.

TÉCNICAS PARA LIBERAR EL PIGMENTO DE LA LEVADURA

La industria biotecnológica ha desarrollado diferentes técnicas para liberar el pigmento de


la levadura, como la optimización de las condiciones de secado, técnicas de rotura
mecánica y tratamientos enzimáticos.

A pesar de ello, estos métodos tradicionales tienen una serie de inconvenientes como son
la toxicidad de los solventes, su impacto en el medio ambiente, su costo, y el hecho de
que el aplicar calor para la evaporación de los solventes puede provocar una degradación
irreversible del producto. Aparte de esto, se han desarrollado procedimientos de
extracción mediante el uso de fluidos supercríticos como el dióxido de carbono, que
debido a sus propiedades muestran una mayor capacidad de difusión que los solventes
orgánicos convencionales, incrementando así el rendimiento de la extracción. Se
hanrealizado estudios para la extracción de carotenoides a partir de fuentes naturales
mediante esta técnica, así como para la extracción de astaxantina utilizando CO2
supercrítico, que muestra un rendimiento del 90% de astaxantina recuperada. Sin
embargo, la extracción se lleva a cabo a elevadas presiones y se requiere un equipo
costoso. Recientemente ha aumentado el interés por las extracciones y separaciones
basadas en surfactantes, debido a que tienen unos bajos requerimientos en energía, los
surfactantes pueden reciclarse y reutilizarse y son capaces de tratar fácilmente los
compuestos degradados.

Uno de los métodos que se ha estudiado es la posibilidad de utilizar microburbujas de gas


coloidal estabilizadas por surfactantes generadas por la agitación a gran velocidad del
surfactante y situadas en una columna de flotación para extraer la astaxantina de la
levadura. Dependiendo del tipo de surfactante utilizado (catiónico, aniónico o no-iónico),
la superficie externa de la microburbuja será de una forma u otra permitiendo controlar la
selectividad de la adsorción molécula-burbuja. Esta técnica permite separar el producto
de todo el líquido sin necesidad de centrifugar, debido a la flotabilidad de las burbujas de
aire. Sin embargo, uno de los problemas que puede tener es eliminar el surfactante en el

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paso final de recuperación, puesto que altas concentraciones de alguno de ellos son
tóxicas. Sin embargo, el uso de surfactantes no-iónicos de grado alimenticio ofrecen la
ventaja de no tener que ser eliminados pudiendo aumentar la biodisponibilidad de la
astaxantina.

Una herramienta adicional para incrementar la productividad de astaxantina durante la


fase de maduración por medio del control de alimentación de fuente de carbono es la
adición de una fuente de carbono lentamente metabolizada tal como Glicerol, etanol o
ácido acético después del agotamiento de la fuente de carbono inicialmente
metabolizada.

El rendimiento de espacio-tiempo más alto reportado hasta ahora de casi 5 mgl-1 h-1 y YP
/ X de más de 6,6 mgg-1 de peso seco de células a alcanzado en un volumen de reacción
de 14 l.

La eliminación in situ del producto podría aumentar aún más la productividad de


astaxantina ya que se asumió un mecanismo de control de retroalimentación por
astaxantina o β-caroteno sobre la biosíntesis de carotenoides. Sin embargo, la estructura
rígida de la pared celular de P. Rhodozyma y la naturaleza lipofílica y tamaño de los
carotenoides plantearía un obstáculo a tal característica del proceso.

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Conclusiones

El alto costo de producción es todavía el factor limitante para el uso de P. rhodozyma para
la producción natural de astaxantina. Típicamente, el P. rhodozyma de tipo salvaje
sintetiza astaxantina en concentraciones de Aproximadamente 200 a 400 μg / l de peso
seco. Estas cantidades están por debajo del nivel que merece la producción industrial. Por
lo tanto, la concentración de astaxantina de los aislamientos naturales es una de las
medidas que hay que mejorar para desarrollar un proceso industrial con mayor eficiencia
de costos.

La astaxantina es el segundo carotenoide más importante con el creciente valor de


mercado global. La producción biotecnológica actual de astaxantina natural no ha sido
competitiva en cuanto a costos con la síntesis química de este compuesto, por lo que sólo
representa alrededor del 3% de cuota de mercado.

Como una solución directa, la mutagénesis aleatoria mediante tratamiento químico o


físico puede aplicarse para crear eficazmente mutantes hiperproductores de astaxantina.

Un enfoque alternativo a la mutagénesis es la construcción de híbridos que producen


carotenoides mediante la fusión de protoplastos.

Entre algunos organismos capaces de sintetizar astaxantina, la levadura P. rhodozyma es


un candidato muy prometedor tanto para el desarrollo de cepa dirigida como para
bioprocesos mejorados ya que es bien accesible por vía metabólica y ingeniería de
bioprocesos.

Por lo tanto, es concebible que la producción biotecnológica de astaxantina


eventualmente resulte de costo competitivo, especialmente para el mercado humano.

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BIOTEGNOLOGÍA -2017

PRODUCCIÓN DE ASTAXANTINA POR PHAFFIA RHODOZYMA EN UN


CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO UTILIZANDO UN MEDIO DE
CULTIVO DE BAJO COSTO.

La cepa mutante 25-2 de Phaffia rhodozyma fue crecida en medio de cultivo Yuca
utilizando un sistema de cultivo por lote alimentado. El control de la alimentación en el
medio de cultivo fue llevado a cabo en respuesta a los cambios de pH (de ácido a alcalino)
causado por la actividad metabólica de las levaduras. Este cambio fue entendido como
una señal de baja concentración de nutrientes del cultivo y, por lo tanto, como el
interruptor para activar el sistema de alimentación. La fuente de carbono y de nitrógeno
fueron mantenidas entre 15-25 g/l y 0.5-1.0 g/l respectivamente. El extracto de levadura
(1.6 g/l) fue suplementado en el medio de alimentación. El flujo de aire fue incrementado
0.2 l/min cada 12 horas hasta 2.6 l/min, a las 84 horas. Bajo estas condiciones, fue posible
observar un crecimiento lineal y una formación de pigmento durante casi todo el cultivo,
hasta que la concentración de oxígeno disuelto fue limitante (<20%). La adecuada
suplementación de nutrientes, principalmente extracto de levadura y oxígeno, incrementó
significativamente, la formación de astaxantina y biomasa. La máxima producción de
astaxantina lograda fue de 23810, mientras que la formación de biomasa fue de 39 g/l.

P. rhodozyma es capaz de crecer a baja concentración de oxígeno y / o alta concentración


de azúcar; Sin embargo la producción de carotenoides es gravemente afectada en estas
condiciones.

Los sistemas de producción por lotes tradicional tiene la desventaja de inducir el efecto
Crabtree, las altas concentraciones de glucosa en cultivos aeróbicos de Phaffia rhodozyma
inducen la desviación de la metabolismo hacia la síntesis de etanol y ácidos orgánicos
como productos de fermentación, disminuyendo el pigmento y rendimiento de biomasa.
Por lo tanto, una estrategia para resolver este problema está utilizando el cultivo
discontinuo alimentado.

El pH-stat es un cultivo discontinuo alimentado con un control de retroalimentación; el


medio de cultivo se alimenta intermitentemente en respuesta al cambio en el pH del
cultivo. La adición de nutrientes durante la fermentación se optimiza para lograr una
producción rápida tanto de la biomasa de levadura Phaffia y astaxantina.

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BIOTEGNOLOGÍA -2017

Materiales y métodos

Microorganismos y medios

El 25-2 mutante superproductoras de astaxantina (CECT 11780) se deriva de la de tipo


salvaje P. rhodozyma ATCC 24202, se obtuvo por mutagénesis con nitrosoguanidina y
seleccionado por su de color naranja oscuro. La cepa se cultivó en medio YM Difco
(extracto de malta 0,3%, 0,3% de extracto de levadura; 1% de glucosa y 0,5% Bacto-
peptona o medio Yuca (2 gl-1KH2correos4, 0,5 gl-1MgSO4, 1.0 gl-1 urea, Sigma;
suplementado con jugo de fecha como fuente de carbono).

Las condiciones de cultivo inóculo. Asas llenas de 25-2P. rhodozyma cepa mutante se
utilizaron para inocular 10 ml de caldo YM, se incubó a 20 ° C durante 24 h en un agitador
rotatorio a 300 rpm. El caldo de precultivo se inoculó en 500 ml matraz Erlenmeyer que
contiene 100 ml del medio YM y se incubaron durante 24 h en un agitador rotatorio a 300
rpm.

Cultivo por lotes.

Los experimentos se realizaron en un Applikon Biorreactor de 3-litros que contiene 1,5 l


de Yuca medio, de 22,5 gl -1 la reducción de la concentración de azúcar. El medio se
inoculó con el precultivo 100 ml en el biorreactor.

Las condiciones de funcionamiento fueron:

20 ° C de temperatura
6,0 pH
velocidad de agitación 900 rpm
1.5 l min -1 flujo de aire.

Mediante la adición de una solución al 15% de HCl o NaOH al 15%. El biorreactor


fue esterilizado, bajo 1 kg / cm 2 y 120 ° C durante 10 min. La formación de
espuma se controló añadiendo solución de antiespumante 15% (Sigma). El pH,
oxígeno disuelto y lecturas de temperatura se registraron cada 5 minutos, así como
el volumen de ácido y el álcali añadido durante el crecimiento.

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BIOTEGNOLOGÍA -2017

Cultivo discontinuo alimentado.

El precultivo (100 ml) se inoculó en un Applikon Biorreactor de 3-litros (de trabajo


volumen 1,2 l). Las condiciones de funcionamiento fueron: 20 ° C de temperatura;
6,0 pH; velocidad de agitación 900 rpm; 1,2 l min -1 flujo de aire. El flujo de aire se
incrementó 0,2 l min -1 cada 12 h hasta 2,6 l min -1 a 84 h. La alimentación fue
realizado en respuesta a incrementos de pH, la adición de volumen variable
programado para el fermentador. El primero período y el proceso de pH-stat del
cultivo discontinuo alimentado alimentación se inicia cuando el pH cambió de
ácido a alcalino. El código de la aplicación de la condición pH fue escrito y de
ejecución mediante el software Bioexpert. La solución de alimentación contenía:
300 gl-1 jugo de la fecha; 1.6 gl-1 extracto de levadura; 10 gl-1 urea

El crecimiento celular se informó de la medición de la turbidez (600 nm) y masa celular


seca.

Tanto el pH y el oxígeno son excelentes parámetros a utilizar como sensores de levadura


de la estado metabólico en un proceso de producción de astaxantina para fed-batch.

Resultados

El pH, la temperatura y el oxígeno disuelto se midieron en línea durante el cultivo de


alimentación por lotes. La cultura pH lote mostró dos etapas claramente diferentes: la
primera se observó 2 horas después de inocular el reactor y se caracterizó por una
progresiva acidificación del medio de 6,0 a 5,9, que es el límite inferior para el controlador
de pH-stat. El pH se mantuvo en 5,9 durante 28 horas; esta etapa de actividad ácido fuerte
coincidió con la fase de crecimiento exponencial. En la segunda etapa, un cambio se
observó el comportamiento de pH. Después de la hora 28 el pH del cultivo aumentó hasta
alcanzar un valor pH 6,1 límite tan alto. La fase alcalinización continuó hasta el final de
cultivo. Esta fase incluye la final de la fase exponencial y fase estacionaria de crecimiento.

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Al igual que en pH, el consumo de oxígeno se asocia con el crecimiento, la fase de


consumo máximo coincidió con la fase logarítmica y la fase de bajo consumo de oxígeno
que coincidió con la estacionaria fase. El consumo de azúcares estaba directamente
relacionado con el crecimiento, se observó consumo máximo entre 6 y 48 h, en esta etapa
la levadura consume cerca de 90% de los azúcares presentes.

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En el cultivo discontinuo alimentado, después de 88ºh, el oxígeno disuelto alcanza el nivel


inferior (18%), pero una hora después del oxígeno disuelto comenzó a aumentar
gradualmente hasta alcanzar valores de 60% de oxígeno disuelto a las 96 hs. La
disminución de actividad metabólica estaba relacionada con la concentración de azúcar
bajo (inferior al 15 gl-1). Que era suficiente para el mantenimiento del cultivo a un nivel
basal, pero insuficiente para activar el metabolismo secundario de la levadura. El
suministro de oxígeno en cantidades suficientes estimula la síntesis de astaxantina
eficiente.

El cambio de pH observado al final de la fase de crecimiento exponencial en el cultivo


discontinuo se utilizó como un parámetro de referencia para el desarrollo de un sistema
de alimentación que respondía a las exigencias del cultivo, sin exceder el la concentración
de azúcar y evitando el efecto Crabtree. El cultivo discontinuo alimentado se inició con
22,5 gl-1 la reducción azúcares y la concentración de azúcar se mantuvo entre 15-25 gl-1.
La primera alimentación era realizado en el 30ºh, los siguientes adiciones de sustrato se
llevaron a cabo automáticamente en respuesta al pH incrementos de cultivo (pH mayor
que 5,98). El crecimiento celular mostró una fase de latencia de casi 6 horas seguido por
una muy grande fase logarítmica observada a partir de la 12ºh y se continuó hasta el final
del cultivo (96ºh), cuando un gl 39-1 se logró la biomasa.

Un incremento de pH en el cultivo estaba relacionado con una gota de nutrientes y, por lo


tanto, como el disparador para activar el sistema de alimentación. El cambio de pH
observado (28ºh) en el cultivo discontinuo estaba relacionada con la inicial la
concentración de azúcar, ya que las concentraciones altas de sustrato retrasar el cambio
de fase (datos no mostrados). Dos horas previas al consumo máximo de oxígeno (30ºh) y
la conclusión de la fase de crecimiento exponencial, una se observó cambio en el pH y
podría ser tomado como la primera señal de alerta que indica bajos nutrientes
(principalmente fuente de carbono), mientras que el cambio en el consumo de oxígeno,
como la segunda señal de un inminente alteración de la velocidad de crecimiento. El
oxígeno es otro parámetro que permite la evaluación en línea de la levadura estado
fisiológico. Al igual que en pH, el consumo de oxígeno se asocia con el crecimiento, ya que
el estado de consumo máximo de oxígeno coincidió con la fase de crecimiento
exponencial, mientras que un bajo nivel de oxígeno consumo coincidió con el final de la
fase exponencial y comienzo de la fase estacionaria.

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BIOTEGNOLOGÍA -2017

El sistema de alimentación empleada permite una alta biomasa y producciones de


pigmento. La biomasa obtenida es el más elevado informado, Sin embargo la producción
de astaxantina en base de masas era bajo (600 μgg-1levadura), probablemente causado
por la alimentación de oxígeno insuficiente.

En conclusión, el medio de Yuca combinado con un sistema de alimentación de responder


a los requerimientos de cultivo y la adición de los nutrientes durante el tiempo del curso
de cultivo representa una excelente alternativa para la producción industrial de
astaxantina por P. rhodozyma.

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TRABAJO ANEXADO

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BIBLIOGRAFÍA

 http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0325-
75412016000100003&lang=pt
 http://ruc.udc.es/dspace/bitstream/handle/2183/10771/CC%2048%20art%201.pdf;jsessio
nid=5966BC55E7017B61B8810B971E3A6FB5?sequence=1
 http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_2010_3/GALERAS_ART_56_FINAL.pdf
 http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2729_DucreySantopietro.pdf
 http://ruc.udc.es/dspace/bitstream/handle/2183/10771/CC%2048%20art%201.pdf?seque
nce=1&isAllowed=y
 https://es.wikipedia.org/wiki/Astaxantina
 http://www.espatentes.com/pdf/2115637_t3.pdf
 http://www.bdigital.unal.edu.co/11205/1/300061.2013.pdf
 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Antonio/Mis%20documentos/Downloads/DOC-
20170624-WA0028%20(1).pdf
 http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/merida05/TRABAJOS/AREA_X/OX-
08.pdf
 http://www.google.st/patents/WO1994023594A1?cl=en&hl=es
 http://repositoriodigital.corfo.cl/bitstream/handle/11373/5218/195-
0607_IF.pdf?sequence=2
 http://www.redalyc.org/html/730/73000405/
 https://buleria.unileon.es/bitstream/handle/10612/2144/tesis_1a2340.PDF?sequence=1
 http://www.google.st/patents/EP0438182A1?cl=en&hl=es
 http://www.google.st/patents/WO1994023594A1?cl=en&hl=es
 http://www.google.st/patents/WO2003066875A1?cl=es&hl=es

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