FACULTAD DE CIENCIAS DE SALUD

“EXTRACCIÓN DEL ADN,

FUNDAMENTOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR) Y
FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS”

PROFESOR: Gerardo Sánchez

INTEGRANTES:
 Nieves Araujo, Guadalupe
 Nishijima Cadillo, Kiosany
 Huaro Reyes, Milagros
 Irey Pomari, Fatima

HORARIO DE PRACTICA: 11:00 am – 1:00pm

FECHA REALIZADA: 28 de octubre – 04 de noviembre – 11 de noviembre
del 2019
FECHA DE ENTREGA: 25 de noviembre del 2019

2019
 INTRODUCCIÓN

El ADN que constituye el material genetico de los seres vivos y que ha sido punto de
investigación desde hace ya tiempo, ahora es posible ser observada y anlizada
atraves de distintos procesos.
En este presente informe explicaremos los procesos realizados en el laboratorio que
sirvieron para poder observar las bandas finales del ADN (muestra). Para poder
hacer esto posible se debe llevar a cabo tres procedimientos fundamentales, que
son:
 Extracción de ADN (muestra).
 Proceso de PCR.
 Electroforesis.
La extracción de ADN es una metodologia mediante la cual podemos obtener material
genetico que nos permite la manipulación del producto obtenido. Es un metodo por el
cual podemos estudiar mutaciones que esten involucradas con diferentes potologias
humanas, mapeos y secuenciación de genes con fines terapeuticos.
El proceso de PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) es una tecnica utilizada para
obtener un gran numero de copias de un fragmento de ADN en una amplificación in
vitro, ademas de ser una amplificación selectiva la cual se basa en una capacidad de la
enzima ADN polimerasa para fabricar una cadena ADN complementaria a la existente.
La electroforesis es una tecnica utilizada para observar la concentración e integridad
del ADN, proteinas y otras biomoleculas. Ya que permite las separación de las
proteinas y acidos nucleicos a traves de una matriz tamponada de pH 8.
Estos procedimientos hacen posible una amplificación del ADN para asi poder
detectar o determinar ciertas patologias como errores geneticos, además de la
determinación de paternidad; esto nos permite tener un mejor conocimiento acerca
de la aplicación de estos metodos en el campo de la medicina y asi poder ponerlos en
practica en el momento adecuado.

MARCO TEORICO

La extracción de DNA a partir de muestras de distinta naturaleza, constituye la

etapa previa de todo análisis genético. En general; los métodos de extracción de
DNA tienen una serie de pasos básicos, que se cumplen independientemente del
origen de la muestra. Estos son, a saber: disrupción celular (ruptura de la bicapa
lipídica de las membranas celulares por tratamiento con detergentes, agentes
quelantes que secuestran cationes estabilizantes de la membrana, etc.), eliminación
de las proteínas (que constituyen los principales contaminantes del extracto),
concentración del DNA (por precipitación con alcoholes), lavado (para eliminar
restos de reactivos y solventes que puedan inhibir la Taq polimerasa) y resuspensión.
El PCR (Reacción en la cadena de la polimerasa) es una técnica "in vitro" que imita la
habilidad natural de la célula de duplicar el ADN.Técnica usada para crear un gran
número de copias de un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalización,
apareamiento con cebadores y extensión por un ADN polimerasa termoresistente.
Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de
ADN en un tubo de ensayo, pueden generarse millones de moléculas idénticas, a
partir de una molécula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas. La reacción
es muy sencilla, necesita cantidades de ADN muy pequeñas y sólo se precisa un tubo
de ensayo, algunos reactivos, una fuente de calor y unas pequeñas cadenas de
nucleótidos que actúan como cebadores.
La electroforesis es una técnica de laboratorio utilizada para separar moléculas
cargadas colocadas en un campo eléctrico. Las moléculas cargadas positivamente se
desplazarán hacia el polo negativo y las cargadas negativamente hacia el polo
positivo. Uno de los factores que afecta la separación de las moléculas en una
electroforesis es su carga. Para el caso del DNA, los grupos fosfato le dan la carga
a la molécula. Los grupos fosfato son grupos ácidos con pK bajos, esto significa que
a pH neutro (7.0 – 7.5) sus grupos hidroxilo pierden los protones (H+) y quedan
cargados negativamente. Por lo anterior, los ácidos nucleicos (DNA y RNA) son
moléculas cargadas negativamente a pH neutro, en un sistema electroforético se
desplazarán hacia el polo positivo, es decir, separación de moléculas por diferencia
en su movilidad electroforética. Para separar moléculas de DNA de diferente tamaño
se incluye en el sistema la utilización de geles, tanto de agarosa como poliacrilamida
(acrilamida más bis-acrilamida).

Ley De Lambert-Beer
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de
onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:
A = log I/Io = ε·c·l
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración –a
mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende
de la distancia que recorre la luz por la solución a igual concentración, cuanto mayor
distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y, por último,
depende de ε, una constante de proporcionalidad -denominada coeficiente de
extinción- que es específica de cada cromóforo. Como A es adimensional, las
dimensiones de ε dependen de las de c y l. La segunda magnitud (l) se expresa siempre
en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que
las dimensiones de ε resultan ser M-1·cm-1. Este coeficiente así expresado, en
términos de unidades de concentración molar (o un submúltiplo apropiado), se
denomina coeficiente de extinción molar (εM). Cuando, por desconocerse el peso
molecular del soluto, la concentración de la disolución se expresa en otras unidades
distintas de M, por ejemplo, g·L-1, las dimensiones de ε resultan ser distintas, por
ejemplo, g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente de
extinción específico (εs). La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas;
para valores de c altos, ε varía con la concentración, debido a fenómenos de
dispersión de la luz, agregación de moléculas, cambios del medio, etc.
 Temperatura De Melting
Tm significa en inglés melting temperature y se refiere al temple a la que se hibridan
o se pegan los oligonucleótidos en los sitios que son complementarios. Este
procedimiento dependerá principalmente del prototipo de uniones (dobles o triples
enlaces de hidrógeno) que formarán sus bases, y por eso la serie de cada oligo es la
que se toma en recuento para echar de ver cuáles la temperatura óptima para su
alineamiento. Existen muchas maneras de calcularla, por ejemplo, una sencilla es:
Tm = 4(G+C) + 2 (A+T)
Aunque hay muchas otras que asimismo pueden utilizarse. Saber la Tm puede darnos
una imagen, pero no perennemente es la temperatura que se utiliza en el
termociclador, ya que además los iones y otras sustancias que haya en la reacción
pueden influir en el modo en que se unen los oligos. Una de estas fórmulas toma en
recuento los iones, pero en habitual hay que ensayar experimentalmente hasta hallar
la temperatura adecuada.

Dímero De Pirimidina
El título dímero de pirimidina hace indicación a un conjunto de enzimas con
actividades similares pertenecientes a diferentes especies entre las que se
encuentran varias bacterias y fagos, y que cataliza la separación endonucleolítica de
una serie de ADN en la población de un dímero de pirimidina. Esta enzima tiene
primacía para proceder sobre ADN de doble cadena, generando una muesca o corte
simple sobre la cadena dañada, más necesariamente en orientación 5' con relación al
espacio dañado, generando dos extremos uno hidroxi-3' y uno fosfato-5' este último
proximal al dímero. Otros nombres por los cuales se conoce a esta enzima son
endodesoxirribonucleasa V de bacteriófago T4 y T4 endonucleasa. Es una enzima
compleja que presenta en realidad dos actividades diferentes, una actividad ADN
glicosilasa sobre dímeros de pirimidina, y una actividad endonucleasa AP
(apurínica/apirimidínica).
1. La acción glicosilasa rompe el enlace N-glicosídico entre el extremo 5' del
dímero de pirimidina y el azúcar propio, creando un espacio AP
(apurínico/apirimidínico).
2. A continuidad, la acción endonucleasa AP hidroliza el enlace fosfodiéster en
el extremo 3' del sitio AP, generando un rompimiento en la serie afectada
 PCR Y Prueba De Paternidad

El proceder de conseguir un perfil de ADN se fundamento en formar millones de

copias o ampliar las secuencias del genoma que permiten diferenciar individuos,
en este caso los marcadores STRs. Esta técnica permite replicar al ADN in vitro, y
se conoce considerablemente por sus siglas en inglés como PCR (polymerase chain
reaction). La PCR se realiza por ciclos de temperatura en los que básicamente
suceden los siguientes tres pasos en cada período: 1) desnaturalización, por calor se
abren las cadenas de ADN, 2) alineamiento de secuencias cortas conocidas como
primers, que delimitan las regiones que se van a replicar, y 3) propagación,
formándose cadenas nuevas de ADN por acto de la Taq polimerasa,
una enzima termoestable capaz de añadir nucleótidos a los extremos de los primers.
En cada período de PCR se duplica la serie de utilidad (STRs), por lo que en solo 25
ciclos hipotéticamente habrá un sinnúmero de copias, a lo que se conoce como
“amplificado”, lo que facilitará considerablemente su análisis posterior. Para el
análisis post-PCR hay que acordarse que los alelos STRs se diferencian por la cifra
de veces que se repite una serie, esto significa que el tamaño o extensión va a ser
desigual de un alelo de otro. Para ver estas diferencias se emplea la electroforesis,
técnica para separar moléculas en una superficie de soporte (gel) por acto de un
campo eléctrico en base a la carga y tamaño de la molécula; las más pequeñas corren
más raudo mientras las grandes se van retrasando.

OBJETIVOS

Extracción:
•Extraer ADN a partir de muestras biológicas
•Conocer las diferentes técnicas de aislamiento de ADN
•Analizar cada proceso de la técnica de aislamiento de ADN

PCR:
•Conocer los fundamentos en los que se basa la técnica de PCR.
•Conocer su importancia del uso de la técnica de PCR para el diagnóstico de
enfermedades en los seres humanos.
•Explicar cómo se genera un fragmento especifico de ADN genómico humano
utilizado la técnica de PCR.

Electroforesis:
•Apreciar la técnica de electroforesis en gel.
•Comprender los conceptos que están involucrados en la separación de ácidos
nucleicos en una corrida electroforética.
•Observar la muestra de ADN aislada de la práctica anterior
MATERIALES

•Kit de extracción de ADN

•Micro pipetas de 20-100,100-1000ul
•Puntas de 10-1000ul y de 100-1000ul
•Tubos ependorff de 1,5 Ml
•Micro pipetas de 20-100, 100- 1000
•Puntas de 10 -100ul y de 100-1000ul
•Tubos ependorf de 1,5 mL
•Microcentrifuga 16000 rpm
•Tubos ependorf
•Termociclador
•Agua estéril
•Muestra de ADN
•Mix de PCR (taq polimerasa, dNTPs, primer, Mg, agua)
•Primers Alfa tubiluna y beta actina
•Marcador de peso molecular.
•Cámara de electroforesis y accesorios (peines, soporte, tabla niveladora,
etc).
•Fuente de poder.
•Micropipetas para volúmenes de 0,5 - 20 μl
•Guantes.
•Gradilla para tubos de 1,5 mL.

PROCEDIMIENTO

Extracción De ADN De Sangre Total:

Para la práctica de extracción primero se extraerá sangre de los voluntarios con una
lanceta esterilizada pinchando el dedo índice hasta obtener la cantidad preferida
para realizar la práctica y será colocada en un portaobjeto (ósea la sangre). Tener
en cuenta de que
+se realizará el mismo procedimiento para obtener las 4 muestras.
En un tubo de eppendorf añadir la sangre fresca de 20 ul que será extraída con una
pipeta amarilla ( marcado 0.20) , de ahí agregar 20 ul de proteinasa k .Seguidamente
añadimos la ARNasa 20 ul al tubo de la muestra sometiéndose al vórtex 15 segundos
para que la sangre no se coagule e incubar en agua a 55 C por 10 minutos.
Extraer 100 ul de buffer lisis con la pipeta y agregarlo al tubo de la muestra y
homogeneizar utilizando el vórtex 15 segundos .Añadir 100 ul de etanol (alcohol)
extraído con la pipeta al tubo de la muestra .Mezclar en el vórtex 15 segundos y
reposar a temperatura ambiente 5 minutos, después de este proceso la muestra ya
no mantendrá el color original .
 Proceso De Purificación:
Traspasar el contenido (muestra) al tubo de sílica (columna de extracción) con una
pipeta marcada a 260 ul , luego centrifugar a 8000 rpm contra pasándolo con otros
tubos y descartamos el filtrado y colocamos el tubo de sílica en un nuevo tubo de
lavado . Lavar con 200 ul de buffer de lavado y centrifugado por un minuto a 8000
rpm , luego descartamos el filtrado .Seguidamente realizamos el mismo proceso
pero centrifugamos por 3 minutos y así filtramos todo lo que no sirve descartando.
Colocamos el tubo de sílica en un nuevo tubo y añadimos 100 ul buffer de elución al
tubo e incubar 1 minuto y centrifugar 1 minuto a velocidad máxima . Finalmente
votamos la columna de extracción y el tubo tendrá ADN puro (purificado) y este
será llevado a un almacén de -80 C para las siguiente práctica .

Cuantificación De Ácidos Nucleicos:

Para la continuación de esta práctica usaremos la muestra obtenida del anterior

procedimiento y añadimos 2 ul del ADN extraído con una pipeta en el sensor del
espectrofotómetro (máquina nanodrop) y anotar los resultados .
 Espectrofotómetro de Lambda

4. PCR- REACCIÓN EN CADENA POLIMERASA :

Primero tener en cuenta de que las muestras ( 4 tubos ) estén rotuladas como
J1,J2,H1,H2.Luego en un tubo de PCR se le añadirá la muestra y el mix de PCR, la
cantidad será según lo mostrado en el siguiente cuadro :

COMPONENTE CONCENTRACIÓN A CONCENTRACIÓN FINAL VOLUMEN A

LA QUE SE CONSERVA EN LA REACCIÓN AÑADIR ( ul )

AGUA …………….. ………………. 12,1 ul

TAMPÓN 10X 1X 6,6 ul

MgCl2 25 mM 1 mM 6,6 ul
 PRIMERS R 10 uM 0.4 uM 0,6 ul

PRIMERS F 10 uM 0.4 um 0,6 ul

dNTPS 10mM 0.4 mM 6,6 ul

Taq 5 unidades (ul) 1 unidad ( 25 ul ) 6,6 ul

ADN …………………. ………………….. 5,1 ul

DESNATURALIZACIÓN HIBRIDACIÓN ELONGACIÓN N DE MANTENER A

CICLOS

94 C por 15 segundos 58 C por 30 72 C por 15 x1,x 25 ,x 1 20 C

segundos segundos

Luego de de que esté listo , centrifugar a 8500 rpm brevemente hasta mezclar
bien los componentes .
Después colocar los tubos en el termociclador , el cual ya debe de estar
programado de esta manera :

En esta imagen observamos de una manera más específica la programación en el

termociclador según lo indicado.

Finalizando el proceso de amplificación, retirar los tubos del termociclador y

guardar las muestras a 20 C y este tomará un lapso de reposo y será utilizado en la
siguiente práctica.
DISCUSION

Extracción:
Una vez que obtuvimos los tubos de ensayo con las muestras de sangre se le agrega
proteínasa k que funciona como facilitador de la lisis y para degradar las proteínas
que se encuentran en la sangre obteniendo así una muestra mucho más pura, luego se
le agrego RNasas son enzimas que cortan las cadenas de ARN para su posterior
degradación esta igual que la proteinasa k nos ayudara a conseguir una solución más
purificada para solo poder examinar el ADN. Seguidamente incubamos a alta
temperatura y añadimos buffer lisis y lo sometemos a vortex para cumplir con el
paso de la homogenización.
El buffer lisis es un método químico que permite la ruptura de las células este está
formado por un detergente que funciona solubilizando los lípidos y para disolver la
membrana celular y romper la membrana nuclear , un agente quelante que se encarga
de inactivar las nucleasas de penden del ion magnesio y sustancias cautropicas que
cambian las cargas de las proteínas o de la molécula para evitar que otras moléculas
interaccionen con la matriz de silica .Continuamos añadiendo etanol que ayuda a
incrementar la carga del ADN para que tenga mayor afinidad a la matriz de silica ,
luego dejamos incubar 0nuestra muestra durante cinco minutos para dejar actuar el
etanol y así concluimos con la parte de la extracción dando paso al siguiente paso que
es la purificación .
Para iniciar la purificación se coloca la mezcla en una columna de silica que funciona
como un filtro y tiene carga positiva y se centrifuga, aplicando este procedimiento
dos veces para seguidamente añadir el buffer de lavado para eliminar sustancias que
quedan y luego el buffer de elución que permitirá que se libere el ADN de la columna
de silica y seguidamente lo centrifugamos para obtener el producto que sería el
ADN genómico purificado.
Cuantificación
La obtención de los datos de ADN total de la muestra de sangre de cada uno de
nuestros compañeros fue gracias al uso del método de fluorometria que tiene un alto
grado de sensibilidad y nos permite medir pequeñas cantidades de ADN, este
funciona usando un flurometro donde se va a colocar 1ul de la muestra + 199ul
fluorocromo que se va unir al ADN de la muestra
Las concentraciones son diferentes debido a la cantidad de glóbulos blancos que
tenía en la sangre cada persona debido a eso las diferentes concentraciones de ADN
recuperado ya que el ADN se encuentra en las células nucleares en este caso como
los linfocitos de la sangre de cada estudiante.
También puede ser debido al manejo de la muestra, al traspar la muestra a otro
recipiente

PCR
Gracias a la ayuda de los productos utilizados como Dntps,cebadores,ADN
polimeraza ,ADN molde , Solución Tampón o Buffer y Iones divalentes (Mg++)
logramos obtener copias de fragmentos de ADN ,
el cebador dan especificidad y se unen de forma específica a la región de interés
El que se encargó de polimerizar el ADN fue el ADN polimeraza que es una enzima
que necesita la ayuda de los cofactores iones mg ++ para que pueda formar la enzima

Electroforesis
Las muestras de la proteína suelen disolverse en una solución de sacarosa cuya
densidad impide que la muestra se mezcle con el amortiguador y luego se carga en
los pozos con una pipeta fina. En el paso 2 se aplica una corriente directa al gel, lo
que ocasiona que las proteínas se muevan en la poliacrilamida en carriles paralelos.
Cuando se realiza en el detergente SDS, las proteínas se mueven como bandas a
velocidades inversamente proporcionales a su masa molecular. Una vez que la
electroforesis se completa, el gel se retira del marco de vidrio y se tiñe.
Nosotras pudimos observar que en los carriles uno, siete y once del gel de
poliacrilamida se encontraban los marcadores de peso molecular, se lo adicionó ya
que es necesario tener una guía para saber cuántos pares de bases miden cada uno.
Luego observamos que en los carriles dos y diez en la parte superior, casi al inicio,
se encontraba el patrón de banda del ADN total; pudimos notarlo ya que sí funcionó
la extracción de ADN debido a que realizamos todos los pasos necesarios y la
extracción de sangre fue la adecuada. En los carriles tres (donde se añadió el PCR
amplificado del grupo I) y cuatro (el PCR amplificado del grupo II) no observamos
ningún patrón de banda. Esto se debe a que la extracción de sangre tenía poca
cantidad de glóbulos blancos, tal vez se pudo contaminar con ADNasas de los guantes
contaminados, o la concentración de ADN no fue suficiente para realizar un buen
PCR y por consiguiente no se pudo realizar un buen proceso de electroforesis, u otra
opción fue que en el momento de trasvasar la muestra de un tubo a otro tubo colector
se pudo quedar la mayor concentración en unos de los ellos. En los carriles cinco
(donde se añadió el PCR amplificado del grupo III) y seis (el PCR amplificado del
grupo IV) si se pudo evidenciar los patrones de bandas, esto se debe a que la
extracción de ADN fue la correcta por consiguiente se hizo un buen PCR y también
se realizó el proceso de electroforesis de manera correcta. Por último en los carriles
ocho y nueve (donde se les agregó ADN total + ECOR I) pudimos observar que si se
formaron los fragmentos; debido a que la extracción de ADN fue buena, además que
las enzimas de restricción funcionaron de la manera correcta cumpliendo con su
trabajo.
Las posibles causas por la que no se obtuvo resultados positivos fueron.
•Degradación del ADN: esto puede ocurrir cuando se manipula la muestra en
condiciones subóptimas o cuando se hace una autopsia, por ejemplo, y resulta en
ausencia de amplificación o resultados parciales. Un caso particular es el "allele
dropout", o bien pérdida de un alelo, que se puede llegar a confundir con ser
homocigótico para dicho alelo.
•Inhibición de la PCR: puede haber agentes que interfieran en el correcto transcurso
de la PCR. Requerirá un procesamiento adicional de la muestra para eliminar estos
compuestos del medio antes de preparar la mezcla de PCR. Tanto la sangre como el
semen contienen este tipo de inhibidores, por lo que es necesario una purificación
previa.
•Modificación del ADN: las sustancias como el formol (empleado en conservación de
tejidos) o la luz ultravioleta modifican el ADN, alterando así los resultados de la
amplificación

CONCLUSIONES

Esta práctica podemos concluir que se logró la extracción y purificación de ADN de

células eucariotas obteniendo la muestra de sangre periférica, De esta manera, se
puedo separar de otros componentes como proteínas, lípidos, carbohidratos, etc. se
concluye que la practica fue un éxito ya que se consiguió paso a paso como se debe
realizar la extracción y purificación del ADN.

La reacción de cadena de la polimerasa o PCR es una técnica fundamental para la

mayor parte de las aplicaciones de la biología molecular. Sea presentado la base
teórica y práctica de la PCR existen muchas variantes de la PCR convencional, como
son la PCR en el tiempo real o PCR cuantitativa (que permite cuantificar la cantidad
de producto amplificado) o la PCR por transcripción inversa (mediante la cual se
obtiene una copia de DNA complementario, DNAc, utilizando como molde ácido
ribonucleico, RNA) Existen gran cantidad de información referida tanto en la PCR
convencional como a sus variantes
Se observa que la mayor concentración de ADN hay mayor intensidad de la coloración
en la electroforesis. los resultados de ADN se pueden obtener gracias a que la
temperatura desnaturaliza proteínas dejando al ADN puro para su lectura en el
Qubit y su posterior corrida electroferica.
El peso molecular y el tamaño influirán en el movimiento del ADN por los poros de la
agarosa en los diferentes parámetros establecidos en la electroforesis.

REFERENCIA BIBLIOGRAFIA

 Advincula. Extracción del ADN .Santiago,Chile:Ministerio de Salud

Consultado el: [01 de noviembre de 2019].Disponible en
http://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S1851-
75872010000200001&script=sci_arttext
 Choque B. Extracción del ADN.Colombia.Zuckta.Consultado el: [01 de
noviembre de 2019].Disponible en:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf