R. Carlos Burbano V.

Enzimas de Restricción
 Hasta 1970, no existían métodos disponibles para cortar en ADN
genómico, técnica necesaria para el estudio de la función de los
genes.

Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.

 Enzimas de Restricción
 Son enzimas capaces de cortar el ADN en secuencias específicas. Su
descubrimiento fue un hito muy importante para la biología
molecular.
 Este descubrimiento le valió ganar el premio Nobel a Werner Arber,
Daniel Nathans y Hamilton O. Smith.

Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.

 El descubrimiento

Virus (Bacteriofago)
Metilasa

Enzima de restricción Metilación del ADN

bacteriano

Sitio específico
de
reconocimiento

Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.

 Enzimas de Restricción
 El Sistema de modificación mediados por enzimas de restricción esta
compuesto de dos partes:

Enzimas de
restricción

Endonucleasa DNA methylase

Enzima encargada
Corta secuencias de marcar el ADN
específicas de ADN con un grupo
metilo
Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.
 Enzimas de Restricción

Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.

 Primera Enzima de Restricción
 La primera enzima de restricción fue aislada a partir de E. coli en 1968
(Meselson and Yuan, 1968).
 Esta enzima era capaz de cortar el ADN, pero el sitio preciso de corte no
estaba claramente definido.

La enzima mostró un gran

número de actividades
complejas, lo que dificultó
su estudio.

Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.

 Enzimas de
restricción

Tipo I y III Tipo II

•Tienen actividad de restricción y modificación (metilan)

•Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las tipo I Sólo tiene actividad de restricción
cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea rio arriba o rio
abajo. Las tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que Cortan de manera consistente y predecible,
reconocen. dentro de la secuencia que reconocen.
•Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de ADN, desde el Sólo requieren Mg++ como cofactor
lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
No necesitan ATP

Cortesia: Luis Eduardo Sanchez Timm PhD

 En 1970, Hamilton Smith y sus colegas aislaron una enzima de
restricción de la bacteria Haemophilus influenza cepa Rd y
demostraron que era capaz de realizar un corte específico en el
ADN.
 Ellos nombraron la enzima como HindIII, la cual reconoce una
cadena doble de ADN de 6 pares de bases.

Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.

 Poco después del descubrimiento de Smith, fue aislada y
caracterizada la enzima EcoRI, a partir de Escherichia coli, strain
RY13 (Hedgpeth, Goodman and Boyer, 1972). Esta enzima cuenta con
un sitio de reconocimiento 5’-GAATTC-3’.

Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.

  Más de 900 enzimas de restricción han sido identificadas de mas de
230 especies de bacterias.
 La primera letra del nombre proviene del género, la segunda y
tercera letra corresponden a la especie de la bacteria de la cual fue
aislada.
 Los números que están después del nombre indican el orden en que
la enzima fue aislada de esa cepa de bacteria, este número siempre
se lo escribe en numeración romana.

Haemophilus influenza, cepa Rd

Escherichia coli, cepa RY13

Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.

Extremos cohesivos y extremos francos
Extremos cohesivos y extremos francos
Palíndromos
 DNA Recombinante
 “Las moléculas de ADN recombinante (ADNr) son moléculas de ADN
formadas mediante métodos de laboratorio conocidos como
recombinación genética (como la clonación molecular) para juntar
material genético de diversos medios, creando secuencias de ADN
que no se encuentran de otra manera en el genoma”.

https://es.wikipedia.org/wiki/Tecnolog%C3%ADa_de_ADN_recombinante#Aplicaciones_de_la_tecnolog.C3.A
Da_de_ADN_recombinante

Cortesia: Luis Eduardo Sanchez Timm PhD

 Vectores de clonaje
 Vectores de clonación. Su función es el almacenamiento de
secuencias y obtención de grandes cantidades de ADN.
 Vectores de expresión. Su objetivo es producir un transcrito
(RNA) o la proteína resultante de ese transcrito.
Elementos que forman un Vector de clonación
 Origen de replicación
 Marcador de selección
 Sitio de clonación multiple
Marcador de selección
Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.
Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.
 https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8
Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.
Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.
Vectores de clonación más utilizados
o Plásmidos
o Bacteriofagos
o Cósmidos
o Cromosomas artificiales:
BAC y YAC.
 ADN
recombinante
Aplicaciones:
Diagnóstico de
Arroz Dorado, infección con
Factor de Resistencia a VIH
El test de ELISA, usa
Insulina (r) Hormona del coagulacion herbicidas, etc proteínas
producidas por ADN
crecimiento (r) VIII ®Proteína de recombinante para
detector la
coagulación presencia de
Reemplaza la insulina Administrada a sanguínea anticuerpos que el
derivada de animales pacientes cuya administrada a Bt, EPSP, Beta-
Caroteno cuerpo ha producido
(puercos y Ganado), glándula pituitaria pacientes con el en respuesta a la
siendo sintetizada genera cantidades desorden de infección, de igual
insertando el gen de insuficientes para sangrado conocido manera la RT-PCR,
insulina humana en E. sostener un como hemofilia, antes
coli, o en levadura pudo desarrollarse
crecimiento y la proteína era gracias a la
(saccharomyces desarrollo normal. obtenida mediante el
cerevisiae) clonación y
Antes se extraía de procesamiento de secuenciación del
glándulas pituitarias grandes cantidades genoma del virus.
de cadáveres. de sangre humana de
múltiples donadores.

Cortesia: Luis Eduardo Sanchez Timm PhD

Methods of genetic engineering in plants
 Agrobacterium tumefaciens.
 Biolistic.
 Electroporation.
 Chloroplast transformation.
 Improving plant transformation.
 Excision of selectable marker genes from
transgenic plants.

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27
Genetic Transformation
 DNA has to bypass different membrane barriers:
 Plant cell wall.
 Plasma membrane.
 Nucleus membrane.
 Integrate into the chromosomes.

 Different methods:
 Agrobacterium tumefaciens.
 Biolistics.
 Electroporation.

Página
28
Making a Transgenic Plant
 Identification of a gene.
 Isolation of the gene.
 Modification of the gene.
 Clone the gene into a vector.
 Introduce the vector in E. coli for
multiplication.
 Genetic transformation of plant cells.
 Regeneration of transformed plant cells.

Página
29
Agrobacterium tumefaciens

 Gram-negative soil
bacterium.
 1907 (Smith and
Townsed). Crown-gall
tumor in plants in
wounded cells.
 Armin Braun – tumor cells
are transformed.
 1974 – Zaenen, Schell, Van
Montagu found
Megaplasmid present
only in virulent
Agrobacterium.
Página
30
Página
31
 Agrobacterium tumefaciens
 Virulent plasmid:
Tumor-inducing or Ti
plasmid.
 Only some genes of the
Ti plasmid are transfer
to chromosome of
plants.
 Transfer DNA (T-DNA) is
transferred from
bacteria to plant cells. It
is necessary for tumor
formation.

Página
32
Ti Plasmid

 T-DNA (transferred DNA).

 23 kbp in size found in Agrobacterium

infected plants.
 Integrated in plant nuclear at a “random
site”. Hot spots of integration have been
found in plant genomes.
 Carries genes responsible for
unregulated growth and for synthesis of
opines.
 Opines are unusual amino acids
derivatives: source of carbon and
nitrogen for Agrobacterium.

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33
T-DNA
 T-DNA is flanked by 25 bp imperfect repeats known
as border sequences (RB, LB).
 All DNA contained between the left and right border
is transferred to the plant genome as single strand.

T-DNA

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34
GENES REQUIRED FOR TRANSFER
 The genes are located in a separate part of the Ti
plasmid called the vir (virulence) region.

Página
35
Vir Region

 VirA and VirG are constitutively expressed and

controlled the activation of the other vir genes.
 VirA is a transmembrane dimeric protein with a kinase
domain, that a acts as a receptor for certain phenolic
molecules, sugars or amino acids that are released by
wounded plant cells.
 The Agrobacterium responds to these chemoattractants
by seeking out the wounded cells that produced them
and then binding to them by a polar attachment
mechanism.
 Vir genes are induced after attachment
 Acetosyringone.

Página
36
Página
37
Vir A
 Kinase domain activates VirA by
phosphorylating itlself in response
to signalling molecules from
wounded plant sites.
 Activated VirA transfer its
phosphate to the soluble
cytoplasmic transcriptional
factor VirG.
 VirG stimulates the transcription of
the other vir genes.

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38
Agrobacterium tumefaciens

Página
39
Vir D and Vir E
 VirD1 and VirD2 responsible for
cleavege of T-DNA strand at borders.
 VirD2 binds covalently to 5´end of
the T-strand which is then coated to
form a T-complex with the single
strand binding protein VirE2.
 VirD2 contains one nuclear
localization signal. Protects T-DNA
against nucleases.
 VirE2 contains two nuclear
localization sequences that interact
with plant components targeting the
T-strand to the nucleus.

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40
Página
41
T-DNA Integration
ifferent integrated T-DNA forms.

Página
42
Arabidopsis thaliana
Bacillus thuringiensis
Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.
Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.
Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.
Genes Cry

 Una gran cantidad de genes Cry han sido clonados, secuenciados y nombrados
como genes cry y cyt.
 Actualmente mas de 100 genes Cry han sido secuenciados y clasificados en 22
grupos y subgrupos diferentes dependiendo de su similaridad de aminoacidos.
 Las proteinas tóxicas para lepidopteros son las Cry1, Cry9 y Cry2.
 Las proteinas tóxico activas para coleopteros son las Cry3, Cry7 y Cry8.
 Cry1B y Cri1I tienen actividad dual.
 Cry2, Cry4, Cry10, Cry11, Cry16, Cry17, Cry19 y Cyt son tóxicas para dípteros.
 Cry5, Cry12, Cry13 y Cry14 son tóxicas para nemátodos.

Cortesia: Luis Eduardo Sánchez Timm Ph.D.

Plantas resistentes a Herbicidas
(Glyfosato)
 Glycines (glyphosate) are herbicides that inhibit 5-enolpyruvylshikimate-3-
phosphate (EPSP) synthase, a key enzyme in the shikimic acid pathway, which is
involved in the synthesis of the aromatic amino acids. EPSP inhibition leads to
depletion of the aromatic amino acids tryptophan, tyrosine, and phenylalanine that
are needed for protein synthesis. Glyphosate resistant crops with an alternative
EPSP enzyme have been developed that allow using glyphosate on these crops
with no crop injury. Glyphosate is a relatively nonselective postemergent herbicide
that is inactive in the soil because of high soil adsorption. The EPSP Inhibitor
herbicides are readily absorbed through plant foliage and translocated in the
phloem to the growing points.
Documental Alimentos transgénicos

https://www.youtube.com/watch?v=beq-tgdBZnY