Metodología para el aislamiento de Rhizobium en Medicago sativa

RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

Se tomarán muestras aleatorias de alfalfa excavando a una profundidad de 20 centímetros, y

alrededor de la planta 15 cm aproximadamente.

Lavado y selección de nódulos

Se lavaron las raíces con agua corriente evitando perder nódulos. Los nódulos serán
separados de las raíces y cortados transversalmente para verificar la actividad de la
nitrogenada considerando los siguientes parámetros: tamaño y color externo e interno de los
nódulos. Se eligieran nódulos con coloración interna roja y rosada que coinciden al mencionar
que la gran abundancia de nódulos con dicha coloración se explica por la presencia de la le
hemoglobina (proteína específica del nódulo o nodulina), encargada de aportar O2 a los
bacteroides y controlar los niveles de este elemento para proteger a la nitrogenasa y evitar la
inactivación de dicha enzima. Además, la leghemoglobina indica que existe fijación eficiente de
nitrógeno.

Los nódulos serán sumergidos en alcohol al 95 % por 10 segundos, enjuagados con agua
destilada y colocados en solución de cloro al 50 % por 5 minutos, se enjuagan seis veces con el
fin de eliminar residuos de cloro y alcohol, evitando la contaminación de otros
microorganismos. Finalmente se macerarán y se sometieron a tinción de Gram en fresco.

técnica de tinción de Gram en fresco (macerado)

Con asa de platino se tomará una muestra de cultivo puro de rizobios macerados
extendiéndola sobre lámina portaobjetos y fijándola sobre la llama del mechero. Se cubrira
con cristal violeta durante dos minutos y se lavó con agua destilada. Se adicionará Lugol por
tres minutos

Para decolorar se utilizó alcohol al 95 % durante 4 a 5 segundos. Finalmente, safranina por

cinco minutos y se lavara por tercera vez. Se observará al microscopio con objetivo (100 X) de
inmersión en aceite

Siembra

Preparara el medio de cultivo Extracto de levadura-Manitol-Agar-Rojo Congo y esterilizado en

autoclave por 15 minutos a 120 °C y 15 libras de presión

Se utilizará cajas Petri y tubos de ensayo esterilizados y se sembrará por estrías en el medio
sólido Se sellará cada muestra con cinta parafilm e incubó por 72 horas a una temperatura de
27 ˚C. Se evaluó diariamente el desarrollo de las colonias

Prueba de Catalasa

Se realizará únicamente para comprobar si los microorganismos en estudio son bacterias. Se

agregará una gota de H2O2 a una colonia de cada cepa. La prueba se considera positiva si al
entrar en contacto la colonia con el reactivo produce gas (burbujas). Esta reacción se explica
porque la membrana de las bacterias posee una enzima (catalasa) que actúa como catalizador
desdoblando el H2O2 en H2 y O2 libre, que se manifiesta por la presencia de burbujas

Prueba ANTIMIC con pesticidas

Las cepas se sembrarán en medio ELMA (Extracto Levadura Manitol Agar). Se realizará un
barrido sobre el medio sólido con un hisopo esterilizado, se esterilizaran discos de papel filtro
y se embebieron con pesticidas y agua destilada (testigo) por un lapso de 10 - 20 min. Las cajas
sembradas se rotularán con la inicial de cada pesticida más el testigo y la fecha de siembra.
Transcurrido el tiempo los discos se colocaron sobre el medio en la respectiva inicial y se
incubarán por tres días a 28 ºC. Finalmente se medirá el halo de inhibición según la escala
SPAN Diagnostics Ltd. para microorganismos Gram negativos .Esta prueba mide el grado de
tolerancia, sensibilidad o resistencia (mediante el halo de inhibición), que presentan las
bacterias a diferentes pesticidas, debido a que, se ha observado que no siempre repercuten
negativamente sobre Rhizobium.