Exhibición de investigación sobre la detección y recuperación de células tumorales

circulantes de sangre periférica de pacientes con cáncer usando microfluidos espirales

del equipo del Profesor Chwee Teck Lim en el Departamento de Ingeniería Biomédica
y el Instituto de Mecanobiología, Universidad Nacional de Singapur, y el Profesor
Jongyoon Han en la Alianza Singapur-MIT para Investigación y Tecnología (SMART),
Singapur. (Ilustraciones de Larisa Bulavina del Instituto de Mecanobiología de la
Universidad Nacional de Singapur)

Título: Un biochip de microfichas en espiral de ultra alto rendimiento para el enriquecimiento de las
células tumorales circulantes

El microchip de microfichas en espiral para detectar y caracterizar células tumorales

circulantes raras de la sangre de pacientes con cáncer no solo puede proporcionar
información crítica sobre la biología del tumor, sino que también es muy prometedor
para el diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento del cáncer.

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La detección y caracterización de células tumorales circulantes (CTC) raras a partir de la sangre de

pacientes con cáncer puede proporcionar una visión crítica de la biología del tumor y puede ser muy
prometedor para el tratamiento del cáncer. La capacidad de recopilar una gran cantidad de CTC viables
para varios ensayos posteriores, como las mediciones cuantitativas de biomarcadores específicos o el
análisis de mutación somática dirigida es cada vez más importante en la oncología médica. Aquí,
presentamos un dispositivo microfluídico simple pero confiable para el aislamiento basado en el tamaño,
sin etiquetas, de ultra alto rendimiento de CTC a partir de volúmenes de sangre clínicamente relevantes.
El tiempo de procesamiento rápido de la técnica (7,5 ml de sangre en menos de 10 min) y la capacidad de
recolectar más CTC a partir de grandes volúmenes de sangre se presta a una amplia gama de posibles
aplicaciones genómicas y transcriptómicas.Una ventaja fundamental de este protocolo es la
capacidad de devolver todas las fracciones de sangre (es decir, plasma (centrifugación), CTC y
glóbulos blancos (WBC) (clasificación basada en el tamaño) que pueden utilizarse para
diversos estudios de biomarcadores o sensibles al tiempo ensayos moleculares tales como
qRT-PCR. El uso clínico de este biochip se demostró mediante la detección de CTC del 100%
(10/10) de muestras de sangre tomadas de pacientes con cáncer de mama y pulmón
metastásico en etapa avanzada. La tasa de recuperación de CTC varió de 20 a 135 CTCs mL-
1 y se obtuvo con alta pureza (de 1 CTC de cada 30-100 WBC, lo que da un agotamiento de
aproximadamente 4 log de los WBC). Se identificaron con ensayos de inmunofluorescencia
(pan citoqueratina + / CD45-) y sondas moleculares tales como HER2 / neu.

Introducción:

Las células tumorales circulantes (CTC), células cancerosas de origen tumoral sólido que se
vierten en el torrente sanguíneo a partir de tumores primarios o secundarios de pacientes,
contribuyen directamente a la diseminación metastásica hematógena y al crecimiento posterior
de células tumorales en sitios distantes dentro del cuerpo1. 2 El aislamiento y la recuperación
de estos CTC es muy desafiante, principalmente debido a su rareza en sangre periférica y su
heterogeneidad.3 Sin embargo, el enriquecimiento de los CTC puede ayudar a los médicos a
comprender mejor la biología de la metástasis y la progresión de la enfermedad y contribuir al
cáncer gestión por potencialmente que sirve como una poderosa herramienta de pronóstico
clínico y análisis no invasivo de genotipos tumorales para el tratamiento terapéutico de las
enfermedades relacionadas con el cáncer.3,4. Sin embargo, los enfoques clínicos convencionales
para el aislamiento de CTCs de sangre periférica, incluyendo citometría de flujo, centrifugación de 5
gradientes, 6 y fluorescencia y clasificación de células activadas magnéticamente, 7,8 a menudo se basan
en técnicas de reconocimiento de antígenos, que son costosas y
limitado en rendimiento y pureza La mayoría de las técnicas requieren largos tiempos de procesamiento,
lo que resulta en una baja viabilidad celular de los CTC enriquecidos. Tampoco permiten el
fraccionamiento completo y la preservación de plasma, glóbulos blancos (WBC) y CTC. Por lo tanto, un
método confiable para el enriquecimiento rápido, eficiente y efectivo de las CTC será fundamental para
profundizar nuestra comprensión del proceso metastásico y contribuir al campo de la oncología clínica.

Microfluidics es una de las tecnologías que se desarrollan más rápidamente para la innovación
en la investigación del cáncer. La aplicación de sistemas microfluídicos para la separación de
CTC proporciona oportunidades sin precedentes para el enriquecimiento eficiente de estas
células extrañas de la sangre, lo que permite una caracterización molecular detallada de ellas a
nivel de célula única.9 Aunque se han informado varios dispositivos microfluídicos para el
aislamiento de CTC que utilizan antígenos de superficie de células epiteliales como EpCAM
(molécula de adhesión de células epiteliales), 10,11. estas plataformas / técnicas se basan en la
mediación de la interacción de CTC diana con características recubiertas con anticuerpos anti-EpCAM,
que incluyen micropilares10 o superficies nanoporosas12 en condiciones laminares controladas con
precisión y eficacia confiable. Sin embargo, algunas células tumorales expresan poca o ninguna EpCAM
(p. Ej., Para células que experimentan transición mesenquimal epitelial (EMT)), lo que da como resultado
la recuperación incompleta de CTC1,13. Además, los enfoques de aislamiento inmunomagnético
implican la manipulación bioquímica de las células, lo que son inviables o desafiantes tanto para el
cultivo como para el análisis molecular aguas abajo.14,15 Hasta la fecha, también se han desarrollado
varios dispositivos microfluídicos que emplean fuerzas dielectroforéticas para el aislamiento de células
cancerosas en función de las diferencias en las respuestas de las células al campo eléctrico.14,16,17

Aunque esto permite la clasificación de células sin etiquetas sin depender de la inmunoquímica, esta
técnica es limitada debido a las sutiles diferencias dieléctricas entre CTC y células sanguíneas, lo que
afecta el rendimiento y la pureza y los altos campos eléctricos que potencialmente pueden causar la
expresión génica (fenotípica) cambios.18 Para superar las limitaciones anteriores, se han explotado el
tamaño y la deformabilidad de las células para aislar los CTC de la sangre. Se cree que la mayoría de los
CTC son más grandes que los otros componentes sanguíneos (<20 mm) (glóbulos rojos, glóbulos blancos
periféricos y plaquetas), 19,20 incluyendo células tumorales obtenidas de pacientes con cáncer de pulmón
de células pequeñas.21 Esto evita la necesidad de cualquier conocimiento previo de las características
bioquímicas de las células diana, al tiempo que permiten la recolección de supuestos CTC
independientemente de su expresión EpCAM.. Los métodos de aislamiento de CTC basados en tamaño /
deformabilidad más populares se basan en el uso de membranas grabadas por seguimiento o filtros
microfabricados.22,23 Estas técnicas están limitadas por el volumen de sangre que se puede procesar
debido a problemas derivados de obstrucción del filtro, baja recuperación, baja pureza y baja viabilidad
celular debido al daño celular causado por la alta cizalla que se produce cuando las células pasan a través
de los poros del filtro

Los sistemas de filtración hidrodinámica para la separación basada en el tamaño en

los dispositivos microfluídicos pueden superar estas deficiencias de los enfoques
actuales que incluyen obstrucción, baja recuperación y problemas de viabilidad
celular.24,25 El flujo laminar controlado dentro de los canales microfluídicos se puede
manipular para generar tamaños dependientes trayectorias celulares para el
enriquecimiento CTC de alta resolución. Anteriormente, informamos sobre una
novedosa plataforma de microfluidos para el fraccionamiento de la sangre (también
conocida como "Dean Flow Fractionation") y la aplicamos con éxito para el aislamiento
de CTC de sangre completa.25,26 Hemos demostrado que el biochip espiral integrado
es capaz de procesar sangre con un hematocrito de 20-25%, lo que permite el
procesamiento y el enriquecimiento de células raras con una velocidad de 3 ml h-1.

Aquí, informamos el desarrollo de un biochip espiral multiplexado simple pero confiable para el
aislamiento de ultra alto rendimiento, aislamiento sin etiquetas de CTC para abordar los
desafíos de la plataforma de enriquecimiento CTC de próxima generación, como alta
sensibilidad (tasa de detección cercana al 100%) ), alta pureza (750 WBCs mL-1), alto
rendimiento (7.5 mL en menos de 10 min), enriquecimiento sin etiquetas, simplicidad y facilidad
de operación. A diferencia de la versión anterior, este dispositivo puede funcionar con un
mínimo de dos bombas de jeringa en lugar de tres (es decir, simplificando la automatización) y
puede procesar un mayor volumen de muestras de sangre en menos tiempo con una
sensibilidad y pureza relativamente más altas. El procesamiento de un mayor volumen de muestras
de sangre puede aumentar la cantidad de CTC enriquecidos para múltiples análisis aguas abajo, como
tinción inmunofluorescente, RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR),
hibridación fluorescente in situ (FISH) y también pruebas moleculares sensibles al tiempo como la
secuenciación de ARN. El uso clínico de este biochip se demostró mediante el aislamiento de CTC del
100% (10/10) de muestras de sangre tomadas de pacientes con cáncer de mama y pulmón metastásico en
etapa avanzada. Las células recuperadas no están etiquetadas y, por lo tanto, son más viables para la
propagación,
pruebas de desarrollo de medicamentos y otros análisis posteriores. Este diseño es ideal para el desarrollo
de un dispositivo de detección y recuperación de CTC automatizado y de bajo costo para el diagnóstico
de cáncer
y pronóstico

Materiales y métodos.

Fabricación del dispositivo

Los moldes de silicio SU-8 se fabricaron utilizando técnicas de litografía

estándar27,28. La oblea de silicio con patrón se silanizó con tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-
perfluorooctil) silano (Sigma Aldrich, EE. UU.) Para hacer que la superficie fuera
hidrófoba. El prepolímero de PDMS se preparó mezclando el PDMS a una proporción
estándar de 1:10 (Sylgard 184, Dow Corning, EE. UU.) Y desgasificación en una
cámara de vacío. Para producir el biochip espiral de una sola capa, el prepolímero
PDMS se vertió en el molde SU-8 y se curó a 80 grados C durante 1-2 horas dentro de
un horno convencional. Luego se cortó el PDMS del molde y se perforaron cuatro
orificios de acceso fluídico (dos entradas y dos salidas). Para obtener el dispositivo
multiplexado, se unieron tres biochips espirales utilizando plasma de oxígeno y
alineaciones manuales. El dispositivo final se obtuvo uniendo todo el conjunto a un
portaobjetos de vidrio microscópico utilizando una máquina de plasma de aire

Cultivo celular y preparación de muestras

Dos líneas celulares de cáncer humanas comercialmente disponibles, a saber, el

adenocarcinoma de mama (MCF-7) y la vejiga (T24) se usaron por primera vez para
imitar la separación de CTC. Se cultivaron las células MCF-7 (HTB-22 ™, ATCC, EE.
UU.) Y las células T24 (HTB-4 ™ ATCC, EE. UU.) en medio de Eagle modificado con
Dulbecco de alta glucosa (DMEM) (Invitrogen, EE. UU.) suplementado con suero
bovino fetal al 10% (FBS) (Invitrogen, EE. UU.) junto con 1% de penicilina-
estreptomicina (Invitrogen, EE. UU.). El cultivo se mantuvo a 37ºC en una atmósfera
humidificada que contenía 5% (v / v) de CO _ {2} hasta 80% de confluencia. Las
células se cultivaron en placas estériles de 6 pocillos (BD Bioscience, EE. UU.) Y se
subcultivaron (1: 3) dos veces por semana, con medios reemplazados cada 48 horas.
Las monocapas subconfluentes se disociaron usando tripsina al 0,01% y solución de
EDTA 5,3 mM (Lonza, Suiza). Para los experimentos de control y recuperación, las
células cancerosas se diluyeron en tampón que contiene 1x solución salina tamponada
con fosfato (PBS), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM suplementado con
albúmina de suero bovino al 0,5% (BSA) (Miltenyi Biotec, Alemania) para prevenir
adsorción específica en la tubería y paredes de microcanales
Para todos los experimentos a menos que se mencione lo contrario, la sangre
completa obtenida de donantes sanos se lisó usando tampón de lisis de eritrocitos
(RBC) (Bioscience, EE. UU.) Durante 5 minutos a temperatura ambiente bajo mezcla
suave continua. Los RBC lisadas se eliminaron por centrifugación a 1000xg durante 5
minutos y la fracción de células nucleadas se resuspendió en solución salina
tamponada con fosfato (PBS) en consecuencia. El proceso de lisis de RBC elimina los
contaminantes sanguíneos y, por lo tanto, reduce la concentración total de células. Por
lo tanto, las células nucleadas pueden resuspenderse en un volumen menor de
tampón, acelerando el proceso de clasificación basada en el tamaño mediante el
dispositivo microfluídico.

Tinción de inmunofluorescencia y análisis del sistema de citometría

automatizada fluorescente (FACS)

Los resultados de los experimentos llevados a cabo para determinar la pérdida de células producida por
lisis se analizaron realizando análisis de citometría de flujo usando un citómetro de flujo BD Accuri C6
(BD Biosciences, EE. UU.) En las muestras lisadas y de sangre completa enriquecida. Las muestras se
enriquecieron con 100.000 células T24 preteñidas con anticuerpo de pancitoqueratina (CK) conjugado
con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1: 100, Miltenyi Biotec Asia Pacific, Singapur). Muestras de
salida
se concentraron a 1 ml y se procesaron para la cuantificación de células pan-CK +. Para la cuantificación
de los recuentos de células, se llevó a cabo la tinción de inmunofluorescencia (IF) para permitir la
visualización y diferenciación de los diversos tipos de células. Las muestras de salida se fijaron con
paraformaldehído al 4% (PFA) (Sigma, EE. UU.) Durante 10 min a temperatura ambiente, se
permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 en PBS (Sigma, EE. UU.).

Las células permeabilizadas se trataron con un cóctel de anticuerpos (anticuerpo pan-CK, anticuerpo
CD45 conjugado con APC (1: 100), Miltenyi Biotec Asia Pacific, Singapur) y colorante Hoechst en
tampón PBS durante 30 min en hielo. Durante el análisis de citometría de flujo, las células se cerraron en
base a las dispersiones directa e indirecta, así como a la intensidad de fluorescencia

Experimentos de cultura de viabilidad

Se añadió una concentración conocida de células T24 a sangre completa antes de la
lisis. Los recuentos de células T24 (antes y después de la lisis) se compararon
mediante la enumeración de sangre enriquecida con T24 recuperada después de su
tratamiento respectivo. Las células recuperadas se sembraron en sustratos 2D en
condiciones de crecimiento óptimas y se obtuvieron imágenes de campo brillante
después de 5 minutos desde la siembra.

Hibridación de fluorescencia de ADN in situ

(FISH)

Se obtuvieron muestras de pacientes con estado tumoral HER2 +. Los tumores se

extrajeron mediante biopsia en la etapa de diagnóstico (pretratamiento) y se analizaron
para la amplificación génica por PCR en el hospital (no se muestra). Las células se
hilaron en portaobjetos usando una centrífuga Cytospin (Thermo Scientific, EE.UU.) a
600 rpm durante 6 min. Los portaobjetos se fijaron en PFA al 4% a temperatura
ambiente durante 10 minutos y se deshidrataron a través de series de etanol (80%,
90% y 100%). Para DNA FISH, los portaobjetos se trataron con RNasa (4 mg mL-1)
(Sigma, EE. UU.) Durante 40 min a 37 ° C, se lavaron con 1x PBS / 0,2% Tween 20
(Sigma, EE. UU.) Tres veces y se desnaturalizaron con 70% formamida / 2x SCC
durante 10 min a 80 ° C. Luego se apagaron de nuevo con una serie de etanol
enfriado en hielo.

Las sondas HER2 se aplicaron directamente a portaobjetos mantenidos a 42 ° C. La

hibridación se continuó a 42 ° C bajo condiciones oscuras y húmedas durante la
noche. Los portaobjetos se lavaron con 50% de formamida / 2x SSC y 2x SSC a 45 °
C bajo agitación, se contratiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y se sellaron
con un cubreobjetos de 50 mm x 50 mm (Fisher Scientific, EE. UU. )

Muestras clínicas

Se obtuvieron muestras de sangre completa de donantes sanos y 10 pacientes con

cáncer de pulmón o de mama metastásico. Este estudio fue aprobado por nuestro
comité de ética local de acuerdo con un protocolo permitido por la Revisión
Institucional. Junta (IRB). Un total de 5 muestras de sangre de donantes sanos se
usaron como controles y 10 muestras de pacientes con cáncer de pulmón y de mama
se procesaron para la enumeración de CTC. Se tomaron muestras de sangre en tubos
Vacutainer® (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) Que contienen
anticoagulante con EDTA y se procesaron en 2-4 h para evitar la coagulación
sanguínea. Para todas las muestras, se lisaron inicialmente 7, 5 ml de sangre
completa usando tampón de lisis de RBC y se resuspendieron en PBS antes del
procesamiento en el biochip. Se concentraron 7,5 ml de sangre a 3,75 ml para el
procesamiento, reduciendo el tiempo de procesamiento. Las muestras se procesaron a
una velocidad de entrada de 350 mL min-1

Resultados y discusión
Working principle

La Fig. 1A ilustra esquemáticamente el principio de separación hidrodinámica en

canales de microfluidos en espiral. En los microcanales en espiral con sección
transversal rectangular, la influencia de las fuerzas centrífugas que actúan en la
dirección radial da como resultado la formación de dos vórtices simétricos
contrarrotativos a través de la sección transversal del canal, también conocidos como
vórtices Dean. Bajo condiciones de flujo Poiseuille, partículas naturalmente flotantes
de diferentes tamaños se equilibran en diferentes posiciones a lo largo de la sección
transversal del microcanal bajo la influencia del levantamiento inercial y las fuerzas de
arrastre Dean.24 Al confinar las células en la entrada a una región de la sección
transversal del canal, podemos efectivamente fraccionar las células equilibrando los
CTC cerca de la pared interior de microcanal mientras conduce las células
smallerhematological (plaquetas y WBC) a la pared exterior de microcanal, lo que
permite una separación eficiente en el outlet.29 El biochip espiral enriquece la
población CTC por un significativo 10 4 - pliegue de una fracción celular nucleada
empobrecida en glóbulos rojos. Se compone de dos entradas y dos salidas para
enriquecer los CTC más grandes en la salida. Los CTC recogidos pueden luego
analizarse mediante técnicas adecuadas posteriores tales como inmunotinción, qRT-
PCR y FISH, o pueden emplearse para el cultivo y el análisis de células individuales
(figura 1B).

Optimización de parámetros de operación Spiral Biochip

El desafío para el uso clínico de los CTC es desarrollar un ensayo imparcial, de alto rendimiento y
confiable para enriquecer los CTC viables de sangre periférica dentro de un período de tiempo razonable.
La captura de cuadro de alta velocidad (6.400 cuadros por segundo) de aislamiento de CTC a través del
dispositivo espiral se ilustra en la figura 2A. Para todos los experimentos, se realizaron imágenes de alta
velocidad para monitorear la posición de CTC y WBC cerca de la región de salida (ver Película S1 y S2
en ESI †). El 99,99% de los glóbulos blancos y los eritrocitos residuales se sometieron a una migración
completa del ciclo Dean y se retiraron a la salida de los desechos, mientras que los CTC que se enfocaron
cerca de la pared interna durante la migración lateral se pueden recoger de la salida del CTC. Para reducir
la cantidad de componentes celulares que fluyen en el biochip espiral, empleamos una técnica de lisis de
RBC convencional (usando solución de cloruro de amonio) para procesar un
mayor volumen de muestras clínicas. Si bien los WBC constituyen solo el 1% de la fracción de volumen
sanguíneo total, todavía es un desafío separar eficientemente cantidades mínimas de CTC de ellos.
Se llevó a cabo una extensa caracterización de la metodología propuesta para estudiar la capacidad de
agotamiento de los WBC en el biochip espiral. Para demostrar el impacto de la concentración de células
de muestra de entrada en el rendimiento del dispositivo y la pureza final, llevamos a cabo el
procesamiento de la sangre en diferentes concentraciones de células nucleadas. Un inicial de 7,5 ml de
sangre total recogida de donantes sanos se lisaron los RBC y la fracción celular nucleada se centrifugó y
se resuspendió de nuevo a 7,5 ml.
(Concentración 1x), 3,75 ml (concentración 2x) y 2,5 ml (concentración 3x), respectivamente. La Fig. 2B
muestra el recuento celular total recogido de la salida de CTC a diferentes concentraciones de muestra en
5 min. Se observa una tendencia incremental lineal en el recuento total de células, lo que sugiere el efecto
de la concentración inicial de WBC en la pureza final.
Dado que el número total de glóbulos blancos varió de un paciente a otro y con el tipo / estadio
de cáncer, 30 decidimos usar una concentración 2x (≈14 x 10 ^ 6 glóbulos blancos) como
óptimo para pruebas futuras y validación clínica. Esto se traduce a un tiempo total de
procesamiento de alrededor de 10 minutos para una muestra de sangre de 7,5 ml utilizando un
dispositivo multiplexado con tres biochips en espiral apilados (ver Fig. 1).

A continuación, para demostrar robustez y repetibilidad, se procesó una población pura de

leucocitos a través del biochip a una concentración 2 veces continua. Se recogieron muestras
enriquecidas que contenían los WBC contaminantes de la salida de CTC para un período de 5
minutos, cada colección tomada de diferentes intervalos de tiempo (0-5, 5-10 y 10-15 minutos)
desde el inicio del procesamiento. El recuento de leucocitos recolectados en los diferentes
puntos de tiempo es bastante uniforme con aproximadamente 900-1200 células recogidas bajo
las condiciones de flujo óptimas (véase la Fig. 2C). El análisis microscópico de los WBC
recogidos (datos no mostrados) reveló que esta subpoblación era del orden de los CTC en
términos de tamaño (es decir, 12-15 mm), y se puede diferenciar fácilmente usando tinción de
inmunofluorescencia y enfoques moleculares. Comenzando con una concentración inicial de
nucle7 x 10 ^ 6 células nucleadas, el biochip espiral redujo el 99,99% de los WBC,
proporcionando una fracción de CTC más pura a la salida.
Esto es particularmente importante para muchos ensayos moleculares aguas abajo donde los
materiales contaminantes de los WBC pueden reducir significativamente la relación señal /
ruido, lo que lleva a un diagnóstico inexacto.

Efecto de la lisis de RBC en la eficiencia de separación y la viabilidad celular

La lisis química de sangre completa usando cloruro de amonio se ha empleado ampliamente para el
agotamiento de glóbulos rojos contaminados en diversas aplicaciones tales como el análisis de
transcriptoma de glóbulos blancos en diversas enfermedades humanas. Mientras que algunas personas
tienen
informaron que la lisis de RBC puede conducir a la pérdida compuesta de células, 30 hemos demostrado
aquí que la depleción de RBC no comprometió significativamente la recuperación y el aislamiento de las
células cancerosas (Fig. 3A). La exposición al tampón de lisis tampoco alteró la morfología
y tamaño de las celdas (Fig. 3B). También comparamos el rendimiento de nuestro biochip26 integrado
anterior con el nuevo espiral multiplexado uno para CTC
aislamiento. En el biochip integrado anterior, se procesó sangre completa (100 uL min-1) con el
dispositivo espiral en cascada de dos biochips y se diluyó progresivamente con un flujo de vaina (750 uL
min-1) que atraviesa el dispositivo. 7.5 ml de sangre total es
procesado en aproximadamente 30 min. Los recuentos de CTC obtenidos de ambos biochips donde se
usaron para el análisis de muestras de pacientes con cáncer de pulmón se muestran en la Fig. 3C. El
biochip en espiral multiplexado produjo una eficiencia de captura significativamente mejorada en
comparación con el biochip integrado anterior que procesó sangre completa. Esto también se hace en un
tiempo más corto (7,5 ml de sangre en 10 minutos), lo que da lugar a un aumento mucho mayor.
rendimiento (Fig. 3D). Además, la pureza de los CTC recuperados capturados entre los WBC
contaminantes fue significativamente mayor para el biochip multiplexado, en comparación con el
integrado.

Eficiencia de aislamiento y viabilidad celular utilizando líneas celulares cancerosas

Para probar el rendimiento del biochip espiral multiplexado para el aislamiento y la

recuperación de CTC, caracterizó el biochip con líneas celulares de cáncer disponibles
comercialmente. Se ha demostrado que las líneas celulares son un buen sustituto para la
caracterización de varios microfluidos, así como otros ensayos de enriquecimiento de CTC.
Usando el biochip espiral, demostramos la alta recuperación de células cancerosas de mama
(MCF-7) y vejiga (T24) añadidas a muestras de sangre sana. Estas líneas celulares se eligieron
debido a su diferente rango de diámetros celulares (MCF-7: 20 mm; T24: 30 mm), que
validaron la capacidad del biochip espiral multiplexado para enriquecer los CTC de diferentes
tamaños de varios tipos de cáncer.
Después del enriquecimiento, las células cancerosas se identificaron mediante tinción de
inmunofluorescencia, ya sea enumerando bajo microscopía de epi-fluorescencia o mediante
análisis de citometría de flujo con biomarcadores comunes (CK + / CD45-). Para ambas líneas
celulares activadas a concentraciones clínicamente relevantes de 500 células por 7.5 mL de
sangre completa, se logró una recuperación de 87.6% para MCF-7 y 76.4% para células T24
(Fig. 4A). Para verificar la viabilidad celular, se realizó la tinción con yoduro de propidio (PI) de las
muestras recuperadas. La alta viabilidad se confirmó por la tinción mínima (<10%) detectada por
citometría de flujo
(Fig. 4B). Las células viables aisladas pueden luego sembrarse en sustratos de cultivo 2-D, donde se unen
y proliferan en condiciones de cultivo estándar. La morfología de las células permaneció relativamente
sin cambios en diferentes etapas de procesamiento (antes de la lisis, después de la lisis y después del
procesamiento con lisis (ver Fig. 4C)). Las células aisladas después del procesamiento del dispositivo
también pueden permanecer durante días después de la siembra en los sustratos de cultivo (ver ESI Fig.
S1 †).

Esto ilustra que tanto el proceso de lisis como la fuerza de corte inducida durante la
recuperación no afectaron la viabilidad celular, y está en buen acuerdo con estudios
previos que muestran que las condiciones de alto cizallamiento dentro de los
microcanales en espiral no tienen efectos adversos sobre las células enriquecidas31.

Enriquecimiento de CTC de pacientes con cáncer de mama y pulmón

metastásico

Usando los parámetros de prueba óptimos, se procesaron muestras de sangre de 7,5 ml de 5

voluntarios sanos (control) y 5 pacientes con cáncer de mama metastásico y 5 pacientes con
cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) (Tabla 1). CTC capturados por la espiral
biochip se identificaron mediante un análisis de imagen completo Algoritmo, que consiste en
teñir con Hoechst el contenido de ADN, anticuerpos pancitoqueratina conjugados con FITC
para células cancerosas / epiteliales, y anticuerpos anti-CD45 conjugados con APC para
células hematológicas (figura 5B).
Las células se tiñeron positivamente tanto para Hoechst como para panquetoqueratina,
mientras que las negativas para CD45 se puntuaron como CTC. Se detectaron CTC en 10 de
10 muestras de pacientes (100% de detección) con recuentos de 20 a 67 CTCs mL-1 para
muestras de cáncer de mama y de 33 a 135 CTCs mL-1 para muestras de cáncer de pulmón
(Fig. 5A). Los intervalos de diámetro CTC fueron de 15-25 mm para muestras de cáncer de
pulmón y de 20-35 mm para muestras de cáncer de mama (datos no mostrados). También se
detectaron células epiteliales positivas para pancitoqueratina en voluntarios sanos (1-4 ml-1), lo
que indica un umbral de detección claro. Para evaluar la viabilidad de caracterizar la alteración del
número de copias del gen por FISH de CTC aisladas utilizando el biochip espiral multiplexado, hemos
seleccionado unas pocas muestras de cáncer de mama HER2-positivas para su análisis. Estas muestras se
obtuvieron de pacientes con estado tumoral positivo para HER2. Se ha informado que el cáncer de mama
HER2 positivo es más agresivo que otros tipos de cáncer de mama; 32,33, sin embargo, los tratamientos
que se dirigen específicamente a HER2 son muy efectivos34. Las señales de HER2 en CTC aisladas se
compararon con las líneas celulares de cáncer de mama control SKBR3 (amplificadas Señales HER2) y
MDA-MB-231 (señal HER2 no amplificada) como se muestra en la figura 5C. Curiosamente,
encontramos que el estado de HER2 en CTC aisladas no se correlacionaba con las características del
tumor primario.
Para 3 (de 5) pacientes que se analizaron en este estudio, el estado de HER2 fue negativo (donde se
determinó la expresión de HER2 amplificada cuando la relación de HER2 / centrómero de las señales del
cromosoma 17 (Cen17) en un solo núcleo fue> 2), lo que indica la heterogeneidad del estado de HER2 en
células diseminadas y tumor primario.

Pleomorfismo y heterogeneidad de células CK + enriquecidas