ESPECTROFOTOMETRIA

Sandra Lorena Realpe1, Ingrid Alejandra Briñez2, Ana María Lasso.3

Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de Química, Universidad Santiago de Cali
Laboratorio de Bioquímica
Lorena.realpe@gmail.com, Ibrinez23@gmail.com. Analasso82@hotmail.com
Marzo 4 2015

RESUMEN:

Se realizo las determinación del espectro de absorción de la sustancia Rojo Congo y la Mezcla de
Azul de Bromotimol-Rojo Congo pH: 7,5, mediante mediciones de la absorción de luz de cada
analito en un espectrofotómetro digital en el rango del ultravioleta visible (400 – 700) nm; con los
cuales se obtuvo un máximo de absorción para el Rojo Congo a 490 nm a 0,226 U.A. y para la
mezcla de Azul de Bromotimol-Rojo Congo a 460 nm a 1,398 U.A. y 610 nm a 1,302 U.A. .

Luego se obtuvo las lecturas de las absorbancias de 7 soluciones de Rojo Congo preparadas a
diferentes concentraciones a partir de un stock de 100 mg\L, se construyo una curva y se cuantifico
la muestra problema. Se obtuvo la siguiente ecuación de la recta y=0,023x +0,0018 con un
coeficiente de correlación de 0,999 y para la muestra problema una absorbancia de 0,204 U.A., es
decir una concentración de 8,79 mg\L aproximadamente.

PALABRAS CLAVE: Espectro de absorción; Espectrofotómetro; Máximos de Absorción; Ley de

Beer-Lambert.

ABSTRACT:

The determination of the absorption spectra of Congo red substance and the mixture of
bromothymol blue Congo-Red pH was 7.5, by measuring the light absorption of each analyte in a
digital spectrophotometer in the range of visible ultraviolet (400-700) nm; with which an absorption
maximum for Congo red was obtained 0.226 AU at 490 nm and for mixing Bromothymol Blue-Red
Congo at 490 nm to 1,388 U.A. and 610 nm to 1,302 U.A.

Absorbance readings 7 Congo red solutions prepared at various concentrations from a stock of
100 mg\L is then obtained, a curve was constructed and the test sample is quantified. The following
equation of the line is y = 0,023x +0.0018 obtained with a correlation coefficient of 0.999 for the test
sample and an absorbance of 0.204 A.U., a concentration of 8.79 mg\L approximately.

KEYWORDS: Absorption spectrum; Spectrophotometer; Maximum Absorption, Beer- Lambert Law

________________________________________________________________________
INTRODUCCION
La espectrofotometría es el método más
usado en investigaciones bioquímicas y
químicas. Se refiere a los métodos,
cuantitativos, de análisis químico que utilizan
la luz para medir la concentración de las
sustancias químicas. Es una técnica que
permite determinar la concentración de un
compuesto en una solución.
Cada sustancia (liquida) absorbe o trasmite
la luz de forma característica generando una
curva o espectro espacial, que depende de la
diferente intensidad con que absorbe la luz a
diferentes longitudes de onda; esto quiere
decir que cualquier sustancia de un espectro
definido de absorción, puede ser identificada
(serkovic, 2006).
La Ley de Beer afirma que la cantidad de luz
absorbida por un cuerpo depende de la
concentración en la solución.
La ley de Lambert establece que cuando
pasa la luz monocromática (de una sola
longitud de onda) por un medio homogéneo,
la intensidad de la luz transmitida disminuye
exponencialmente al aumentar
aritméticamente el espesor del medio
absorbente.
La Ley Lambert Beer es un medio
matemático de expresar cómo la materia
absorbe la luz. Esta ley afirma que la
cantidad de luz que sale de una muestra es
disminuida por tres fenómenos físicos:
1. La cantidad de material de absorción
en su trayectoria (concentración)
2. La distancia que la luz debe
atravesar a través de la muestra
(distancia de la trayectoria óptica)
3. La probabilidad de que el fotón de
esa amplitud particular de onda sea
absorbido por el material
(absorbencia o coeficiente de
extinción) (optek, 2015)
Esta relación puede ser expresada como:
A = εdc Ecu1
Donde
A = Absorbancia
ε = Coeficiente molar de extinción
d = Distancia en cm
c = Concentración molar
La espectroscopia de absorción es muy útil
para resolver preguntas de diferente índole al
estudiar la estructura y propiedades de
sustancias, su análisis cualitativo y
cuantitativo: determinación de la estructura e
identificación de la sustancia.
En esta práctica se trabajó con dos
soluciones coloreadas como lo son el azul de
bromotimol y el rojo congo, con el fin de
determinar espectros de absorción y
longitudes de onda máxima de absorción, las
cuales son características de cada sustancia.
Además se aplica la ley de Beer-Lambert
determinando la concentración de una
muestra problema.
PARTE EXPERIMENTAL
1.1 Determinación del espectro del Rojo
Congo
Se tomó dos tubos de ensayo: a uno se le
adicionó 1mL de una solución de Rojo Congo
(100 mg/L) y 9mL de agua destilada para
obtener finalmente 10mL de solución patrón,
en el otro tubo se agregó 10mL de agua
destilada (blanco).
Posteriormente se procedió a tomar la Tabla 1. Resultado de la determinación
absorbancia de la muestra patrón a distintas del espectro de absorción del Rojo
longitudes de onda entre un rango de 400 nm Congo
a 700 nm variando la longitud de onda cada
30 nm, para ello se introdujo el blanco y Longitud de onda Absorbancia
luego la muestra para cada lectura. (nm) (U.A)
400 0,116
430 0,139
460 0,182
1.2 Determinación del espectro de Azul de
Bromotimol y Rojo Congo a pH 7.5 490 0,226
520 0,202
Se tomó dos tubos de ensayo: a uno de ellos 550 0,111
se le agregó 1mL de la solución de Azul de 580 0,041
Bromotimol (100 mg/L), 1mL de la solución
610 0,018
amortiguadora de fosfatos pH 7.5, 1mL de la
640 0,014
solución de Rojo Congo (100 mg/L) y 7mL de
agua destilada para tener finalmente 10mL 670 0,012
de esta mezcla, y al otro tubo se le adiciono 700 0,012
10mL de agua destilada (blanco). Se realizó
la medición de absorbancias en el Grafica 1. Espectro de Absorción Rojo
espectrofotómetro de la muestra a distintas Congo
longitudes de onda entre un rango de 400 nm
a 700 nm variando la longitud de onda cada
30 nm, para ello se introdujo el blanco y
luego la muestra para cada lectura.
Absorbancia

1.3 Comprobación de la Ley de Lambert

Beer

Una vez determinada la longitud de máxima

absorbancia del Rojo Congo (490nm), se
procedió a realizar una curva de calibración a
distintas concentraciones conocidas para
Longitud de Onda (nm)
identificar una muestra problema. La curva se
preparó a las concentraciones que se
registran en la tabla 3.

A partir de la máxima longitud de onda, la

DATOS Y RESULTADOS: máxima absorbancia y la concentración del
Rojo Congo, como se muestra en la tabla
anterior, se encuentra su absortividad (a) a
En la tabla 1 se muestran las absorbancias
partir de la siguiente ecuación:
del Rojo Congo con una concentración de
10 mg/L, con un barrido de longitudes de
onda desde 400 nm a 700 nm a través de un
camino óptico de 1 cm.
 Gráfica 2. Espectro de absorción Mezcla
Azul de Bromotimol y Rojo Congo pH: 7,5

Ecu 2

Donde:
a=absortividad en L mg-1 cm-1
b=camino óptico en cm
C= concentración en mg/L

Absorbancia
Por lo tanto:

0.226
𝑎= = 22.6 x 10-03 L mg-1 cm-1
1 𝑐𝑚∗10 𝑚𝑔∗𝐿

En la tabla 2 se muestran el espectro de la

mezcla de 10 mg/L de Rojo Congo y 10
mg/L de Azul de Bromotimol con un barrido
de longitudes de onda desde 400 nm a 700
nm. El pico de absorción a 610 nm
corresponde al Azul de Bromotimol.
Tabla 2. Resultado de la determinación del
Espectro de absorción del Azul de
Bromotimol + Rojo Congo a pH 7.5
Longitud de onda (nm)
A partir de la tabla 2 y con la ayuda de la
ecuación 2 se encuentra la absortividad del
Rojo Congo y del Azul de Bromotimol en un
pH de 7.5.
α=139.8 x 10-03 L mg-1 cm-1 absortividad del
Rojo Congo a pH: 7,5

Longitud de onda Absorbancia α=130.2 x10-03 L mg-1 cm-1 absortividad del

(nm) (U.A) Azul de Bromotimol pH: 7,5
400 1,327
En la tabla 3 se muestran los datos de la
430 1,359
curva de calibración del Rojo Congo con un
460 1,398 rango de concentración de 2.5 ppm a 40 ppm
490 1,388
520 1,174 Tabla 3. Resultado de la comprobación de
550 1,043 la ley de Beer-Lambert y determinación de
la concentración de una solución
580 1,073
problema.
610 1,302
Concentración (mg/L) Absorbancia
640 0,931
0,0 0,000
670 0,251
2,5 0,065
700 0,055
5,0 0,111
10,0 0,228
15,0 0,341
20,0 0,470
30,0 0,701
40,0 0,911
Muestra Problema 0,204
Gráfica 3. Relación entre la absorbancia ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE
del Rojo Congo a diferentes RESULTADOS:
concentraciones a un ‫= גּ‬490 nm
La espectrofotometría es una técnica de gran
uso debido a las ventajas que esta brinda
Relación entre la absorbancia del Rojo para la determinación cualitativa y
Congo a diferentes concentraciones a cuantitativa de diferentes compuestos
un ɻ=490 nm químicos que absorben dentro de un rango
de longitud determinado.
El espectrofotómetro UV/BIS permite
comparar la radiación absorbida o transmitida
Absorbancia

y = 0,023x + 0,0018 por una solución que contiene una cantidad

R² = 0,9995 desconocida de soluto de una de
concentración conocida, a través de un foco
de radiación visible o UV que emite una
radiación que atraviesa un selector, esta
radiación incide sobre la muestra contenida
en una cubeta transparente, en donde una
Concentración (mg/L)
parte de la radiación es absorbida y otra es
transmitida, lo cual se lee a través de un
detector. Esta longitud de onda es
Ecuación de la recta: y=0,023x +0,0018
característica para cada molécula en función
de su configuración electrónica.
- Concentración de la muestra
Problema:
Durante la práctica se determinó los
espectros de absorción de una solución de
𝒎𝒈 0,204 − 0,0018
⁄𝑳 = = 8,79 𝑚𝑔/𝐿 Rojo Congo y una mezcla de Azul de
0,023
Bromotimol y Rojo Congo a pH: 7.50; se
midió la absorbancia de cada solución en un
Tabla 4. Resumen resultados
rango de longitud de onda UV-VIS de 400-
experimentales en el análisis
700 nm cada 30 nm de variación.
espectrofotométrico

El Rojo Congo es un colorante azoico que

Azul presenta una coloración roja a un pH básico
parametros Rojo Congo
bromotimol lo que indica que la sustancia absorbe verde-
Maxima longitud de onda azul, dentro de un rango de 470-500 nm
490 -
de absorcion (tabla 5); al compararlo con los datos
Maxima longitud de onda obtenidos de la tabla 1 y la gráfica 1 se
460 610
de absorcion a pH 7,5 observó un máximo de absorción a 490 nm
22,6E-03 Lmg-
Absortividad - con una absorbancia de 0,226 de esta
1 cm-1
139,8E-03 Lmg- 130,2E-03 Lmg- manera se confirmó la presencia del rojo
Absortividad a pH 7,5 gongo en la solución.
1 cm-1 1 cm-1
curva de calibracion
y=0,023x
Ecuación de la recta:
+0,0018
Concentracion muestra
8,79 mg/l
problema
 Tabla 5. Relación de longitud de onda
entre color absorbido y color
complementario (Harris)
Despues de haber calculado el máximo de
absorbancia se procedió ha comprobar la
Ley de Beer-Lambert en la que se establece
que la absorbancia de una solución es
directamente proporcional a su
concentración, es decir a mayor número de
moléculas, mayor será la interacción de la luz
entre ella (Martín, 2010), para ello, se
prepararon ocho soluciones de diferentes
concentraciones como muestra la imagen 1
y se obtuvieron las absorbancias de cada
una en la longitud de máxima absorbancia
ver (tabla 3)
Imagen 1. Curva de calibración
De esta manera se obtuvo una relación
lineal, entre las concentraciones conocidas
de las soluciones y la absorbancia
determinada en cada una de ellas (ver
gráfico 3). Se obtuvo un coeficiente de
correlación de 0.999, y permitiendo encontrar
la ecuación de la recta y=0,023x +0,0018,
esta ecuación permite fácilmente relacionar
la variable dependiente “Y” que representa
en este caso la medida de absorbancia, con
la variable independiente “X” que sería la
concentración en ppm, de una manera
confiable y efectiva.
La medición de absorbancia de la muestra
problema de Rojo Congo correspondió a
0.204 y con la regresión lineal hallada en la
curva de calibración se determinó que la
concentración de la muestra era de 8.79 mg/l
Al comparar la absortividad del Rojo Congo
en la solución de pH 7.5 y la solución
preparada a un pH no defino (tabla 4) se
observa que hay una relación 0.1616 veces,
a pesar de ser muy baja esto nos indica que
su coeficiente de extinción se ve afectado
con la variación de hidrógenos en la solución.
(Hopp, 1994)
En la segunda parte de la práctica se
determinó el espectro de una mezcla de azul
de bromotimol con rojo Congo.
Al igual que el rojo Congo el azul de
bromotimol también es un indicador que varía
su color de acuerdo al pH de la solución
(Hopp, 1994).
Tabla 6. Relacion de indicadores con
respeto al pH (Hopp, 1994)
En el espectro de la mezcla de Azul de
Bromotimol y Rojo Congo (grafica 2), se pudo
observar que cada sustancia posee moléculas absorben un fotón de una
características espectrales diferentes, por lo radiación tal que:
cual cada especie absorbente se ve presente
en el espectro sin llevar a cabo previas
separaciones de los analitos. Esto se debe a
que cada molécula presenta una longitud
característica, debido a su configuración
electrónica. Lo anterior se confirma en los
picos a 460 nm y 610 nm, en donde están
representadas las absorbancias
características para el Rojo Congo y Azul de
Bromotimol respectivamente, que presentan
un color absorbido de azul-verde y naranja
respectivamente, observándose que los de
menor longitud de onda presentan una mayor
Estos tránsitos energéticos son los que dan
energía; pero sin embargo se debe de tener
origen a los espectros. Debido a la existencia
en cuenta que para estas mezclas la
de diferentes tipos de energía: de los
absorbancia total medida a una longitud de
electrones en si, de los movimientos
onda, es igual a la suma de las absorbancias
vibracionales de las moléculas, de la rotación
de los componentes individuales y, que el
de las mismas .etc., las moléculas pueden
aporte de cada componente a la absorbancia
interaccionar con radiaciones
total es función del valor del coeficiente de
electromagnéticas de un rango muy amplio
absortividad molar de cada especie
de longitudes de onda, dando lugar a
absorbente y su concentración para una
distintos tipos de espectroscopias según las
longitud de onda dada; es decir, en un
diferentes regiones. (Carmen). Un esquema
sistema con varias especies absorbentes de
podría ser el siguiente:
la misma concentración si se mide la
absorbancia a una longitud de onda
determinada ,especie que presentara una
mayor contribución a la absorbancia total
será la que presente mayor valor del
coeficiente de absortividad molar.

PREGUNTAS: Imagen 2. Esquema del rango de radiaciones

electromagnéticas. (Carmen)
1. ¿Cuáles son los fundamentos en los
que se basan las técnicas
espectrofotométricas? 2. ¿Qué relación existe entre los
espectros de absorción de las
Las técnicas espectroscópicas se basan en sustancias y el color que poseen?
la interacción de la radiación
electromagnética con la materia. A través de La relación que existe entre los espectros de
esta interacción las moléculas pueden pasar absorción y el color que poseen ciertas
de un estado energético, m, a otro estado sustancias se debe a que en la región visible
energético distinto, l, absorbiendo una apreciamos el color visible de una solución,
cantidad de energía radiante igual a la el cual corresponde a las longitudes de onda
diferencia energética existente entre los dos de luz que transmite, no que absorbe. Por
niveles: El - Em. Para conseguir esto, las tanto el color que absorbe es el
complementario del color que transmite.
 Entonces, para realizar mediciones de - Complemento y apoyo de diversas
absorción es necesario utilizar la longitud de técnicas instrumentales y analíticas
onda en la que absorbe luz la solución para la determinación de estructuras
coloreada. La fuente de radiación visible moleculares.
suele ser una lámpara de tungsteno y no
proporciona suficiente energía por debajo de
320 nm. (Nieves Abril Díaz) 4. ¿Qué factores pueden producir
desviaciones al aplicar la Ley de Beer
Lambert?
Algunos de los factores que pueden causar
desviaciones en la Ley de Beer Lambert son:

- Si las moléculas de las especies

absorbentes son demasiado grande y
estereoquímicamente complejas y se
encuentran muy cercanas entre sí, se
originaran atracciones y repulsiones
moleculares que causan distorsiones en la
Imagen 3. Espectro Electromagnetico. (Nieves
forma de absorción de la radiación. (Skoog &
Abril Díaz)
J.J., 1994)

- Si la matriz en donde se encuentra el

3. ¿Qué aplicaciones tienen las técnicas
analito tiene un alto contenido de sales
espectrofotométricas?
disueltas como agua de mar, salmueras,
fluidos biológicos entre otras se pueden
- Análisis de elementos-traza por
presentar interacciones intermoleculares que
espectrofotometría de absorción
absorban en el rango del analito de estudio
molecular UV-Visible
ocasionando lecturas erróneas. (Skoog &
J.J., 1994)
- Medida del color en sólidos o líquidos
por reflexión, reduciendo el tiempo de
- La absorción ocurre en un volumen de
preparación de la muestra y obteniendo
sección transversal uniforme por eso en
una medida representativa del conjunto.
celdas con deformaciones en las paredes,
distorsiones o fisuras distorsionan la calidad
- Medida en puntos lejanos o poco
óptica por los que las lecturas serán de baja
accesibles mediante fibra óptica.
calidad. (Skoog & J.J., 1994)
- Sistemas para la determinación en
- Dentro de las limitaciones instrumentales se
continuo de parámetros de calidad en
encuentran:
matrices alimentarias líquidas o sólidas,
 La radiación extraña que alcanza al
de forma rápida y no invasiva (proteína,
detector.
humedad, grasa, etc.).
 Los cambios en la sensibilidad del
detector.
- Sistemas para la discriminación en lotes
 Las ffluctuaciones en el poder de la
de distinta calidad en continuo de forma
fuente de radiación y en el sistema de
rápida y no invasiva.
amplificación del detector
- Determinación del correcto nivel de
- Los bajos y altos valores de absorbancias o
llenado en envases opacos. (ainia )
transmitancias ocasionan un grado de
incertidumbre grande el cual es
considerando que a bajas absorbancias la
intensidad del haz incidente y transmitido es
prácticamente igual y el detector incurre en
un error grande al percibir la intensidad de
dos haces muy semejantes. Mientras que a
altos valores de absorbancias, la energía
transmitida es tan pequeña que no es posible
medirla con precisión. (Baeza, 2006)
- Debido a las interacciones soluto–
disolvente se originan con frecuencia
desplazamientos espectrales,
ensanchamientos de bandas y otros
fenómenos, lo que es conocido como errores
por influencia del disolvente. (Baeza, 2006)
- Cuando la sustancia problema interviene o
forma parte de un sistema en equilibrio con
otras especies, el desplazamiento del
equilibrio implica una modificación en la
concentración, y, en consecuencia, en la
absorbancia, pudiendo originar reacciones de
Dimerización, Acido–base, Formación de
Complejos, Redox, entre otras. (Baeza,
2006)
- El haz de radiación incidente suele estar
contaminado con pequeñas cantidades de
radiación parásita o dispersada originada por
reflexión de los distintos componentes
ópticos, tiene una λ diferente de la radiación
principal. (Baeza, 2006)
CONCLUSIONES:
- Se comprobó el funcionamiento del
espectrofotómetro digital tras leer unas
soluciones del Indicador Rojo Congo y la
Mezcla Azul de Bromotimol-Rojo Congo
pH: 7,5 y una muestra desconocida.
- Se escogió una longitud de onda de
trabajo para la solución Rojo Congo con
la cual se realizo una curva de
calibración.
- A partir de la regresión lineal hallada en
la curva de calibración realizada de Rojo
de Congo se determinó la concentración
de la muestra problema, obteniéndose
una concentración de 8.79 ppm
- Se comprobó el cumplimiento de la Ley
de Beer paras las soluciones de Rojo
Congo, la Mezcla Azul de Bromotimol y
una muestra desconocida al encontrar
una relación directamente proporcional
entre la concentración y la absorbancia.
- Aunque no se uso se observo las
diferencias físicas entre un
espectrofotómetro análogo y un
espectrofotómetro digital.
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Skoog, D., & J.J., L. (1994). ANÁLISIS
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TICA. En D. Skoog, & L. J.J.,
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