Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
EXPERIMENTALA, FUNCTIONALA SI
CLINICA
1
STRUCTURA CURSULUI DE PROTEOMICA FUNCTIONALA SI CLINICA
2
INTRODUCERE LA CURSUL DE PROTEOMICĂ
FUNCŢIONALA ŞI CLINICĂ (2016)
3
proteomică,această problemă este rezolvată din punct de vedere a morfologiei
proteinei la nivel de 2014.
.
4
identificarea caracteristicilor calitative şi cantitative la un anumit pacient, prin
metodele proteomicii, în principal MS = spectrometria de masa.
Tehnicile de identificare imunologice derivate din Wester Blotting sunt în
dezvoltare. Cîştigul uriaş va fi posibilitatea utilizării moleculei proteice separate şi
identificate în experimente in vitro sau in vivo ulterioare, ea nefiind distrusă in urma
trecerii prin aparat (cum se intimplă la spectrometria de masă).
Proteomica este studiul tuturor proteinelor celulare sau extracelulare, asamblate în
căi de transmitere a informaţiei, sau de producere a energiei, în organismul sănătos
sau bolnav.
Proteinele şi peptidele pot fi analizate şi sintetizate: structura lor poate fi
aproximată prin cristalografie şi difractie, modelarea prin soft iar legătura cu chimia
suparamoleculara, duce la structuri biologice intracelulare.
5
Se ajunge la fiziologie abia acum, în sensul că proteina a fost purificată din
rinichi şi administrată experimental in vivo. Efectul de scădere a presiunii , plus alte
studii enzimatice in vitro, au susţinut activitatea proteinei, de degradare a
catecolaminelor. S-a studiat prin spectroscopie de masă, structura acesteia şi s-a
modelat molecula. După detaliile calitative şi cantitative, comune cu cele clasice ale
MAO (monomamin oxidaza) şi COMT (catecol ortometil transferaza), i s-a dat în
final şi denumirea: Renalase.
Aplicaţii clinice: s-au gindit să fie investite 5 miliarde de dolari pentru realizarea
unui agent terapeutic pentru hipertensiunea arterială esenţială bazat pe această
proteină (2005).
Bibliografie
6
7
TEME CURS PROTEOMICA EXPERIMENTALA, FUNCTIONALA
SICLINICA
8
15) Bazele de date de proteomica
9
33) Multiple proteine tinta si multiple regiuni moleculare proteice ca ţintă pentru
moleculele mici. Actiunea reglatorie a moleculelor mici se realizeaza prin
activarea moleculelor mari proteice (ex integrinalfa vb3 contine un situs
receptor pentru resveratrol.
41) Critica separarii fenomenu;ui biologic intre mediul intra si cel extracelular
(organisme pluricelulare): cellular likeage, secretory granules, apoptotic bodyes
si exosomi; integrarea viziunii conceptului de mediu intern in proteomica
functionala si clinica.
10
45) Biomarkerii moleculari proteici in cancer; dezvoltari smple si
surprinzatoare.
60) Un nou tip de prezentare a functiei de tip grafic (fiziologia de inalta definitie)
necesita noi concepte integrative. E suficient termenul de BIOLOGIE
SISTEMICA ?
11
62) Putem sa ne gindim la relatiile temporospatiale (la scara molecular proteice
cuantica) de modificare posttranslationala normala sau patologica ?
Plecind de la concurenta fosforilare/nitrare.
12
Caracteristica la nivel celular ne-o dau tehnicile de marcare
celulara(ex:imunofluorescenta;flow-citometrie).
13
Proteomica este studiul tuturor proteinelor celulare sau extracelulare,
asamblate in cai de transmitere a informatiei, sau de producere a energiei, in
organismul sanatos sau bolnav.
14
3) Proteomica experimentala, functionala si clinica 2017 (argumente pentru
selectarea acestor parti de proteomica si pledoarie pentru asamblarea lor sub
titlul de mai sus)
15
Vom descrie aici descoperirea renalazei .Enzima de tip degradativ al
catecolaminelor(asemanatoare cu MAO si COMT,dar circulanta) a fost gandita
initial prin analiza genelor cu expresie necunoscuta.
Cercetatorii au studiat timp de sase luni aceste gene in silico, dupa care au
observat o proteina, ce parea sa aiba semnificatie functional mare.Au obtinut
anticorpi monoclonali anti aceasta proteina.Prin imunofluorescenata au
descoperit- o in rinichi( membrane glomerulara), si ulterior in sange.
5). Proteomica functionala este mai mult decit biologia celulara si moleculara.
16
EXTRAORDINARA REEVALUARE TEMPORALĂ A UNUI
BIOMARKER DE IMPACT MAXIM PENTRU ONCOLOGIE
17
RBMF nr.1/2016
Bibliografie
10
11
12
13
14
GENOMICA / PROTEOMICA
Factori mediu intern (ex glicemia)
V V
Transcriptomica Factor mediu extern (ex toxine
bacterii, radiatii)
V V
Proteina Proteina modificata
posttranslational
NATIVA
EPIGENETICA
Adică numai atunci când este necesară sinteza proteinelor respective. Iar
factorii de mediu acţionează asupra genomului, prin intermediul epigenomului.
Epigenomul reprezintă un fel de interfaţă dintre mediu şi genom (Leberder,
2001, Bell şi Beck, 2010).
15
16
17
18
Tot mai recunoscut devine faptul că tulburările din spectrul autist (TSA)
reprezintă afecţiuni condiţionate prin mecanisme de reglare epigenetică. Mutaţii
epigenetice (sindromul X fragil) şi mutaţii ale factorului seminal de reglare
(sindromul Rett, MeCP2) conduc la apariţia trăsăturilor autiste. Unele
mecanisme epigenetice-cheie asociate cu apariţia tulburărilor din spectrul autist
includ efecte de origine parentală şi afectări citogenetice de imprinting, cum ar fi
cele de pe cromozomul 15q11-13, locus-ul de deleţie în sindromul Prader-Willi şi
sindromul Angelman. Testele moleculare la pacienţii cu TSA, sindroamele
Angelman şi Rett, au confirmat prezenţa anormalităţilor epigenetice, inclusiv
metilarea aberantă a ADN-ului în locusurile genice candidate. Acestea din urmă,
dar şi alte locusuri de imprinting observate în TSA, înglobează regiuni genomice
regulatorii complexe care conţin un amalgam complicat de gene supuse
imprintingului şi gene nesupuse imprintingului implicate în dezvoltarea neurală,
excitabilitatea şi transmisia neuronală, plasticitatea sinaptică, reţeaua de
conexiune neuronală, homeostaza creierului, reacţiile la mediu şi alte procese ale
sistemului nervos central.
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
ONOOH = OH + NO2.
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
Bibliografie
50
51
52
53
54
Introducere
Rezultate
Pacienţii diabetici tratati la Centrul Antidiabetic Iaşi cu valori mari ale
glicemiei s-au constatat valori mari ale hemoglobinei glicozilate.
La bolnavii cu valori apropiate de normal ale glicemiei s-au găsit valori
scăzute ale hemoglobinei glicozilate.
În cazurile nou descoperite, bolnavi cu diabet insulinodependent controlaţi
prin dietă şi insulină, determinarea hemoglobinei glicozilate este de un real folos.
Valorile iniţiale, în medie de 350 mg glucoză/100 ml sânge, ce denotă un slab
control metabolic, au coborît la valori medii de 125 mg/100 ml sânge, iar ale Hb A1c,
într-o perioadă de 4 luni la valori de 7%. Aceasta s-a realizat prin administrarea
corectă a insulinei şi instituirea unui program de instruire a bolnavilor denumit home
self monitoringul.
La un bolnav cu valori mari ale glicemiei şi ale hemoglobinei glicozilate
(13,5%) echilibrarea metabolică nu s-a reuşit dupa 4 luni de tratament, schema de
insulină fiind incorect administrată.
Valoarea hemoglobinei glicozilate la diabeticii insulino-dependenţi urmăriţi
prezintă valori ridicate (pe intervalul 7% - 20%) în funcţie de gradul de decompensare
al fiecărui diabetic.
Doar 31% din diabeticii evaluaţi prezintă un control metabolic bun, restul
avînd valori mari ale HbA1c, ceea ce arată că în săptămînile precedente evaluării
diabetul zaharat nu a fost echilibrat.
În diabetul zaharat decompensat HbA1c are valori între 12 şi 20% (50% din
subiecţii studiaţi de noi au avut dozarea pe acest interval). Valorile de pînă la 9% arata
un dezechilibru metabolic uşor controlabil, între 11 şi 14% un dezechilibru pronunţat,
iar de la 14% şi peste această valoare o stare de dezechilibru grav.
Concluzii
Pacienţii cu valori mari ale glicemiei au prezentat şi valori mari ale HbA1c.
Creşterea hemoglobinei glicozilate determină modificarea posibilităţii d etransport de
oxigen la ţesuturi şi apariţia strailor de hipoxie. Acestă anomalie apare şi în ţesuturile
independente de insulină şi duce la apariţia retinopatiei, nefropatiei iar la nivelor
nervilor periferici scădrea vitezei de conducere nervoasă iar în cristalin la cataractă.
Valori crescute ale LDL colesterolului au fost gasite la 36% din pacienţii studiaţi iar
HDL colesterolul a fost evaluat la sub 35 mg/100 ml singe la 30% din bolnavi. Acesti
bolnavi prezentau valori ale trigliceridelor mai mari de 150 mg/100 ml sînge ajungînd
pînă la 240mg/100 ml singe.
Bibliografie
2. Lee PD, Sherman LD, O’Day MR, Rognerud CL, Ou CN. Comparisons of home
blood glucose testing and glycated protein measurements. Diabetes Res Clin Pract
1992 Apr;16(1):53-62.
4. Wolff SP, Jiang ZY, Hunt JV. Protein glycation and oxidative stress in diabetes
mellitus and ageing. Free Radic Biol Med 1991;10(5):339-52.
5. Morrison AD, Clements RS, Travis SB. Glucose utilization by the polyol pathway
in human erythrocytes. Biochem Biophys Res Commun 1970;40:199-205.
59
15. Kelly FJ. Use of antioxidants in the prevention and treatment of disease. J Int Fed
Clin Chem 1998 Mar;10(1):21-3.
MIHAI BOTEZ1,
1
UMF ,,Gr. T. Popa”- Iaşi, România (UE)
60
10. Tokizane, T., Shiina, H., Igawa, M., et al., Cytochrome P450 1B1 is
overexpressed and regulated by hypomethylation in prostate cancer. Clin
Cancer Res, (2005) 11: 5793-5801.
11. Barnett, J., Urbauer, D., Murray, G., et al., Cytochrome P450 1B1
expression in glial cell tumours: an immunotherapeutic target. Clin Cancer
Res, (2007) 13: 3559-3567.
12. McFadyen, M., Murray, G., and Melvin, W., Cytochrome P450 CYP1B1
mRNA in normal human brain.
propus.
18). Viata moleculelor proteice: viata la nivel de populatie, individ, rasa, organ,
celule si molecula.
Spre deosebire de organelle vizualizate prin chirurgie si de celulele
studiate cu microscopul in culture celulare, studiul moleculelor proteice nu
depinde de prepararea anatomica sau de colorarea celulara. Moleculele nu se pot
vedea in dinamica lor fizicochimica si noi avem astazi solutia modelarii si
posibilitatea de a ne apropia de realitatea lor intrabiostructurala. Relatiile
functionale se numesc in biologie sistemica retea de interactiuni functionale).
Toate elementele vii sunt supuse radiatiei si vibratiei. De asemenea ele au radiatie si vibratie
(cosminc minde = astrologie stiintifica).
6
Odată instruiţi, aceştia vor trebui să aibă acces la facilităţile de diagnostic şi tratament pentru
a asigura asistenţa medicală în conformitate cu principiul Uniunii Europene al egalităţii accesului la
sistemele de sănătate şi cu cel al accesului universal la medicamente.
Rolul pacienţilor în medicina personalizată este complex.
Datele relevante pentru medicina personalizată nu sunt generate numai în clinici şi
laboratoare. Cetăţenii şi pacienţii profită tot mai mult de mediile sociale şi de noile tehnologii pentru a
împărtăşii informaţii despre starea lor de sănătate şi stilul de viaţă.
Capacitatea de a reacţiona la o problemă de sănătate reală sau anticipată depinde de nivelul de
educaţie medicală şi de alţi factori. De aceea succesul asistenţei medicale personalizate va depinde de
capacitatea ei de adaptare la nevoile diverşilor indivizi, din care doar o parte se va putea implica
proactiv în menţinerea propriului nivel de bunăstare şi de sănătate.
Demografia joacă de asemenea un rol din ce în ce mai important în contextul social actual şi în
viitorul apropiat. Persoanele vârstnice sunt tot mai numeroase, iar costul asistenţei medicale este în
creştere, ceea ce pune sub semnul întrebării sustenabilitatea pe termen lung a sistemului de asigurări
de sănătate.
Cheltuielile în sistemele de sănătate sunt în creştere. În prezent pacienţii de pe tot globul au la
dispoziţie 7500 medicamente şi acest succes constituie un obstacol în calea progresului.
7
20). Corelatii structura functie; geometria sacra a proteinelor
In biologie si medicina, forma si structura este conditionata de functie; forma (shape)
proteinelor este conditionata de energie. Energia este concentrate si permite receptarea informatiei ce
consta in forma geometrica.
Prof Dr C Cocea, Prof Dr F G Frunză, Conf Dr Alina Petre-Balan, Prof M Botez şi Prof Dr Cristina
Luca- USA
VDAC este o porină din membrana mitocondriala cu rol in apoptoză. In plus fata de
permeabilitatea voltaj dependenta fata de anioni se pare ca in anumite situatii se produce o crestere
majora a permeabilitatii sale cu trecerea unor peptiode cu importanta functionala din mitocondrie in
citosol.
Exista ipoteza ca diversi factori modulatori cum sunt cei oxidativi pot declansa apoptoză si cu
participarea porinei VDAC.
Noi dorim sa evaluam asemenea modificari cu importanta functionala ce se produc dupa
atacul oxidativ asupra anumitor radicali tirozinice din structura moleculei.
Din experimente in vitro şi in vivo, modificarea se produce prin nitrare sau agregare sub
acţiunea anionului peroxinitrit. Acesta este produs din oxid nitric si anionul superoxid generate in
exces in conditiile expunerii la microrganisme, substante chimice, radiatii electromagnetice ionizante
si stress psihic.
Fenomenul de generare la nivele inalte de peroxinitrit si acţiunea acestuia asupra moleculelor
proteice şi lipidice se numeste stress nitrooxidativ.
Nitrarea VDAC este un eveniment cu consecinţe funcţionale majore atât prin fenomenul de
oligomerizare cât şi prin posibilele punţi ditirozinice formate sub acţiunea peroxynitritului.
Structurile supramoleculare rezultate modifică major structura membranară şi asta în condiţiile
stressului nitrooxidativ.
Porina VDAC este implicata in multiple patologii ce contin o amplificare a apoptozei
mitocondrial induse.
Pentru a modela si a prezice prin experimente in silico efectul peroxinitritului asupra porinei
VDAC trebuie mai intai sa construim structura tritimensionala a canalului.
Studiul nostru porneste de la obtinerea datelor din bazele date NCBI, SCOPUS, ATHEN
privitoare la descoperirea si rolul acestei molecule canal.
In site ul de proteomica www.ExPASy.org am cautat molecula dupa deniumire si am gasit 3
isoforme.
Pentru inceput trebuie sa obtinem structura primara si sa facem evaluari privind radicalii
tirozinici din molecula.
Proteina este alcătuită din 230 aminoiacizi si ea există la om în 3 izoforme VDAC 1, VDAC 2 şi
VDAC 3.
10 20 30 40 50 60
MAVPPTYADL GKSARDVFTK GYGFGLIKLD LKTKSENGLE FTSSGSANTE TTKVTGSLET
9
10 20 30 40 50 60
MATHGQTCAR PMCIPPSYAD LGKAARDIFN KGFGFGLVKL DVKTKSCSGV EFSTSGSSNT
10 20 30 40 50 60
MCNTPTYCDL GKAAKDVFNK GYGFGMVKID LKTKSCSGVE FSTSGHAYTD
TGKASGNLET
10
Prin converitirea structurii tridimensionale la planul absolut al moleculei obţinem informaţii
preliminare legate de ordonarea aminoacizilor în lanţuri şi bucle.
Pentru a prezice nitrarea si/sau agregarea sub actiunea peroxinitritului am obținut din SWISS
MODEL structura tridimensionala a porinei VDAC si incepem sa ne gandim la posibilitatea
modificarii functionale a unor anumite reziduuri tirozinice (situs de nitrare sau de formare a puntilor
ditirozinice) si daca printr o anumita pozitionare a tirozinelor in structura canalului modificarea
acestora ar putea avea rol functional.
Ne folosim si de ribbonul PDB de reconstrucţie tridimensional pentru a explica modalitatea si
funcţionarea canalului. Pornim pe acest drum datorită faptului că argumentarea unui anumit tip de
structura geometrică tridimensională însemana şi un anumit comportament fizico-chimic
condiţionînd în acest fel funcţia porinei.
Prezentam cateva modelari de tip ribbon pentru porina VDAC realizate in ultimii ani. Aici s-a
folsit programul de ORIGAMI FOLDING of protein pentru a descrie acest canal.
11
Experimentul se poate face in vitro sau in vivo pentru a face nitrarea a urmari ce modificări
există prin spectrometrie de masă si ulterior ce modificari functionale pot apare..
Efectele functionale şi a importanţa canalului porină VDAC este că prin el nu trec doar ioni ci
şi proteine respectiv din mitocondrie in citosol.
Elemente ce pledeaza pentru forma de tip hiperboloid a canalului porina VDAC au fost
obtinute prin geometrie diferentiala in spatiu.
12
Studiind geometria canalelor ionice, efectul acesteia asupra functiei in special păermeabilitate
a condus la forma cilindrica si de catena toridala ( vezi canalul pentru receptorul colinergic). Acestea
pot fi construite utilizand ecuatia Poiosson.
13
Comparatia intre ecuatia hiperboloidului si a toroiidului (ecuatia Poisson) releva utilitatea
matematicii (geometrie diferentuiala) in modelarea moleculelor proteice tip canal.
Nitrarea VDAC este un eveniment cu consecinţe funcţionale majore atât prin fenomenul de
oligomerizare cât şi prin posibilele punţi ditirozinice formate sub acţiunea peroxynitritului.
Structurile supramoleculare rezultate modifică major structura membranară şi asta în condiţiile
stressului nitrooxidativ.
14
Porina VDAC este implicata in multiple patologii ce contin o amplificare a apoptozei
mitocondrial induse.
VDAC este studiata in cadrul interactosomului mitocondrial cardiac si muscular impreuna cu
cel oxidativ musculo-scheletal in care porina este legata de ANC= trnasprtorul adenin nucleotidic si
PIC= transportorul fosfat anorganic. Ea este cuplata cu creatin kinasa mitocondriala MtCK si este
reglata de tubulina si proteina linker LP.
Permeabilitatea VDAC este reglata de catre tubulina heterodimerica si cateva proteine linker. Mici
cantitati cu valoare de semnal ale ADP citosolic patrund intre cele doua membrane mitocondriale si
cresc productia fosfocreatinei in interiorul mitocondriei datorita cuplarii functionale a sinthasomului
ATP cu Creatin Kinasa mitocondriala care amplifica semnalul ADP citosolic.
Structura porinei este alcatuita din 19 alfahelixuri si bucle corespunzatoare. Transpunînd în
plan adica gepmetrice in 2 dimensiuni rezulta structura următoare. Ea conţine atât buclele cat şi alfa
helixurile din structura liniara a moleculei sintetizate reibozomial adică structura primară.
Se pot produce modificari intrinseci sau oligo sau polimerizari ace porinei VDAC cu
semnificatie functionala.
Datorita pozitionarii tirozinei ce poate fi nitrata in zona mijlocie, ingustata a canalului pot
apare modificari de permeabilitate.
Exista doua categrrii de lanţuri aminoacidice pus e cap la cap şi anume 1 lanţuri aproape
liniare dar în helix şi 2 bucle de aspect complex ce se interpun între primele.
Relata dintre porina VDAC si beta amiloid si proteina tau fosforilata a fost studiata in boala
Alzheimer. S au folosit specimene de creer de la bolnavi, subiecti de control sin soarecele transgenic
purtator al proteinei precursoare a amiloidului beta; la acestea s a masurat nivelul proteinei VDAC.
S a gasit nivele crescute progresiv ale VDAC 1 in tesutul cortical de la paciemnti cu boala
Alzheimer comp[arativ cu subiectii de control, normali si de asemenea cresteri la soarecele transgenic
purtator al precursorului amiloidic beta.
VDAC 1 a fost gasit interactionind cu amiloidul beta si proteina fosorilata tau in creerul
bolnavilor cu Alzheimer si la soarecele transgenic. S-a gasit o crestere progresiva a disfunctiei
mitocondriale in soarecele transgenic fata de varianta wild. Aceste observatii determina concluzia ca
VDAC interactioneaza cu amiloidul beta si proteina tau fosforilata blocind porii mitocondriali ceea ce
va determina disfunxctie mitoondriala in patiogenia bolii Alzheimer.
Concluzii
Pe baza studierii din prisma matematica a relatiei structura functie a porinei VDAC am gasit
forma hiperbolidala cu prezenta unui reziduu tirozinic (36) in zona ingusta de flexiune-rotatie
descrisa matematic de ecuatia x2/a2 ± y2/b2 − z2/c2 = 1.
Molecula proteica a fost expusa peroxinitritului in experiment virtual asemanator din punct de
vedere stiintific cu situatia in silico. Probabilitatea cea mai mare de nitrare (situs de nitrare)
identificat cu softul GPS NO este la tirozina 236 situata in zona inustata a canalului.
Tinind seama de forma de hiperboloid nitrarea apoate modifica permeabilitatea ionica si la
peptide a porinei VDAC. In acelasi timp datorita structurii sale expunerea la peroxinitrit poate duce
la punti ditirozinice ceea ce determina oligomerizarea (agregarea porinei).
Ambele fenomene au rol in perturbarea permeabilitatii mitocondriale sub stress nitrooxidativ
si apoptoza.
Bibliografie
1. Origami in outer membrane mimetics: correlating the first detailed images of refolded VDAC
with over 20 years of biochemical data.Summers WA1, Court DA. Biochem Cell Biol. 2010
Jun;88(3):425-38. doi: 10.1139/o09-115.
2. Lateral Pressure Profile, Spontaneous Curvature Frustration, and the Incorporation and
Conformation of Proteins in Membranes Derek Marsh ,
3. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and
Dynamical Structure Thomas Huber*, , Ana V. Botelho , Klaus Beyer and Michael F.
Brown Laboratory of Molecular Biology and Biochemistry, Howard Hughes Medical Institute
16
and Rockefeller University, New York, New York 10021 USA University of Arizona, Tucson,
Lehrstuhl für Stoffwechselbiochemie der Universität München, D-80336 Munich, German
b. Identification of nitrated proteins in Alzheimer's disease brain using a redox proteomics approach
Rukhsana SultanaaH. Fai Poona Jian Caid, William M. Pierced,
c. Michael Merchante, Jon B. Kleine, William R. Markesberyb, f, D. Allan Butterfielda, b, c, ,
Department of Chemistry, University of Kentucky, Lexington, KY 40506, USA
d. Sanders-Brown Center on Aging, University of Kentucky, Lexington, KY 40506, USA
e. Center of Membrane Sciences, University of Kentucky, Lexington, KY 40506, USA
f. Department of Pharmacology, University of Louisville, School of Medicine and VAMC, Louisville,
KY 40202, USA Core Proteomics Laboratory, University of Louisville, Louisville, KY 40208, USA
Department of Neurology and Pathology, University of Kentucky, Lexington, KY 40536, USA
9. Abnormal interaction of VDAC1 with amyloid beta and phosphorylated tau causes
mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease.
a. Manczak M, Reddy PH. Neurogenetics Laboratory, Division of Neuroscience, Oregon National
Primate Research Center, Oregon Health and Science University, 505 NW 185th Avenue,
Beaverton, OR 97006, USA.
13. Supramolecular assembly of VDAC in native mitochondrial outer membranes. Gonçalves RP,
Buzhynskyy N, Prima V, Sturgis JN, Scheuring S.
a. Institut Curie, UMR168-CNRS, 26 Rue d'Ulm, 75248 Paris Cedex 5, France
marimilor ɸ (), = (x1, …, xi) se poate calcula probabilitatea de a intalni sistemul intr-o configuratie
descrisa de valori xi, cuprinse intre xi0 si xi0+d xi0:p(xi0) d x10… d xn0 = │ ɸ(x0)
│2 dx10... d xn0.
Valorile medii ale acestor marimi M se pot estima cu ajutorul lui ɸ, daca tinem seama de
faptul ca marimii M, i se asociaza un operator –diferential, de obicei, ce actioneaza asupra lui .
=*(( ɸ()) d x1… d xn; Marimea M poate lua diferite valori Mi ce se obtin ca valori proprii ale
operatorului Relatiile ɸMi= Mi * ɸMi ne indica starile ɸMi pentru care M are o singura valoare; in
general insa M poate lua diverse valori Mi:functia de unda a starii respective ɸ se poate descompune
dupa functiile ɸMi, ɸ=Mi ɸMi, astfel incat │CMi│2 dau posibilitatile de a obtine o anumita valoare Mi a
marimii M.
Starile stationare sunt starile pentru care energia este unica si egala cu una dintre valorile
proprii ale operatorului ; deci ele se obtin din ecuatia Schrӧdinger ɸ=E ɸ.
Daca sistemul se afla initial intr-o stare ɸi si temporar intervine o perturbatie deschisa printr-
un termen suplimentar δ in hamiltonian, vor avea loc tranzitii spre alte stari; posibilitatile de tranzitie
pe unitatea de timp sunt pij = │δ Hij │2 p(Ei). Variatia de energie Ei – Ej este produsa de cuante de
lumina absorbite sau emise; δHij =i*δ ɸj dx1,..,dxn este elementul de matrice a lui ; δH, iar p(Ei)
numarul de stari de energie egala cu cea a starii initiale.
Daca U=0, pentru o particula cu impulsul , functia de unda-solutie a ecuatiei lui Schrӧdinger
corespunde unei unde plane ɸ=ɸ0exp , lungimea de unda fiind λx =, iar frecventa ν= E/h ( relatiile lui
Broglie).
Pentru cazului unui electron in campul unui nucleu de sarcina ze, potentialul U= -ze2/r
determina aparitia unor stari legate (orbital atomic) caracterizate de 4 numere cuantice:
-l, numar cuantic orbital l=0,1 … n-1 indica excentricitatea norarului electronic elipsoidal de
-m, numarul cuantic magnetic m=-l, -(l-1) …, (l-1), l indica cele 2(l+1) orientari (“cuantificate”)
posibile ale planului central al orbitei (norului).In functie de m si l norul electronic are o forma
multilobata diferit orientata;
Sub actiunea unor perturbatii, de exemplu radiatiile luminoase- electronii pot sari spre orbitele
cu valori n mai mari cu energii de legatura mai mici; electronii cei mai slabi legati sunt cei din
paturile exterioare, incomplete si cu valori maxime a lui n.Ei sunt angrenati in toate procesele fizico-
chimice uzuale- sunt electroni de valenta ( electronii interiori din paturile complete sunt legati
puternic de nucleu, cu care formeaza un miez ionic greu deformabil).
Trecand la sisteme moleculare , vom observa ca electronii de valenta pot forma pachete de
sarcini negative internucleare, ca urmare a trecerii lor continue de pe unele nuclee (miezuri ionice) pe
celelalte; aceste pachete pot suda edificiul molecular prin atractii electron- nucleu, ce domina
repulsiile miezurilor ionice pozitive.
Analizand evolutia unui electron in campul mediu al sarcinilor nucleare si electronice se obtin
o serie de nivele – orbitale moleculare, ce presupun o posibila prezenta a electronilor inapropierea
diverselor miezuri ionice; ɸOM=∑ciϑi arata ca electronul se poate afla cu o probabilitate |ci|2 langa
In cele mai simple situatii, 2 atomi isi suprapun norii electronici s cu simetrie sferica(l=0), pe
directia dreptei Δ ce-i uneste; se formeaza o legatura chimica de tip σ cu un pachet de sarcina negativa
intre cei doi atomi, invariant la rotatii in jurul axei Δ.
Daca atomii vecini isi suprapun norii elecronici de tip p2, cu doi lobi situati de o parte si de alta
a planului moleculei ( cu densitate nula in acest plan), apare o legatura de tip п; pachetele de sarcini
negative stabilizatoare se afla de o parte si de alta a directiei Δ- legatura п este deci mai slaba; 2 atomi
vecini se pot lega fie prin cuplari de tip σ, fie prin cuplari de tip п.Legaturile σ singure sunt legaturi
chimice simple; insotite de una sau doua legaturi п obtinute prin cuplaje ale unor orbitale atomice p
perpendiculare axei Δ-legaturile devin duble sau triple.
Uneori, in moleculele plane conjugate, atomii vecini, aand orbitale p2 vecine, pot forma-
deasupra si dedesuptul planului moleculei – 2 nori electronici п, in care electronii diferitelor miezuri
sunt pusi in comun, colectivizati, delocalizati, obtinandu-se o stabilizare suplimentara (“prin
rezonanta”).
Pentru fiecare legatura chimica, daca pachetul de sarcini negative puse in comun este dintre
miezuri, legatura este covalenta, homeopolara; daca pachetul este deplasat spre unul dintre miezuri,
20
legatura este ionica, heteropolara (si are loc o tranzitie electronica de la un donor – compus cu ultima
orbitala ocupata de inalta energie, nestabila, spre un acceptor – cu o prima orbitala libera pe care
electronul va ajunge cu o energie destul de joasa).
Configuratia completa a norului electronic este data de valoarea coeficientilor ci rezultati din
rezolvarea unei ecuatii Schrӧdinger de forma ∑j Hijcj = Eci. Hij indica afinitatea miezului i pentru
electron, Hij descriu intensitatea schimburilor electronice intre doua mizeuri vecine i si j. In cazul
hidrocarburilor conjugate se pot lua Hii = α, Hij =β<0 (i,j vecini directi); rezulta n nivele energetice
Ek=α+mkβ. ( dintre care n/2 sunt legate mk >0,iar n/2 nelegate mk <0) [1, 6, 10]
Densitatea electronica pe un nucleu i se poate calcula stiind densitatea ǀǀ2 asociata electronilor
situati pe nivelele ocupate α, qi= functie (daca qi<1, exista un deficit de sarcini negative- pozitia este
pozitiva; daca qi >1- sarcina totala – cu a miezului ionic inclusiv , 1- qi este negativa).
Calculand energia E= *(Ĥɸ) dxi ... dxn , cu forma mentionata a lui ϕ, obtinem E= + Pij= )
caracterizeaza distributia de sarcina intermiezuri, mai exact, ordinul legaturii ij fixat de intensitatea
schimburilor dintre cele doua miezuri, de tipul legaturilor п sau σ ce se formeaza intre ele ( daca
Pij=0 electronii п nu participa la formarea legaturii, 1+ pij da ordinul legaturii – el este eventual
neintreg).
Cu cat o pozitie are o sarcina 1-qj mai pozitiva, tendinta ei de a reactiona cu agenti negativi
(nucleofili) va fi mai mare; pentru 1-qj negativi, va exista o mai mare sensibilitate la atacul unor
agenti pozitivi, electrofili.
Pe de alta parte, cu cat pij si ordinul legaturii sunt mai marin , cu atat creste mai mult
probabilitatea reactiilor de aditie la molecula respectiva.
Puterea de legare a unui atom este data de Pi = formula ; daca Pi max este valoarea maxima a
21
lui P, valenta libera Vi =Pi,max-Pi≠0, indica reactivitatea pozitiei i (in special sensibilitatea la agenti
radicalici).
Am aratat mai sus ca pentru cazul a n electroni п delocalizati, apare o energie de legatura
suplimentara R, fata de aceea a legaturilor biomoleculare din molecula respectiva.
Pentru un anumit nivel Ek=α+mkβ, mk este indicele de stabilitate.Daca cel mai inalt nivel
ocupat «HOMO » este inalt (mk <0,3), compusul respectiv este un bun donor de electroni;daca pentru
cel mai jos nivel liber “LEMO”, mk are valoare negativa, superioara lui –o,3-0,4, el va fi un bun
acceptor de electroni; cupluri donori-acceptori de electroni formeaza complecsi cu transfer de
sarcina, in care benzile compusilor separati sufera uneori deplasari spre lungimi de unda mai mari :
hν=Id - Ea - C; Id este potentialul de ionizare al donorului, Ea -afinitatea pentru electroni a
acceptorului, iar C- o masura a intensitatii interactiilor electrostatice din complex [9, 1, 2].
In cazul moleculelor conjugate, energia de activare se poate calcula aproximativ, prin asa
numita energie de localizare; se compara energia moleculei initiale cu aceea a unei molecule din care
s-a extras ansamblul de nuclee, de centri, implicati in reactia respectiva, impreuna cu electronii de
valenta asociati (daca agentul respectiv este pozitiv, neutru sau negativ, el va atrage in plus 1,0 sau -1
electroni din sistemul de electroni п restant).
Uneori variatiile energiei de activare se pot corela cu variatiile analoge ale energiei libere
eliberate din reactia respectiva.
22
a.Caracteristici microscopice ale unor centri locali, esentiali in determinarea proprietatilor
globale (centri de fixare, centri activi sau de reglare).
b.Caracteristici ale subunitatilor mai mari si ale interrelatiilor acestora ( pozitice, orientare,
forma, densitate medie a diferitelor sarcini, valente, capacitati donoare sau acceptoare, masa de
micromolecule adsorbite).
c.Caracteristici globale ale lantului, in masura in care ele nu rezulta din datele anterioare ( de
altfel, uneori datele despre subunitati pot fi absente sau incomplete).
xα= iαxi(εiα=±1)
Transformari analoge ale marimilor statice Mi, cinematice dMi/ di si dinamice (forte) Fi permit
gasirea ecuatiilor de evolutie ale marimilor macroscopice.
Daca o marime macroscopica retinuta y este cuplata cu toate caracteristicile xi ale unei
subunitati analoge , in toate ecuatiile de evolutie ale marimii xi intervine y; y va influenta deci si
ecuatiile asociate marimilor macroscopice Mi corespondente; invers, deoarece xi sunt toate cuplate cu
marimea y, in ecuatia lui y putem considera aproximativ doar cuplaje cu marimile macroscopice
Mi(x).
Am putea in principiu descrie fortele dintre macromolecule prin variatia valorilor momentane
xi pe masura modificarii graduale ale starii macromoleculelor; din nefericire, nu dispunem de
informatiile necesare- nici asupra conditiilor dinamice si nici asupra conditiilor microscopice initiale,
desi modificari relativ mici ale starii initiale pot schimba mult starile finale.
23
Din acest motiv este mai realist sa nu folosim metoda amintita decat pentru variatii stabile,
mici, lente, simple, monotone.
Pentru modificari radicale ale starii, rapide si puternic dependente de conditiile initiale, este
mai comod, sa indicam doar rezultatul procesului, tranzitia globala stare initiala- stare finala, mai
bine cunoscuta.
Aceste simplicitati se pot face prin neglijarea nor detalii microscopice spatiiale fine si a unor
detalii fine temporale ale evolutiilor parametrilor macroscopici anteriori.
a.ciocniri elastice sau nu, modificatoare ale pozitiilor, orientarilor relative si ale miscarilor
interne( interactii fizice);
Aceste tipuri de interactii pot coexista, diferitele subunitati putand fi angrenate simultan in
mai multe procese fizicochimice de tipul mentionat.
Fiecare lant este cuplat simultan cu multe altele; apar efecte multiparticulare, ce intaresc
neliniaritatile ecuatiilor de evolutie si dependentele de istorie ( de ex. Transferurile le distanta sunt
asociate cu intarzieri neneglijabile); de altfel acest tip de complicatii a aparut o data cu trecerea la
variabilele agregate, macroscopice.
24
Daca ne referim numai la interactiile centrilor de fixare, vedem ca din macromoleculele
anizotrope se pot construi medii ”continui”, cu diferite caracteristici reologice- cu diverse moduri de a
raspunde (pasiv) la actiunea deformatoare a unor factori perturbatori externi (de ex. organite,
“suport” a diverse activitati).
Alaturi de interactiile de fixare (de vecini sau de suport) exista interactii prin fluxuri de
semnale cu macromoleculele de pe acelasi nivel de organizare, sau de pe nivele inferioare. In cazul
centrilor activi, ce alimenteaza cu produsi ultimele etaje sau in cazul centrilor de reglaj, se simte
influenta etajelor superioare de control.
Posibilitatea de avedea direct moleculele proteice este foarte redusa. Le putem recosnstitui
caracterele macromoleculare rezultrate in urma FOLDINGULUI.
Prezentam citeva fotografii rezultate din modelarea SWISS MODELL a citorva molecule
proteice cu mare semnificatie functionala.
25
Proteina C reactiva umana
26
27
28
Serum albumina umana
1. Parsons, J., Holmes, J. B., Rojas, J. M., Tsai, J., Strauss, C. E., Practical conversion from
torsion space to cartesian space for in silico protein synthesis. [1] J Comput Chem 26 (2005),
1063-1068.[2]
2. M. P. Allen, D. J. Tildesley, Computer simulation of liquids, 1989, Oxford University
Press, ISBN 0-19-855645-4.
3. R. Leach, Molecular Modelling: Principles and Applications, 2001, ISBN 0-582-38210-6
4. D. Frenkel, B. Smit, Understanding Molecular Simulation: From Algorithms to Applications,
1996, ISBN 0-12-267370-0
5. D. C. Rapaport, The Art of Molecular Dynamics Simulation, 2004, ISBN 0-521-82568-7
6. R. J. Sadus, Molecular Simulation of Fluids: Theory, Algorithms and Object-Orientation,
2002, ISBN 0-444-51082-6
7. K.I.Ramachandran, G Deepa and Krishnan Namboori. P.K. Computational Chemistry and
Molecular Modeling Principles and Applications 2008 [3] ISBN 978-3-540-77302-3 Springer-
Verlag GmbH
29
24). Modificari de conformatie implicate de activitatea macromoleculelor si a sistemelor de
macromolecule
Uneori mai multe pachete de portiuni pot fi cuplate in blocuri separate, paralele; alteori –
pentru a respecta continuitatea lantului- blocurile sunt asezate in forma de “stea”, mai mult sau mai
putin deformata. Vom presupune ca unul sau mai multi centri de pe fiecare bloc se cupleaza cu un
“miez”care contribuie la stabilizarea pozitiilor si orientarilor relative ale blocurilor; nu este insa
exclus ca mai multi centri a diferitelor blocuri sa se lege reciproc rigid.
Centrii pot contine diversi cofactori, micromolecule. Deci putem deosebi doua tipuri de centri ,
30
unii atasati de portiunile neregulate intermediare , de capetele blocurilor (in general de forma
alungita) si altii situati intre blocuri si actionand ca niste puntide legare reciproca ( dupa cum alti
centri mai mici sau mai simpli , realizeaza puntile de sulf, saline etc. Stabilizand structurile interne
ale blocurilor mentionate). Pentru prima categorie de centri am semnalat eventuala prezenta in
regiunea centrala (de obicei apolara) a unui miez apolar, dar avand eventual si alte sarcini si valente;
acest multipol este capabil sa lege multe blocuril el actioneaza ca un centru de organizare a intregului
edificiu; totusi prin participarea mai multor centri separati, dar cuplati indeplinirea acestei functii de
organizare este posibila si in absenta centrului amintit.Centrul principal de organizare poate avea in
“subordine” centri de organizare secundari aflati in jurul sau si ocupandu-se de organizarea
nemijlocita a partii mai exterioare a macromoleculei, a capetelor respective ale blocurilor (capete mai
polare, aflate in apropierea mediului apos inconjurator).
Toti acesti centri , inconjurati de distributie in stea ale blocurilor controlate, sunt obiectul
preferential al actiunilor de reglaj; diverse micromolecule ajungand pe acesti centri le modifica
reactivitatea ceea ce altereaza 1) intregul edificiu (daca este vorba de miezul central) sau 2) o intraga
zona, a carei conformatie este controlata de centrul modificat.
Modificarea consta de obicei dintr-o marire sau o reducere a fortei atractive a centrului, a
capacitatii sale de a tine legate toate blocurile functionale, puse sub controlul sau; in primul caz are
loc o compactare , in al doilea caz are loc o afanare a structurii (in intreaga macromolecula sau doar
intr-o singura parte a ei). Bineinteles centrul isi poate modifica capacitatea de legare numai a
anumitor blocuri controlate de el: se observa o deplasare relativa a blocurilor “eliberate” partial din
“cuplaj” fata de acelea ce raman strans legate de centrul respectiv de organizare.Astfel de deplasari
relative (de obicei similare unor dilatari sau contractii) pot fi induse si de influente ale unor
micromolecule, provenite din exterior si care actioneaza asupra centrilor sau puntilor de cuplare intre
perechi sau grupuri de blocuri vecine.Nu trebuie sa neglijam posibilitatea unor cuplaje intre doua
blocuri functionale realizate prin legaturi uzuale, pe suprafete mai mari, sau anumite muchii vecine
ale parechii de blocuri.Modelarea compactitatii unor astfel de structuri (analoga aceleia a
membranelor)este datorita actiunii unui flux de micromolecule, ce ajung pe zona de cuplaj si schimba
proprietatile micilor centri de pe blocurile care participa la formarea multiplelor legaturi interblocuri
mentionate mai sus.
Aceste legaturi intalnite in studiul conractiei musculare, unde apar intre molecule de actina si
de miozina, pot explica deplasari perpendiculare pe directiile legaturilor interbocuri; entalpia libera
G a sistemuluise reduce ca urmare a deplasarii mentionate ( creste numarul n de legaturi, in cazul
unei reactivitati complementare adecvate ale centrilor de pe cele doua blocuri; n scade, daca formarile
31
de legaturi nu mai sunt favorizate de reactivitatile perechilor de centri modificate discordant).Alaturi
de modificarile de reactivitate ale centrilor de organizare si de cele de conformatie rezultante, se
modifica si reactivitatea altor centri, se modifica potentialele donoare si acceptoare ale diverselor
pozitii, ceea ce nu este dificil, data fiind mica inaltime (adancime) a barierelor (gropilor) de potential
respective; in unele cazuri, unele gropi de potential ( pozitii acceptoare) isi schimba doar
caracteristicile (centrul, adancimea, largimea), in alte cazuri, din gropi de potential, ele devin chiar
maxime de potential (pozitiile devin instabile donoare, dupa cuplarea cu compusul micromolecular
respectiv);capacitatile aceeptoare si donoare nu se refera numai la unele micromolecule speciale, ce se
leaga de macromolecula, ci si la ionii normal adsorbiti pe ea (care vor intra sau vor iesi din
macromolecula, daca cresc sau respectiv scad proprietatile ei acceptoare globale).
32
de topire zonala, ce se deplaseaza de la un capat la celalalt al lantului. Dimensiunea transversala a
“farfuriei” si a zonei topite asigura trecerea usoara la etapa urmatoare a procesului (o eventuala
“porozitate” centrala crescuta a enzimelor care poate permite o deplasare a centrului activ de la
pozitia initiala acceptoare a substratului, vecina enzimei anterioare , spre pozitia donoare a
produsului, vecina enzimei ulterioare pe lant); procesul poate implica deci deplasari longitudinale
(translatii, rotatii ale centrului) ce insotesc pe cele transversale mentionate mai sus.In ceea ce priveste
cuplajul cu alte sisteme efectoare a diverse travalii, vom mentiona faptul ca , spre deosebire de
procesele descrise (in care se elibera energie si se afanau structuri, reducandu-se potentialul energetic
si reactogen al substratului in degradare), in sistemele efectoare de travalii se obtin stari caracterizate
dimpotriva prin cresterea energiilor potentiale “nobile”. Sursa modificarilor mentionate este greu de
identificat cu precizie in momentul de fata;de exemplu, enzimele sistemului anterior discutat, ar putea
accepta, din cauza afanarii lor, ioni din jur , in special de la molecule ce fac parte din sistemele
efectoare (care vor fi saracite in contraioni si vor avea un numar de sarcini neneutralizate mai mare).
Se poate astfel induce in sistemul efector o transformare de faza, o trecere la conformatie de elice (ce
inmagazineaza energie conformationala) indepartand totodata diversele sarcini pozitive si negative
(ceea ce creste energia potentiala electrostatica a sistemului); mecanisme de acest gen valorifica
experientele si analizele teoretice ale lui Katchalsky discutate anterior, care au demonstrat ca iesirea
de sare din sistem poate explica extensia unei fibre; modelul propus pare natural si din alt punct de
vedere; este universala inducerea modificarilor de stare ale membranei prin fluxuri incidente de ioni
mici, de tipul celor care pot fi schimbati usor de componentele sistemelor cuplate producatoare de
energii- consumatoare, cu ocazia a efectuarii de diverse travalii.
Este evident ca pentru genom, pentru acizii nucleici esentiali in functionarea celulei,
modificarile de conformatie sunt puternic corelate cu acelea de activitate specifica diverselor etape ale
ciclului celular.
Genomul (mai exact cromozomii)- macromolecule gigant , ar putea sa sufere toate modificarile
mentionate mai sus, sa evidentieze aceleasi caracteristici generale ale modului de stabilizare si
modificare ale structurii tertiare;in plus vor interveni din cauza structurii de dubla spirala, procese de
desfacere sau de refacere a dublei elici, realizate partial in timpul transcriptiei sau complet in timpul
mitozei (in timpul replicarii acizilor nucleici).
34
Mai mult ca oricare alta macromolecula, un centru de organizare principal trebuie sa existe si
sa raspunda in mod specific si adecvat la diversele semnale de informare (prin activarea genelor ce
induc sinteza proteinelor necesare raspunsului global al celulei la starea momentana a mediului); vom
remarca ca acest centru “miez” trebuie sa aiba multe stari, sa fie compus din mai multi centri cuplati,
formand un fel de retea logica, care in functe de sosirea unor semnale de o anumita intensitate,
produce semnale de activare ale genelor conform unui program de reactie optimala; unul din
raspunsurile posibile este eliberarea unor mediatori de tipul represorilor sau derepresorilor, aflati in
anumite zone ce se demascheaza si isi pierd proprietatile fixatoare a compusilor mentionati, ca
urmare a unor stimuli de informare potriviti; acest miez, centru de organizare, joaca rolul de etaj
superior de reglaj la nivel celular si poate fi de exemplu un coloid eterogen cu o structura de gel
particulara, de care se leaga diferite parti ale cromozomului (in afara perioadei de mitoza); el
comanda atat prin legaturi geometrice, directe, cat si prin legaturi chimice (la distanta, sau de contact
mediate de represori si derepresori ale diverselor gene) conformatia si reactivitatea diverselor
portiuni (gene si sisteme de gene) de pe cromozomi.
Cromozomii pot fi considerati formati din mai multe paturi , straturi distincte, ceea ce nu este
normal in cazul unor molecule atat de mari; aceste paturi sunt controlate de diversi centri de
ierarhizare secundari sau tertiari (aflati respectiv sub controlul centrilor de organizare prinicipali si
respectiv secundari, ce se ocupa fiecare de stabilirea conformatiei si reactivitatii centrilor
in”subordine”); genele analoge, repartizate in diverse directii, se pot clasifica analog , ierarhizarea
mentionata a controlului asigurand eficacitatea lui (mai ales daca consideram ca paturile exterioare
contin mai multe gene , din cauza volumului mai mare aflat la dispozitie); deoarece structura
genomului rezuma pe cea a celulei este natural sa asociem paturile exterioare cu sistemele enzimatice
si efectoare mai diferentiate, multe la numar, in timp ce paturile interioare nucleare le vom considera
responsabile pentru activitatile biologice esentiale (legate de replicarea acizilor nucleici, de activitatea
acestora, de proteinele fundamentale , fara de care nu se poate asigura energia, reactivii si monomerii
necesari activitatii si reproducerii setului limitat de proteine si acizi nuceici fundamentali- probabil
aceiasi ca la majoritatea organismelor).
Daca asociem ca de obicei starilor afanate si compactate o activitate mica si respectiv mare,
observam ca edificiul presupus de noi poate evidentia o activitate intensa a tuturor paturilor sau
numai a celor centrale, dupa cum este compact intreg edificiul sau numai partea lui centrala.
In primul caz starea celulei este cea normala; toate structurile diferentiate sunt prezente, in
particular acelea de pe membrana, ce asigura inhibitia de contact a cresterii.In schimb cand doar
setul de acizi nucleici si proteine fundamentale si simple este stabilizat, structurile exterioare de la
35
suprafata celulei se pierd, o data cu diferentierea, starea celulei deviaza mult de la normal.
Scade intr-o oarecare masura raportul volumelor (si maselor) citoplasmei fata de acelea ale
nucleelor si raportul analog proteina/acid nucleic; nucleul are acum o raza mai mica de actiune
organizatoare si stabilizatoare (atat in sens calitativ, al numarului de proteine sintetizabile, cat si in
sens geometric, al distantei la care poate fi asigurata sinteza proteinelor de genomul activ de volum
redus, caracterizat si de capacitatile de reglaj la distanta,mult mai slabe ale acizilor nucleici neevoluati
continuti);in schimb simplitatea setului de acizi nucleici si de proteine mentinute permite o mai rapida
reproducere a fiecarui tip de componenta celulara si a celulei in totalitate, ritmul de mutiplicare
crescand foarte mult.Vom incerca sa corelam toate caracteristicele interne anterioare cu modificarea
proprietatilor de membrana dependente de structuri specializate: diferentierile disparand in starea
discutata, eliminandu-se inhibitia de contact (asigurata de cuplajul unor centri specifici de pe
membrane);
Ipoteza noastra este ca dezvoltarea tumorala este produsa prin scoaterea din functie a paturii
externe a genomului (responsabila pentru limitarea vitezei de multiplicare prin inhibitia de contact si
prin lungimea mare a ciclului de replicare si responsabila de asemenea pentrumentinerea diferentierii
celulare); presupunem deci ca exista cel putin doua tipuri de stari ale miezului ce controleaza starea,
conformatia,activitatea si reactivitatea genomului;Atat in cazul proteinelor cat si al acizilor nucleici
(cromozomilor) centrii de organizare pot contine si elemente straine macromoleculei in cauza ( in
cazul cromozomilor acesta pare sa fie absolut necesar pentru a se asigura reactia atat de variata si de
specifica a stimulilor sositi).
Pentru prima categorie de stari ale centrului de organizare, raza de actiune compactanta a
genomului este mare si toate genele sunt direct sau indirect controlate de el; in starea corespunzatoare
dezvoltarii tumorale, raza de actiune este mai mica, genele din paturile exterioare nu mai ajung sa fie
active,nu mai este asigurata nici replicarea lor si nici a enzimelor si structurilor asociate; starea de
afanare exagerata initiala indusa de slabiciunea fortelor de atractie, permite si eliberarea treptata a
unor depolimeraze, ce elimina acizii nucleici si proteinele evoluate, in lipsa activitatii de inlocuire a
acestora prin biopolimeri nou sintetizati; bineinteles, printr-o transformare tumorala intelegem o
scadere ireversibila si marcata a razei de actiune a centrului de organizare, ce nu are nimic in comun
cu modularea normala reversibila si de mica amplitudine a razei de actiune (ce adesea se reduce in
directiile genelor nenecesare, dar creste in directiile in care se poate asigura activarea genelor
necesare in conditiile de mediu respective).
Aceasta ipoteza ar putea fi utilizata in explicarea altor aspecte ale evolutiei celulelor; de ex. in
36
timpul mitozei, sub influenta unor eventuale interactii cu centriolul,centrul de organizare se poate
decupla de genom, ce poate acum replica (poate centrul de organizare avand eventual o natura in
principal proteica serveste la formarea legaturilor cu polii mitozei, calitatile coontractile putand de
altfel interveni si in tmpul modularii conformatiei genomului in interfaza), deplasarile centriolului
poate explica in interfaza , modificarile de activitate, iar in timpul mitozei, dedublarea sa si
desprinderea de pe genom a centrului de organizare, de care centriolul este legat.
25). Transferul ireversibil de energie si particule. Legaturi dinamice mediate de schimburi intre
macromolecule.
Ca sistem deschis, continand pe langa lantul central si o serie de cofactori si un numar mare de
ioni adsorbiti, macromolecula este capabila sa transfere altor macromolecule vecine, energie si
particule.
Aceste interactii “chimice” mediate de micromolecule, pot determina aparitia unor forte de
legatura dinamice intre lanturi.
Cel mai simplu transfer este cel simetric, reversibil, intre doi parteneri (este tipic cuplurilor de
micromolecule pentru care particulele schimbate pot fi fotoni, electroni, ioni de hidrogen, etc.)
In acest caz, particula schimbata de parteneri este situata pe un nivel de energie constanta,
comun celor doua molecule.
Fie de exemplu macromoleculele I si II, descrise de hamiltonienii ĤI, ĤII , cu nivelele (Ei0I, ϕiII)
si respectiv (Ei0II, ϕiII). Vom considera ocupate si in interactie doar nivelele de energii nu prea inalte.
Ecuatiile Schrödinger:
37
= 0; Ek = Ek0 + ; k=i.j
( = dr)
2(E1-)/(- ) = 2 este devierea de la pozitiile initiale (ρ≈0), ce tinde catre ρ pentru ρ mare,
(ρ2=4││2 / ( – )2)
Tinand seama de conditia de formare, │αI│2 + │αII│2 =1, obtinem pentru raportul
probabilitatilor de situare pe cele doua molecule
Pentru ρ2 mic, r este diferit mult de unitate (daca E=E1, r ≈∞, │αI│2 ≈ 1,
│αII│2 ≈ 0 (particular este pe molecula 1), daca r≈0, │αI│2 ≈ 0, │αII│2 ≈ 1 (particula este pe
molecula 2).
Pe nivelul de energie constanta, particula trece de la o molecula la cealalta cu atat mai usor cu
cat ρ este mai mare.
38
Daca ρ este mai mic, particula ramane practic in groapa de potential initiala; pentru ρ mare,
trecerile peste bariera de potential despartitoare a celor doua domenii sunt frecvente, cele doua gropi
de potential fiind practic unificate, in fiecare ramanand o jumatate din timpul de observare.Pentru
orice ρ, nivelul E1 este mai instabil (stare “antilegata”), nivelul E2 este mai stabil (stare “legata”);
schimbul discutata explica energia de legatura E-(EiI + EiII ); (E= E1, E2).
Sistemele cuantice sunt sisteme deschise, ce pot pune in evidenta nu numai evolutii oscilante,
reversibile, ci si evolutii ireversibile, implicand schimburi de energie si de particule, cu excitari
(acceptari de particule) si respectiv dezexcitari (sau donari de particule activatoare).
1.un transfer “izoenergetic”, pe o orbitala comuna, are loc dupa cuplarea “orbitelor” de energii
aproximativ egale ale celor doua molecule;initial particula este pe un orbital nelegat, localizat adesea
in vecinatatea moleculei 1;
Disiparea, doar in regiunea moleculei 2 se poate explica prin prezenta unei forte disipative in
acest domeniu, a unui cuplaj cu alt acceptor de energie etc.
In molecula 2, dezexcitarea se poate face eventual si spre alta stare libera de energie mai mica,
strict localizata.
In regiunea moleculei 1 nu existau nici nivele libere localizate, nu existau nici forte disipative
capabile sa produca o trecere spre nivelul inferior E2 (intervenea o regula de selectie “locala”, o
bariera de potential despartitoare prea mare).In timpul transferului, in intervalul de timp mic τ0,
particula leaga cei doi centri, mediind aparitia unei temporare atractii, de intensitate proportionala cu
energia disipata (cu diferenta de afinitate). Tranzitia E1 →E2 in dreptul moleculei 2 realizeaza un
transfer ireversibil, din cauza imposibilitatii revenirii spontane de pe starea localizata de langa
molecula 2, spre cea initiala de langa molecula 1.Probabilitatea dezexcitarii – in analogie cu aceea a
dezexcitarea radiativa in vid- ne-o putem imagina proportionala cu ω12|V12|2C; ω12 este frecventa
Bohr asociata tranzitiei E1 →E2 , h ω12= E1 →E2 ≈ EiI →EjII, iar V12= ω12r12 este elementul de matrice
al operatorului viteza, corespunzand lui
12=ɸ2 dτ
39
C este eficienta cuplajului cu acceptorul de energie- mediul etc., iar S gradul de suprapunere
( fiind distanta dintre centrele de masa ale moleculelor), rezulta probabilitatea de tranzitie, a
carei expresie aproximativa este deci:
P12=1/h2(- )3 ││ CS2
In functie de durata celor doua etape mentionate, inversbilitatea este mai mult sau mai putin
pronuntata:
-daca frecventele ω12 ale tranzitiilor pe aceiasi orbitala izoenergetica E1 este mult mai mareca
frecventa 1/ τ a dezexcitarilor, schimbul este mult timp reversibil, practic simetric; disiparea este
tarzie;
-daca frecventele actelor de dezexciatre sunt mai mari ca a celor de trecere de pe molecula 1 pe
molecula 2, in cadrul nivelului E1 , transferul este ireversibil, disiparea energiei este imediata (nu au
timp sa aiba loc tranzitii intre cele 2 molecule pe nivelul E1, acesta fiind repede parasit).
Schimbul este simetric cand coborarea pe verticale e mai lenta decat circulatia orizontala, si
asimetric, ireversibil, in cazul opus.
Daca intre “coloanele” I si II se stabileste un echilibru, “pe coloane” are loc o “coborare” spre
starile de energii minime si ; si sunt egale, la echilibru are loc un schimb continuu I↔ II; mult mai
40
frcvent este cazul in care pe coloana II, nivelul ultim este mai jos decat in coloana pozitiei initial-
transferul este ireversibil. Respectiva constanta de viteza pentru doua │nivele i=1,2 pentru tranzitia I 1
→ II2 este , k+/(k-+k+) fiind ponderea αII a moleculei 2 in E1, iar x+ probabilitatea transferului E1
→E2 “in dreptul” moleculei 2.
O descriere mai complexa ar tine seama si de mica probabilitate a tranzitiei II2 → II1, x-
;constanta de viteza a tranzitiei II2 → I2 este
k- x-/( x+ + x-).
Constanta de echilibru, K, K-1= (I2) / (II2)=( k-x-/ k+x+). (k++ k-/ x++ x-), ne da o masura a
capacitatii “donoare” a lui I1 si a celei “acceptoare” a lui II2.Pentru un compus 1, putem introduce o
marime analoagapotentialului redox:vom allege o substanta 2 de referinta, si vom define potentialul
de transfer пt prin ∆G=-RT ln K eliberat la tranzitia 1→2 (in conditii standard T=25, p=1 atm
etc.);potentialul de transfer пt la donori buni este puternic negative, la acceptori el este pozitiv.
Pentru moleculele cu пt analog, schimburile pot fi practice simetrce, reversibile; particular este
situate intre cei doi parteneri, intre care oscileaza; se formeaza o legatura homeopolara, ambii
reactanti I si II, avand afinitate pentru particula care ii atrage (ii sudeaza).
Am calculate mai sus energia de legatura rezultata care creste o data cu intensitatea
schimbului ││2.
Daca particulele пt1, пt2, ale moleculelor difera sensibil, particula va trece rapid pe accelerator,
transferal determinand aparitia unei legaturi heterotropolare (afinitatea donorului pentru particular
devine afinitatea C pentru complexul particular- acceptor); daca luam particular, o scoatem din
molecula I (cu un consum de energie pentru “ionizare”, A1), o ducem la infinit, o aducem apoi pe
molecula II (cu o eliberare de energie A2 corespunzatoare “afinitatii” respective), si apropiem la
distanta normal molecula I “ionizata” si molecula II (transformata in complex particular- molecula II,
energia mai scazand cu C),obtinem un bilant al modificarilor de energie, valoarea energiei de legatura
heteropolara: Eleg=A2-A1+C; daca transferul este incomplet si realizat doar in proportie de R%, Eleg
scade la ElegR/100. Pentru un flux de ɸ particule transferate pe sec., atractia medie dintre centrii si
energia legaturii dinamice respective poate fi estimate ca proportional cu Eleg ɸτ0 (R= const ɸτ0).
Caracteristicile anterioare fac din macromolecule, mici automate elementare, elemente ale
grafului de deplasare geometrica (si eventual chimica) a semnalelor, conform unui program inscris in
sirul de centrii cu potentiale de transfer din ce in ce mai mari de pe directia de propagare impusa.
Diverse astfel de sisteme separate si protejate se pot descarca in scopul efectuarii de diverse
travalii celulare utile.
Descarcarile nu sunt “radiative” sau pur dissipative (transformari in caldura); uneori energia
este convertita in forme stabile, nobile, sau este cedata direct gradelor de libertate ale unor miscari
ordonate (associate unor travalii specific); randamentul este practice 1.
42
26). Epigenetica in clinica psihiatrica umana
De ce unii indivizi care au o anumită predispoziţie genetică fac boala respectivă, iar alţii nu fac
boala respectivă. Pentru a explica aceste probleme, unii cercetători Apariţia epigeneticii. Deşi a dus la
progrese exraordinare, genetica nu a putut explica unele procese biologice sau patologice. Aşa spre
exemplu, genetica nu poate explica modul în care se face diferenţierea celulară. Organismul uman este
format din peste 200 de tipuri de celule diferite, aşa cum ar fi celulele musculare, neuronii, leucocitele,
osteocitele, astrocitele şi altele.
Toate celulele din organismul uman provin din aceeaşi celulă-ou şi au aceeaşi informaţie
genetică. Toate celulele organismului conţin toată informaţia genetică. Adică toate au acelaşi potenţial
genetic. Dar genetica nu poate explica de ce o celulă activează o anumită parte din informaţia
genetică, devenind neuron, iar altă celulă activează altă informaţie genetică, devenind
celulă musculară. Genetica nu poate explica de ce doi gemeni monozigoţi nu sunt absolut
identici. De asemenea, ea nu poate explica de
au căutat răspunsul în epigenetică. Termenul de “epigenetică” înseamnă “deasupra geneticii”,
“peste genetică”, “în jurul geneticii”. El a fost introdus de Conrad Waddington, în 1942, pentru a
explica relaţiile dintre mediu şi genom. Baza nucleară a epigeneticii este reprezentată de moleculele
care se află în jurul ADN şi anume din cromatina care înconjoară ADN, din radicalii metil, care se pot
lega de nucleotide, din procesele de acetilare şi de fosforilare etc.
În mod normal genele sunt silenţioase, ele nu sintetizează proteine decât atunci când sunt
stimulate de factorii de mediu. Adică numai atunci când este necesară sinteza proteinelor respective.
Iar factorii de mediu acţionează asupra genomului, prin intermediul epigenomului. Epigenomul
reprezintă un fel de interfaţă dintre mediu şi genom (Leberder, 2001, Bell şi Beck, 2010).
Metilarea bazelor azotate inhibă sinteza de proteine, iar demetilarea bazelor azotate stimulează
sinteza proteinelor. În felul acesta epigenomul ar fi un fel de dirijor al genelor, care sub influenţa
factorilor de mediu determină intrarea în funcţiune a unor anumite gene
Epigenomica este cea care îl adaptează la mediu. De aceea unele celule aflate într-un anumit
mediu vor deveni celule musculare, iar alte celule, aflate într-un alt mediu, vor deveni neuroni. De
aceea dintre doi indivizi care au aceeaşi predispoziţie genetică, unul va face boala, iar altul nu va face
boala respectivă în funcţie de factorii epigenetici(Jaenisch şi Bird, 2003).
Importanţa epigenomicii. Dacă genele sunt silenţioase şi nu sintetizează proteine decât atunci
când sunt stimulate de factorii de mediu, prin intermediul factorilor epigenetici, înseamnă că nu
numai genele, ci şi factorii epigenetici joacă un rol deosebit în dezvoltarea şi în variabilitatea
fenotipică a organismului. După cum arată H. Wu şi Y. E. Sun ( 2006), epigenetica poate explica mai
43
bine cum se face diferenţierea celulară, cum celulele stem se transformă în celule diferenţiate. Adică
chiar şi fără modificarea ADN-ului celulele se vor putea deosebi între ele prin actualizarea unor părţi
diferite din zestrea lor geneti că. J. Feng, S. Fouse şi G. Fan ( 2007) arată că factorii epigenetici
reglează expresia genelor neuronale. Iar J. Hsieh şi F.G. Gaget (2005) arată că prin remodelarea
cromatinei, factorii epigenetici pot influenţa dezvoltarea sistemului nervos. Pe de altă parte, dacă
predispoziţiile genetice pentru o anumită boală nu vor acţiona decât atunci când sunt stimulate de
factorii de mediu prin intermediul factorilor epigenetici, înseamnă că nu numai genele, ci şi
epigenomul joacă un rol deosebit în patologia umană (Bredy şi Sun, 2010). Descoperirea factorilor
epigenetici arată că noi nu suntem chiar atât de rigid determinaţi genetic. Este adevărat că în genom
se află înscris programul nostru de funcţionare. Dar el nu se va manifesta decât atunci când factorii
de mediu contribuie la acest lucru prin intermediul factorilor epigenetici. De aceea noi nu suntem
rezultatul unui determinism genetic rigid, ci suntem de fapt rezultatul jocului dintre organism şi
mediu, prin intermediul epigenomului care înconjoară genomul.
Genomul este componenta stabilă, a potenţialităţilor noastre, iar epigenomul reprezintă
componenta adaptativă a organismului.Genele transmise de părinţi vor interacţiona cu mediul prin
intermediul factorilor epigenetici, dând naştere la formele cele mai adecvate situaţiei respective.
După cum arată S. P. Feinberg şi A. R. Irizarry (2009), epigenomica reprezintă forţa care
conduce procesul de dezvoltare şi de adaptare a organismului. Ea actualizează din zestrea genetică
numai acele potenţialităţi care corespund nevoilor actuale şi mereu sunt actualizate doar anumite
potenţialităţi. După cum s-a constatat în ultimul timp, alimentele acţionează asupra genomului
celular,prin intermediul factorilor epigenetici. Organismul nu este un vas în care au loc reacţiile
dintre alimentele ingerate pentru a elibera substanţele plastice şi energetice de care organsimul are
nevoie, ci dimpotrivă, pentru a fi asimilate, alimentele trebuie să acţioneze mai întâi asupra genomului
celular. Glucoza pe care o ingerăm va acţiona mai întâi asupra genomului celular pentru a stimula
sinteza de insulină şi de enzime necesare metabolizării ei. Pentru a aprofunda aceste fenomene, a
apărut nutrigenomica care studiază influenţa alimentelor asupra genomului celular (Simopoulos şi
Ordovas, 2004). De asemenea şi medicamentele, pentru a putea fi utile, acţionează mai întâi asupra
genomului celular şi astf el a apărut farmacogenomica care studiază influenţa medicamentelor asupra
genomului celular, influenţă care se produce prin intermediul epigeneticii (Evans şi McLeod,2003).
44
Concentraţia proteinelor sintetizate în sistemele celulare este determinată de rata cu care sunt
realizate copiile de ARNm în procesul de transcriere. Aceasta rată de sinteză este condiţionată de
legarea factorilor de transcripţie la secvenţa de recunoaştere specifică a ADN-ului. Sunt multe date
care indică existenţa neîndoielnică a corelaţiei dintre alimentaţia în perioadele critice de dezvoltare a
copilului şi susceptibilitatea sporită la unele afecţiuni cronice în perioada de adult, cum ar fi
afecţiunile cardiovasculare, diabetul zaharat tip2, obezitatea, cancerul şi altele, afecţiuni cu
mecanisme biologice elucidate incomplect, dar care ar putea să aibă la bază „imprintingul metabolic”,
adică mecanisme epigenetice de afectare, cu alterarea expresiei genice şi schimbări în ADN.
Există dovezi că şi condiţiile nefavorabile de îngrijire a copilului mic, neglijarea şi maltratarea,
la fel, au un efect de durată prin mecanisme epigenetice, condiţionând un risc sporit pentru diabetul
zaharat, afecţiunile cardiovasculare în perioada de adult, schizofrenie, anxietate, depresie,
predispoziţie la abuzul de droguri etc.
La baza acestor fenomene stau procese de programare şi de plasticitate a dezvoltării ca
răspuns la factorii de mediu din perioadele timpurii şi perioadele critice de dezvoltare a copilului.
Factorii nocivi de mediu (tratamentele hormonale, stresul cronic, tulburările endocrine etc.)
pot induce apariţia fenotipurilor transgeneraţionale, adică aceste condiţii nocive din perioada
intranatală sau postnatală conduc la susceptibilitate sporită la unele afecţiuni nu numai la individul
dat, dar această vulnerabilitate se transmite din generaţie în generaţie, chiar în lipsa unei expuneri la
factori nocivi de ambianţă.
45
mecanisme genetice. In realitate, de-a lungul generaţiilor, o celulă mamă schimbă cu celulele-fiice şi
informaţii care nu sunt conţinute în secvenţa de baza a ADN-ului.
Epigenetica studiază fenomenele biochimice care permit acidului dezoxiribonucleic să se
exprime într-o manieră diferită, graţie activării sau reprimării anumitor gene, dar fără a provoca
schimbări la nivelul secvenţei genice. În ultimii ani s-a descoperit că, acţionând asupra enzimelor de
bază ale epigeneticii, care fac ADN-ul mai mult sau mai puţin accesibil sistemelor de producere a
proteinelor, poate fi controlată activitatea genelor şi că unele boli complexe, precum tumorile, pot fi
declanşate nu numai de mutaţii genetice, ci şi de funcţionarea defectuoasă a unuia sau mai multor
fenomene epigenetice. Astfel, epigenetica ar putea explica multe probleme care nu pot fi lămurite prin
abordările clasice ale geneticii.
De ce doar unul dintre gemenii monozigoţi dezvoltă schizofrenie?
De ce anumite gene purtătoare de boli afectează numai unele persoane?
De ce unele maladii complexe, precum tulburările din spectrul autist, se observă preponderent
la băieţi?
46
sindromul CHARGE – 8q12;
sindromul Rubinstein-Taybi – retard mintal cu dismosrfism facial, cu îngroşarea
degetelor mari ale mâinilor şi picioarelor; afectarea este localizată pe 16p13, uneori pe
cromozomul 22q13;
sindromul ICF cu localizare mai frecventă pe regiunea 20q11-q13, dar cu
instabilitatea cromozomilor 1, 9 şi 16 se caracterizează prin imunodeficienţă, anomalii faciale,
retard mintal;
sindromul de deleţie subtelomeric 9q (9q34.3) – retard mintal, hipotonie
musculară, microcefalie, convulsii, faţa plată cu hipertelorism, malformaţii cardiace şi alte
semne;
Sindromul Rett, sindromul Angelman, retard mintal cu spasticitate progresivă şi
alte afecţiuni cu localizare pe Xq28;
Sindromul Sotos, cu localizare pe cromozomul 5q35.2. Se caracterizează prin
gigantism cerebral, macrocefalie, dismorfism facial, dificultăţi de învăţare, tulburări
comportamentale, anxietate, depresie, fobii, tulburări de somn, de vorbire etc.;
Sindromul Borjeson-Forssman-Lehman – deficienţă mintală-epilepsie-tulburări
endocrine, cu localizare pe cromozomul Xq26, caracterizat prin dismorfism facial, hipostatură,
hipogonadism, hipotonie musculară, obezitate;
Retard mintal cu palatoschizis, cu localizare pe Xp11.2;
Sindromul Coffin-Lowry – retard mintal sever, anomalii ale scheletului,
dismorfism facial, cu localizare defectului pe cromozomul Xp22.
Tot mai recunoscut devine faptul că tulburările din spectrul autist (TSA) reprezintă afecţiuni
condiţionate prin mecanisme de reglare epigenetică. Mutaţii epigenetice (sindromul X fragil) şi
mutaţii ale factorului seminal de reglare (sindromul Rett, MeCP2) conduc la apariţia trăsăturilor
autiste. Unele mecanisme epigenetice-cheie asociate cu apariţia tulburărilor din spectrul autist includ
efecte de origine parentală şi afectări citogenetice de imprinting, cum ar fi cele de pe cromozomul
15q11-13, locus-ul de deleţie în sindromul Prader-Willi şi sindromul Angelman. Testele moleculare la
pacienţii cu TSA, sindroamele Angelman şi Rett, au confirmat prezenţa anormalităţilor epigenetice,
inclusiv metilarea aberantă a ADN-ului în locusurile genice candidate. Acestea din urmă, dar şi alte
locusuri de imprinting observate în TSA, înglobează regiuni genomice regulatorii complexe care
conţin un amalgam complicat de gene supuse imprintingului şi gene nesupuse imprintingului
implicate în dezvoltarea neurală, excitabilitatea şi transmisia neuronală, plasticitatea sinaptică,
reţeaua de conexiune neuronală, homeostaza creierului, reacţiile la mediu şi alte procese ale
47
sistemului nervos central.
Aceste observaţii ar putea explica un şir întreg de trăsături asociate TSA, cum ar fi:
concordanţa monozigotă incompletă, susceptibilitatea sporită la factorii trigger din mediul ambiant,
heterogenitatea etiologică şi fenotipică, rata neobişnuită de progresie
sau regresie a dezvoltării, anormalităţi sistemice şi incidenţa sporită a unor afecţiuni.
Aceste procese epigenetice se realizează prin intermediul unui şir larg de mecanisme
modulatorii (procese regulatorii ARN, metilare ADN, remodelarea cromatinei, interacţiuni gene-
mediu şi alte procese de modelare genomică). Trăsăturile foarte variate ale afecţiunilor din spectrul
autist pot fi explicate parţial şi prin caracteristicile biologice unice ale genelor supuse imprintingului,
şi prin procesele epigenetice asociate, inclusiv ale expresiei selective la unele etape de dezvoltare
distincte. Acestea pot avea loc în cadrul unor regiuni specifice ale creierului sau altor ţesuturi,
rezultând în tulburări epigenetice de reglare, cu reducerea expresiei genelor nesupuse imprintingului,
cu efecte dozate complexe asupra genelor alele materne şi paterne, cu efecte înalt pleiotropice asociate
şi relaţii genice ierarhice. Dereglarea multiplelor procese interrelaţionate epigenetice în cazul TSA pot
conduce la afectări complexe ale reţelei expresiei genice şi ale funcţiei creierului, inclusiv expresia
eronată a genelor supuse imprintingului şi a genelor cu expresivitate bi-alelică fără a cauza o afectare
genetică clasică, stări detectate contextual şi prin studii asociate. Unele studii sugerează că patogenia
TSA, inclusiv prevalenţa semnificativă a bolii la băieţi, este corelată cu implicarea cromozomului X,
prin imprintingul genelor, prin conflicte intragenomice şi dezechilibre care favorizează expresia şi
efectele paterne versus expresia genelor materne şi care rezultă în carenţe caracteristice sociale şi
comportamentale. Sindromul Prader-Willi reprezintă o tulburare complexă a dezvoltării neurologice,
cu retard mintal uşor sau moderat, disfuncţii hipotalamice ca rezultat al diverselor mutaţii, inclusiv a
pierderii 15q11-13 patern, disomie uniparentală maternă şi mutaţii cu localizare în centrul de
imprinting a sindromului Prader-Willi/sindromului Angelman. Şi, dimpotrivă,sindromul Angelman
rezultă din trei mutaţii reciproce celor ce au loc în sindromul Prader-Willi, însă decurge cu retard
mintal sever, ataxie, convulsii, microcefalie şi tulburări de somn pe fundalul atrofiei corticale,
tulburărilor de mielinizare cerebelare, pierderea neuronilor Purkinje. UBE3A, gena responsabilă
pentru dezvoltarea sindromului Angelman, manifestă expresie bialelică în majoritatea ţesuturilor, dar
expresie preferenţială în alela maternă şi în creierul cu imprinting selectiv în ţesutul neuronal.
Pierderea funcţiei genei UBE3A în sindromul Angelman rezultă din deleţia genei materne şi a
genelor adiacente (grupul 1), prezenţa duplicării cromozomiale 15 de origine parentală cu absenţa
alelei materne (grupul 2), mutaţii în centrul de imprinting cu metilări aberante şi prezenţa a două
alele parentale funcţionale (grup 3), mutaţii în gena maternă UBE3A cu inactivarea funcţională fără
alterarea profilului de metilare la mamă sau tată (grup 4); pot fi observate şi cazuri de boală fără un
48
model clar de alterare genetică moleculară (grup 5) cu mame asimptomatice care nasc copii cu
mutaţii UBE3A şi afectări severe neobişnuite de tipul sindrom Prader-Willi asociat cu profil de
metilare similar sindromului Angelman. Este deja pe larg recunoscută existenţa unui spectru mare de
schimbări epigenetice specific-parentale ale locusului Prader-Willi/sindromul Angelman, care
contribuie la patogenia afectării şi diversitatea enormă a manifestărilor clinice. Aceste schimbări
epigenetice cuprind tulburări de metilare ADN, modificări histonice şi cromatine, asociaţii nonsens
ARN, diferite modificări ale ARN în celulele somatice şi cele germinale. Multe din defectele de
imprinting observate reprezintă epimutaţii, care nu sunt asociate cu un risc sporit de recurenţă a bolii
în familie. Unele studii recente denotă corelaţii etiologice dintre sindromul Rett, sindromul Angelman
şi tulburările din spectrul autist. Sindromul X-fragil, cauza cea mai frecventă a retardului mintal
ereditar, este asociat cu o expansiune largă a repetărilor trinucleotidice în tandem CGG (peste 200
repetări) şi metilarea regiunilor CpG aflate cu 250 pb în faţa repetării trinucleotidice, schimbări care
conduc la silenţierea genei FMR1. Aici se observă tulburări ale ului. Premutaţia FMR1 (cu 60-200
repetări CGG) constituie o afecţiune neurodegenerativă, manifest prin tremur şi ataxie plasticităţii
sinaptice şi ale mecanismelor memoriei de durată, prin implicarea proceselor post-translaţionale şi
modificări diverse ale ARN-.
49
29). Proteinele nitrate ca sursa de aminoacizi modificati PTM; Nitrotirozina molecula vedeta a
stressului nitrooxidativ
Tesuturile unui organism normal (si in particular in diverse situatii patologice) sint supuse
agresiunii diverselor specii radicalare (de oxigen, azot, carbon) care sint inactivate permanent prin
sisteme ce protejeaza celulele prin transformarea lor in compusi cu reactivitate din ce in ce mai
redusa.
Problema anilor 90 a fost, in ceea ce priveste oxidul nitric, interpre tarea semnificatiei
fiziologice sau fiziopatologice a valorilor normale (de ordin picomolar) fata de valorile crescute (de
ordin nanomolar), a momentelor functionale cind in organism avem o situatie sau alta si a efectelor
nivelelor reduse si respectiv foarte mari ale NO in celule si tesuturi.
Concluzia la care s-a ajuns a fost: nivelele cresute ale NO, si care nu au oscilatiile caracteristice
producerii normale, si care sint realizate in condi tiile activarii iNOS declanseaza evenimente
patogenice ce duc la boala.
Clarificari ulterioare au rezultat in urma izolarii nitrotirozinei din rinichiul rejetat si mai
tirziu prin formularea conceptului de stress nitro-sativ.
Astazi (2005) vorbim de stress nitrativ atunci cind se formeaza nitrotirozina sub actiunea
peroxinitritului si de stress nitrosativ in conditiile formarii de nitrozotioli prin actiune dioxidului si
trioxidului de azot.
Un rol central pare sa aiba anionul nitroxil, probabil o placa turnanta a tuturor speciilor
radicalare a azotului si a substantelor intracelulare cu care acestia reactioneaza.
Studiat de PAOLOCCI si colab. (2003) utilizind donorul ANGELLI Salt, nitroxilul prezinta
efecte inotrop pozitive si vasodilatatorii pe vene, in conditiile experimentului in vivo pe animal
constient, de unde posibila utili zare in tratamentul insuficientei cardiace. Deoarece acest radical liber
actioneaza prin eliberarea peptidului CGRP din nervii perivasculari, el se delimiteaza net de oxidul
nitric (din care provine prin reducere) atit la nivelul transductiei cit si in ceea ce priveste efectele sale
fiziologice sau rolul patogen.
Radicalii liberi de azot rezulta in cascada dupa reactia limitanta si fundamentala dintre
anionul superoxid si oxidul nitric, prin reactia oxidului nitric cu oxigenul sau prin reducerea oxidului
nitric si ei vor realiza ulterior in tesuturi reactii de oxidare, nitritare si nitrozilare determinind
activari sau inhibari enzimatice, initierea unor meca nisme de transductie cu posibilita- tea inducerii
apoptozei si chiar efecte functionale importante si modularea morfogenezei tesutului.
Radicalii liberi de azot (NO, NO-, NO2, N2O3, ONOO-) in exces sint inactivati prin mecanisme
specifice: micro si macrotiolii, denitrolaze sau prin formarea de aminoacizi modificati (nitrotirozina
sau nitrotriptofan).
50
Efectele biologice ale RLN in exces (stress nitrativ sau stress nitrosativ se realizeaza prin a)
alterari celulare cu eliberare de RLN, b) RLN sint generati in mediul extracelular si c) radicali liberi
ai azotului provenind din ambele surse (intra si respectiv extracelulara), actioneaza la o anumita
distanta asupra unei celule (sau tesut) neafectata de stressul nitrativ-nitrosativ.
In general se afirma ca radicalii liberi de azot si compusii ce-i inactiveaza/stocheaza prelungesc
viata oxidului ni tric eliberat din celula endoteliala spre celulele tesutului strabatut de microvase.
Nitrotirozina rezulta din reactia peroxinitritului cu tirozina, aminoacid implicat in multiple
mecanisme functionale. Datorita faptului ca peroxinitri tul a fost identificat ca principal radical liber
de azot ce realizeaza efecte oxidative in absenta oxigenului (J. STAMLER 1996), nitrotirozina a fost
initial considerata un marker de patologie, respectiv de a permite evidentierea imuno-histochimica a
stressului nitrosativ pe lame de tesut patologic si chiar evalularea indirecta a nivelelor de peroxinitrit
produs in cursul experimentelor functionale.
Nitrotirozina se poate forma si pe o cale comuna cu formarea de nitro zotioli (RSNO), care
pleaca de la NO, rezultind din reactia peroxinitritului cu cu bioxidul de carbon
Cresterea nivelelor radicalilor liberi ai azotului peste posibilitatile de inactivare sau
indepartare din organism adica din celule si mediul intern se numeste stress nitrativ-nitrosativ.
Stressul nitrativ-nitrosativ este in general consecutivadica succede in timp si cauzal stressului
oxidativ, fiind precedat aproape totdeauna de cresteri ale RLO care reactionind cu oxidul nitric vor
determina formarea in exces, peste posibilitatile de neutralizare ale organismu lui, de specii radica
lare de azot.
Studiata la inceputul anilor 90 de catre H. ISCHIROPOULOS, nitrotirozina a fost evidentiata
si extrasa din tesuturi de catre ANN McMILLAN-CROW in 1996 iar ulterior J. BECKMAN a
realizat primele cuanatificari biochi mice in produse biologice si evidentierea imunohistochimica pe
preparate de tesuturi supuse stressului nitrosativ.
Nitrotirozina a fost vazuta initial ca un “end product” al cascadei ra dicalare azotate (deci
prezentind reactivitate moleculara redusa in momentul fragmentarii proteinelor care o contin).
Studii recente (G. WALKER 1998 si I. HAULICA 2004) ca ea este, ca si nitrozotiolii un stoc
permanent de NO, din care acesta (sau NO-) este eliberat in conditiile stressului oxidativ realizat
experimental de oxigenul singlet si respectiv peroxidul de hidrogen. Nu poate fi exclusa posibilitatea
legarii de un receptor intracelular (proteasomal).
Rezultatele acestor experimente pun problema unei a treia surse de NO(alaturi de eNOS si
iNOS) si care este mult mai importanta functional datorita reactivitatii mari a com pusilor ce
reactioneaza in milisecunde (D. WINK si colab. 2003).
In acest fel pot fi inactivate cantitati relativ mari de RLO si aparute brusc in celula.
51
Deoarece aceste stocuri de radicali liberi de azot prezinta o relativa stabilitate moleculara s-a
pus problema relatiilor temporospatiale in tesutul in care ei se formeaza si acest aspect este valabil si
pentru nitrotirozina.
Cum principalele surse de NO sint celula endoteliala, macrofagul si neuronul iar declansarea
cascadei radicalare azotate este realizata de exce sul de NO, ne-am pus problema formarii (in
conditiile stresului nitrosativ) a nitrotirozinei si a rolului acesteiain modularea unor functii nervoase
somatice cum este durerea.
In conditiile stressului oxidativ in neuroni se formeaza cantitati mari de peroxinitrit care pot
determina nitritarea tirozinei.
RLO care ar putea determina un stress oxidativ puternic, extrem de nociv la nivel celular sint
permanent inacti vati de catre enzime (CAT, SOD) rezultind specii mai putin reactive; pe de alta
parte RLO,intrind in reactie cu RLN vor determina formarea de specii radicalare mai putin reactive
(de exemplu agresivitatea peroxinitritului este mai redusa ca a peroxidului de hidrogen) si acesti
compusi RLN+RLO au reactivitate din ce in ce mai redusa pina la nivelul ultim reprezentat de
nitrotirozina si nitrotriptofan.
Acesti ultimi produsi ai cascadei de frinare a reactivitatii ce pleaca de la superoxid si oxigen
singlet) pot fi si modalitati de stocare a NO (asemeni nitrozotiolilor) rea- lizind astfel o sursa
permanent disponibila pentru acest important reglator vascular in conditii de hipoxie si mai ales de
anoxie. De aici afirmatia pe care o fac WINK, MIRANDA si ESPEY : protectia fata de leziunea de
ischemie-reperfuzie se face prin a) preconditionarea ischemica realizata de ATP dar si b) prin
eliberare de oxid nitric si c) actiunea unor radicali liberi ai azotului (peroxinitrit).
Inactivarea RLN se face prin a) fixare de tioli (glutation, cisteina, homocisteina, N-
acetilcisteina si albumina care sint microtioli si de captopril si penicilamina care sint macrotioli); b)
fixarea temporara pe hemoglobine (flavo hemoglobine monomer numite si denitrolaze) care este un
mecanism antinitrosativ pe toata scara animala, de la bacterii la om, sau fixarea pe hemoglobine
induse in diverse celule cum ar fi macrofagele si c) eliminare din organism prin clearance-ul mediului
intern (depurarea renala si extrarenala) de nitriti si nitrati.
Problema pe care o pun radicalii liberi de azot si sistemele ce-i tamponeaza/stocheaza (inclusiv
nitrotirozina) este cum, unde si cind/cit timp actioneaza acestia sau cu alte cuvinte care este
semnificatia fiziologica si patologica a stressului nitrosativ.
Intr-un studiu recent GANDLEY (2002), arata implicarea stressului nitrativ si nitrosativ (cu
nitrotirozina ca marker de patologie) in patogenia preeclampsiei gravidice cu strinsele relatii dintre
oxidul nitric si sistemul renina-angiotensina. El citeaza studiul lui CHAPPELL si colab. publicat in
Lancet (1999) in care aparitia eclampsiei a fost prevenita prin intermediul administrari de acid
52
ascorbic indoza de 1000 mg/zi impreuna cu vitamina E 400 UI/zi; vitamina C a interactionat cu
nitrozotiolii eliberind NO din acestia pentru a pentru a combate reactivitatea vasculara crescuta de
RLN (peroxinitrit) in exces.
Intr-un studiu de referinta pentru cercetatorii in domeniu, AULAK si colab (2001) evidentiaza
prin proteomica functionala nitrarea a 50 de proteine din cele 1000 continute de celula A549. Aceasta
constituie neoplasmul pulmonar uman de tip adenocarcinom si, foarte interesant pentru subiectul
nostru, exprima iNOS ca raspuns la citokine(IL 1,TNF si IFN).
Analizind proteinele mitocondriale, ei gasesc ca tirozina nitritata la nitrotirozina apartine la
patru enzime anti-oxidante puternice: Mn SOD, catalaza, glutation-S-transferaza si anhidraza
carbonica III (RAISANEN si colab din1999). Se subliniaza faptul ca nitritarea reziduului tirozinic are
impact important asupra producerii de energie si pentru evolutia apoptozei in vivo.
In ALS (scleroza laterala amiotrofica) determinata de moartea progresiva a neuronilor motori
medulari, apare degenerescenta musculara si paralizia progresiva. Plecind de la ideea ca soarecii ce
poseda o SOD Cu/Zn mutanta nu dezvolta ALS decit in conditiile scaderii zincului si cresterii
anormale a cuprului. Se ajunge la generarea de superoxid, care , in conditiile unei generari scazute de
NO formeaza formeaza peroxinitrit (prin reactia biochimica cea mai rapi da din sistemele biologice).
Datorita faptului ca peroxinitri tul inactiveaza sistemele antioxidante celulare si activeaza caspazele
inneuronii motorii motori se ajunge la boala.
In ALS nitrotyrozina a fost gasita prin imunofluorescenta in astrocitele reactive la
peroxinitritul ce le modifica fenotipic. Astfel, prin stimularea astrocitelor din vecinata tea unor
neuroni apoptotici se initiaza moartea unor neu- roni din vecinatate.
Observam si in aceste teorii patogenice relatia de succesiune in timp dintre stressul oxidativ ce
precede stressul nitrativ-nitrosativ si acesta din urma succedind primului. De aici si remarca autorilor
ca, in loc sa induca apoptoza astrocitelor unii oxidanti induc acest fenotip proinflamator care conduce
la producerea de peroxinitrit in neuronii motori si acesta va activa apoptoza.
Din aceste studii de patogenie se degaja ideea ca stressul nitrativ nu poate fi inteles doar ca
fenomen biochimic intra sau extracelular ci este necesara evaluarea relatiilor intercelulare care se
stabilesc in timp si spatiu si de asemenea trebuie tinut cont si de controlul exercitat de factorii de
transcriptie din nucleu asupra echilibrului redox intracitoplasmatic.
Exista de mult timp incercari terapeutice in bolile degenerative ce au la baza combaterea
stressului nitrativ-nitrosativ.
Despre efectele terapeutice ale inhibitorilor de NOS 1 (nitric oxid sin taza constitutiva) vorbesc
H. ISCHIROPOU LOS si J. BECKMANN dar mai eficienta pare, pentru multi cercetatori, blocarea
NOS 2 (nitric oxid sintaza inducibila) din celulele gliale ale encefalului.
53
In scleroza multipla, placile caracteristice prezinta imunoreactivitate pentru NOS 2 si
nitrotirozina iar fenome nul de nitrare participa major la compromiterea barierei hematoencefalice.
Pe modele animale, acidul uric are efecte protectoare fata de scleroza multipla si atacul
ischemic indus experimental si reface permeabilitatea barierei hematoencefali- ce; actiunea sa nu este
insa de tip scavenger fata de peroxinitrit.
In ALS (scleroza laterala amiotrofica) blocarea NOS 2 si a activarii microgliale cu minociclina
are efecte neuroprotectoare ca de altfel si in modelele animale de boala PARKiNSON.
Una din cele mai spectaculoase terapii antinitrative o realizeaza H. ISCHIRO- POULOS,
profesor de biochimie si cercetator experimentat in stressul nitrativ si nitrosativ, dar si medic
pediatru la Childrens Hospital din Pennsilvania (USA).
Monitorizind evolutia displaziei bronhopulmonare la nou-nascut prin nivelele nitrotirozinei si
clortirozinei libere, el obtine o ameliorare importanta a acestei boli cu evolutie grava folosind (NO)
oxid nitric inhalat in concen tratia de 20-22 picomolar (ppm).
Pornind de la studii mai vechi, realizate de HAMA si SAGEN in 1994, care lansau ideea
refacerii NOS constitutive dupa transplantul de glanda suprarenala la nivel intratecal, s-a ajuns
(2002) la inhibitorii selectivi ai iNOS ca de exemplu aminoguanidina. Aceasta substanta, administra ta
oral sau aplicata pe celulele gliale retiniene stimulate prin hiperglicemie, a realizat scaderea activitatii
NOS si a nivelelor de nitrotirozina in celulele endoteliale asociate acestor celule. Aminoguanidina
inhiba de asemenea produsilor glicati in diabetul zaharat (BROWNLEE 1992).
Cunoscute ca antioxidante, acidul ascorbic, alfatocoferolul si flavono idele sint si scavengeri de
peroxinitrit.
Acest punct de atac asupra stressului nitrativ-nitrosativ in scopul prevenirii cronicizarii bolii
este propus (printre altii) de W. ERIKSEN in cervicalgie. Contractia prelungita a muschiului trapez si
vasoconstrictia determinata de stressul psihosocial sint bazele patogenice ale acestei boli.
Alterarea activitatii mitocondriale determina acumu larea peroxinitri tului care blocheaza
ireversibil lantul transportor de electroni; in mici zone musculare fenome nul duce la exacerbarea
durerii. Plecind de la aceasta patogenie se recomanda in scop terapeutic blocantii adrenergici sau
inhibi torii de NO-sintaza.
Procesele de remodelare a peretelui arterial sau venos intereseaza chirurgia vasculara.
Restenozarea postangioplastie, mai importanta dupa tratamentul cu stent comparativ cu tratamentul
prin dilatatie cu balon, are ca patogenie producerea de RLO in exces si apoi de RLN care nitreaza
proteinele. In acelasi timp se inregistreaza o scadere a activitatii SOD.
In aceste conditii LEITE F si colab (2004) propun administrarea de SOD cit si de vitamina C si
vitamina E sau de hipolipemiante cum este probucolul si analogii sai.
54
In final acesti chirurgi doresc o mai buna intelegere a fiziopatologiei echilibrului redox in
cursul refacerii vasculare.
Aceeasi dorinta o au si neurologii sau psihiatri confruntati cu evolutii grave ale bolii cit si
internistii pusi in situatia ineficientei intregului arsenal terapeutic de care dispun.
De aceea am putea gindi o evolutie ampla a nivelelor RLN si progresia stressului asociat
acestora in toate situatiile relativ refractare sau total refractare la tratament.
In ceea ce priveste un eventual rol fiziologic al stressului nitrativ-nitrosativ, este foarte dificil
(2005) sa concluzionam asupra finalitatii sale.
Ea este probabil legata de turnoverul (reinnoirea intracelulara) in cadrul tesutului, unii
cercetatori aratind strinsa relatie dintre factorii de crestere (cu rol protec tor), stressul nitrativ-
nitrosativ si fenomenul de apoptoza.
Datorita inaltei lor reactivitati dar si difuzibilitatii mari prin celule si tesuturi (celule si
substanta fundamen tala) RLN ar pute fi (alaturi de RLO) factori de stimulare a activitatii celulare in
cadrul tesutului ce realizeaza reactii functionale rapide (ca de exemplu vasodilatatia).
Sa fie platit pretul realizarii adaptarii importante pentru functie sau macroroga-nism prin
abandonarea si ulterior evacuarea celulelor ce au fost atit de utile si de solicitate in acel moment ?!
Dar la nivel celular exista multiple mecanisme care permanent catabo lizeaza proteinele
alterate prin nitritare.
Astfel HALLIWELL (2002) propaga ipoteza incarcarii neuronale (in bolile neurodegenerative)
cu proteine alterate de catre RLN in exces. Bloca rea proteazomului duce la cresterea stressului
oxidativ si nitrosativ. De aceea agentii care amplifica activitatea acestui component intracitoplasma tic
pot fi neuroprotectivi.
Ideea indepartarii radicalilor liberi de azot de pe proteinele pe care le modifica din punct de
vedere functional a aparut la F. MURAD si colab., prima lucrare fiind prezentata in 1998. Se vorbeste
de o denitraza a nitrotirozinei care reduce astfel toxicitatea peroxinitritului; ca localizare ea ar fi
prezenta in splina si pulmon iar activitatea ei a fost demonstrata asupra proteinelor plasmatice ce
contin nitrotirozina.
Datorita faptului ca nitrarea tirozinei compromite transductia pe calea tirozinkinazelor acesta
nitrotirozin-denitraza are efect important in reglarea celulara.
Acelasi grup din jurul laureatului premiului NOBEL acordat in 1998 (alaturi de R
FURCHGOTT si L IGNARRO) publica in 1999 posibilitatea redu cerii nonenzimatice a
nitrotirozinei la aminotirozina. Acest mecanism, depen dent de hem si tioli evolueaza la un pH
fiziologic si scade in conditii de acido za.
55
Reactia s-a produs sub actiunea substantei 2aminoetilN2amonioe tilaminodiazen1ium2diolat
care este astfel agent farmacologic, dar acelasi efect poate fi obtinut cu glutation sau cysteina.
In final, in loc de concluzii, va propun urmatoarea imagine schematica asupra stressului
nitrativ-nitrosativ.
Cresterea (brusca) a nivelului stimularii tisulare de catre multiplii mesa geri primari in
conditiile adaptarilor mari si foarte mari declansate de stressul psihosocial determina adaptarea
“tintei” respectiv hipertrofia tesutului.
RLO (in special anionul superoxid) reactionind cu RLN (NO) determina formarea de compusi
cu evolutie temporo spatiala bine definita, speciile radicalare actionind atit ca mesageri primari cit si
ca mesageri secunzi vor putea asigura atit amplitudinea mare a reactiei functionale solicitate cit si
sincronizarea “celulelor” ce alcatuiesc tesutul (mai ales la nivel de paren- chim) dar si in relatia
parenchim-stroma.
Ulterior, datorita amplificarii masei tisulare functionale (parenchim) si apoptozei mult mai
extinse se ajunge la necesitatea evacuarii, de catre macrofage, a unui numar mult mai mare de celule
care contin cantitati mult mai mari de proteine uzate.
Acest fenomen de tip inflamator ce este consecutiv (si care sprijina) activitatea tisulara intensa
are ca factori ce il mediaza radicalii liberi de azot iar ca marker (foot print) formarea nitrotirozinei
(NTY).
In tesuturi evolutia fenomenului poate fi pina la limita patologicului sau, datorita
imposibilitatii refacerii continue si intense a masei parenchimatoase functionale, se ajunge la boala
latenta si apoi la boala manifesta.
Dati un websearch si veti vedea molecula vedeta citata de 17000 ori!
P.S. Pe de alta parte sa nu uitam ca formarea si actiunile nitrotyro- zinei sint doar virful
aisbergului. Vorbim azi de stress oxidativ, nitrosativ, nitrativ, clorinativ (realizat de acidul hipocloros
in exces), carbonilic si metilativ.
Cateva dintre acestea se vor scrie la Iasi, la Institutul Regional de Oncologie unde Prof Eugen
Carsevici, prin proiectul TRANSCEND îşi propune sa descopere noi biomarkeri in patologia
tumorala şi degenerativă.
Moleculele proteice asa cum sunt prezentate in PDB sunt structuri statice si generice (cu
prezentarea doar a unor mutatii – modificari in structura primara si secundar in final tertiara) Ele
apoximeaza realitatea chimica oferind posibilitatea vietii moleculare proteice, prin prezenta miscarilor
de rotatie si vibratie.
Ele sunt (inclusiv biomarkerii tumorali) sunt structuri ce poseda receptori (situsuri de
modificare posttranslationala) care conditioneaza functia lor.
Asfel ca putem spune: molecula proteica poate fi receptor celular dar in acelasi timp poseda
receptori (situsuri) unde seproduc modificarile postranslationale ce le conditioneaza functia si
activitatea.
Markerii tumorali sunt reprezentaţi de un spectru larg de molecule produse sau induse de
activitatea celulelor tumorale, care reflectă proliferarea sau metabolismul acestora şi permit în acest
fel evaluarea prezenţei, evoluţiei, prognosticului tumorii maligne, recum şi răspunsul la tratament.
Este important să ştim ca markerii tumorali nu sunt specifici cancerului, în marea lor
majoritate aceştia fiind sintetizaţi şi eliberati in cantitati mici de catre celulele normale. De aceea,
specificitatea markerilor tumorali nu reyida în preyenţa acestora în tumorile maligne, ci în
concentratia în care sunt detectaţi.
Exista multiple afecţiuni benigne ce pot determina creşterea niveluleui seric al markerilor
tumorali şi crea dificultaţi în interpretarea rezultatelor.
Moleculele proteice ce pot fi considerate biomarkeri tumorali sunt foarte variate din punct de
vedere al structurii si funcţiei aici incluzîndu+se enzyme, hormone, imunoglobuline, receptori celulari,
antigene oncofetale, proteine placentare, antigene de proliferare şi diferenţiere, cabohidrati proteine.
57
celulară, vascularizaţia tumorală, numărul şi localizarea nodulilor tumorali, timpul de înjumătăţire
plasmatică. Specificitatea markerilor tumorali depinde de: catabolismul şi excereţia factorilor
tumorali şi de leziunile tisulare care produc biomarkeri tumorali.
În acest articol dorim sa asociem biomarkerii tumorali proteomici si genomici la formele
clinice, imagistice şi histopatologice ale cancerelor.
De aceea vom descrie mai intai forma de cancer asa cum apare ea la bolnav dupa care vom
personaliza diagnosticul si tratamentul dupa rezultatele evaluarilor biomarkerilor moleculari.
Markerii tumorali sunt proteine endogene sau metaboliți ale căror cantități sau modificări sunt
Ele sunt prezente în țesuturile tumorale sau fluide ale corpului si cuprind o mare varietate de
molecule, inclusiv factori de transcripție, receptorii de suprafață celulară și proteinele secretate. markeri
tumorali eficiente sunt în mare a cererii, deoarece acestea au potențialul de a reduce ratele de mortalitate de
cancer prin facilitarea diagnosticul de cancer la stadiile timpurii și ajutând la individualiza tratamente. Pe
parcursul ultimului deceniu, o mai bună înțelegere a carcinogeneza si progresia tumorii a scos la iveală un
număr mare de markeri tumorali potențiali. Este prezis că, chiar și mai mult vor fi descoperite în viitorul
spectrometrie de masă.
dezvoltare pentru mulți markeri tumorali este in prezent in curs de desfasurare. C & D Systems are o gamă
largă de reactivi de cercetare pentru utilizare în fiecare etapă a procesului de dezvoltare marker tumoral.
Aceste produse includ o mare colecție de proteine recombinante, anticorpi și kituri de proteine de cuantificare
59
CCR7 OXGR1/GPR80/P2Y15
CCR9 p15INK4b/CDKN2B
CD7 p16INK4a/CDKN2A
CD24 p18INK4c/CDKN2C
CD31/PECAM-1 p21/CIP1/CDKN1A
CD38 p27/Kip1
CD44 p53
CD63 p130Cas
CD74 P2X5/P2RX5
CD96 PAUF/ZG16B
CD98 PDCD4
CD109 PDCD5
CDC73 PDGF R beta
CDX2 PDZD2
CEACAM-4 Peptidase Inhibitor 16/PI16
CEACAM-5/CD66e PGCP
CEACAM-6/CD66c PIWIL2
CEACAM-7 PKM2
CEACAM-8/CD66b PLRP1
CHD1L PRMT1
Cholecystokinin-B R/CCKBR Profilin 1
Chorionic Gonadotropin alpha Chain (alpha HCG) Prolactin
Chorionic Gonadotropin alpha/beta (HCG) PSCA
CKAP4/p63 PSMA/FOLH1/NAALADase I
Claudin-18 PSMA1
Coactosin-like Protein 1/CotL1 PSMA2
COMMD1 PSMB7
Cornulin PSP94/MSMB
Cortactin PTEN
CRISP-3 Prostaglandin E Synthase 2/PTGES2
CTCF PTH1R/PTHR1
CXCL17/VCC-1 PTK7/CCK4
CXCR4 Rab25
Cyclin D2 RARRES1
60
CYLD RARRES3
Cytokeratin 18 Reg4
DC-LAMP Ret
DCBLD2/ESDN RNF2
DMBT1 RNF43
DNMT1 S100A1
DPPA2 S100A2
DPPA4 S100A4
E6 S100A6
ECM-1 S100A7
EGF S100A16
EGF R/ErbB1 S100B
ELF3 S100P
EMMPRIN/CD147 SCF R/c-kit
EMP2 SCUBE3
Endosialin/CD248 Secretin R
EpCAM/TROP1 Serpin A9/Centerin
ErbB3/Her3 Serpin E1/PAI-1
ErbB4/Her4 Serum Amyloid A4
ERK1 SEZ6L
Ets-1 Skp2
Ezrin SLC16A3
Fascin SLC5A5
FATP3 SMAGP
FGF acidic SOCS-1
FGF basic SOCS-2
FGF R3 SOCS-6
Fibroblast Activation Protein alpha/FAP Soggy-1/DkkL1
FOLR1 SOX2
FOLR2 SOX11
FOLR3 SPINK1
FOLR4 Src
FosB/G0S3 STEAP1
FoxO3 STYK1
61
FXYD5/Dysadherin Survivin
Galectin-3 Syndecan-1/CD138
Gastrin-releasing Peptide R/GRPR Syntaxin 4
Gastrokine 1 Synuclein-gamma
gamma-Glutamylcyclotransferase/CRF21 t-Plasminogen Activator/tPA
Glypican 3 Tankyrase 1
Golgi Glycoprotein 1/GLG1 TCL1A
gp96/HSP90B1 TCL1B
GPR10 TEM7/PLXDC1
GPR18 TEM8/ANTXR1
GPR31 TGF-beta 1
GPR110 TGF-beta 1, 2, 3
GRP78/HSPA5 TGF-beta 1/1.2
HE4/WFDC2 TGF-beta 2/1.2
Heparanase/HPSE TGF-beta RI/ALK-5
Hepsin THRSP
HGF R/c-MET Thymosin beta 4
HIN-1/SCGB3A1 Thymosin beta 10
Hyaluronidase 1/HYAL1 TIMP Assay Kits
IGF-I TIMP-1
IGF-I R TIMP-2
IGF-II TIMP-3
IGFBP-3 TIMP-4
IGFL-3 TLE1
IL-6 TLE2
ING1 TM4SF1
ITM2C TMEFF2/Tomoregulin-2
JunB TMEM219
JunD TNF-alpha/TNFSF1A
Kallikrein 2 TopBP1
Kallikrein 6/Neurosin TRA-1-85/CD147
KiSS1R/GPR54 TRAF-4
KLF10 Transgelin/TAGLN
KLF17 TSPAN1
62
L1CAM beta-III Tubulin
LEF1 u-Plasminogen Activator/Urokinase
Leptin/OB UBE2S
LIN-28A uPAR
LIN-28B Urotensin-II R
LKB1 VCAM-1/CD106
LPAR3/LPA3/EDG-7 VEGF
LRMP VEGF/PlGF Heterodimer
LRP-1B VSIG1
LRRC4 VSIG3
LRRC3B ZAG
LRRN1/NLRR-1 ZAP70
Related Information
Adhesion Molecules
BDGI/OKL38: A New Breast Cancer Target
BIObrief: Microenvironmental Regulation of Tumor Growth & Metastasis (PDF 3MB)
New Tools: Human Tissue Kallikrein Products
p27/Kip1 IHC Detection Kit
Technical Note: R&D Systems Cell Selection Kits for Cancer-associated Cells
TSLP, Inflammation, & Cancer
63
Testarea activitatii vasoactive endoteliu mediate s-a facut pentru serumalbumina nitrata si
agregata subactiunea peroxinitritului, angiotensina II nitrata si/sau agregata si insulina modificata de
asemenea postrranslational sub actiunea peroxinitritului; ele au fost procurate in forma
nativa.Peroxinitritul a fost sinetizat din nitrit de sodiu si peroxid de hidrogen dupa metoda
KOPPENOL. Nitrarea s-a facut in anumite proportii de proteina si peroxinitrit dupa metoda
BECKMANN.
Pe modelul experimental de presiune arteriala singerinda de sobolan utilizand dispozitivul de
monitorizate Digital Electro Manometer (Marty) proteinele modificate posttranslational au fost
injectate in vena jugulara.
In acest fel traiectul substantei a inclus si cordul dar substanta a fost biodisponibila la nivel
arterial si mai ales arteriolar.
Toate cele trei proteine modificate au determinat vasodilatatie arteriala urmata de scaderea
presiunii arteriale minime si medii, fenomen mediat de endoteliu.
In baia de organ s-a obtinut avcelasi efect de relaxare ce conditioneaza vasodilatatia si scaderea
presionala; acest efct a fost blocat de denudarea (inlaturarea) endoteliului pe inele de aorte de sobolan
in baia de organ termostatata si cu ser Krebs.
Efectul vasodilatator poate explica crestrea presionala compensatorie ce poate fi explicata prin
crestrerea compensatorie adaptativa de durata a activitatii sistemului nervos vegetativ simpatic (
cardioaccelerator xsi vasoconstrictor) explicand debutul Hipertensiunii Arteriale Esentiale.
Este necesara o colrelare a concentratiei substantei adminstrate cu nivelele din plasma
bolnavului si o evaluare corespunzatoare a rectivitatii vasculare a animalului comparativ cu cea
umana.
In conmcluzie biomarkerii de stress nitrooxidativ au efecte biologice proprii, relativ nespecifice
ce pot fi legate de patogenia bolii ceea ce ne face sa afirmam ca biomarkerul este un factor activ in
calea de transductie de la nivel endotelial.
64
2) Recoltare proba si nitrarea serului cu peroxinitrit (UMF Iasi)
3) Reluarea testului serologic cu ser nitrat; daca este negativ se face=
4) Din acelasi ser electroforeza bidimensionala SDS PAGE. Pentru diagnostic de
imunoglobulina nitrata;
5) Daca nu se obtine test negativ se repeta nitrarea probei la Iasi
6) Testare pe aglutinarea anticorpilor cu antigen fungic sau bacterian;
Daca se obtine negativ s-a confirmat alterarea legarii anticorpului de antigen test (bacterian
sau fungic).
Scaderea raspunsului imun in baceteriemii si septicemii este un fapt evident. Mai dificil este sa
gasim un mecansim prin care imunitatea specifica celulara sau umorala poate fi afectata incat sa
diminue sau blocheze raspunsul imun.
De asemenea eforturile terapeutice in sepsis sunt grevate de aparitia colapsului si evolutia catre
soc ireversibil cu toata refacerea volemica si medicatia vasoactiva.
Nitrare la tirozina este un fenomen de tip modificare psttranslationala ce evidentiaza prezentra
si intensitatea stressului biochimic de tip nitrooxidativ. Aparitia nitrotirozinei este determinata de
65
fluxurile de peroxinitrit rezultat din reactia anionului superoxid cu gazul oxid nitric din endoteliu,
macrofag si neuron.
Mai intai am studiat fenomenul in silico respectiv obtinearea moleculei de IgG si IgM din baza
de date SWISS PROT si analiza (cu un software de tip pattern matching) a zonei varabile a
anticorpului. S-au identificat doua situsuri de nitrare adica 2 regiuni de tip motif cu lungimea de 10
aminoacizi cu tirozina in mijloc.
Printr-o metoda de tip ELISA s-a testat ipoteza modficarii structurii tetiare prin nitrare la
pacienti pozitivi serologic fata de fungul ( ) prezent in sepsis. Dupa nitrare reactia pozitiva se
transforma in negativa prin diminuarea importanta a reactiei ligandului imunoglobulina G si M
datorita modificarii conformationale prin nitrare.
Al treilea studiu consta in preluarea serului cu separarea cromatografica a imunoglobulinelor
si studiul spectrometric de masa a acestora. In acest stadiu s-au evidentiat modificari ale masei ce
corespund peptidelor rezultate in urma digestiei enzimatice si care au fost nitrate conform predictiei
din studiul in silico.
In ultimul studiu s-au injectat anticorpii modificati posttranslational prin nitrare la tirozina in
anumite concentratii intravenos jugular pe sobolani WISTAR cu monitorizarea presiunii arteriale
prinmetoda directa; ulterior s-au adminstyrtat anticorpi modificati si pe modelul de carotida
perfuzxata de iepure pe cale endo si exoluminala pentru evidentierea modificariilor determinate de
interactiunea imunoglobulinelor nitrate asupra endoteliului vascular arterial; studiul
imunoglobulinelor nitrate s-a finalizat prin adminstrarea lor in baia de organ pe preparat de inel de
aorta de sobolan cu si fara endoteliu (dezendotelizare mecanica si chimica cu Levo-NAME).
Rezultatele indica rolul vasodilatator al imunoglobulinelor nitrate la tirozina.
Studiile noastre explica scaderea raspunsului imun si colapsul din sepsis prin modificarea de
catre radicalii liberi de oxigen si azot, in special peroxinitrit (acidul peroxinitrios) a efectorilor
umorali respectiv imunoglobuline Ig G si Ig M.
Corelatul terapeutic al acestor studii este necesitatea folosirii antioxidantelor, a scavengerilor
de peroxinitrit sau a peptidelor (inclusiv insulina) in terapeutica sepsisului pentru a combate eficient
fenomenul de nitrare si in acest fel a prezerva activitatea anticorpiulor si a combate stimularea
endoteliala ce duce la colaps.
66
32). Fitoterapia, dietoterapia si vaccinarea in refacerea competentei imune antitumorale =
IMUNOTERAPIA RESTAURATIVA A CANCERULUI
Multiplicarea celulară anormală în mod localizat sau populînd diferite regiuni ale organismului este
însoţită de deprimarea (supresarea sau blocarea) sistemului imun.
Refacerea reactivitatii sistemului imun (mai ales apărarea specifică) presupune stimularea prin
antigene tumorale plus refacerea căilor de transducţie din limfocitele T şi B la care se adaugă o bună
transmitere prin mesagerii primari.
Prof I Chiricuţă este printre putinii care ţine cont de raspunsul imun in vindecarea cancerului;
in Tratatul sau de Oncologie el mentionează in 1986 tehnici de evaluare a raspunsului imun in cursul
tratamentelor imunostimulante din cancer.
Vom descrie un remediu original si dieta asociată lui, numit Immunofitron TM.
Avind la baza extracte de plante, mai ales resveratrol si proantocianozide are cu componentele
dietei efect dovedit si foarte amplu de tip antioxidant. Remediul si dieta realizeaza impreuna cu
examinarea periodica si urmarirea biomarkerilor tumorali si ai sistemului imun, sistemul terapeutic
Immunofitron.
67
In acest sistem terapeutic principalul rol al dietei este de a realiza impreuna cu remediul
fitoterapeutic o refacere ortomoleculară (a structurii proteinei la nivel tertiar sau cuaternar) si
aceasta pe toata lungimea lanţului de transmitere a informaţiei (transducţie) din sistemul imun. De
asemenea se gandeste si refacerea structurii mesagerilor primari implicati in raspunsul imun
(interleukine – citokine). Se suplimenteaza dieta cu Vitamina C si se adauga în unele forme de boala
cel de al III lea element si anume vaccinul antitumoral realizat din antigene tumorale. Acesta are rol
stimulant al sistemului imun.
MONITORIZARE BIOAMRKERULUI
TUMORAL SI A REACTIEI IMUNE IN
CANCER
REACTIA SISTEMULUI
APARITIA SI IMU
DEZVOLTAREA Nv
CORECTAREA PARARII
NESPECIFICE SI A
TUMORI - RASPUNSULUI IMUN
I
metastazazare V
V PARAMETRII REACTIVITATII
IMUNE UMORALE SI CELULARE
V
Antigeni biomarkeri Factori mediu intern (ex
TUMORALI glicemia)
V
Factor mediu extern (ex toxine
bacterii,
radiatii) V
Proteina modificata
posttranslational
(EPIGENETICA )
Viziunea holistică asupra bolii ne permite integrarea celor 3 elemente: dieta, remediul
fitoterapeutic şi vaccinul.
E mai bine sa folosim biomarkeri ai sistemului imun de tip proteomic datorita modificarilor
postranslationale ce pot apare si au rol negativ. Şi mai mult aceste apar functie de micromediul in
care se gasesc proteinele si peptidele respective. El depinde de fractori homeostatici interni dar si de
conţinutul apei solului si alimentelor introdude permanent in organism; trebuie spus ca modificarile
68
produse in microenviromement sunty discrete si se manifesta tirziu. Acest micromediu este corectat
prin medicina ortomoleculara cu molecule mici numite osmolite dar si altele (antineoplastoni).
Aceste terapii speculeaza faptul ca toate cancerele au trasaturi moleculare proteomice diferite
inclusiv de suprafata celulara care sunt recunoscute ca antigene de sistemul imun; aceste molecule
numite antigene tumorale sunt de origine proteica dar si carbohidrati. Imunoterapia clasica insemna
stimularea sistemului imun in sensul ca acesta sa atace celulele tumorale care vor fi dirijate (targetate)
de antigenele tumorale.
In timp au fost propuse si s-au dezvoltat idei experimentale si clinice privind reactia sistemului
imun fata de tumori.
69
Limfocitele B se pot studia prin electroforeza proteinelor srice, imunelectroforeza (IgG, IgM, IgA, IgE
și IgD), dozarea izoalglutininelor, viscozitatea sanguina și VSH,
Explorarea sistemului imun in cancer a fost preluata din Tratatul de Oncologie din 1988 a
Prof. I. Chiricuta de la Institutul Oncologic Cluj.
Testul de blastogeneză limfocitară la PHA, Con A, PWM și în cultura limfocitară mixtă = MLC.
70
Evaluarea complementemiei (CH50),
Moleculele native din celula canceroasă nu stimulează celulele dendritice (nu sunt danger
signals) iar unele din proteinele nitrate (și agregate) la tyrozina stimuleaza celulele dendritice
determinind raspuns imun și formarea organelor limfoide tertiare - neolimfogeneză.
Din această perspectivă imunoterapia restaurativă a cancerului face parte din componenta de
terapie patogenică eludind etiologia (cuplajul dietei cu fitoterapia asigura o refacere multițintită a
conformației moleculare alterate in cancer datorita excesului de peroxinitrit rezultat din interactiunea
tumora-gazdă. Proteinele rezultate din necroza tumorala, modificate posttranslational prin nitrare
acționează ca antigene solubile realizînd o stimulare nespecifică a celulelor dendritice. Ele pot fi un
71
adjuvant imunologic endogen atunci cind predomina agregarea proteica prezentind antigenele
tumorale sistemului imun.
Transferul informatiei imune de tip antigenic se face în ganglionii limfatici sau în periferie la
locul țesutului agresat informational prin microorganism sau bacterie în context hemodinamic
limfatic.
De aceea noi considerăm că un răspuns eficient în cancer se poate produce numai după
stimularea celulelor dendritice de catre proteinele proprii transformate în neoantigene (proteine
nitrate și agregate) cu formarea de organe limfoide terțiare de neoformație.
Explicația fenomenului constă în faptul că celulele tumorale metastatice intacte (vii) inhibă
răspunsurile imune.
De fapt există un factor protector tumoral nespecific ce constă într-o peliculă de fibrinogen și
serumalbumină agregate (și nitrate) ce acoperă celulele tumorale și un factor specific reprezentat de
anticorpii blocanți și de complexele imune.
Putem să gîndim la o imunizare profilactică mai ales cînd bolnavul are recidive tumorale.
72
Restaurarea imunocompetenței față de cancer implică numaidecît administrarea dietei și a
suplimentelor alimentare ortomoleculare ce se adaugă imunomodulării prin proteine nitrate și
agregate în cancer.
In multe reviste medicale importante imunoterapia cancerului este în principal vaccinare, făra
a se evalua starea sistemului imun in detaliul celular şi molecular şi acţionînd pe secţiuni ale
raspunsului imun fără a ţine cont de ansamblu respectiv cale aferenta, centrul germinal şi calea
eferenta.
De asemenea fenomene destul de obscure cum este raspunsul de tip aparare anticanceroasa
prin formarea de microganglioni intratumorali, asa numita neolimfogeneză ce generează organe
limfoide asemnatoare cu cele tertiare din tubul digestiv sau bronşii sunt putin studiiate sau folosite –
declanșate in imunoterapia cancerului.
Mascarea antigenelor tumorale prin fibrina şi fibrinogen agregate sub acţiunea peroxinitritului
la suprafata celulelor tumorale blochează un raspuns imun eficient; aceste antgene trebuie
“demascate” sau blocat peroxinitritul care autointretine reactia.
Am găsit un studiu mai vechi în care serul bolnavilor vindecaţi de tumora esofagiană avea efect
terapeutic cînd a fost administrat la bolnavi cu acesta forma de cancer.
Sunt foarte multe verigi moleculare afectate si de aceea noi dorim o reparare a acestora în
spiritul medicinii ortomoleculare care nu este agonistica ci multitargetata pe ţinte (asemănătoare
receptorilor celular) dar din interiorul moleculei asa numitele situsuri (ex de nitrare, fosforilare,
oxidare).
73
În acest fel părăsim viziunea sistemica fiziologică a intregului organism total inadecvata
dezvoltarii cancerului. De asemenea coboram sub nivelul celular unde cancerul este inteles putin
(recent celulele stem canceroase au luminat scena) şi ajungem la nivelul molecular care înseamna şi
gena şi proteina modificata postranslational.
Antigenele tumorale sunt şi ţinta sistemului imun dar şi biomarkeri functionali depaşind ca
valoare diagnostică şi terapeutică oncogenele; este acoperita si diversitatea genica în polulații umane
dar mai ales factorii de mediu intern si cei externi aczaţí de malignizare adeseori dar care pot
modifică şi raspunsul imun.
Imunoterapia cancerului s-a dezvoltat prin cercetarile din domeniul imunologiei si oncologiei
din ultimele decenii. Imunoterapia a inceput in 1796 cind Edward Jenner a produs primul vaccin.
Spre sfirsitul secolului 19 Emil von Behring si Shibashabo Kitasato au descoperit ca dupa injectarea
animalelor cu toxina difterica s-au generat in serul sanguin al lor antitoxine. Ulterior cercetarile lui
Paul Ehrlich a dus la conceptul de glonț magic; utilizarea anticorpilor pentru a tinti boala.
Productia de anticorpi monoclonali puri pentru utilizare terapeutica a fost oferita in 1975 de
catre Georges J F Kohler si Cesar Milstein prin tehnologia hibridomului iar in 1997 s-a produs
Rituximab, primul tratament pentru cancer a fost aprobat de FDA pentru tratamentul limfomului
folicular.
O reactie inflamatorie pare sa fie elementul principal pentru declansarea raspunsului imun
împotriva cancerului. Totuși în multe situații multiplicarea anormala nu este insotita de inflamatie.
74
Noi ne propunem sa evaluam remediile fitoterapeutice si dieta adminstrata prin evaluari
dinamice nu atat ale markerilor tumorali cât modificarea testelor de imunitate generala si
antitumorală.
Avem un exemplu de astfel de terapie este Provenge a firmei Dendreon utilizată în tratamentul
cancerului de prostată.
Terapia cu anticorpi este cea mai de succes forma a imunoterapiei, cu multe produse
farmaceutice aprobate pentru o varietate de forme de cancer.
Anticorpii sunt proteine produse de sistemul imun care se leaga de un antigen tinta de pe
suprafata celulei. In conditii fiziologice anticorpii sunt utilizati de sistemul imun pentru a lupta cu
agentii patogeni. Fiecare anticorp este specific pentru una si cele ce se leaga de antigenele cancerului
sunt utilizati ca tratamente antitumorale.
Odata fixat de antigenul tumoral anticorpii pot induce citotoxicitate celular mediata anticorp
dependenta, se produce activarea sistemului complement, poate bloca interactiunea unui receptor cu
un ligand sau sa elibereze chemoterapicul sau sursa de iradiere. Toate aceste fenomene determina
moartea celulara.
Receptorii celulari de suprafaţă din celulele tumorale sunt ţintele comune pentru terapiile cu
anticorpi inclusiv receptorul pentru factorul epidermic de creştere şi receptorul HER 2.
Interferonul alfa este utilizat in leucemia cu celule paroase, in sarcomul Kaposi din Aids,
limfomul folicular, leucemia mieloida cronica si melanomul malign. Interleukina 2 este utilizata in
tratamentul melanomului malign si a carcinomului renal.
75
Terapia adoptiva cu celule T realizeaza o imunizare pasiva prin transfuzia de limfocite T.
Acestea se gasesc in singe si tesuturi si sunt activate de microorganismele patogene.
Imunoterapia cancerului s-a dezvoltat prin cercetarile din domeniul imunologiei si oncologiei
din ultimele decenii. Imunoterapia a inceput in 1796 cind Edward Jenner a produs primul vaccin.
Spre sfirsitul secolului 19 Emil von Behring si Shibashabo Kitasato au descoperit ca dupa injectarea
animalelor cu toxina difterica s-au generat in serul sanguin al lor antitoxine. Ulterior cercetarile lui
Paul Ehrlich a dus la conceptul de glonț magic; utilizarea anticorpilor pentru a tinti boala.
Productia de anticorpi monoclonali puri pentru utilizare terapeutica a fost oferita in 1975 de
catre Georges J F Kohler si Cesar Milstein prin tehnologia hibridomului iar in 1997 s-a produs
Rituximab, primul tratament pentru cancer a fost aprobat de FDA pentru tratamentul limfomului
folicular.
O reactie inflamatorie pare sa fie elementul principal pentru declansarea raspunsului imun
împotriva cancerului. Totuși în multe situații multiplicarea anormala nu este insotita de inflamatie.
76
Avem un exemplu de astfel de terapie este Provenge a firmei Dendreon utilizată în tratamentul
cancerului de prostată.
77
Terapia cu anticorpi este cea mai de succes forma a imunoterapiei, cu multe produse
farmaceutice aprobate pentru o varietate de forme de cancer.
Anticorpii sunt proteine produse de sistemul imun care se leaga de un antigen tinta de pe
suprafata celulei. In conditii fiziologice anticorpii sunt utilizati de sistemul imun pentru a lupta cu
agentii patogeni. Fiecare anticorp este specific pentru una si cele ce se leaga de antigenele cancerului
sunt utilizati ca tratamente antitumorale.
Odata fixat de antigenul tumoral anticorpii pot induce citotoxicitate celular mediata anticorp
dependenta, se produce activarea sistemului complement, poate bloca interactiunea unui receptor cu
un ligand sau sa elibereze chemoterapicul sau sursa de iradiere. Toate aceste fenomene determina
moartea celulara.
Receptorii celulari de suprafaţă din celulele tumorale sunt ţintele comune pentru terapiile cu
anticorpi inclusiv receptorul pentru factorul epidermic de creştere şi receptorul HER 2.
Interferonul alfa este utilizat in leucemia cu celule paroase, in sarcomul Kaposi din Aids,
limfomul folicular, leucemia mieloida cronica si melanomul malign. Interleukina 2 este utilizata in
tratamentul melanomului malign si a carcinomului renal.
Hiperstimularea imună inclusiv in cancer pe componente scazute sau blocate nu poate avea
efect; e nevoie de refacerea responsivitatii imune.
In aceste situatii este vorba de o imunoterapie pasiva asemnatoare tratarii bolilor infectiose
cum este tetanosul cu ser obtinut de la animale imunizate împotriva bacteriei respective.
Din punctul de vedere expus mai sus tratamentul propus de noi inseamna refacerea integritatii
functionale a intregului sistem imun prin repararea ortomoleculara. Ulterior se poate adauga sau nu
un vaccin antitumoral care sa stimuleze suplimentar sistemul imun.
La aceste tratamente se adauga extractele din organisme vii mai ales din regnul vegetal.
78
Plantele, ciupercile si bacteriile la care se adauga organismele marine sunt surse potentiale de
remedii si medicamente anticancer. S-au extras din plante si bacterii anthraciclinele, taxanii si
alcaliozii vinca. Acestea interfereaza sinteza ADN ului si de aceea sunt numite medicamente citotoxice.
Pe linga cele de mai sus se cunosc produsi naturali care stimulează sistemul imun și de aceea pot fi
utilizate in tratamentul cancerului. [79]
Unii compuși din ciupercile medicinale, în primul rînd compuși polizaharidici pot up-regla
sistemul imun și au proprietăți anticanceroase.
Beta-glucanii, cum este lentinanul sunt cunoscuți ca modificatori ai raspunsului biologic, iar
abilitatea lor de a activa sistemul imun este bine documentata. Acesti compuși stimulează specific
componenta innascuta a sistemului imun. Cercetarile au arătat că beta-glucanii stimulează
macrofagele, celulele NK si celulele T si cresc citokinele.
Mecanismul prin care se realizeaza actiunea stimulatorie a beta glucanilor este doar parțial
cunoscută.
Un mecanism prin care beta-glucani, de a activa sistemul imun se realizează prin interactiunea
cu antigenul macrofagic 1 (CD18) de pe membrana celulelor imune.
Ciuperca Agaricus subrufescens (adesea greșit numită Agaricus blazei), Lentinula edodes
(ciuperca Shiitake) Grifola frondosa și Hericium erinaceus sunt fungi producatori de beta-glucani și
au fost testate pentru potentialul lor antitumoral.
Tinctura de resveratrol este un produs natural care scade formarea trombusului de fibrina,
scade riscul de trombogeneza. Intareste vasele de singe scazind riscul hemoragiilor. Are o puternica
actiune antiaterosclerotica. Extractul de seminţe si coaja de struguri inhibă funcţia plachetara si
răspunsul inflamator dependent de plachetele sanguine, sugerând proprietati benefice antitrombotice
şi antiinflamatorii. Resveratrolul reduce simptomele insuficienţei venoase cronice (oboseală, senzaţía
de greutate sau durere in membrul respectiv). Îmbunatateste circulaţia sanguină prin consolidarea
capilarelor, arterelor şi venelor. Extractul din seminţe de struguri reduce riscul afecţiunilor
cardiovasculare, mai ales prin îmbunătăţirea funcţiei endoteliale şi scaderea oxidării LDL.
79
Resveratrolul din struguri protejeaza materialul genetic (ADN) ferindu-l de mutatii, activeaza
si stimuleaza familia de gene SIRT 1 – gena longevitatii – cu effect benefic asupra calitatii si duratei
vietii. Reduce semnele externe de imbatranire si ajuta organismul la combaterea “din interior” a
procesului de imbatranire celulara. Efect protective fata de boala Alzheimer si alte boli
neurodegenerative, preintimpina ridarea si imbatranirea pielii, mentinindu-I elesticitatea si
fermitatea. Efectul antioxidant consta in neutralizarea cu pina la 50 % din radicalii liberi (poluare,
fumat, stress). Reduce stressful oxidative cu 182 % incetinind astfel procesul de imbatranire celulara.
Creste capacitatea antioxidanta a pielii cu pina la 89 %. Scade nivelul sanguine al colesterolului total
(LDL) si al trigliceridelor. Resveratrolul este vasodilatator arterial si are effect antitrombotic. El se
opune espansiunii fibroase a cicatricei post infarct si reduce markerii cu risc aterogen.
Eficacitatea sa a fost demonstrate prin studii clinice. Efectele vizibile dupa 60 administrare
sunt: reducerea profunzimii ridurilor cu pina la 39 %, cresterea luminozitatii pielii cu pina la 88 %
cresterea gradului de hidratare a pielii cu pina la 79 %, crestrea elesticitati pielii cu pina la 43 5 si
crestrea catifelarii pielii cu pina la 19 %. Efectele la nivelul intern dupa 6 luni de tratament sunt:
scaderea stressului oxidative cu 182 %, scaderea nivelului sanguine al colesterolului LDL si
trigliceridelor , reducerea markerilor tumorali su cu risc aterogen, cresterea elasticitatii endoteliului
vascular si protectie antiaterosclerotica si fata de bolile neurodegenerative. Preparatul nu are efecte
secundare adverse si nu realizeaza interactiuni medicamentoase nefavorabile.
Strugurele este recunoscut pentru actiunea sa antioxidanta; compusii bioactivi din boabele de
struguri neutralizeaza radicalii liberi ce pot ataca membranele celulare; se impiedica oxidarea LDL
(care contine colesterolul rau). Resveratrolul din struguri stimuleaza sinteza de oxid nitric cu
proprietati vasodilatatoare. Regleaza tranzitul intestinal. Reduce absorbtia grasimilor. Reduce nivelul
de cholesterol. Ajuta la mentibnerea greutatii. Stimuleaza dezvoltarea bifidobacteriilor endogene
intarind sistemul imunitar.
Frunzele de menta au un efect calmant si antispastic. Uleiul de menta s-a dovedit eficient
pentru ameliorarea spasmelor de la nivelul tractului digestiv. Aplicat direct pe piele uleiul de menta
are capacitatea de a incalzi zona cu care vine in contact, ameliorand in acest fel senzatiile dureroase.
Sunatoarea se foloseste cu succes in toate bolile de stomac, ulcer gastric, colite cronice, diaree,
boli de ficat, deoarece influenteaza in bine stările inflamatorii si stimuleaza secretiile unor glande
importante ale organismului.
In bolile ficatului, salvia mareste secretia bilei. Inflamatiile gastrointestinale urmate de
flatulenta (balonari) sunt influentate in bine de această plantă. Are efct benefic în diabetul zaharat,
menstruatii neregulate, circulație defectuoasa a sangelui, stari de nervozitate.
80
Resveratrolul (3,4’,5 tri-hydroxystilbene) este o fitoalexină din plante generată in cantitati
mari in pielita de sttruguri ca raspuns la stress de tip radiatie ultravioleta, tratamente fitosanitare si
de cele mai multe ori dupa infectarea strugurilor cu Bothrytis cinerea . In aceasta situatie sinteza
resveratrolului creste si el inhiba proliferarea bacteriei actionand astefel ca un antifungic. Desi pare o
descoperire de ultima ora, aceasta substanta a fost identificata inca din anul 1939, de catre un chimist
japonez, M. Takaoka, intr-o planta cu efecte medicinale foarte puternice, dar si destul de toxica, care
creste si la noi, numita Strigoaie (Veratrum album). Multa vreme aceasta substanta nu a fost luata in
seama, pana cand s-a descoperit ca este continuta in cantitati destul de mari in strugurii rosii si,
important, in vinul rosu.
Resveratrolul se găseşte în general în fructele de culoare indigo-vişiniu spre negru, dar si în
dude negre, cireşe negre, struguri negri, sâmburii de struguri negri (dar şi albi), mure negre,
corcoduşe negre, coacăze negre, prune închise la culoare, afinele, varza roşie, ceapa roşie, mere
violete, salata Lollo, linte neagra, fasole neagra, precum şi in varza de Bruxelles (poate fi consumată şi
fiartă), fragi, alune.Varietăţile de legume şi fructe care nu prezintă culoarea neagra, conţin totuşi mai
putin resveratrol.
Într-o cantitate de 50-100 mg / g pieliţă de strugure, se gaseste mai mult resveratrol decât
dublul oricărei alte surse identificate.Resveratrolul se mai gaseste de asemenea în concentraţii mari în
rădăcinile unor plante asiatice dintre care Polygonum Cuspidatum este cel mai bogat în trans-
resveratrol permiţând extracţia în concentraţii de până la 99%.
Multe studii experimentale au raportat proprietăţile curative interesante ale trans-
resveratrolului ca agent de prevenţie a bolilor vasculare, cancerelor, infecţiilor virale sau a proceselor
neurodegenerative.
În plus studii epidemiologice au arătat că resveratrolul este principalul microcomponent din
vinul roşu ce realizează beneficii importante pentru sănătate (cum ar fi prevenirea bolii coronariene şi
a cancerului, aşa zisul paradox francez).
Resveratrolul previne sau intârzie carcinogeneza prin inhibarea celor trei faze ale procesului
canceros: iniţierea, promovarea, progresia şi faza de invazie.
De asemenea el posedă proprietaţi proapoptotice mai ales în cancerele colorectale. Este foarte
important că resveratrolul nu este toxic pe modelele animale chiar în doze forte mari.
Mai mult, concentraţiile plasmatice ale resveratrolului pot fi suficiente pentru capacitatea
antiinvazivă. Recircularea enterohepatică a sângelui contribuie la eliminarea sa întîrziată din
organism şi de asemenea efectul resveratrolului este prelungit datorită fixării sale de proteinele
plasmatice.
81
Este interesant ca resveratrolul poate sensibiliza faţă de dozele mici de medicamente citostatice
arătând astfel posibilitatea creşterii eficienţei terapiei anticancer.
Ca şi multi alţi polifenoli din plante, resveratrolul este un puternic antioxidant şi poate fi
considerat un microcomponent al alimentelor de tip preventiv ca flavonoizii şi epicatechinele din
ceaiul verde şi cacao (7). Întradevăr, numeroase studii au raportat proprietăţi interesante ale trans-
resveratrolului ca agent preventiv în multe patologii: boli vasculare, cancere, infecţii virale, procese
neurodegenerative ca boala Alzheimer (8) şi maladia Huntington (9).
Resveratrolul protejează LDL fata de agenţii oxidanţi (12). Şi mai ales ultimele studii au arătat
că resveratrolul creşte durata de viaţa a animalului. Mai mult, studiile epidemiologice au arătat poate
fi unul din principalii microcomponenţi ai vinului responsabil de beneficiile pentru viaţă (faţa de
bolile vasocoronariene şi mortalitatea în cancer) în situaţia unui consum moderat de vin.
Resveratrolul actionează asupra carcinogenezei prin inhibarea fazei de iniţiere care este legată de
alterările AND-ului în celulele somatice normale. Această activitate este legată de supresarea activării
metabolice a carcinogenilor şi/sau creşterii detoxifierii prin modularea enzimelor ce metabolizează
medicamentele atât în reacţia de faza I cât şi în conjugarea de faza II.
Prevenţia chimică se face prin scavengingul radicalilor liberi de oxygen şi duce la repararea
ADN. Inhibarea enzimelor P450 de către resveratrol poate reduce activarea reactivă a oxigenului
molecular.
Aceste acţiuni antioxidante ale resveratrolului contribuie la prevenirea stresului oxidativ
lezional asupra ADN-ului care joacă un rol central în activitatea carcinogenetică a multor agenţi
genotoxici. Resveratrolul promovează de asemenea repararea ADN ului prin creşterea activitaţii p53
în variate linii celulare.
82
De exemplu Wang et al.(19), în celule de cancer de prostată CWR22vl , Lin et al. (20) în cellule
tumorale de glandă mamară MCF7 şi Han et al. (21), în membrana plasmalemală a creerului de
şobolan.
Apoptotic bodies
Tissue homeostasis
83
IHost – pathogen interaction Plant Physiopathology Oxidative stress
(antibiotic, antiseptic, anti- (phytoalexin dependent – (anti-oxidant, prevention of
inflammatory) defense mechanism) vascular diseases)
- Inhibition of Helicobacter pylori - Antifungal - LDL oxidation prevention
growth - Xeno-hormesis - Neuprotection (Alzheimer)
- Anti viral (Herpes, HIV)
Resveratrol
HO
OH Ageing
Cell growth (Lifespan increase)
(anti tumor effect)
HO - Sirtuin activation pathway
- Cell proliferation inhibition - Caloric – restriction mimicking)
- Pro apoptosis
- Prevention of UV irradiation injury
Resveratrolul poate să interfereze mai multe etape ale cascadei kinazelor. Întradevăr el poate
inhiba fosforilarea şi activarea PKC şi de asemenea modulează cascada MAPK (27). Prin contrast
resveratrolul este dovedit că activeaza ERK=protein kinazele reglate de semnalul extracelular, p38
kinazele şi c-Jun NH2 terminal kinazele şi fosforilarea acestora.
84
Realiizarea chemopreventiei se face şi prin inhibarea sintezei de poliamine.
Acestea afectează numeroase procese în carcinogeneză cum ar fi promovarea, progresia şi
invazia. Downreglarea nivelelor poliaminelor se asociază cu scăderea creşterii celulare şi o creştere a
apoptozei. Se pare că resveratrolul poate inhiba sinteza de poliamine şi că ar creşte catabolismul
acestora (29).
Mediatorii lipidici cum sunt prostaglandinele au fost arătaţi a fi implicate în promovarea
proliferării celulare, supresarea supravegherii immune şi stimularea tumorigenezei.
Sinteza acestor compuşi din acidul arahidonic se face prin mai multe căi biochimice cum sunt
prostaglandin H sintaza, ciclooxigenaza şi lipooxigenaza.
Inhibarea ciclooxigenazei de către resveratrol previne formarea produşilor lipidici activi cum
sunt prostaglandinele şi tromboxanii (30).
Chemoprevenţia de către resveratrol se poate face şi prin inhibarea formării oxidului nitric.
În celulele endoteliale tumorale NO sintaza endotelială promovează creşterea şi metastazarea
prin variate mecanisme cum ar fi stimularea migrării celulelor tumorale, invazia şi angiogeneza (31)).
De exemplu s-a arătat că o creştere a sintazei NO inducibile şi a sintazei NO endoteliale se corelează
cu creşterea tumorală şi invazia vasculară în cancerul colorectal uman. Resveratrolul poate să inhibe
generarea oxidului nitric (NO) în macrofagele activate prin reducerea cantităţii de proteine, scaderea
NO sintazei inducibile şi inhibarea activării NFkB.
Resveratrolul realizează chemoprevenţie şi prin blocarea ciclului cellular.
85
Ca şi mulţi agenţi citotoxici medicamentoşi acesta afectează proliferarea celulară prin
perturbarea evoluţiei fiziologice a ciclului cellular: opreşte ciclul celular în faza G1, scade nivelele
cyclinei D1,D2 şi E.; în faza S ciclul celular este blocat prin creşterea ciclinelor A şi B1 cu acumularea
cdk 1 şi cdk 2 (care cresc şi în formele lor inactive fosforilate). Ciclinele B1,D1 şi cdk 4 sunt
downreglate (scăzute). De asemenea oprirea in faza S se produce şi prin inhibarea ribonucleotid
sintazei şi prin scăderea sintezei ADN.
Resveratrolul blochează diviziunea celulară în faza G2/M. Ciclina B2 este în relaţie funcţională
cu completarea fazei M. Ea se combină cu cdk1 pentru a forma MPF care joacă un rol important in
tranziţia de la faza G2 la faza M. Analiza biochimică a demonstrat că disrupţia progresiei fazei G2 de
către resveratrol este însoţită de inactivarea cdk1 şi o creştere a tirozinei fosforilate (inactive).
Inducerea apoptozei în celulele maligne precanceroase este considerată o strategie
promiţătoare pentru chemoprevenţie sau pentru scopuri chemopreventive. Apoptoza a fost triggerată
de către resveratrol în variate tipuri celulare şi ea se desfăşoară pe mai multe căi biochimice. S-a
demonstrat că resveratrolul poate să activeze moartea celulară pe căi de semnalizare mitocondriale
sau pe calea receptorului pentru moarte celulară (35).
Acest compus colorant acţionează asupra progresiei ce este asociată cu evoluţia celulelor
iniţiale într-o populaţie de celule biologic maligne.
86
Studiile au arătat implicarea metaboliţilor acidului arahidonic în invazia tumorală şi
metastazare . Deoarece resveratrolul este un inhibitor al lipooxigenazei şi ciclooxigenazei el inhibă
invazia celulelor de hepatom ascitic de şobolan.
Angiogeneza oferă o cale prin care celulele tumorale intră în circulaţie şi în sens invers
leucocitele infiltrează tumora oferind enzime proteolitice şi chemokine care facilitează migrarea şi
invazia celulelor tumorale.
Resveratrolul poate acţiona asupra angiogenezei prin inhibarea matrix metaloproteinazei
(MMP-9), activatorului plasminogenului urokinaze like şi moleculelor de adeziune. Mai mult,
resveratrolul inhibă factorul 1 alfa hypoxia inducibil (HIF-1alfa) şi exprimarea VEGF în celulele
cancerului ovarian uman.
Protecţia realizată de resveratrol în cancerul colorectal se face pe mai multe căi.
87
redistribuire resveratrol-dependentă ce are loc la nivelul rafturilor lipidice este un pas esenţial în
exprimarea efectului sensibilizant.
În plus, s-a arătat că preluarea rapidă a resveratrolului de către celulele tumorale atât prin
difuzie pasivă cât şi printr-un mecanism transportor mediat. Acesta din urmă permite o bună
absorbţie celulară a resveratrolului în ciuda fixării sale puternice pe proteinele plasmatice, în mod
particular pe albumină.
Rezultatele anterioare pe culturi celulare au indicat posibilitatea de a preveni sau trata
cancerele colorectale. Studiile arată testarea efectelor resveratrolului asupra tumorilor heterotopice.
Rezultatele preliminare tind să arate o acţiune citostatică şi citolitică în situaţia resveratrolului
administrat pe cale bucală la şobolanii la care s-au implantat celule de cancer colorectal.
Experimentele ne permit să determinăm pragul de eficacitate şi toxicitate a resveratrolului, de
a caracteriza metabolismul său, biodisponibilitatea sa ca şi implicaţiile asupra efluxului de proteine.
Regresia tumorală resveratrol indusă va fi corelată cu modificările ciclului celular, inducerea
apoptozei şi redistribuirea componentelor din microdomeniile membranare.
Mai mult, deoarece resveratrolul prezintă proprietăţi imunomodulatoare in vitro poate fi de
asemenea imunomodulator in vivo; de aceea o posibilă activare macrofagică şi limfocitară la
animalele tratate este posibilă.
În ciuda terapiilor agresive, rezistenţa multor tumori la procedurile treapeutice încă constituie
o problemă majora a tratamentului cancerului. Dorim să aflăm dacă resveratrolul este un bun
candidat pentru a lupta cu cancerul colorectal, utilizat singur sau în asociaţie şi realizînd
chemosensibilizare la cancerele de colon.
Resveratrolul sensibilizează celulele tumorale de colon la apoptoza indusă pe calea liganzilor
receptorilor de moarte celulară. Mai mult s-a arătat ca resveratrolul sensibilizează aceste celule la
apoptoza indusă de TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-indeucing ligand) în celulele
canceroase.
88
În celulele de neuroblastom, tratamentul cu resveratrol sensibilizează aceste celule la apoptoza
TRAIL indusă în absenţa unei căi p53 funcţionale. Această sensibilizare implică o depletie a
survivinului prin blocarea ciclului cellular şi o upreglare a p 21.
În celulele cancerului de colon uman rezistente la efectul citotoxic al resveratrolului, s-a arătat
că resveratrolul sensibilizează aceste tumori la TNF, la anticorpii anti-CD 95 şi la apoptoza TRAIL-
mediată şi de asemena activează o cale de moarte celulară caspază-dependentă evitând exprimarea
Bcl-2.
Pe de altă parte pentru a înţelege aplicarea resveratrolului în terapia umană ar fi interesant să-
l utilizăm cu alte antitumorale cum sunt 5-fluorouracil şi cisplatinul.
Utilizarea unui model experimental de adenocarcinom colorectal ne permite o mai bună
investigare a eficacităţii terapeutice a resveratrolului în cancere de colon şi identificarea ţintelor
pentru acest tip de cancer.
O terapie cu resveratrol ce precede terapia prin radiaţie ionizantă, radiosensibilizează
liniile celulare tumorile cervicale umane la factorul dstructiv într-o manieră doză dependentă.
Poplifenolii din dietă (incluzând resveratrolul) sunt de mare interes pentru activităţile lor
antioxidative şi anticarcinogenice.
89
Resveratrolul poate inhiba ultimile etape ale carcinogenezei inclusiv angiogeneza şi
metastazarea. Interesant este faptul că resveratrolul nu are nici un fel de citotoxicitate pe modelele
animale. Mai mult, concentraţiile resveratrolului şi ai metaboliţilor săi în singe par sa fie suficiente
pentru activitatea antiinvaziva.
Cea mai mare parte a resveratrolului este metabolizată în compuşi ce îşi păstrează activitatea
antioxidantă dar se pierde activitatea antiproliferativă.
De fapt conjugatele înalt polare sunt în general inactive şi rapid eliminate prin urină şi materii
fecale.
Recircularea hepato-entero-hepatică care eliberează medicamentul mama în circulaţia
sistemică se asociază cu eliminarea întârziată a medicamentului din organism şi cu prelungirea
efectului său.
Prin fixarea sa de proteinele plasmatice, efectul resveratrolului poate fi prelungit. Altă
proprietate a polifenolului este chemosensibilizarea. Doze mici de resveratrol pot sensibiliza celulele
ţintă la doze reduse de medicamente citotoxice oferind in acest fel o noua strategie de amplificare a
tratamentelor anticancer in variate forme tumorale.
90
Studiul nostru de proteomica computationala isi propune identificarea existentei situsurilor de
nitrare la tirozina in proteine intracelulare si plasmatice cu rol de mesageri primari. Speciile inalt
reactive de azot (RLN) realizeaza nitrosilare, nitrosare si nitrare. Nitrarea are specificitate de
aminoacid dar si de structura tridimensionala . Molecula este activata sau inhibata (enzima sau
hormon) ceea ce poate implica veriga moleculara in patogenia bolii.
Identificarea in molecule a dublei tirozine (Y-Y posibil marker al situsului de nitrare in
structura liniara polipeptidica) ne permite prognoza nitrarii si astfel o evaluare-prognoza a evolutiei
functionale.
O alta probabilitate foarte mare de nitrare o are tirozina aflata la capatul lantului polipeptidic
sau foarte aproape de capatul lui (X-X -Tyr).
Dupa listarea proteinelor plasmatice cuantificate prin studii recente de cromatografie lichida
cuplata cu spectroscopie de masa (P. NILSSON 2006) s-au extras fisierele proteinelor respective din
serverul www.ExPASy.org ; acestea contin molecula in formatul FASTA .de asemenea s-au scanat
proteinele intracelulare cu rol functional important (enzime).
Folosind softul Motif Scan al site-ului Prosite s-au identificat proteinele si peptidele ce contin
secventa tyr-tyr dupa care ele au fost listate.
De asemenea au fost identificate peptidele ce poseda tirozina terminala (la capatul catenei
aminoacidice sau cu 1-2 aminoacizi inainte de capat).
Dupa o faza de integrare metabolomica sa putut deduce implicarea moleculei ca veriga
patogenica .
Principalele proteine cu tinta de nitrare de tip Tyr-Tyr si Tyr terminal au serum albumina
umana, POMC, GLP-1, GIP, gastrina, LH-RH si renalasa (monoaminoa oxidaza plamatica
secretata de rinichi).
Exemplificam prin sindromul descris de P. WHITE in diabetul zaharat juvenil utilitatea
practica de interpretare a patogeniei bolii folosind datele obtinute prin studiului nostru.
Introducere
Molecula modificata posttranslational prin nitrare isi modifica inainte de pliere = folding
proteic sau dupa acest fenomen, structura tridimensionala ceea ce are implicatii asupra efectului pe
receptor sau poate declansa fenomenul de insamintare = seeding proteic.
Datorita existentei fenomenului de denitrare enzimatica (si neenzimatica) implicatiii
functionale ale nitrarii pot fi asemanate cu mecanism de piedica al armei de foc.
91
Din punct de vedere biochimic aceste noi structuri sint relativ stabile atit in vitro cit si in vivo
mai ales in situatia nitrarii proteinelor si peptidelor. Dupa J. GREENACRE si colab (2004) proteinele
nitrate dupa administare de peroxinitrit intracutan la sobolan au fost depistate timp de 24 ore cea mai
importanata cantitativ fiind serum albumina plasmatica (trecuta in tesuturi in urma nitrarii).
La fenomenul de nitrare participa RLN, proteina si apa ce o inconjoara
92
computationala, acest adevarat “situs” (zona, regiune) de nitrare la nivelul proteinelor extracelulare
(plasmatice).
Material si metoda
93
Dupa identificarea clasei functionale de proteine (peptide) plasmatice (albumine, gamma-
globuline, enzime, hormon, etc) s-au extras din baza de date doar proteinele umane (incluzind rolul
functional, modificarile posttranslationale identificate si mai ales structura primara (in formatul
FASTA).
In a doua etapa a analizei de proteomica computationala s-a evaluat pe serverul NPSA
(France, Lyon) continutul in tirozina al peptidului.
Pentru pozitia aminoacidului in structura tertiara a moleculei s-a studiat manual proteina in
formatul Fasta di fisierul HTML al proteinei respective din site-ul ExPasy dupa care s-a solicitat
modelul 3D la serverul bioinformatic SWISS-MODEL. El este realizat de informaticienii elvetieni T.
SCWEDE, J. KOPP si N. GUEX si contine modelari a 70 % din proteinele si peptidele existente in
diverse baze de date. Acest site ofera un viewer (SPDBViewer) care permite multiple modalitati de
studiu bioinformatic si de chimie fizica a moleculei. De exemplu atit deplasarea in trei dimensiuni cit
si evaluarea cimpului electrostatic la nivelul intregii molecule si la nivelul zonelor de interes pentru
investigator respectiv al tirozinelor si dublu tirozinelor ce pot constitui tinte ale agentilor nitranti si
astfel posibile situsuri de nitrare.
Tirozina a fost marcata cu o culoare conventionala si s-a inceput studiul pozitiei si a
aminoacizilor din vecinatate pe structura tridimensionala.
Au fost studiate datele taxonomice si de proteomica functionala ce sprijina posibilele implicatii
ale moleculei (biomarker) in patogenia bolii.
94
Marcarea tirozinei in molecula serumalbuminei umane
Proteinele si peptidele selectate au fost studiate si in formatul BLAST si aceasta s-a realizat cu
utilizind softul de sinteza de date proteomice CLC ProteinWorkBench ce ne permite desenarea
arborelui filogenetic al proteinei ce poate fi modificata posttranslational, ceea ce ne- a oferit date
suplimentare referitoare la implicatiile functionale ale acesteia sau posibile alterari in stari
patologice.
Rezultate
In urma studiului de proteomica functionala computationala principalele proteine si peptide
plasmatice si intracelulare ce pot constitui tinta (target) pentru nitrarea la tirozina si in acest fel pot
fi implicate in patogenia bolilor in care joaca un rol functional sint: LH-RH, leu -enkefalin, met-
enkefalyn, dynorphin, angiotensin I, angiotensina II, vasopresin, oxytocin, serumalbumin, insulina,
POMC, glucagonul, fibrinogenul, GLP-1 (glucagon like peptide), GIP (glucose-dependent
insulinotropic polypeptide), gastrin si dintre enzime renalasa: monoaminoxidaza sistemica secretata
de rinichi.
Name
95
2
Isoform ID
Q5VYX0-2
Note: No experimental confirmation available.
Features which should be applied to build the isoform sequence: VSP_015211,
VSP_015212.
TISSUE SPECIFICITY: Secreted into the blood by the kidney. Highly expressed in
the kidney, expressed at lower level in heart, skeletal muscle and small intestine. Its plasma
concentration is markedly reduced in patients with end-stage renal disease, as compared
with healthy subjects.
10 20 30 40 50 60
MAQVLIVGAG MTGSLCAALL RRQTSGPLYL AVWDKAEDSG
GRMTTACSPH NPQCTADLGA
96
250 260 270 280 290 300
SLVIHTTVPF GVTYLEHSIE DVQELVFQQL ENILPGLPQP IATKCQKWRH
SQVTNAAANC
10 20 30 40 50 60
MQRLCVYVLI FALALAAFSE ASWKPRSQQP DAPLGTGANR
DLELPWLEQQ GPASHHRRQL
70 80 90 100
GPQGPPHLVA DPSKKQGPWL EEEEEAYGWM DFGRRSAEDE N
97
10 20 30 40 50 60
MKSIYFVAGL FVMLVQGSWQ RSLQDTEEKS RSFSASQADP
LSDPDQMNED KRHSQGTFTS
Peptid si structura
98
Aplicind metoda de analiza de tip proteomica postranslationala computationala in evaluarea
tintirii (targetarii) nitrarii extracelulare la Sindromul WHITE din diabetul zaharat insulinodependent
juvenil cu debut sub virsta de 10 ani (pubertate intirziata, amenoree periodica cu edeme, control
metabolic slab) putem implica drept veriga patogenica principala nitrarea LH-RH-ului hipotalamic
(sursa mare de peroxinitrit din oxidul nitric neuronal si superoxidul generat ca efect al glicozilarii
proteinelor), factorul solvent posibil favorizant si mai ales situs de nitrare (target) pe structura
tertiara a peptidului nativ.
Confirmarea ipotezei necesita, ca de altfel pentru toate proteinele si peptidele gasit de noi cu
posibil situs de nitrare, HPLC (separare cromatografica la inalta presiune) si SM (analiza ampla si
precisa prin spectrometrie de masa) a probei de singe recoltata din vasele sistemului port hipotalamo-
hipofizar. Cu toate ca nivelele plasmatice sint reduse aici si foarte reduse in circulatia generala unii
autori sustin posibilitatea dozarii peptidului din plasma sanguina. Ar fi posibila deci confirmareea
ipotezei de proteomica computationala propusa de noi prin compararea concentratiei peptidului
nativ cu cea a peptidului nitrat (deci inactivat). Datele clinice arata doar ca sindromul WHITE apare
atunci cind debutul diabetuklui zaharat este foarte apropiat (1-2 ani) de virsta probabila a debutului
pubertar. Oricum diabetul zaharat insemana stress oxidativ (superoxid) in cantitate mare de diferite
surse (proteine glicozilate, hipoglicemii cu cresteri de catecolamine, infectii caracteristice bolii si
stress psihic permanent dat de internari multiple si tratamentul complex). Este posibila antrenarea
oxidului nitric si generarea de cantitati mari de peroxinitrit (mecanism autointretinut) ceea ce duce la
agravarae complicatiilor cronice cum este retinopatia.
Pe de alta parte aceste bolnave pot avea (in conditiile unui control metabolic bun) menarha si
pubarha, cicluri ovulatorii si ele pot fi chiar fertile dar la o virsta cu 5 -10 ani dupa nivelul normal.
Discutii si concluzii
Acest studiu de proteomica posttranslationala computationala constituie “background-ul”
bioinformatic ce ne apropie de posibilitatea unor experimente eficiente realizate in scopul intelegerii
semnificatiei functionale a nitrarii si denitrarii target-ului reprezentat de situsul de nitrare din unele
proteine sau peptide plasmatice.
Atunci cind am pornit sa scanam moleculele plasmatice aveam doua optiuni: 1) sa le scanam
absolut pe toate in ideea gasirii secventelor Tyr-X-X-X-X-X , X-Tyr sau X-X-Tyr in petide scurte si
X—X-X-X-X-Tyr-Tyr-X-X-X-X-X si 2) sa alegem numai pe cele in concentratii mai mari (deci cu
posibilitate de imp;licare patogenica mai ampla).
Dupa autorii ce au studiat plasma sanguina aceasta contine nu numai proteinele ci si produsii
de leakage celular si citokinele dar acestea din urma sint in cantitati reduse.
99
Daca pentru nitrarea tirozinelor terminale avem date experimenale numeroase considerind
asemenea lui MOSSMANN si BEHL (2002) ca peptidele acestea ar avea si un efect antioxidant,
pentru dubla tirozina datele experimentale sint mai putine (D. BIGELOW care a experimentat
nitrarea SERCA).
Analiza noastra este utila in dirijarea studiilor de proteomica functionala, in alegerea
mesagerilor primari ce pot fi investigati prin tehnici analitice in ceea ce priveste posibilitatea
modificarii posttranslationale de tip nitrare respectiv cromatografie de inalta presiune sau
cromatografie lichida cuplata cu spectroscopie de masa.
De asemeni se poate merge in continuare la studiu functional respectiv aplicare pe tinta
biologica a mesagerului primar in forma nitrata versus forma nativa si comparare efectelor
functionale in cele doua cazuri.
Evaluind in timp (periodic) nivelul plasmatic al biomarkerului reprezentat de proteina nitrata
se poate prognoza evolutia functionala si clinica a bolii cu mare acuratete si acesta ne permite o
terapie farmacologica bine reglata temporospatial (vezi farmacocinetica produsului terapeutic).
In acest context apare atractiva ideea denitrarii (si astfel reactivarii) mesagerului primar
inactivat.
Ulterior datele experimentale pot fi cuplate cu alterarile biochimice de la bolnav (identificate
tot prin separari si evalulari spectrofotometrice sau de masa).
Ramine deschisa intrebarea: care sint caracteristicile fizicochimice ale situsului de nitrare din
interiorul lantului polipeptidic ?
Bibliografie
Peitsch MC, Herzyk P, Wells TNC and Hubbard RE (1996) Automated modelling of the
transmembrane region of G-protein coupled receptor by Swiss-Model. Receptors and Channels 4:161-
164. Peitsch MC, Wilkins MR, Tonella L, Sanchez J-C, Appel RD and Hochstrasser DF (1997) Large
scale protein modelling and integration with the SWISS-PROT and SWISS-2DPAGE databases: the
example of Escherichia coli. Electrophoresis. 18:498-501. Peitsch MC (1997) Large scale protein
modelling and model repository. in: Proceedings of the fifth international conference on intelligent
systems for molecular biology, vol 5, p 234-236, Gaasterland T, Karp P, Karplus K, Ouzounis C,
Sander C and Valencia A eds., AAAI Press.
100
Peitsch MC and Guex N (1997) Large-scale comparative protein modelling. in: Proteome
research: new frontiers in functional genomics, p 177-186, Wilkins MR, Williams KL, Appel RO,
Hochstrasser DF eds., Springer.
Guex N and Peitsch MC (1997) SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment
for comparative protein modelling.
Guex N and Peitsch MC (1999) Molecular modelling of proteins. Immunology News 6:132-134.
Guex N, Diemand A and Peitsch MC (1999) Protein modelling for all. TiBS 24:364-367.
Peitsch MC, Schwede T and Guex N (2000) Automated protein modelling - the proteome in 3D
Pharmacogenomics 1:257-266.
Schwede T., Diemand A, Guex N, and Peitsch MC (2000) Protein structure computing in the
genomic era. Res. Microbiol. 151:107-112.
Schwede T, Kopp J, Guex N, and Peitsch MC (2003) SWISS-MODEL: an automated protein
homology-modeling server. Nucleic Acids Research 31, 3381-3385.
Kopp J, and Schwede T (2004). The SWISS-MODEL Repository of annotated three-
dimensional protein structure homology models. Nucleic Acids Research 32, D230-D234.
Kopp J, and Schwede T (2006). The SWISS-MODEL Repository: new features and
functionalities. Nucleic Acids Research 34, D315-D318.
Arnold K, Bordoli L, Kopp J, and Schwede T (2006). The SWISS-MODEL Workspace: A web-
based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics 22,195-201.
34). Identificarea software a receptorului molecular proteic pentru factorii reglatori (situs de nitrare)
Folosind un program de tip pattern matching se pot identifica aceste zone active din proteinele
stocate in bazele de date.
Pentru prima data H.ISCHIROPOULOS pune problema unei zone tip receptor alcatuita din 5
aminoacizi inaintea tirozinei si 5 aminoacizi dupa tirozina din lantul polipeptidic al proteinei.
101
37). Aportul diagnostic si eficienta biomarkerilor proteomici – Sindromul Ehlers –Danlos patologie a
colagenului
102
Sindromul Ehlers-Danlos (SED) este un grup eterogen de boli genetice rare, care afectează
1:2.500–1:5.000 de indivizi. Este cauzat de un defect în structura, producerea sau prelucrarea
colagenului sau a proteinelor care interacţionează cu colagenul, cum ar fi mutaţii în genele COL5A
sau COL3A. Ca urmare, apar modificări în ţesutul conjunctiv; fragilitatea pielii şi instabilitatea
articulară sunt rezultatul cantităţii reduse ori calităţii defectuoase a colagenului.
Caracteristicile clinice ale SED au fost descrise pentru prima dată de Hipocrate (400 î.Hr.).
Sindromul este numit după medicii Edvard Ehlers (Danemarca) şi Henri-Alexandre Danlos (Franţa),
care au descris afecţiunea la începutul secolului 20.
Cele mai frecvente semne ale SED sunt: hipermobilitate articulară, hiperextensibilitate a
pielii şi fragilitate a ţesuturilor. Există şase tipuri principale de SED, clasificate în funcţie de
manifestările clinice, semne şi simptome. Fiecare tip este definit ca o tulburare distinctă, care se
păstrează în cadrul aceleiaşi familii.
Hiperflexibilitate articulară. Deoarece ţesutul conjunctiv este mai relaxat, articulaţiile se pot
deplasa mult dincolo de limitele normale de mişcare (fig. 1). Sunt afectate în special articulaţiile mici.
De asemenea, la nivelul articulaţiilor poate apărea instabilitate, predispunând pacienţii la
dislocări şi/sau subluxaţii frecvente, dureri articulare sau debut precoce al osteoartritei.
Elasticitate excesivă a pielii. Ţesutul conjunctiv lax permite pielii să se întindă mai mult decât în
mod normal (fig. 2). Aceasta este, de asemenea, foarte catifelată.
Piele fragilă.Rănile pielii se vindecă defectuos, cu cicatrici cheloide sau defecte de închidere.
Acumulări de grăsime (puncte) în zonele de presiune.Pot apărea în jurul genunchilor sau
coatelor, putând fi vizibile pe radiografii.
Alte semne mai puţin comune asociate SED sunt: fragilitate crescută (rupturi) la nivel arterial,
intestinal sau uterin; scolioză la naştere şi fragilitate sclerală; tonus muscular slab; prolaps de valvă
mitrală; afecţiuni gingivale.
Severitatea simptomatologiei şi afectării clinice variază de la o persoană la alta. Unii pacienţi
pot avea hiperflexibilitate articulară, dar fără simptome ale pielii.
În trecut, au existat 10 tipuri recunoscute de SED. În 1997, cercetătorii au propus o
clasificare mai simplă, care a redus numărul de tipuri majore de boală la şase şi le-a dat nume
descriptive. Pot exista şi alte tipuri de SED, dar au fost raportate izolat în cadrul unor familii sau
nu au fost bine caracterizate. Cu excepţia tipului 1, au fost identificate mutaţii specifice responsabile
de apariţia bolii. Rezultatele negative ale testelor genetice nu exclud diagnosticul, deoarece nu au fost
descoperite toate mutaţiile asociate fiecărui tip de boală. Prin urmare, tabloul clinic este foarte
important. Sunt rare cazurile în care pacientul prezintă doar simptomatologia specifică unui anume
103
tip. Astfel, el poate asocia simptome din mai multe tipuri de boală, deşi testele genetice pot fi pozitive
pentru unul singur.
În ordinea prevalenţei în rândul populaţiei, tipurile de SED sunt:
1. Tipul hipermobilitate (SED tipul III). Afectează 1:10.000 până la 1:15.000 de indivizi şi se
produce prin mecanism autozomal dominant sau recesiv – mutaţii în oricare dintre genele COL3A1 şi
TNXB. Hipermobilitatea este semnul distinctiv al acestui tip, asociind manifestări mai puţin grave ale
pielii. Sunt caracteristice instabilitatea articulară şi durerile cronice musculo-scheletice. Pacienţii
prezintă frecvent dislocări şi subluxaţii articulare, cu sau fără traume. Ca rezultat, durerea este un
simptom comun; ea este severă şi continuă. Osteoartrita este frecventă şi are debut precoce.
2. Tipul clasic (SED tipurile I şi II). Afectează 1:20.000 până la 1:50.000 de indivizi, prin
mecanism autozomal dominant şi afectează colagenul tip V. Tipul I de boală se asociază de obicei cu
afectarea severă a pielii; tipul II – cu afectare uşoară/moderată a acesteia. Pacienţii cu tipul clasic pot
avea aceleaşi simptome ca şi cei cu tipul III (hipermobilitate), principala diferenţă fiind afectarea
predominantă a pielii. Genele responsabile de acest tip de boală sunt COL5A1, COL5A2, COL1A1.
3. Tipul vascular (SED tipul IV). Este cauzat de un defect autozomal dominant în sinteza de
colagen tip III; afectează 1:100.000–1:250.000 de persoane. Este considerat unul dintre cele mai
grave forme de SED, deoarece vasele sanguine şi organele sunt fragile şi predispuse la rupere.
Mulţi pacienţi au un aspect facial caracteristic (ochi mari, bărbie mică, obraji scofâlciţi, nas şi buze
subţiri, urechi fără lobi), o statură mică, constituţie subţire, piele subţire, palidă, translucidă (vene
vizibile de obicei la nivelul pieptului şi abdomenului), cu hematoame şi echimoze (fără traume) (fig.
4). Aproximativ una din patru persoane cu SED tip vascular are o problemă semnificativă de sănătate
la 20 de ani şi mai mult de 80% vor dezvolta complicaţii ameninţătoare de viaţă înainte de 40 de ani.
Principala genă responsabilă de apariţia acestui tip este COL3A1.
4. Tipul cifoscolioză (SED tipul VI). Este cauzat de un defect recesiv autozomal, deficitul
enzimei lizil-hidroxilază; este foarte rar, cu mai puţin de 60 de cazuri raportate în literatura de
specialitate. Este caracterizat prin scolioză progresivă, sensibilitate oculară şi slăbiciune musculară
severă. Gena specifică este PLOD1.
5. Tipul artrochalazie (SED tipurile VII A şi B). Sunt aproximativ 30 de cazuri raportate
până în prezent. Afectează sinteza de colagen tip I. Se caracterizează prin articulaţii foarte largi şi
dislocări ale ambelor şolduri. Articulaţiile sunt mult mai laxe, cu un grad de instabilitate de două ori
mai mare decât tipul III. Genele afectate sunt COL1A1 şi COL1A2.
6. Tipul dermatosparaxis (SED tipul VII C). Este cel mai rar; se caracterizează prin piele
extrem de fragilă şi căzută. Gena afectată este ADAMTS2.
104
Diagnosticul se bazează în primul rând pe istoricul familial şi evaluarea clinică. Pacientul este
încadrat în funcţie de caracteristicile fiecărui tip de SED. Testarea genetică este disponibilă pentru
cinci tipuri de SED, cu excepţia celui mai frecvent, cu hipermobilitate. Testele variază în precizie; în
cele mai multe cazuri, testarea genetică ar trebui să fie utilizată conservator pentru a confirma
diagnosticul, mai degrabă decât pentru a-l exclude.
Teste diagnostice: biopsia cutanată cu evaluare la microscopul electronic – în tipul clasic
evidenţiază o deformare în conopidă a fibrelor de colagen (dar nu este o modificare specifică SED);
teste biochimice pe celule dermice (fibroblaste); teste genetice: secvenţiere genică, analiza
deleţiilor/duplicaţiilor, alelelor
105
Nu există tratament specific, dar terapiile adjuvante contribuie la controlul bolii şi
prevenirea complicaţiilor.
Din cauza eterogenităţii genetice a bolii şi a mutaţiilor de novo, adesea sfatul genetic este dificil
de acordat. În cazurile clasice, cu transmitere conform unui model evident, riscul de recurenţă este
stabilit în funcţie de tipul transmiterii monogenice. Cel mai frecvent, acest risc va fi de 1:2 în cazul
transmiterii autozomal dominante şi 1:4 în formele autozomal recesive.
Diagnosticul molecular este posibil teoretic, dacă mutaţia a fost evidenţiată la părintele afectat.
În practică, acest test este încă aproape excepţional.
Evoluţia şi prognosticul diferă în funcţie de tipul şi gravitatea bolii. Există forme uşoare,
medii sau severe, care, în cursul evoluţiei, pot prezenta complicaţii grave. În SED tip IV pot apărea
106
perforaţii de colon, rupturi arteriale spontane, prolaps de valvă mitrală. Sarcina sau naşterea (adesea
prematură) se pot complica cu ruptură uterină. În SED tip VI există risc de leziuni de cornee,
subluxaţii de cristalin sau decolare de retină.
Nitric oxide is a major contributor to the normal homeostasis of the cardiovascular system.
Physiological levels of •NO are principal determinants of endothelium-dependent relaxation and
regulator of vascular tone .
NO inhibits platelet aggregation adhesive molecules expression , and regulates cell proliferation and
differentiation at the vascular wall .
107
Regulation of nitric oxide output from the endothelium by superoxide
The above mentioned pathologies are associated with an increase in production of reactive oxygen
species.
The net concentrations of ·NO at the tissue level may predict its protective or toxic effects.
Many lines of evidence suggest that modulation of ·NO concentration will determine whether or not
the roles played by RNS/ROS will be protective or detrimental to the cardiovascular system.
The artery wall is a major site of nitroxidative protein modification in several pathologies such as
hypertension and atheromatosis. Nitration reactions are favoured in the artery wall given that some of
the detoxifying reactions that occur at the lumen are less relevant for example in the extracellular
matrix due to their low concentration.
Clinical trials have shown an association between nitroxidative stress and fibrinogen in
patients with CAD. A 30% increase in nitrated fibrinogen was detected in plasma of patients with
documented CAD. Nitrated fibrinogen from patients or in vitro modified fibrinogen polymerizes
faster than normal fibrinogen.
108
Fibrinogen
Nitrated LDL triggers the release of TNF-α from non differentiated human monocytes,
consequently amplifying the inflammatory process in vivo. Nitrated LDL from human thoracic aorta
atheroma plaques has been detected.
Low levels of ONOO− and other peroxides in presence of arachidonic acid can activate COX
but higher pathophysio- logical levels Inhibit and nitrate COX. Nitration is associated with inhibition
of enzyme activity and and has been detected in human atheroma plaques. Mn-SOD is located in the
mitochondrial matrix. It was the first nitrated proteins to be identified in chronic renal allograft
rejection disease in humans.
Nitrated Mn-SOD was identified in vascular aging on rats. Mn-SOD nitration in endothelial cells after
addition of Cyclosporine A due to peroxynitrite formation, has just been reported.
109
Fibrin network as a result of nitrated fibrinogen activation
Nitroxidative stress generated by inflammatory changes that occur after myocardial infarction,
infectious process of the myocardium such as myocarditis, or other experimental setups, have been
linked to the alteration of energetic balance and contractile dysfunction of the failing heart.
Alterations in Ca2+ homeostasis have been recognized for a long time in heart failure.Studies
with transgenic mice confirm that cardiac contrac- tility is modulated by SERCA levels. SERCA-2a,
found predominantly in slow twitch skeletal muscle,vessel smooth muscle and cardiac muscle, is
sensitive to inhibition and nitration by ONOO−.
Recent studies have been devoted to unravel the connection between nitroxidative modification
of SERCA-2a and functionality in the senescent heart.
Hypertension is associated with endothelial dysfunction and altered •NO bioavailability in part by an
increase in O2- production. The identity of nitrated proteins in hypertension remains to be
determined .
They did not find expected elevations of inducible nitric oxide Synthase mRNA expression
during ischaemia or reperfusion and we suggest that ischaemia/reperfusion injury is not associated
with nitric oxide overproduction.
Nitration methods
110
Denitration
Protein nitration is a usual process in the living organism and 3-NO2-Tyr accumulates during
the aging process reflecting the basal nitroxidative stress normally produced.
Nevertheless, as the physiological redox balance is weakened during the disease state,
nitroxidative stress emerges as a mediator of damage, which includes among others, tyrosine
nitration.
111
CREAREA BIOMARKERULUI DE STRESS NITROOXIDATIV (SCHEMA)
References
Ischiropoulos H. Biological selectivity and functional aspects of protein tyrosine nitration. Biochem
Biophys Res Commun 2003;305:776–83.
VadsethC, Souza JM, Thomson L, SeagravesA,NagaswamiC, ScheinerT, et al. Pro-thrombotic state
induced by post-translational modification of fibrinogen by reactive nitrogen species. J Biol Chem
2004;279:
Olah GA, Malhotra R, Narang SC. (1989) In: Nitration, Methods and Mechanisms. Organic Nitro-
Chemistry Series, VCH Publishers, Inc. Review Biochemistry of protein tyrosine nitration in
cardiovascular pathology
Gonzalo Peluffo, Rafael RadiKoolman , Colored Atlas of biochemistry , 2005 Ischaemia or
reperfusion: which isa main trigger for changes in nitric oxide mRNA synthases expression?
Pevni D;Frolkis I; Shapira I; Schwartz D; Schwartz IF; Chernichovski T; Lev-Ran O; Sharony R;
Uretzky G Department of Cardiothoracic Surgery, Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel.
112
40). Proteinele la lucru in tratamentul bolilor cronice – Entomoterapia si creatorul ei Prof. Dr. Mircea
Ciuhrii
↓
BACTERICIDE
113
Deşi în prezent, se cunosc peste 1,5 milioane de specii de insecte (cea mai mare diversitate a fiinţelor
vii), omul încă nu utilizează nici o specie de insecte la valoarea ei adevărată. Se utilizează numai câteva
produse ale insectelor, cum ar fi mierea de albine, propolisul, veninul, lăptişorul de matcă, firul viermelui de
mătase.
În ultimii ani, s-au utilizat câteva specii de Noctuidae pentru a utiliza Baculovirusurile modificate
genetic prin intermediul cărora se pot obţine substanţe biologic active (SBA) de tipul interleukinelor,
vaccinurilor, unele tipuri de interferon şi altele. În cazul dat insectele se utilizează ca un substrat de
multiplicare a virusurilor, dar valoarea cea mai importantă a unor specii de insecte este extragerea directă a
SBA din tesuturile insectelor. Nimeni până acum încă nu a exploatat insectele, ca sursă de obţinere pentru
extragerea SBA.
La şedinţa comisiei de nutriţie care a avut loc la Roma (Italia) în anul 2008, s-a precizat că insectele
pot fi considerate ca fiind una dintre resurse 99 care pot fi utilizate în viitor pentru alimentaţia Omului.
Este o prognoză sigură, deoarece creşterea specială a insectelor (Entomologia tehnică) include
producerea de substanţe necesare pentru reglarea anumitor procese vitale ale organismului uman. Produsele
entomologice conţin compoziţii valoroase, care pot active unele funcţii necesare funcţiei organismului
uman. În anumite situaţii, produsele entomologice nutritive pot completa necesarul anumitor aminoacizi
pentru activarea sau inhibarea unor procese. De exemplu, noi am descoperit unele compoziţii din anumite
specii de insecte, care includ cantităţi mari de Mg, Ca şi P.
În baza acestor compoziţii am elaborate unele preparate, care pot trata osteoporoza, ce apare din
cauza lipsei de Ca asimilabil în organismul uman (Brevet Nr. ), SBA pentru stimularea memoriei omului
(Brevet Nr.876/14.10.2005). În baza altor SBA am elaborat mai mult de 40 de preparate cosmetice. Trebuie
înţeles că în organismul diferitor specii de insecte sunt incluse o varietate de SBA, care pot regla anumite
funcţii ale organismului uman.
Majoritatea insectelor îşi schimbă morfologia pe parcursul existenţei lor (ou, larvă, pupă, adult)
(figura de mai jos), iar în acest proces au loc o serie de transformări ale substanţelor organice, la care
participă multe enzime activitoare şi inhibitore. O generaţie de insecte durează de la câteva zile până la
câteva luni sau câţiva ani.
Una din cele mai mari realizări ale Centrului Ştiinţific Aplicativ INSECT FARM este depistarea
proteinelor cu efect antiviral.
Primul pacient tratat de o infecţie virală produsă de virusul herpes-Zoster a fost subsemnatul. Exact în
timpul când aveam extrase proteice cu efect antiviral Dumnezeu mi-a trimis mie o infecţie cumplită
provocată de virusul herpes. Cine a fost infectat cu acest virus herpes - Zona Zoster ştie ce înseamnă această
afecţiune şi ce dureri cumplite poate provoca. Eu am aplicat substanţa activă direct pe zona infectată şi vă
mărturisesc cu cea mai mare sinceritate că în trei zile nici urmă de infecţie nu a mai rămas. Am avut foarte
multe cazuri rezolvate.
Trebuie sa vă prezint un caz ieşit din comun. Un fost cetăţean român de naţionalitate armeană de
85 de ani, care plecase în SUA cu vreo 30 de ani în urmă, era infectat cu virusul Zona -Zoster şi în America
l-au tratat cu tot ce era mai nou, dar virusul nu a cedat. O rudă de-a lui s-a adresat nouă. Povestea că de ani
de zile pacientul nu mai putea dormi culcat ca toată lumea şi urla de dureri insuportabile. După
administrarea unguentului nostru „Zona-zoster-liz”, infecţia a dispărut în câteva zile. Au publicat articole de
mulţumire în câteva ziare din Los Angeles, unde eram pe atunci mai cunoscut decât în România. La o
femeie infectată cu virusul Zona-Zoster s-au observat progrese după 5 zile de tratament.
Specialitatea mea de bază fiind virusologia, tot timpul am fost preocupat de această direcţie foarte
importantă, deoarece dintre toate infecţiile care-l atacă pe om, 75 % sunt provocate de virusuri. Până în
prezent omul este neputincios în faţa infecţiilor virale. Am elaborat vaccinuri şi interferoni, care sunt
preparate profilactice: ele nu pot stopa infecţiile virale. Fiind conştient de acest lucru şi fiindcă toată viaţa
mea am produs preparate biologice numai pentru a distruge, ştiam foarte bine că nu este atât de uşor, nici de
114
a obţine o mortalitate totală. Aşa cum sunt programate virusurile, ele nu se pot multiplica în afara celulelor
vii.
Apoi virusurile sunt foarte bine specializate, ele infectează numai unele şi aceleaşi ţesuturi sau
chiar numai unele şi aceleaşi celule. Dacă în celulele specifice unor virusuri se schimbă un component ai
proteinelor, virusul nu se mai multiplică. Aceste informaţii pe care le aveam din propriile experienţe, au
contribuit la elaborarea unor noi tehlologii pentru stoparea infecţiilor virale.
Aşa am început să realizez metode de obţinere şi de utilizare a unor preparate pentru stoparea
infecţiilor hepatice - cele mai răspândite la începutul mileniului trei. Pentru acest lucru a trebuit să extrag
anumite proteine din anumite specii de insecte la anumite stadii de dezvoltare ale acestora.
Pentru a fi înţeles corect trebuie să explic că, insectele, spre deosebire de alte organisme vii, au un
metabolism specific. Organismul insectei la diferite stadii de dezvoltare se transformă complet atât
morfologic cât şi chimic.
În ciclul de viaţă al oricărei insecte la început apare oul din care se dezvoltă larva. În larva unei
insecte se acumulează multe lipide. Stadiul de larvă durează de obicei 15-29 de zile. Larva se transformă în
pupă, o formaţiune complet închisă, sterilă, în care se găsesc 5 tipuri de proteine cu greutăţi moleculare
diferite. Aceste proteine se pot separa uşor prin centrifugare în diferite gradiente de zaharoză. La sfârşitul
stadiului de pupă toate proteinele se transformă în alte tipuri de proteine de tipul cheratozelor (la adult), care
constituie 90% substanţa uscată şi ouă sau spermatoizi: proteine pure de la care ciclul dezvoltării se reia.
Natura singură ne-a pregătit substanţele biologic active. Dar trebuie numai să ştii unde să le cauţi.
Astfel, s-au identificat SBA care au proprietatea de a stopa multiplicarea virusurilor la etapa
asamblării acizilor nucleici în capside. Am depistat acest fenomen, modelând procesul pe culturi celulare
după infecţii cu două virusuri diferite, care conţineau acizi nucleici diferiţi (Ciuhrii M, Compendiu N 12
1981, Paris). Procesul de asamblare nu se efectua. Cauza blocării acestui proces îl constituia prezenţa unei
proteine străine. O proteină străină extrasă din insecte şi care, introdusă în sângele omului, sânge care
vascularizează şi ficatul, poate bloca definitiv multiplicarea virusurilor hepatice. Mecanismul de acţiune
necesită un studiu mai detaliat. Astfel am inclus un alt principiu de stopare a infecţiilor virale, care spre
deosebire de cunoscutul preparat INTERFERON sau mai nou INTRON, PEGNINTON şi altele, dau reacţii
adverse foarte puternice şi nu-l pot suporta mulţi pacienţi. Preparatul nostru „HEPATITO-LIZ”, spre
deosebire de ceilalţi interferoni clasici, se administrează per os şi nu provoacă absolut nici o reacţie adversă
care să pună pacientul în dificultate. Dimpotrivă, după câteva zile de utilizare a preparatului „HEPATITO-
LIZ” pacienţii simt o energie în timpul zilei şi un somn mai profund în timpul nopţii. Sunt două tipuri de
capsule care se administrează. Una energizantă dimineaţa, cu o oră înainte de micul dejun, se înghite cu un
pahar de ceai de codiţe de 3 cireşe, care se bea ca pe apă dintr-o singură înghiţitură. După ce a luat capsula
de dimineaţă, este obligatoriu ca pacientul să stea întins pe partea dreaptă timp de o oră. Capsula de seară se
administreză cu 2-3 ore după cină, când stomacul este gol, apoi se întinde pe partea dreaptă. După
administrare, capsulele se dizolvă în aproximativ 15-20 de minute, exact când ajung în regiunea duodenului
unde conţinutul se absoarbe în cea mai mare parte în sânge şi este transportat la toate organele, inclusiv la
ficat.
115
Datele experimentale ale clinicii noastre au demonstrat că aceste proteine ridică considerabil numărul
de trombocite, scade cantitatea de colesterol din organism, reglează cantitatea imunoglobulinelor mai ales a
g-globulinelor. Scad transaminazele până la valori normale. Viremia (încărcătura virală) scade considerabil.
Ciclul tratamentului este de trei luni de zile, după care se repetă analizele pentru determinarea stării
funcţionale a ficatului (transaminazele, electroforeza, hemoleucograma, ecografia, viremia). În funcţie de
analizele pacientului se recomandă dacă se continuă tratamentul sau se modifică compoziţia.
Dacă se consideră că hepatitele s-au tratat odată cu dispariţia virusurilor din organism, atunci putem
spune că viruşii HBs se elimină mai rapid decât viruşii HCV.
Un alt preparat - „IMUNO-MAX” - a fost testat pe pacienţi infectaţi cu HIV (SIDA). Tehnica de
utilizare a preparatului este aceeaşi ca şi la „HEPATITO – LIZ”. Se administrează câte două capsule pe zi,
doar componenţa proteinelor diferă evident. Parametrii de urmărire a efectului preparatului sunt următorii:
CD4, CD8, viremia, hemoleucograma, greutatea şi înălţimea corpului pacientului.
Din datele noastre clinice avem multe cazuri când în urma utilizării preparatului IMUNO-MAX
viremia a scăzut până la nivel nedetectabil, CD4 şi CD8 au ajuns în limite normale. Toţi pacienţii au crescut
în greutate după tratament, iar copiii au crescut în înălţime.
Pe baza SBA extrase din anumite specii de insecte a fost elaborat preparatul HERPES-LIZ, în
baza brevetului din anul 2000 N-00579/118114, care se prezintă sub forma unui unguent ce se aplică pe
ţesutul infectat de 2-3 ori de zi. Matricea unguentului are proprietatea de a penetra până în adâncul ţesutului
infectat, inducând şi substanţa activă, care stopează multiplicarea virusurilor la etapa asamblării acizilor
nucleici în nucleocapside. Acizii nucleici în afara nucleocapsidelor se distrug rapid şi sunt eliminaţi din
celule precum un corp străin.
Veziculele cu lichid, imediat se usucă iar leziunile se repară fără a lăsa urme nedorite pe piele. Pe
figură este demonstrat un caz la începutul tratamentului şi peste 5 zile de la tratament.
Preparatul „HERPES - LIZ” este destinat lizării infecţiilor herpetice‚ Simplex 1 şi Simplex 2, care
în fond atacă ţesuturile mucoase din jurul gurii şi aparatului genital, inclusiv fesele. Infecţiile herpetice pot
provoca multe complicaţii grave şi sunt răspândite intens mai ales la adolescenţi. Preparatul se prezintă sub
formă de unguent, iar substanţa activă este o proteină cu efect antiviral. Unguentul se aplică pe zonele
infectate şi se masează uşor timp de câteva minute până când este absorbită complet de către ţesut. Infecţia
dispare în timp de 7-8 zile. Procedura se repetă de două-trei ori până când herpesul este vindecat.
Un alt preparat antiviral este elaborat în baza brevetului din 2000 cu N 00580/118115, care este
denumit HEPATITO-LIZ şi este destinat eliminării infecţiilor hepatice provocate de virusurile
A,B,C,D,E,G, foarte des întâlnite în populaţiile cu densitate mare. Virusurile sunt bine specializate şi
infectează numai anumite zone ale ficatului, provocând virozele hepatice foarte greu suportate de pacienţi.
În componenţa ţesuturilor insectelor se mai ascund multe SBA miraculose, încă nedescoperite de
către om. Dar, dintre aceste substanţe cele mai însemnate sunt cele cu efect antiviral, ce reprezintă un tip de
116
inhibitori ai sintezei proteinelor virale, aşa cum la stadiul de formare a adulţilor, care încep a se forma în
pupe, reprezintă în cea mai mare măsura o cheratină (substanţă moartă).
În secolul XXI va fi secolul în care cercetările în domeniul infecţiilor virale vor fi aprofundate, şi se
vor obţine noi informaţii despre aceste structuri. Este interesant faptul că până acum structura virusurilor a
fost bine studiată, dar rămâne de aflat care sunt relaţiile dintre acizii nucleici şi proteine în cazul funcţiilor
virale. Această problematică poate constitui o lucrare aparte, pe care sper să o scriu în viitor şi în limba
română.
SBA extrase din anumite specii de insecte au şi proprietăţi de eliminare a infecţiilor bacteriene, mai
ales a celor provocate de stafilococi şi streptococi. Pentru acestea am elaborat preparatul „BACTERIO–
LIZ”. Proteinele preparatului induc o rezistenţă a celulelor, iar infecţiile sunt eliminate mai uşor.
O reuşită clară am demonstrat-o la eliminarea acneelor acute provocate de Stafilococcus aureus şi
Stafilococcus albus.
117
Proteinele antibacteriene sunt eficiente şi împotriva bacteriilor care provoacă sinuzitele şi bronşitele
atât de des întâlnite în populaţie. Proteinele preparatului sunt înglobate într-un lipogel special. Se aplică
seara înainte de culcare. Se aplică în urechi cu ajutorul a două tamponase de vată, care mai întâi se inbibă în
lipogel apoi se introduc în urechi unde se lasă toată noaptea. Se aplică şi în fosele nazale, ungând interiorul
nasului cu un beţişor pe care se pune vată. Cu un alt tampon se ung gingiile, cerul gurii şi se masează uşor
limba. Când gelul se amestecă bine cu saliva se înghite cu înghiţituri mici. Este important ca, după aceste
proceduri să se adoarmă, deoarece în timpul somnului glandele salivare funcţionează mai lent şi atunci
preparatul acţionează o perioadă de timp mai îndelungată. Dimineaţa, în primul rând, se face o gargară cu o
soluţie specială pregătită după următoarea compoziţie: la 200 ml de apă caldă, se adaugă o linguriţă mică de
bicarbonat de sodiu, una de sare de bucătărie şi 3-4 picături de tinctură de iod de 2% (soluţie utilizată de
mine în laborator pentru dezmembrarea virusurilor). Gargara se face 3-4 minute. Ea se repetă după fiecare
masă în aşa fel încât în cavitatea bucală să nu rămână nici un fel de resturi de hrană. În timp de 13-14 zile se
curăţă complet toate sinusurile şi bronhiile. Tusea stopează în câteva zile. Se curăţă şi tractul respirator.
După acest tratament majoritatea pacienţilor au revenit şi mi-au mulţumit.
Preparatul „BACTERIO-LIZ” are efecte miraculoase şi asupra escarelor şi paradontozelor
considerate foarte greu de tratat. În cazul escarelor, preparatul se aplică de două ori pe zi într-un strat subţire
care să acopere toată leziunea atunci când se schimbă pansamentul. Înaintea aplicării preparatului, rana se
curăţă bine cu soluţie de rivanol la care se adaugă 59 mg de rimfapicină (antibiotic de inhibare a ARN). Pe
rană nu se pune direct tifon ci o fâşie de celofan dezinfectat, care să nu permită lipirea bandajului de rană,
deoarece distruge crusta sub care se formează celulele noului ţesut. În cazul parodontozei, înainte de
aplicarea gelului cu proteină antibacterienă, cavitatea bucală se clăteşte cu soluţia descrisă anterior (la 200
ml apă caldă se adaugă o linguriţă de bicarbonat de sodiu, una de sare de bucătărie albă extrafină şi 3-4
picături de tinctură de iod). În urma acestui tratament infecţia dispare, iar gingiile revin la normal.
Am descoperit proteine antifungice pe care le-am folosit pentru elaborarea preparatului - „MICO-
LIZ”, care este eficace în combaterea candidozelor bucale, vaginale, unghiale şi a micozelor cutanate.
Pentru eliminarea candidozelor bucale se foloseşte aceeaşi procedură ca şi în cazul sinuzitelor, doar
compoziţia lipogelului diferă. Pentru micozele vaginale se folosesc supozitoare speciale, care includ
proteinele antifungice. Ele se aplică în fiecare seară înainte de culcare. După introducerea supozitorului
(ovulelor) în vagin este necesar ca pacienta să se aşeze în decubit dorsal în aşa fel încât trenul inferior să fie
poziţionat la 25 –30 de grade mai sus decât trenul superior, pentru dispersarea uniformă a proteinei. O dată
la trei zile este necesar să se facă spălături vaginale cu ceai de gălbenele până când apa eliminată este perfect
curată. În timp de aproximativ 30 de zile micoza va fi eliminată definitiv fără complicaţii.
118
În cazul micozelor cutanate, zona infectată se şterge la început cu soluţie de bicarbonat de sodiu, sare
de bucătarie şi tinctură de iod apoi se aplică unguentul „MICO-LIZ”. De obicei procedura se aplică seara
înainte de culcare. În cazuri mai grave se aplică şi dimineaţa.
O nouă direcţie de cercetare şi aplicare sunt preparatele destinate profilaxiei sistemului
cardiovascular. În primul rând de lizare a trombilor din vene şi a embolilor din artere. În cazurile varicelor se
aplică unguente la baza cărora stă o proteină cu proprietăţi de lizare a trombilor şi spasmelor. Se masează
picioarele afectate cu unguentul „pentru îngrijirea gleznelor” şi „îngrijirea picioarelor” începând cu degetele
de la picioare, talpă, glezne, mai ales în zona unde piciorul este de culoare maronie. Masajul se face de jos în
sus, spre genunchi în aşa fel încât unguentul să fie complet absorbit de către piele. După 14-28 zile de
tratament vasele dilatate se retrag sub piele şi se decolorează până la culoarea normală a pielii. În urma
tratamentului circulaţia sanguină se normalizează. La fel şi temperatura picioarelor revine la normal.
În cazurile arteritelor se aplică unguentele şi capsule cu proteine. Preparatul folosit este
,,UNGUENTUL PENTRU ÎNGRIJIREA PICIOARELOR”. Se administrează şi capsulele seara cu 2-3
ore după masă, pe stomacul gol, iar dimineaţa se fac masaje cu unguente. Piciorul se masează începând de la
glezne în sus spre genunchi. Dacă piciorul este înnegrit, masajele se fac uşor pe degetele afectate, în toate
direcţiile. După un tratament de 30-40 de zile în regiunea afectată reapare circulaţia normală. Astfel, dacă se
aplică tratamentul în timp util, picioarele pot fi salvate de la amputare.
Preparatele pentru tratarea tromboflebitelor şi varicelor au fost testate pe propriul organism.
În 2003 am stat la spitalul Colţea timp de 4 săptămâni. Mi s-a propus să se facă operaţie „by pass’’, care
putea să amelioreze durerile infernale. Medicii de la cardiologie a Spitalului de Urgenţă preconizau
119
„moarte”. Eu m-am salvat singur (Patent N 706/03.10.2003) şi am înregistrat preparatele la Ministerul
Sănătăţii.
Prezint fotografii reale (Fig.) până şi după tratament. La un moment dat după un efort efectuat la
Universitatea din Louvain din BELGIA.
120
În viitor, vom produce preparate noi perfuzabile, care vor permite efectuarea unor profilaxii a
întregului sistem sanguin. Vor fi posibile eliminarea spasmelor din interiorul vaselor sanguine şi eliminarea
operaţiunelor chirurgicale de înlăturare a vaselor înfundate, deoarece după înlăturarea unor vase înfundate
apar altele. În cazurile noastre nu am avut surpriza ca emboliile sau tromozele să recidiveze.
Preparatul „Crema solidă IMUNO-MAX” are proprietatea de a absorbi hemoroizii şi a stopa
hemoragiile în timp de 15-30 de zile evitând astfel operaţiile chirurgicale, care de multe ori provoacă mari
complicaţii la nivelul intestinului sau rectal. Preparatul se aplică după fiecare scaun. Se spală regiunea
anusului cu apă călduţă, apoi se şterge cu un prosop. În cazul hemoroizilor externi, unguentul se aplică direct
pe hemoroizi. Dacă hemoroizii sunt şi interni există două posibilităţi: clismă sau supozitoare speciale. În
cazul clismei, se pregăteşte o soluţie compusă din 20 ml apă caldă şi un gram (un vârf de cuţit) de unguent.
Se amestecă până se obţine o suspensie uniformă, care apoi se foloseşte pentru clismă. Pacientul se aşează
pe pat în decubit dorsal. Cu o pompiţă se absoarbe suspensia care apoi este introdusă rectal. După
introducerea soluţiei, pacientul se întoarce în decubit ventral, cu trenul inferior la 30 de grade mai ridicat
decât cel superior şi aşteaptă timp de 30 de minute. Astfel, suspensia pătrunde până în adâncul intestinului,
rect şi absoarbe formaţiunile hemoroidale. A doua posibilitate o reprezintă supozitoarele speciale (Crema
solidă „Imuno-Max” cu efect antihemoragic şi anti fisural. Pacientul se aşează pe pat în decubit dorsal. Se
introduce supozitorul rectal, pacientul se întoarce în decubit ventral, cu trenul inferior la 30 de grade mai
121
ridicat decât cel superior şi aşteaptă timp de 30 de minute. Supozitorul se topeşte la temperatura corpului şi
se uniformizează în tot anusul, absorbind hemoroizii fără a provoca dureri şi fără a lăsa urme nedorite.
Alte preparate elaborate de centrul nostru aplicativ sunt cele antireumatice: „REUMATO-LIZ”,
„SPONDI-LIZ”, „CIOCO-LIZ”. În cazul durerilor reumatismale (spondilozelor, spondilitelor,
astiofitelor), se fac masaje cu unguentele respective pe zonele dureroase timp de 10-15 minute. Durerile
dispar după câteva masaje dar cauza se rezolvă numai după 4-5 cicluri de masaje a câte 14 proceduri.
Mecanismul de acţiune continuă să fie studiat, dar efectul este garantat.
Unele dintre cele mai grave afecţiuni la femeile de 45-55 de ani sunt fibromul uterin, nodulii de sân
şi chisturile ovariene. Pentru asemenea afecţiuni am preparat „FIBROMO-LIZ”. Pentru fibromul uterin au
fost elaborate ovule (supozitoare) speciale, care se aplică în vagin înainte de culcare, apoi este necesar să se
stea cu bazinul ridicat 25-30 de grade faţă de restul corpului timp de 20-30 de minute. O dată la trei zile se
fac spălături vaginale.
122
Problema întineririi pielii a devenit una acută în fosta Uniune Sovietică, mai ales după catastrofele
nucleare de la Cernobâl şi multe alte incidente nedeclarate până acum. Cine a frecventat regiunea Kiev,
Gomel din Bielorusia nu se poate să nu fi observat că localnicii arată îmbătrâniţi înainte de vreme.
Majoritatea oamenilor în vârstă de până la 40 de ani par a avea 60-70 de ani. Cremele noastre biologice
bazate pe proteine extrase din insecte sunt utile nu numai pentru a întineri pielea, dar şi pentru a-i da o
elasticitate mai mare, astfel încât să nu permită penetrarea microorganismelor cauzatoare de infecţii.
Preparatul „KERATO-LIZ” are proprietatea de exfolia tegumentul cornos, mai ales de la nivelul
bătăturilor, îngroşările din jurul unghiilor şi altele. Sunt convins că odată cu mărirea productivităţii acestor
preparate, vom putea rezolva multe dintre afecţiunile omului.
O altă problemă este calviţia. Mai ales la bărbaţi, care după vârsta de 50 de ani, aproximativ 70%
rămân aproape fără păr pe suprafaţa capului. În ultimul timp, am elaborat un ŞAMPON, o LOŢIUNE şi un
BALSAM PENTRU ÎNGRIJIREA PĂRULUI. ( Brevetele NA 877/14.10.2005, NA878/14.10.2005 ).
Loţiunea de păr conţine substanţe activatoare de creştere a părului, iar şamponul şi balsamul conţin substanţe
care determină regenerarea şi întărirea firului de par. Vă puteţi convinge pe exemplul subsemnatului, care
utilizând un unguent cu substanţe active pentru absorbţia unui lipom de pe mâna dreaptă, am observat că
părul de pe mână a crescut considerabil în comparaţie cu cealaltă mână.
123
ROLUL FUNCŢIONAL AL PROTEINELOR
Dintre toţi compuşii chimici cunoscuţi, proteinele sunt cele mai complexe şi în acelaşi timp cele mai
caracteristice materiei vii. Ele sunt prezente în toate celulele vii, sunt compuşi care ca şi
nucleoproteine sunt esenţiale procesului de diviziune celulară şi ca enzime şi hormoni controlează
multe reacţii chimice în metabolismul celular. Ca unic constituent al virusurilor, nucleoproteinele sunt
sinonime.
TIP EXEMPLE
3.Asociate cu Glicoproteine,lipoproteine,emp
membrane hore
Proteine structurale
Grupate ca proteine structurale sunt proteinele fibroase sau insolubile şi unele proteine globulare care
au un rol structural, dar fără activitate enzimatică.
Proteine contractile
Una din caracteristicile animalelor este mobilitatea care este asociată cu prezenţa proteinelor
contractile. În insecte, ca şi în alte organisme diferenţiate aceste proteine contractile sunt prezente
într-un singur ţesut şi anume muşchiul. Componenţii proteici majori ai muşchilor sunt actina şi
124
miozina, dar au fost descrişi şi alţi componenţi proteici implicaţi în contracţia muşchilor.
Proprietăţi fizico-chimice
Actina există în două forme, monomerul globular G-actina şi polimerul fibros cu greutate moleculară
foarte mare E-actina.
La mamifere G-actina are 4,3-4,7*104. G-actina conţine 374 resturi, corespunzător unei GM 4,1-
4,2*105 Da. G-actina conţine o moleculă de ATP şi Ca2+ (sau Mg2+). Dacă este expusă, săruri 0,1M cu
Mg2+ se polimerizează foarte rapid la F-actină ; în proces ATP este hidrolizat la ADP + Pi, are deci o
activitate ATP-ozică. Prin ultrasonare sau tratament cu ATP reacţia este reversibilă :
Actomozina este complexul molecular al actinei şi miozinei. Este obţinut prin extracţie din muşchi mai
întâi cu apă pentru a îndepărta enzimele glicolice şi apoi cu KCl 0,6M.
Altă proteină musculară este tropomiozina sau paramiozina. Este un helix încolăcit cu HM 2,2*105 şi
lungime aprox. 130-140nm.
125
Troponina I : cu GM=23000
Troponina C : cu GM=18000
Izolarea miozinei, actinei şi tropolinei din muşchiul fibrilat de la insecte a relevat unele diferenţe între
proteinele din insecte şi cele din muşchii vertebratelor. Cele două feluri de miozine au aproximativ
aceeaşi GM, dar diferă compoziţia subunităţii uşoare. Activarea tropomiozinei pare să fie cea mai
mare diferenţă între muşchiul de vertebrate şi de insectă.
Fibroinele
Fibroinele sunt substanţe proteice excretate de diferite specii de artropode în glande speciale şi
depozitate acolo în soluţie înaintea extrudării pentru a forma filamente. Mătasea joacă un rol
important în viaţa multor insecte: nu trebuie menţionată importanţa mătăsii în viaţa păianjenilor.
Structura
Fibroina din mătase este foarte variată în structura lor primară şi secundară. Au fost descoperite
126
tipuri de β-fibroină paralelă, conformaţii care corespund tipurilor: β încrucişate, α-helix şi chiar tipul
colagen. Se vorbeşte de mătasea din larvele de himenoptere (albine, viespi, furnici) care sunt de tip α-
helix.
Fibroinele din Saturniidae au un conţinut ridicat de alanină şi un conţinut mai mic de Gly şi Ser. A
fost foarte mult studiată mătasea de la B. mori. Ea constă dintr-un dublu filament de fibroină
îmbrăcat într-o proteină globulară sericinia. Fibroina din B. mori este o proteină de cocon sintetizată
şi secretată de la capătul posterior al glandelor de viermele de mătase. Fibroinele din Bombycidae şi
Satuniidae au conţinut foarte mare de Ala şi Gly. Filamentele de mătase din B.mori au diametrul de
40 A˚ care constau din două bare de aproximativ 20 A˚ în diametru. Fibroinele pot fi împărţite în
cinci grupuri.
Una din problemele în studiul structurii moleculare a fibroinei din mătase este dificultatea de a
solubiliza fibroina.
Procedeele clasice de solubilizare prin fierbere în mediul alcalin duceau la degradarea moleculei de
fibroină. Mai nou a fost extrasă fibroina direct din glanda de mătase şi s-a determinat GM=3,6*105.
Prin tratament cu clorhidrat de guanină 6-8M sau uree s-au obţinut două fracţiuni una cu coeficient
de sedimentare 4,6S care corespunde sericinei şi alta cu coeficient de sedimentare 10S care
corespunde fibroinei, adică GM=3,65*105.
Fibroina care formează coconii la diferite specii de insecte are aceeaşi funcţie: protecţia de prădători,
de temperaturi extreme, atac microbiologic şi rigorile generale ale climei.
Biosinteza
Proteina din mătasea de B. mori conţine 45% din resturile de Gly alternând mai ales cu resturi de Ala
şi Ser, deci ARNm va avea cel puţin 57% din codoni pentru Gly. Gena structurală pentru fibroină constă din
ADN dublu helix de 11,12 106 Da.
O problemă legată de fibroină din cocon este mecanismul utilizat de viermele de mătase şi alte
specii să iasă din cocon. Pentru acest scop, celule specializate se dezvoltă pentru a produce o cantitate mare
dintr-o enzimă proteolitică, coconaza.
La timpul de ieşire, enzima care iniţial este sub formă de cristal sau semicristal se redizolvă la pH-ul
ei optim de 8,3 într-o soluţie secretată de altă glandă. Este pusă în contact cu coconul şi digeră sericina care
leagă fibrele de mătase împreună. Structura coconului este stabilă şi insecta îşi găseşte calea de ieşire.
Diferenţierea acestor celule este sub controlul hormonal al ecdisonei şi hormonului juvenil. Coconaza
prezintă o asemănare chimică remarcabilă cu tripsina de la mamifere şi alte proteaze serinice cu GM
aproximativ egală cu 24000. Compoziţia în aminoacizi este foarte asemănătoare cu cea a tripsinei din
bovine. Coconaza este diferită de enzima protolitică din fluidul de năpârlire, deci au arene mesageri
specifici.
127
Proteinele din tegument
Integritatea unui ţesut structural este menţinută de influenţa concertată a forţelor fizice şi covalente
între polipeptide şi polizaharide. La fel ca la pielea vertebratelor, exoscheletul insectelor are stabilitate
de la legăturile între lanţuri între resturi specifice de aminoacizi din proteine fibroase şi carbohidraţi.
Proteinele structurale şi enzimele din cuticulă participă la procesul de întărire (« tăbăcire ») cunoscut
ca sclerotizare. Sclerotizarea implică hidroxilarea tirozinei la dihidroxifenilalanina (dopa) care este
decarboxilată la dopamina de dopa-decarboxilaza. Dopamina este N-acetilată la N-acetildopamină.
Sub acţiunea fenolazei, N-acetildopamina este oxidată la o ortochinonă care reacţionează cu gruparea
amino din proteinele cuticulei ; apoi oxidată la dichinonă ca o răspunzătoare de o difenoloxidază.
Spre deosebire de fibroine, proteinele cuticulare au mulţi aminoacizi cu lanţuri laterale. Aminoacizii
din proteinele cuticulare sunt : Asp, Glu, Ser, Gly, Thr, Ala, Tyr, Val, Phe, Leu, Ileu, Pro, Hyp, Lys, Trp şi
probabil Cys şi Met în cantităţi mici.
Un tip special de proteină cuticulară este o proteină insolubilă numita resilină. E posibil ca o parte
din proteinele cuticulare să fie conjugate cu chitina şi glicoproteine.
Colagenul
Colagenul este cea mai importantă fibră insolubilă din ţesutul conjunctiv. Funcţia lui fiziologică este
să acţioneze ca un material inert inextensibil care transmite tensiunile exercitate de muşchi, de
exemplu în tendoane sau în oase. Colagenul este deosebit de inert faţă de enzimele proteolitice mai
ales în stare nativă şi este convertit în gelatină la fierbere îndelungată cu apă sau alcali. Colagenul
apare în multe clase de animale, inclusiv insecte.
Colagenul are o compoziţie neobişnuită de aminoacizi : aproximativ o treime din Gly şi alta treime
Pro sau Hyp. Molecula de colagen sau tropocolagen (colagen solubil sau extras) constă din trei lanţuri
care sunt identice sau neidentice în funcţie de ţesut şi specie. Lanţurile sunt cunoscute ca α 1, α2 şi α3.
Diferitele tipuri de colagen sunt cunoscute ca I, II şi III. Astfel au fost descrişi colageni ai căror
molecule constau din :
128
Histonele
Histonele sunt proteine bazice asociate cu AND-ul. Sunt proteine structurale, dar acţionează şi ca
represori ai activităţii rocilor. Histonele sunt proteine foarte conservate, au foarte mici diferenţele în
secvenţele de aminoacizi. Ele sunt clasificate după caracteristicile chimice.
Chitina este unul din cei mai importanţi biopolimeri în natură. Este în principal produsă de fungi,
artropode şi nematode. La insecte funcţionează ca material de susţinere pentru cuticulele epidermei şi traheei
ca şi matricile peritrofice, căptuşind epiteliul intestinal. Creşterea şi morfogeneza insectelor sunt strict
dependente de capacitatea de a remodela structurile care conţin chitina.
Pentru acest scop, insectele produc în mod repetat chitinsintaze şi enzime chitinolitice în diferite ţesuturi.
Coordonarea sintezei chitinei şi degradării ei necesită un control strict al enzimelor participante în timpul
dezvoltării. În această lucrare noi sumarizăm progresele recente în înţelegerea sintezei chitinei şi degradării
ei la insecte.
Cuticulele insectelor formează un exoschelet care prezintă numai o capacitate limitată de a permite
creşterea corpului pentru că este o structură mai mult sau mai puţin rigidă, datorită prezenţei chitinei şi
sclero-proteinelor. Pentru a permite creşterea şi dezvoltarea insectelor trebuie să-şi înlocuiască cuticula
veche cu una nouă prin năpârlire (ecdysis). Năpârlirea este iniţiată de apoliză, procesul care separă celulele
epidermice de cuticula veche prin lichidul de năpârlire. Lichidul conţine proteaze şi chitinaze care digeră
constituenţii principali ai endocuticulei vechi, care vor fi resorbiţi şi reciclaţi pentru formarea cuticulei noi.
Insectele îşi leapădă învelişul vechi, care acum se cheamă exuvie. Intervin şi hormoni de năpârlire, de
exemplu hormonul de ecloziune.
Chitina este un polimer de N-acetil-β-D-glucozamină. Prin RMN şi analiză gravimetrică s-a văzut că
chitina constituie până la 40% din greutatea uscată a exuviei în funcţie de specie şi variază considerabil cu
diferitele tipuri de cuticulă chiar la acelaşi organism. Chitina este asociată cu proteina care determină în
principal proprietăţile mecanice ale cuticulei. La Locusta migratoria au fost observate prin elecroforeză 2-D
mai mult de 100 de proteine diferite. Una din cele mai bine înţelese proteine este resilina, o proteină bogată
în glicocol şi prolină, care conferă o mare elasticitate cuticulei din regiunile articulaţiilor. Insectele conţin
chitină şi în matricile peritrofice care căptuşesc tubul digestiv 2 tipuri: Tipul 1 este pe întreg traseul tubului
digestiv; Tipul 2 numai în zona cardia (între esofag şi intestinul anterior). Matricele peritrofice au de obicei
3-13% chitină. La Manduco sexta 40% matricile peritrofice mai conţin un amestec de proteine, glicoproteine
şi proteoglicani.
STRUCTURA CHITINEI
Este cel mai răspândit amino-polizazaharid în natură. Se estimează că anual se produc aproape la fel de mult
ca celuloza. În special în exoscheletul artropodelor, pereţii celulari ai fungilor, coaja ouălor de nematode.
Derivaţi ai oligomerilor chitinei au fost implicaţi ca factori morfogenici în comunicarea între plantele
legumionoase şi Rhizobium şi chiar în vertebrate unde pot fi importanţi în stadiile timpurii ale
embriogenezei.
Chitina este compusă din resturi de N-acetil-glucozamina legate prin legături β-(1-4) - glucozidice. Hidroliza
cu chitinază dă glucozamina şi N-acetil-glucozamină. Totuşi RMN-ul cuticulei de la viermele cu corn al
tutunului a arătat că nu este prezentă glucozamina. Chitina tinde să formeze microfibrile (numite şi bare sau
cristalite) de aprox 3 mm în diametru stabilizate prin legături de hidrogen între grupările amino şi carbonil.
Microfibrele din matricile peritrofice pot chiar să depăşească 0,5µ în lungime şi sunt frecvent asociate în
fascicule conţinând grupe paralele de 10 sau mai multe microfibrile. Difracţia de raze X a sugerat că chitina
129
este o substanţă polimorfă care apare sub 3 modificări cristaline, numite chitina α -, β - şi µ -. Ele diferă în
principal în gradul de hidratare, în mărimea unităţii şi în numărul de lanţuri de chitină. În forma α toate
lanţurile prezintă o orientare antiparalelă; în forma β lanţurile sunt aranjate paralel; în forma µ seturi de 2
lanţuri paralele care alternează cu lanţuri antiparalele singulare. Stări necristaline tranzitorii s-au găsit la
ciuperci. Toate cele 3 forme cristaline se regăsesc în structurile chitinoase ale insectelor. Forma α este
predominantă în cuticulele chitinoase, formele β şi nu sunt frecvent găsite în coconi. Matricile peritrofice
constau de obicei din α şi β - chitină. Uneori prezenţa β - chitinei în coconi se explică prin faptul că unii
coconi se formează din matricile peritrofice; de ex. cele din gândacul păianjen australian Ptinus tectus, un
gândac specializat.
Aranjamentul antiparalel al moleculelor de chitină în forma α permite o împachetare strânsă a
microfibrelor de chitină constând în aprox 20 lanţuri de chitină stabilizate printr-un mare număr de legături
de hidrogen intră şi inter moleculare. Acest aranjament contribuie semnificativ la proprietăţile fizico-
chimice ale cuticulei de ex. rezistenţa mecanică şi stabilitatea. Spre deosebire, în formele β şi µ tăria
împachetării şi numărul de legături de hidrogen între lanţuri sunt reduse, fiind un număr mare de legături de
H2 cu apă. Gradul înalt de hidratare şi tăria redusă a împachetării duc la structuri chitinoase mai flexibile şi
moi, în matricile peritrofice sau coconi. Diferenţele în aranjamentul microfibrelor de chitină între cuticule şi
matricile peritrofice ajută la înţelegerea funcţiei lor. Cuticula este secretată sub formă de straturi subţiri de
microvilii apicoli ai celulelor epidermice. Microfibrele de chitină sunt incluse în matricea de proteine şi se
stabilizează ca betonul armat. În matricile peritrofice microfibrele sunt aşezate în mod normal într-o reţea de
structuri incluse într-o matrice amorfă şi numai în puţine cazuri au fost găsite configuraţii înalt ordonate.
FORMAREA CHITINEI
DEGRADAREA CHITINEI
130
Chitinsintazele şi enzimele chitinolitice lucrează mână în mână în remodelarea structurilor
chitinoase. Enzimele degradative includ chitinazele {poli[1,4-(N-acetil-β-D-glucozaminid)]
glicanohidrolază; EC 3.2.1.14} şi β-N-acetilglucozaminidazele (β-N-acetil-β-D-hexozaminid N-acetil-
hexozaminohidrolaze; EC 3.2.1.52). Toate catalizează hidroliza legăturilor β-1-4) - glicozidice ale
polimerilor şi oligomerilor chitinei. Unele din ele incluzând o enzimă din insecte catalizează reacţiile de
transglicozilare. Deoarece enzimele care degradează chitina pot fi utilizate pentru a converti materia primă
cu chitina în componenţi utilizabili biotehnologic, ele sunt importante pentru industria chimică şi
farmaceutică. În plus, chitinazele şi inhibitorii lor pot fi adoptate ca insecticide pentru dăunători sau ca
fungicide.
La organismele care produc chitina enzimele chitinolitice sunt esenţiale pentru menţinerea normală a
funcţiilor ciclului de viaţă, de ex. morfogeneza la artropode sau diviziunea celulară şi sporularea la drojdii şi
alte ciuperci. Ele sunt de asemenea găsite şi în organisme care nu conţin chitin, dar utilizează chitina ca
sursă de hrană, de ex. Streptomyces spp. Au fost identificate gene pentru chitinază în genomul virusului
poliedrozei nucleare (din familia Baculoviridae) insectei Autographa californica, virus specific pentru
artropode.
La insecte, enzimele care degradează chitina joacă un rol crucial în dezvoltarea postembrionară, în
special în năpârlirea larvei şi impupare. Enzime chitinolitice se găsesc de asemenea în unele veninuri de
himenoptere şi în fluidul digestiv la păianjeni unde ele pot facilita pătrunderea toxinelor prin cuticula prăzii.
Recent a fost descoperită o chitinază specifică de corp gras în ţesutul glandei de lapte şi poate fi importantă
pentru dezvoltarea intrauterine a larvelor muştei tsetse vivipare Glossina morsitans.
Este greu de scindat chitina datorită proprietăţilor ei fizicochimice
Endo-chitinazele o scindează la chito-oligomeri. Apoi sunt convertiţi la monomeri prin exo -β-N-
acetilglucozaminidaze.
Enzima exo-desprinde unităţile de N-acetil-glucozamină de la capătul nereducător şi preferă
substanţe mai mici decât chitinazele. Ca urmare viteza generală a hidrolizei chitinei este limitată de acţiunea
chitinazei care produce chito-oligomeri, care măreşte concentraţia efectivă de substrat pentru β-N-
acetilglucozaminidază.
Mecanismul catalizei pare să fie similar cu cel pentru complexul celulazei (endo- şi exocelulază).
Lucru interesant: apariţia ambelor enzime chitinolitice pare să fie în ordine inversă. La Manduca, Bombyx
mori şi Locustae xo - chitinaza apare la năpârlire mai devreme decât endochitinaza. Deoarece cuticula este o
matrice de chitină şi proteine puternic legate, trebuie să fie prezente şi proteaze.
Datorită rolului vital al chitinei în dezvoltarea insectelor, degradarea ei trebuie să fie bine reglată
ca şi sinteză. Activitatea chitinazelor din tegument este restrânsă la perioadele de năpârlire şi impupare, în
timp ce chitinazele din intestin sunt induse de hrănire.
Degradarea cuticulelor de către enzimele chitinolitice necesită cu siguranţă contribuţia proteazelor în
fluidul de năpârlire, care degradeză componenţii proteici. Aceste proteaze pot deasemenea să funcţioneze în
activarea proteolitică a precursorilor reactivi ai chitinazelor.
Activarea proteolitică a chitinazelor a fost extensiv investigată la Manduca şi Bombyx. O formă
zimogenică probabilă a chitinazei cu o greutate moleculară de 215 kDa a fost observată la Bombyx mori în
cursul perioadei de toarcere. 2 – 3 zile mai târziu, când activitatea enzimatică este detectabilă, apar 3
fragmente active de 88 kDa, 65 kDa şi 54 kDa, care pot fi rezultatul unei procesări proteolitice succesive.
Ele au o secvenţă comună N-terminală, deci diferă în lungime la capătul C-terminal.
S-a sugerat că enzima de 88 kDa conţine un domeniu puternic de legare al chitinei. Acest domeniu
poate fi pierdut prin proteoliză de la capătul C-terminal, rezultând variante de chitinaze care sunt mai active
pe substraturi mai scurte.
Rezultate similare au fost observate la tegumentul de Manduca unde o proteină de 119 kDa poate fi
considerată ca un precursor zimogen şi câteva proteine mai mici ca fragmente activate proteolitic. Aceste
enzime cu proprietăţi de degradare a chitinelor au o mare importanţă. Noi am extras din unele specii de
131
insecte chitinaze. Ele au proprietatea de a regla unele procese de regenerare a unor formaţiuni cheratinice
cum sunt verucile seboreice, carcinoamele, keloizii, care apar foarte des şi pe pielea oamenilor, mai ales la
vârste întaintate (după 60 de ani). Substanţele Biologic Active extrase din insecte (Lepidoptere, Colioptere,
Diptere) la anumite stadii de dezvoltare, s-au folosit pentru realizarea unor unguente speciale ,,pentru
îngrijirea pielii”, care au proprietatea de a elimina formaţiunile cutanate chitinice sau cheratinice. Aceste
formaţiuni îmbătrânesc pielea omului. Pielea devine rigidă şi îşi pierde elasticitatea. De aceea, utilizarea
BSA din insecte pot interveni în procesul de regenerare al pielii îmbătrânite şi tratarea diferitor formaţiuni a
căror schelete sunt alcătuite din cheratine sau chitine.
Utilizând proprietăţile cheratolitice ale acestor substanţe biologic active, am construit o gamă de
preparate parafarmaceutice şi cosmetice foarte eficiente în tratarea unor boli de piele. Noi am fost primii,
care am intuit că unele substanţe cu acţiuni specifice insectelor, pot acţiona şi la om.
Deoarece metabolismul chitinei este crucial pentru dezvoltarea fungilor şi artropodelor, inhibarea
sau dereglarea enzimelor cheie sunt obiective importante pentru dezvoltarea fungicidelor şi insecticidelor.
Se consideră că polimerii de chitină sunt absenţi la vertebrate. Dar mai târziu s-a dovedit că sunt incluse
cheratina dar şi chitina în unele formaţiuni cutanate ale vertebratelor.
Inhibitorii sintezei chitinei au fost clasificaţi în 3 grupe majore: peptidil nucleozide, acil ureile şi
substanţe care interferă cu controlul hormonal. Peptidil nucleozidele izolate din specii diverse de
Streptomyces acţionează ca analogi ai substratului şi includ polioxinele şi nikomicinele. Ele inhibă
competitiv chitinsintazele atât în fungi cât şi în insecte, probabil prin legare la situl catalitic. Polioxinele şi-
au găsit câteva aplicaţii în combaterea fitopatogenilor. Aplicarea comercială a nikomicinelor este nesigură,
deşi par să fie inhibitori mai potenţi decât polixinele. În general utilizarea peptidilor nucleozidelor este
complicată din cauza permeabilităţii scăzute, labilităţii hidrolitice, susceptibilităţii variabile a speciilor de
fungi şi multitudinii de răspunsuri negative la animale.
Acil ureile joacă un rol important în controlul integrat al insectelor. Deşi este bine stabilit că acil
ureile (enzuronul şi teflubenzuronul) afectează sinteza chitinei, modul lor de acţiune este încă neclar.
Al treilea grup de inhibitori afectează reglarea hormonală a creşterii şi dezvoltării insectelor. Unul
din numeroasele efecte este dereglarea sintezei chitinei probabil prin împiedicarea exprimării chitin sintazei
sau a factorilor de reglare. Reglarea hormonală poate fi deranjată la nivelul biosintezei hormonilor.S-a arătat
că unii derivaţi sintetici ai imidazolului şi colesterolului împiedică biosinteza ecdysteroidului. Compusul
heterociclic brevioxima şi alcaloidul arborina prezintă un blocaj semnificativ al sintezei hormonului juvenil.
Inhibitorii chitinazei pot fi grupaţi în 2 clase majore: mimează fie substratele carbohidrat, fie
intermediarii. Cel mai studiat inhibitor al chitinazei este allosamidina, un pseudotrizaharid. Allosamidina
constă din 2 zaharuri de N-acetilallosamina legate la o allosamizolina care mimează intermediarul catalitic şi
nu poate fi hidrolizat pentru că îi lipseşte oxigenul piranozic.
Allosamidina este un inhibitor potent al chitinazei. Producerea lui este scumpă pentru că este dificil
de sintetizat. O nouă clasă alternativă de inhibitori include ciclopentapeptidele arginina şi argadina. Sinteza
lor este mai ieftină.
Până în prezent procesele de dezvoltare ale insectelor au fost studiate în scopul elaborării metodelor
de distrugere a lor prin metode chimice, fizice şi biologice. Reglarea densităţii populaţiilor de insecte
nedorite folosind insecticide de natură chimică sau metode fizice, influenţează negativ nu numai insectele
vizate, dar şi sănătatea omului.
De aceea, la ora actuală sunt necesare metode inofensive, care să elimine insectele nedorite, dar să nu
afecteze sănătatea organismelor utile. Elaborarea acestor metode implică studierea mai detaliată a proceselor
fiziologice ale insectelor. O dată cu aceste studii, s-a investigat în ce fel insectele pot fi utilizate în beneficiul
omului. De exemplu, unele specii de insecte care acumulează cantităţi mari de energie prin consumul de
plante, se pierd fără nici un folos, alteori ţesuturile insectelor distruse poluează mediul înconjurător şi
sănătatea oamenilor.
132
La un moment dat, autorului acestei lucrări i-a venit ideea de a utiliza insectele pentru obţinerea
unor SBA ce pot interveni în tratarea unor afecţiuni din cele mai grave ale omului. Astfel, informaţiile
despre biochimia insectelor pot induce extragerea unor SBA, care pot interveni în reglarea proceselor vitale
ale omului şi mai ales ale tratării afecţiunilor tumorale şi infecţiilor virale, care provoacă decesul oamenilor
la vârste încă tinere. Astfel, insectele pot contribui la mărirea longevităţii omului.
Suntem încă departe de înţelegerea modului de acţiune a enzimelor implicate, mai ales a
chitinsintazelor şi a chitinazelor. Nu cunoaştem mecanismele de reglare care controlează şi coordonează
biosinteza şi activitatea în timpul dezvoltării. O problemă majoră în studiul chitinsintazelor din insecte este
că noi încă nu avem preparate omogene din surse native, probabil din cauza lipsei de informaţii noi. În
ultimul timp, Baculovirusurile recombinate care conţin gene responsabile de sinteza chitinazelor la insecte,
constituie biocide potente care pot perturba funcţionarea matricei peritrofice a insectelor infectate, ducând
la o susceptiblitate crescută faţă de alţi compuşi toxici. Aceste virusuri au o structură complicată, iar
genomul lor permite obţinerea de recombinanţi, care pot fi folositi pentru sintetiza de compoziţii importante
pentru fabricarea de noi preparate farmaceutice. Astfel, importanţa insectelor creşte evident. Se organizează
crescătorii pentru unele specii de insecte. Direcţia de creştere special a insectelor se numeşte Entomologie
tehnică.
Se propune elaborarea de suplimente alimentare din ţesuturile insectelor (Ciuhrii, 2009) sau
sintetizarea ,,interferonilor” şi ,,citostaticelor” din anumite ţesuturi de insecte aflate la diferite stadii de
dezvoltare (Ciuhrii, 2009).
În concluzie, înţelegerea principiilor de bază ale metabolismului chitinei la insecte şi reglarea
lui va deschide noi căi în managementul dăunătorilor.
Se presupune o G.M de aprox. 180 kDa, cu 15-18 helixuri transmembranare, indicând că enzima este
integral o proteină de membrane. Prin PCR s-a văzut că este detectabilă în toate stadiile de dezvoltare şi că
se localizează în celulele epidermice sub procuticulă.
Fungii au gene multiple care codifică izoformele de chitin sintază. Nematrozii şi insectele au un
număr limitat de copii ale genei.
Secvenţa de AA a chitinsintazelor din fungi, nematozi şi insecte relevă că enzimele din insecte sunt
mai apropiate de nematozi decât din fungi.
Chitinsintazele din insecte sunt proteine transmembranare mari cu GM 160 kDa-180 kDa. Molecula
este formată din 3 domenii: A, B, C.
Domeniul A este în regiunea N-terminală. Domeniul A are un număr variabil de helixuri
transmembranare. În funcţie de numărul lor, capătul N-terminal pare să fie localizat pe diferite zone ale
membranei, fie spre mediul extracelular, fie în citoplasmă.
Domeniul B este în centrul moleculei şi cuprinde aproximativ 400 AA şi conţine centrul catalitic al
enzimei. Este înalt conservat şi conţine 2 motive unice, EDR (Glu-Asp-Arg) şi QRRRW ( Gln-Arg-Arg-
Arg-Trp) care sunt prezente în toate tipurile de chitin-sintaze şi deci pot fi privite ca secvenţe ,,semnături’’.
Unele resturi conservate se crede că sunt esenţiale pentru mecanismul catalitic pentru că pot fi implicate în
protonarea substratului. Substituirea unor AA ca alţii în aceste secvenţe reduc drastic activitatea chitin
sintazelor. Au fost descrise încă 3 blocuri înalt conservate în chitin sintazele din insecte: CATMWHXT
(Cys-Ala-Thr-Met-Trp-His - Thr; poz.583 - 590), QXFEY (Gln-?-Phe-Glu-Tyr; poz. 794-798) şi WGTRE
(Trp-Gly-Thr-Arg-Glu; poz. 1076 - 1080 în proteina 1 CHS la Drosophila.
Domeniul C cuprinde capătul C-terminal şi conţine 2 AA care ar putea de asemenea să fie implicate
în cataliză: W (Trp, poz 803) şi T (Thr, poz.805), imediat după helixul 5 transmembranar. El are 7 helixuri
transmembranare.
Pe baza diferenţelor de secvenţă chitina sintazelor au fost grupate în două clase: CHS-A şi CHS-B. Multe
insecte par să aibă o copie de genă pentru fiecare enzimă. Ambele gene sunt localizate pe un singur
cromozom la Drosophilla şi Anopheles, este posibil ca ele să provină dintr-un singur ancestor prin
duplicarea genei.
133
REGLAREA CHITINSINTAZELOR
Formarea şi degradarea chitinei sunt esenţiale pentru dezvoltarea insectelor. Metamorfoza insectelor este
reglată prin eliberarea ecdisonei, un hormon steroid secretat în hemolimfă de glandă protoracică.
Activitatea chitinsintazelor este mărită prin proteoliză limitată. Este tentant să speculăm asupra
existenţei unui pool celular de proenzime inactive care sunt activate de semnale specifice. În afară de
proteaze, factori reglatori care afectează activitatea chitin sintazei pot exista în insecte, la drojdie au fost
descrise câteva proteine implicate în reglarea sintezei chitinei.
De multe ori cheratina serveşte pentru formarea unor formaţiuni tumorale, aluniţe, nevi, care apar odată cu
mărirea vârstei omului. Cheratitele, care la prima vedere par banale, pot provoca apariţia formaţiunelor
tumorale, care la rândul lor se acoperă cu un strat de cheratină, care protejează formaţiunele tumorale.
Eliminarea formaţiunelor tumorale este imposibilă din cauza învelişului de cheratină, fapt care ne-a
sugerat să descoperim SBA, care pot dizolva cheratina din formaţiunele tumorale, producând ,,operaţii
biologice” pentru eliminarea formaţiunelor tumorale, fără a utiliza scalpelul sau cauterul. Astfel de operaţii
nu provoacă dureri şi nici semne nedorite pe ţesutul cutanat. Implementarea unor assemenea operaţii este o
premieră mondială, deoarece eliminarea formaţiunelor de cheratină duce la regenerarea epiteliului ţesutului
cutanat, care regenerează pielea.
CHITINAZELE DIN INSECTE
Până în prezent chitina reprezintă un material pentru construcţia diferitor sisteme a fiinţelor
umane. Spre exemplu construcţiei vaselor sanguine sau reparaţia ţesutului conjunctiv (ţesutului cutanat) sau
pentru repararea anumitor organe ale corpuluii uman. Eu sunt adeptul utilizării intense a chitinei în diferite
aspecte a activităţii umane,
134
Chitina poate fi numită un material de construcţie al diferitor formaţiuni nedorite (nevi, cheratoze,
veruci seboreice).
În prezent chitina reprezintă un material considerat ca un deşeu, care mai mult încurcă fiinţa umană.
Eu sunt adeptul utilizării intense a chitinei în diferite aspecte a activităţii umane.
Chitina poate fi numită un material de construcţie al diferitor obiecte.
În primul rând, chitina poate servi un material de construcţii al multor obiecte, inclusiv pentru
construcţia caselor şi obiectelor casnice (tacâmuri, lingerie şi altele). În cel mai scurt timp se vor descoperi
tehnologii noi de utilizare a chitinei. În domeniul construcţiei de obiecte casnice (mese, scaune, obiecte
artizanale). În viitor chitina va putea înlocui fierul, aluminiul, lemnul şi altele.
În ultimul timp avem intenţia să elaborăm nanotehnologii pentru construcţia vaselor sanguine din
unele ţesuturi ale animalelor nevertebrate.
Keratina, după structura ei în viitor poate înlocui fierul, aluminiul, cuprul şi alte materiale de
construcţie. Conform structurii organizate a chitinei, ea poate fi adaptată la alte structuri utile omului.
Am utilizat cheratinele pentru construcţia vaselor sanguine ale omului, deoarece în prezent vsele
sanguine se construiesc din diferite metale, care pot funcţiona un timp scurt şi trebuie schimbate. Tuburile
din cheratină pot funcţiona zeci de ani de zile. Aceste nanotehnologii la ora actuală se vor inplementa.
Această direcţie va constitui o premieră mondială.
În timpul ontogenezei organismelor, mai ales a omului, cantitatea de chitină se măreşte. Pielea se
cheratinizează, devine mai rigidă şi poate forma diferite leziuni prin care pot penetra diferite infecţii
periculoase. Cheratinizarea înseamnă îmbătrânirea pielii: apar riduri, veruci seboreice, aluniţe, negi şi alte
formaţiuni nedorite.
Chitina este uşor de obţinut, deoarece în corpul unor specii de insecte utilizate pentru
extragerea unor SBA, chitina rămâne un deşeu şi se consideră un deşeu, care poluează mediul înconjurător.
PEPTIDE ANTIBIOTICE
INTRODUCERE
Peptidele antimicrobiene de mamifere au asemănări cu cele din plante şi nevertebrate. Sunt codate cu
gene şi sunt iniţial sintetizate ca propeptide care conţin o secvenţă N-terminală de ţintire a reticului
endoplasmatic (numită şi semnal sau pre-secvenţă), secvenţa precursoare adiacentă (numită şi secvenţa
propeptidului) şi peptidul matur la capătul C-terminal. Peptidul matur activ este eliberat din precursor prin
scindare proteolitică şi are activitate împotriva unui şir mare de microbi, inclusiv bacterii, fungi şi unii
paraziţi.
135
Structural, peptidele sunt în general amfipatice, cele mai multe sunt cationice deşi recent s-au descris
şi peptide anionice. Acţionează prin distrugerea structurii şi funcţiei membranei.
Peptidele antimicrobiene din mamifere sunt de obicei grupate după structură, după locul anatomic de
exprimare sau după familia de gene care le codifică. Numărul de peptide antimicrobiene din mamifere
identificate trece de 100. Sunt diferite de la specie la specie. Dat fiind originea comună a mamiferelor,
complexitatea structurii şi distribuţiei peptidelor antimicrobiene sugerează evoluţii diferite.
Cele mai multe peptide antimicrobiene din mamifere sunt cationice şi amfifilice. Multe au punţi
disulfidice. Defensinele cel mai bine caracterizate, peptide antimicrobiene din mamifere au 3 punţi -S-S-
intramoleculare, deci 6 cisteine. În funcţie de poziţia punţilor sunt α-, β-, Φ-.
Proterinele (din neutrofile de porc) au 2 punţi. Dodecapeptidul din bovine are o punte.
Defensinele
Defensinele din mamifere, peste 80 descrise până acum, au 3 punţi -S-S- intramoleculare. Α- şi β-
defensinele diferă prin poziţiile celor 6 cysteine, diferite în lunginea prosegmentului, structura şi poziţia
genelor pe cromozom. Au structuri tridimensionale asemănătoare şi activităţi antimicrobiene asemănătoare.
Au 3 lanţuri β-,
α- defensinele au fost descoperite în mucoasa intestinală şi reproductivă dar şi în leucocite.
Β- defensinele în câteva specii de mamifere şi pasări în rinichi, piele, mucoasa orală şi epiteliul căilor
respiratorii.
Recent a fost descoperită în neutrofilele de macac Φ- defensina ciclică.
Cathelicidinele
Sunt foarte diverse ca structură. Segmentul de propetidă (aproximativ 100 aminoacizi) este similar în
secvenţă cu proteina cathelina, un inhibitor al cistein-proteazei izolată din porc. Molecula activă
antimicrobiană are 12-100 aminoacizi, localizată la capătul C-terminal al precursorului.
136
SPECTRUL DE ACTIVITATE
Activitatea antimicrobiană
Multe peptide antimicrobiene din mamifere sunt active împotriva unei largi serii de microbi: bacterii
gram-negative şi gram-pozitive, fungi, virusuri şi protozoare. Unele au spectru de activitate mai restrâns.
Peptidele antimicrobiene pot să acţioneze sinergic cu alţi factori antimicrobieni, de exemplu proteina care
induce permeabilitatea pentru bactericide. Se crede că omoară microbii prin distrugerea integrităţii
membranei. Se împart în cationice şi amfipatice, proprietăţi care favorizează interacţiunile cu membranele
biologice.
Ipoteza: interacţiunea cu membrana distrusă este disiparea gradientului electrochimic.
Altă posibilitate: peptidul traversează membrane, se asociază cu unele molecule şi duce la deranjarea
funcţiilor celulei. Defensinele induc formarea de pori în stratul dublu fosfolipidic.
Alte activităţi
Peptidele antimicrobiene pot acţiona în vindecarea rănilor, în inflamaţii şi în răspunsul imun
adaptativ. La concentraţii mari pot fi citotoxice.
Anumite defensine şi cathelicidine pot avea activităţi chemoatractante pentru limfocite şi măresc
răspunsul cu anticorpii IgG şi pentru celulele dendritice. În viitor vor fi studii asupra integrării răspunsurilor
de apărare înnăscută şi adaptivitate.
Peptidele antimicrobiene sunt codate de gene prototipice, spre deosebire de alte antibiotice din natură
care sunt produşi prin cascade multienzimatice. Atât cele din plante cât şi cele din animale sunt codate de
gene cu 2 sau mai mulţi exoni fiind o familie aparte de gene.
Defensinele
Genele defensinelor au expresii selective, unele gene care codează defensinele sunt constitutive, altele sunt
induse prin stimulare cu agenţi infecţioşi şi inflamatorii.
Defensinele umane sunt codate de cromozomul 8. Există α-, β-, Φ- defensine. Φ- defensinele au 18
aminoacizi. ½ din peptid este codificată de o genă, cealaltă ½ este codificată de altă genă complet diferită,
apoi sunt unite.
Cathelicidinele
Domeniul cathelinei este codat de toţi 4 exoni ai genei cathelicidinei, iar peptidul matur
antimicrobian (la capătul C-terminal) este codat într-un segment al exonului 4. La om a fost caracterizată o
singură genă de cathelicidină LL-37, care se găseşte pe cromozomul 3.
Peptidele sunt sintetizate ca molecule precursoare care includ secvenţa N-terminală care ţinteşte
reticulul endoplasmatic (secvenţa semnal). Alături de segmental semnal este în prosegment care poate fi
important pentru procesarea intracelulară, neutralizarea sarcinii şi/sau plierea peptidului cationic C-terminal.
Unele sunt scindate extracelular, altele intracelular. Procesarea posttranslaţională: formarea
legăturilor disulfidice, amidarea C-terminală în formarea N-terminală de piroglutamat.
Defensinele
Precursorul α-defensinei este de 90-100 aminoacizi şi include peptidul semnal hidrofob cu 19-20
aminoacizi şi prosegmentul cu 40-50 aminoacizi. Principalele modificări posttranslaţionale sunt formarea a
3 legături disulfidice intramoleculare şi procesarea proteolitică.
β-defensinele au propeptidul mai scurt, 60-65 aminoacid cu un pro-segment de 26-32 aminoacizi. Glutamina
N-terminală este convertită la rest de piroglutamat.
137
Cathelicidinele
Sunt stocate în granulele neutrofile ca propetide (ne-antimicrobiene) care sunt eliberate în spaţiul
extracelular.
41). Se explica efectul terapeutic al proteinelor si peptidelor tinere prin blocarea (si
consumarea lor) ca antioxidanti ce se opun sistemelor de tip oxidant generartoare de peroxinitrit ?
La mamifere şi alte animale superioare întâlnirea iniţială cu patogenii are loc de obicei la suprafaţă,
mai ales pielea şi suprafeţele mucoase ale tractului gastrointestinal, respirator şi genito-urinar.
S-a propus recent un model de apărare a suprafeţelor mucoase. Apărarea include exprimarea
inductibilă şi constitutivă a peptidelor antimicrobiene, molecule anorganice cu activitate antimicrobiană şi
proteine care inhibă direct supravieţuirea microbilor. Aceşti factori antimicrobieni sunt produşi local de
celulele epiteliale, dar în unele cazuri pot fi derivaţi din celulele circulante şi plasmă.
Se sugerează că inflamaţia şi răspunsul imun dobândit sunt sisteme de sprijin care contracarează
confruntările persistente sau invazive.
138
PERSPECTIVE DE VIITOR
Printre mecanismele imunităţii înnăscute la mamifere este producerea unei varietăţi de peptide
antimicrobiene. Rămân de stabilit relaţiile structură-funcţie, activităţile biologice şi reglarea acestor peptide.
Apărarea înnăscută este afectată de exprimarea alterată a peptidelor antimicrobiene, legată de
deficienţe genetice, imaturitate, inflamaţii cronice, toxine din mediu, boli sistemice. O deficienţă în
nivelurile de peptide antimicrobiene duce la un risc crescut de septicemie neonatală, otită, boală de dinţi,
prezenţa patogenilor în nasofaringe, infecţii ale tractului urinar.
O mai bună înţelegere a mecanismelor înnăscute de apărare duce la strategii terapeutice care cresc
eficacitatea apărării. Pot fi agenţi antimicrobieni topici sau sistemici.
Lipidele au căpătat o semnificaţie funcţională considerabilă în timpul evoluţiei clasei Insecta. Ele
sunt un component structural funcţional al membranei celulare şi cuticulei, reprezintă o sursă bogată de
energie metabolică pentru perioadele de cerinţă de energie, facilitează conservarea apei prin formarea unei
bariere cuticulare impermeabile şi prin obţinerea apei metabolice prin oxidare şi ele includ hormoni
importanţi şi feromoni.
Termenul de lipide este aplicat unui grup heterogen de compuşi care au două proprietăţi şi anume :
1. Relativa insolubilitate în apă ;
2. Mare solubilitate în solvenţi nepolari de exemplu cloroformul şi acetona.
Acizii graşi polinesaturaţi, în special cei din seria C18 sunt nedefiniţi în dieta multor specii de animale.
Studii de nutriţie
Datele obţinute din studiile de dietă, carenţa trebuie să fie interpretate cu grijă. Acizii graşi
polinesaturaţi sunt esenţiali ca acomponenţi ai hranei. Pe alte specii s-a demonstrat că deficienţa de acizi
graşi polinesaturaţi în hrană se poate manifesta prin unul sau ambele simptome după cum urmează:
1. Creştere şi dezvoltare incompletă mergând până la emergent
2. Deficitară, imposibilitatea de a întinde aripile şi chiar lipsa aripilor, solzi pe corp
3. Capacitate reproductivă redusă
Fiind constituienţi ai membranei celulare, unde ei participă ca fosfogliceride, absenţa lor va duce la o
funcţionare defectuoasă a membranei.
La vertebrate, acidul arabidonic este precursor al prostaglandinelor şi este posibil să aibă acelaşi rol şi la
insecte.
Studii biochimice
Sterolii
Sterolii contribuie la o varietate de funcţii pentru insecte :
La insectele fitofage, fitosterolii sunt adesea un substrat adecvat şi eventual mai bun al colesterolului
din hrană. Insectele pot realiza conversia fitosterolilor în colesterol. Aceşti fitosteroli sunt sterolul,
campesterolul, stigmasterolul şi ergosterolul. Multe insecte se bazează pe simbioţii din intestin pentru
steroli.
Necesitatea prezenţei în hrană a sterolilor demonstrează absenţa la insecte a căilor de sinteza a
colesterolului cum a fost propusă pentru vertebrate şi microorganisme.
Sinteza pleacă de la acetat, şi un intermediar important este acidul mevalonic. Farmeziprofosfatul este un
intermediar important în producţia de hormoni juvenili.
Digestia şi absorbţia
Macromoleculele care formează hrana insectelor nu penetrează peretele intestinal. Ea trebuie să fie redusă la
o formă absorbabilă prin procesul de digestie.
Digestia
Nu este necesară digestia sau modificarea steronilor pentru ca aceste molecule să fie absorbite.
Lipida care se digeră în intestin este triacilglicerolul care necesită hidroliza esterilor acilglicerol cu catenă
lungă. Lipoliza este efectuată în prezenţa lipazelor, o clasă de esteroze. Hidroliza triacilglicerolului a fost
investigată la puţine specii, mai mult pe gândacii de bucătărie. Enzima este activată în prezenţa Ca 2+, analog
cu lipaza pancreatică de la mamifere. Aşa, mecanismul presupune în prima fază hidroliza acizilor graşi din
poziţia 1 şi 3 a glicerinei. Nu s-a reuşit purificarea şi caracterizarea enzimei. La unele specii,
glicerintrioleina este hidrolizată mai rapid decât tripalmitina. De ,exemplu la lăcuste, prin hidroliza trioleinei
se obţin cantităţi mari de substrat metabolic necesar pentru perioadele prelungite de zbor.
Activitatea enzimatică optimă se obţine după emulsifierea substratului. Nu se cunoaşte natura
agenţilor de emulsificare la insecte, oricum nu sunt săruri biliare ca la vertebrate. Se pare că efectul
emulsifiant este dat de acilgraspeptide.
Absorbţia
Transportul
La insecte, hemolimfa transportă lipidele de la locurile de absorbţie sau sinteză spre locul de utilizare
sau stocare.
Clasele de lipide care pot fi izolate din hemolimfa insectelor sunt insolubile în apă şi deci nu sunt
prezente în hemolimfă ca molecule libere, ci sub formă de complexe macromoleculare, lipoproteinele.
Utilizarea lipidelor
Succesul evolutiv al clasei Insecta a fost facilitat de capacitatea animalului să stocheze cantităţi mari
de grăsime şi să utilizeze acest substrat ca surse de energie pentru activitatea musculară şi ca sursă de apă
metabolică care suplimentează rezerva de apă din corp. Grăsimea este stocată şi transportată în principal sub
formă de tri si digliceride şi hidroliza esterului este un preludiu necesar al evadării acidului gras.
Lipaze extradigestive
S-a demonstrat că în corpul gras al multor specii de insecte are loc β oxidarea acizilor graşi.
Carnitina (1,3-hidroxi-4-trimetilamoniumbutirat) este un cofactor obligatoriu la unele specii, servind pentru
facilitarea transportului gruparii acil în şi din mitocondrii prin acţiunea unei enzime, canitinacil transferază.
Acyl-S-CoA + carnitina↔ acilcarnitina + CoA
Se crede - carnitinacil transferaza este localizată în interiorul mitocondriilor. Nu la toate insectele
carnitina este cofactor obligatoriu pentru oxidarea acizilor graşi. Se pare că la insectele care nu utilizează
lipidele ca sursă primară de energie carnitina are un rol mic sau deloc în oxidarea acizilor graşi.
Permeabilitatea membranelor pentru acizii graşi cu lanţ lung creşte cu temperatura şi este posibil ca
necesitatea de carnitină să fie mai pronunţată la temperaturi mai scăzute şi în timpul fazelor iniţiale de zbor,
înainte ca temperatura corpului să crească.
Soarta glicerolului
Glicerolul este de asemenea produs prin acţiunea enzimelor lipolitice prin activitatea enzimelor
neutre. Se pare că glicerolul este transportat în corpul gras, unde reprezintă sursa de glicerol 3-fosfat pentru
reesterificare.
141
Formarea corpilor cetonici
Biosinteza lipidelor
Acizii graşi
Insectele sintetizează acizi graşi cu lanţ lung saturaţi şi monosaturaţi acetil - CoA. Astfel, orice
compus care dă acetil-CoA poate fi considerat un potenţial precursor al acidului gras:
Acetil-CoA + 7Malonil-CoA +14NADPH + 14H+ → 1Acid palmitic + 7H2O + 14NADP+ + 6H2O
La vertebrate şi microorganisme, dar şi la alte insecte, enzimele care sintetizează acizii graşi sunt
legate de proteine sub forma unui complex enzimatic citoplasmatic, acid gras sintetază.
Prima fază de condensare poate să aibă loc cu propionil-CoA în loc de acetil-CoA. În acest caz
apar acizi graşi cu număr impar de atomi de carbon. La vertebrate şi microorganisme, enzimele care
sintetizează acizii graşi sunt legate de proteină şi se formează un complex enzimatic citoplasmatic, acid gras
sintetază.
Aşa este cazul şi la insecte. Singurul piridin-nucleotid în sintetază de la insecte este NADPH.
Calea de sinteză a acizilor graşi este întrucâtva inversul β-oxidării.
Acizii graşi monosaturaţi se formează în mod normal în sistemul microzomial când acizii graşi
saturaţi sunt desaturaţi la echivalentul monoenoic. Acizii graşi mononesaturaţi pot fi conformaţi cis sau
trans.
Acil-glicerolii
Conţinutul în acizi graşi liberi în ţesuturile insectelor este relativ scăzut, cantitatea cea mare este prezentă
sub formă esterificată ca di- sau triacilgliceroli sau fosfogliceride. Locul major al sintezei di- şi
triacilglicerolului este corpul gras.
Fosfogliceridele
La unele ordine de insecte, fosfolipida majoritară este fosfatidilcolina (lecitina), iar la altele este
fosfatidiletanolamina. Locul major de sinteză al fosfoacilglicerolului pare să fie fracţiunea microzomală. Se
pare că fosfogliceridele mitocondriale sunt transferate în mitocondrii.
Au fost investigate şi fosfolipidele minore, ceramid fosfatidiletanolamina, fosfotidil inozitolul,
fosfatidilserina şi fosfatidilglicerolul. Ele parcurg căi metabolice analog cu mamiferele :
Ceramid fosfatidiletanolamina + HOH → Ceramida + Fosfatidiletanolamina
Ceramida + HOH → Acizi graşi + Sfingozina
Lipidele cuticulare
În cantitatea cea mai mare sunt hidrocarburile: alcani (n-alcani, 3-metilalcani, monometilalcani
ramificaţi intern, dimetilalcani ramificaţi intern), alcadiene.
Factorul adipokinetic
Extractele apoase din corpora cardiacă influenţează nivelurile de lipide în corpul gras şi hemolimfă la câteva
specii. Diferenţele interspecifice în răspunsul la extractele din corpora cardiacă nu par să rezulte din
schimbările evolutive în natura factorilor adipokinetici.
142
Rolul precis fiziologic al factorilor rămâne neprecizat, deşi el pare să implice mai mult decât simpla reglare
homeostatică a nivelurilor de lipide în hemolimfă, mai degrabă factorii furnizează substratele adecvate
pentru metabolismul muşchilor de zbor. Se ştie de mult că muşchii de zbor la lăcuste catabolizează
carbohidraţii în timpul stadiilor timpurii de zbor, iar lipidele devin dominante când zborul continuă. Astfel
comutarea metabolică de la utilizarea carbohidraţilor la utilizarea lipidelor poate fi reglată de secreţiile din
« corpora cardiacă ». Duplicitatea aparentă a acţiunii « hormonului adipokinetic » poate să reflecte efectele
cumulative ale doi sau mai mulţi factori. Se ştie - corpus cardiacum conţine şi eliberează câţiva
neurohormoni şi până când aceşti factori au fost eliberaţi, rolurile specifice fiziologice nu pot fi atribuite
moleculelor individuale.
Lipidele sunt un substrat mai bun decât carbohidraţii pentru zboruri de migraţie lungi, datorită conţinutului
caloric mai mare şi producerii unei cantităţi mai mari de apă metabolică prin oxidare.
Ecdysona
Rolul hormonului de năpârlire al insectelor Ecdysona în metamorfoza insectelor se cunoaşte de
mulţi ani. Hormonul este eliberat ca α-Ecdysona din glandele protoracice ca răspuns la un hormon trofic din
creier. Se crede că el funcţionează ca un precursor fiind convertit la β-Ecdysona mai activă. Cel mai evident
efect al β-Ecdysonei este să iniţieze în procesele de liză prin care ţesutul epidermic se retrage de pe cuticula
veche înaintea năpârlirii.
Se crede că β-Ecdysona stimulează biosinteza de hidrocarburi în timpul pupării. Hormonul provoacă
eliberarea α-Ecdysonei din ovarul în repaus care induce sinteza vitellogeninei în corpul gras.
Câteva căi metabolice care au loc în vertebrate au fost descrise şi la insecte; totuşi este de asemenea
important să recunoaştem acele aspecte ale metabolismului lipidic în care diferă cele 2 clase de animale şi
anume:
- hemolimfa insectelor conţine concentraţii mari de diacilglicerol şi niveluri scăzute de acizi
graşi liberi, spre deosebire de vertebrate ;
- lipsa steroidogenezei la insecte care a condus la dezvoltarea hormonilor din corpus
Allatum ;
- rolul lipidelor în protecţia insectelor la deshidratare.
143
Pentru multe specii, concentraţia optimă de carbohidraţi în dietă este în limite strânse. În schimb,
există larve care necesită concentraţii mari de carbohidraţi alimentari, de exemplu larvele care se hrănesc cu
amidon.
Unele din ele utilizează mai bine polizaharidul ramificat amilopectina decât zaharidul liniar amiloza.
Adulţii consumă carbohidraţii ca sursă de energie pentru zbor, reproducere, şi longevitate : nectarul,
seminţele, etc.
Factori de creştere-carbohidraţi
Pe lângă nevoia de zaharuri şi amidonuri, insectele au nevoie de o sursă de carbohidraţi conjugaţi şi
derivaţi sub formă de vitamine şi compuşi înrudiţi : vitamine B2 (riboflavina), vitamina B12
(ciancobolamina).
Vitaminele sunt necesare pentru reacţii de transfer de hidrogen, transmetilari, în gluconeogeneză. Vitamina
C (acid L ascorbic) se pare că are rol de antioxidant nespecific.
Enozitolul (hexahidroxiciclohexanul) poate exista în câteva forme izomere, dar numai patru se
găsesc în mod natural (mio-, sciyllo-, neo-, chiroenozitolul) în insecte şi alte organisme, izomerul mio este
foarte important pentru că este singurul izomer care este încorporat în fosfatidilenozitol, component
structural esenţial al membranelor celulare şi sub celulare. În ţesuturile insectelor, el este prezent în
concentraţie mult mai mică decât cele două, principale fosfolipide din insecte, fosfotidilcolina şi
fosfatidiletanolamina.
Digestia carbohidraţilor
A.Carbohidraţii comuni
Carbohidrazele digestive din insecte hidrolizează poli-, oligo- şi dizaharidele în monozaharidele
constituente pentru absorbţie : α şi β amilazele care hidrolizează legăturile glucozidice din polizaharide şi
glucozidazele care hidrolizează legăturile glicozidice din oligo- şi dizaharide.
1. Amilazele digestive hidrolizează amidonul (amiloza şi amilopectine) şi glucogenul. α-amilaza sau
endoamilaza (1,4-α-D-glucan glucanohidrolază) dă un amestec de dextrine cu lungimi variabile ale lanţului
şi se găseşte în glandele salivare şi/sau glandele intestinale ale insectelor. Este un singur lanţ polipeptidic cu
MW = 68kDa şi un p.i =4,0, pH optim 5,8, temperatura optimă 37˚C, activat de ionii clorurii şi inhibat de
ionii florurii.
2.Glicozidazele digestive. Insectele conţin 5 glicozidaze : α-glucozidaza, β-glucozidaza, α-
galactozidaza, β-galactozidaza şi β-fructofuranozidaza.
Excreţia şi detoxifierea
144
A. Reglarea excreţiei carbohidraţilor - are loc prin tubii lui Malpighi şi prin rect. Tubii Malpighi produc
un ultrafiltrat al hemolimfei, iar în rect are loc o reabsorbţie a moleculelor mici utile (glucoza, trehaloza şi
aminoacizii). Este posibil ca o permeabilitate selectivă controlată enzimatic a tubilor lui Malpighi este
implicată în conservarea zaharurilor din hemolimfă.
B. Glicozidele în detoxifiere
Reacţiile de detoxifiere care transformă compuşii organici străini în metaboliţi mai puţin toxici implică
adesea formarea de glicozide. Un glicozid se formează când toxicul sau metabolitul lui (agliconul) se
combină cu un rest de monozaharid (de obicei glucoza) printr-o legătură acetilică la atomul C1. Reacţia are
loc de obicei în corpul gras.
Glicozidele sunt mai polare şi mai puţin toxice decât agliconul neconjugat, şi deci sunt mai rapid excretate.
(1) UTP + D- glucoza 1-fosfat → Pirofosfat + UDPglucoza (Glucozo-1- fosfat uridiltransferaza)
(2) UDPglucoza + Fenol→UDP + Aril-β-D-glucozid (UDPglucoziltransferaza)
UDPglucoza care apare în reacţia de detoxifiere serveşte şi ca sursă de glucoză pentru sinteza normală a
glicogenului şi a trehalozei.
Nu s-a reuşit separarea şi izolarea chitinsintazei la insecte. Enzima poate fi legată de membranele
subcelulare şi probabil se dezactivează în timpul prelucrării ţesutului.
B. Glicozidele şi sclerotinizarea
Cuticula de la insecte se întăreşte şi se colorează când se formează un complex proteina-chinona
(screlotina) din proteine şi fenoli polihidrici prezenţi în straturile externe ale cuticulei. Nu se cunoaşte dacă
glicozidele sunt implicate în reglarea formării screlotinei intergumentare. Totuşi ei provin din screlotinizarea
prematură a precursorilor mascând gruparea funcţională a agentului tanant, un fenol dihidric.
Pigmenţii glicozidici şi glicozidele cardiace
Culoarea insectelor depinde în mare masură de prezenţa pigmenţilor ne-carbohidraţi:
screlotina, melanina, omocromi, pterine, carotenoizi şi pigmenţii biliari prezenţi în integument sau
ţesuturi interne, mai ales hemolimfă sau corpul gras. Unele coloraţii protectoare sunt pigmenţi
glicozidici. Pot fi β-glucozide sau 6-acetil-β-D-glucozide cu fenoli naftalinici sau antraceni şi chinone
inrudite.
Unele insecte colorate strălucitor stochează glicozide din plantele gazdă care sunt toxice pentru
prădători, mai ales păsări. Altele mimează insectele necomestibile. Cele care se hrănesc cu plante care conţin
« lapte » (milky-weeds), conţin glicozide cardiace, cardenolide. Cardenolidele sunt medicamente cardiace
145
puternice, care provoacă vomă dacă sunt consumate de prădători. De obicei, femelele au mai mult emetic
decât masculii.
Glicozaminoglicanii în ţesuturile şi cimenturile conjunctive
Există relativ puţine ţesuturi conjunctive în insecte pentru că integumentul dă suportul principal pentru
organe. Conţin glicozaminoglicani acizi şi neutri (mocopolizaharide), frecvent legate covalent cu proteine
(proteglicani) şi asociate cu colagen. În ţesutul conjunctiv colagenic se găsesc acid hialuronic, condroitina,
dermaton sulfaţi, keratansulfati.
Sistemul nervos central este înconjurat de ţesut conjunctiv fibros.
La insecte, glicozaminoglicanii şi proteoglicanii funcţionează intern, ca un ciment care leagă celulele
şi extern, ca un adeziv care încapsulează paraziţii şi corpii străini, în salivă sau ca un adeziv care lipeşte
pupele pe substratul lor.
Sinteza glicogenului.
Glicogenul, polizaharid ramificat, compus din resturi de α-D-glucopiranoză, este principalul
polizaharid de rezervă la insecte. MW=106-108. Porţiunile liniare conţin legături 1,4-glucozidice.
Ramificările sunt legături 1,6-glucozidice.
Între punctele de ramificare sunt 12-18 resturi de glucoză, deci glicogenul are un grad mare de ramificare.
Sinteza este similară cu cea de la vertebrate.
(9) ATP + D-glucoza → ADP + D-glucozo 6-fosfat (hexochinoza)
Cele mai importante depozite de glicogen sunt în corpul gras, muşchii de zbor, intestine, sistemul
nervos central. Excepţie: musca tsetse utilizează ca sursă de energie pentru zbor oxidarea aminoacidului
prolina, muşchii de zbor conţin numai 1% glicogen, iar ţesuturile intestinale conţin de 14 ori mai mult
glicogen decât muşchii de zbor.
2. Sinteza trehalozei (α,α-trehaloza) (α-D-glucopiranozil-α-D-glucopiranozid)
Este zahărul predominant în multe specii de insecte, dar nu în toate, poate fi şi mai mic sau egal cu 2
M. Există şi în alte organisme ca rezervă de zaharid liber sau ca şi component în diferite glicolipide. Alte
organisme în afară de insecte: bacterii, alge, drojdii, fungi, nematode, anelide, crustacee şi în câteva ferigi şi
plante cu seminţe.
Este sintetizată de glucoză sau fructoză:
(13) ATP + D-glucoza → ADP + glucozo 6-fosfat (hexokinaza)
(16) UDPglucozo + D-glucozo 6-fosfat → UDP + α,α-trehalozo 6-fosfat (α,α- trehalozo 6-fosfat sintaza)
Rezervele de glicogen şi trehaloză sunt mobilizate prin reacţii controlate enzimatic care generează
glucoză pentru susţinerea tuturor proceselor vitale.
Glicogenoliza
Glicogenoliza se referă la reacţiile fosforolitice şi hidrolitice care degradează glicogenul la unităţile de
glucoză. Cea mai importantă reacţie este scindarea fosforolitică ce generează glucozo-1-fosfat de la
capătul reducător al moleculei de glicogen :
De asemenea şi α-amilaza poate hidroliza glicogen. Izoenzimele amilazei sunt prezente în hemolimfă, corpul
gras, muşchi şi sistemul reproducător.
Hidroliza trehalozei
Este făcută de α,α-trehaloză (α,α-trehaloz glucohidroliză) :
147
(21) α,α-trehaloză + H2O → 2D-glucoză (α,α-trehaloză)
Enzima este foarte activă în corpul gras, muşchi, intestin şi glandele salivare. Se pare că enzima este
localizată în membrana mitocondrială.
Glicoliza şi calea pentozo-fosfat- În insecte, procesul de glicoliză, când zaharurile sunt metabolizate la
acid piruvic prin derivaţii lor fosforici, este similar cu al altor organisme. Apoi acidul piruvic este convertit
în acetil-CoA care este oxidată la CO2 şi apă prin ciclul acizilor tricarboxilici şi oxidarea terminală.
Conversia 1 mol de glucoză la acid piruvic rezultă 2 moli ATP.
Deşi glicoliza este calea principală de conversie a glucozei la acid piruvic, calea pentozo-fosfat sau
suntul hexozo monofosfat operează în insecte. Nu sunt importante pentru obţinerea de energie, dar
furnizează NADPH pentru sinteza acizilor graşi, pentozofosfaţii pentru sinteza acizilor nucleici şi
triozofosfați pentru sinteza glicogenului.
Carbohidraţii în metamorfoză
Schimbările metamorfice atât la insecte endopterigote cât şi exopterigote sunt de obicei acompaniate
de epuizări substanţiale ale rezervelor lor de carbohidraţi pentru că prin ei se asigură energia metabolică
necesară transformărilor. De exemplu, larvele de vârstă maximă conţin doar 1% carbohidraţi şi ele trebuie să
se bazeze în principal pe lipide. Rezervele de carbohidraţi sunt suplimentate de aminozaharuri 2-amino-2-
deoxi-D-glucoză derivat din chitină la năpârlire.
Carbohidraţii mai pot fi de asemenea secretaţi cu mătasea în cocon.
Deşi la multe specii există o variaţie în utilizarea relativă a rezervelor de glicogen şi trehaloză în
timpul metamorfozei, este clar că insectele în metamorfoză se bazează pe carbohidraţii înmagazinaţi în
timpul perioadei larvare ca sursă de energie şi ca substrat pentru sinteza chitinei şi altor componente
celulare.
148
Carbohidraţii sunt necesari pentru funcţionarea normală a sistemului reproductiv la masculi şi femele
şi pentru dezvoltarea embrionului. La masculi, zaharidele formează un component important al testiculelor
şi al plasmei seminale. La femele, acumularea de carbohidraţi in oocet este o etapă preparatorie esenţială
pentru dezvoltarea embrionului.
B. Dezvoltarea embrionului
În timpul dezvoltării embrionului, carbohidraţii şi lipidele formează substratul principal pentru
producerea de energie. Glicogenul reprezintă şi sursa de glucoză pentru sinteza chitinei care formează
cuticula larvelor de vârstă I.
149
(25) Sorbitol 6-fosfat + H2O → sorbitol + ortofosfat (fosfatază)
Glicerolul, sorbitolul şi alte molecule mici scad punctul de suprarăcire la multe insecte susceptibile la îngheţ.
O rezistenţă crescută la frig este determinată şi de un titru mare de trehaloză şi/sau 3itol.
BIOCHIMIA INSECTELOR
Larvele unor specii de insecte pot înlocui carbohidraţii din hrană prin proteine sau acizi graşi. Pentru
multe specii, concentraţia optimă de carbohidraţi în dietă este în limite strânse. În schimb, există larve care
necesită concentraţii mari de carbohidraţi alimentari, de exemplu larvele care se hrănesc cu amidon. Unele
dintre ele utilizează mai bine polizaharidul ramificat amilopectină decât zaharidul liniar amilază.
Adulţii consumă carbohidraţii ca sursă de energie pentru zbor, reproducere şi longevitate. Pe lângă
nevoia de zaharuri şi amidonuri, insectele au nevoie de o sursă de carbohidraţi conjugaţi şi derivaţi sub
formă de vitamine şi compuşi înrudiţi : vitamine B2 (riboflavina), vitamina B12 (ciancobalamina).
Vitaminele sunt necesare pentru reacţii de transfer de hidrogen, transmetilari, în gluconeogeneză. Vitamina
C (acid ascorbic) se pare că are rol de antioxidant nespecific.
Enozitolul (hexahidroxiciclohexanul) poate exista în câteva forme izomere, dar numai patru se
găsesc în mod natural (mio-, scillo-, neo-, chiroenozitolul) în insecte şi alte organisme. Izomerul « mio »
este foarte important pentru că este singurul izomer care este încorporat în fosfatidilenozitol, component
structural esenţial al membranelor celulare şi subcelulare. În ţesuturile insectelor el este prezent în
concentraţie mult mai mică decât cele două principale fosfolipide din insecte, fosfatidilcolina şi
fosfatidiletanolamina.
Din câte se ştie, proteinele sunt cele mai complexe şi în acelaşi timp cele mai caracteristice pentru
organismele vii. Ele sunt prezente în toate celulele vii şi au componente ca nucleoproteine, care sunt
esenţiale în procesele de diviziune celulară, enzime şi hormoni ce controlează mai multe reacţii chimice în
metabolismul celulelor.
Ca unic constituent al virusurilor, nucleoproteinele sunt sinonime cu cele mai elementare forme de
viaţă. Se găsesc libere în celulele citoplasmei sau asociate cu alte molecule.
Progresul spectaculos în cercetarea sintezei proteinelor a produs o revoluţie în înţelegerea
mecanismului de funcţionare al proceselor biosintetice. Acesta a dat posibilitatea de a descoperi alte
mecanisme de funcţionare a sistemelor celulare.
150
Informaţia genetică conţinută de ADN este transferată ARN-ului mesager prin fenomenul de
transcripţie. La nivel ribozomal are loc procesul de translaţie, unde informaţia ARN-ului mesager este
utilizată pentru a sintetiza lanţul de aminoacizi specific secvenţei respective. Această translaţie este expresia
codului genetic şi astfel rezultă proteinele ce caracterizează un organism.
Clasificarea tradiţională a proteinelor se bazează pe solubilitate, proprietăţile ionice şi funcţie. Ca şi
constituenţi dinamici ai celulelor, proteinele pot fi clasificate şi pe baza structurilor asociate.
Proteinele neasociate corespund proteinelor globulare, în clasificarea clasică, ele sunt reprezentate de
albumine şi globuline. Multe dintre aceste proteine sunt enzime, anticorpi, proteine hormonale şi proteine
contractile.
Nucleoproteinele corespund proteinelor asociate fie cu acizii nucleici (histone şi nonhistone), fie cu
acizi nucleici ribozomali. Proteinele asociate cu membrane celulare sunt reprezentate de lipoproteine,
proteine transportatoare, glicoproteine, mucoproteine.
În final, există proteine care nu au activitate enzimatică şi servesc ca schelete structurale. Din această
categorie fac parte: colagenul, elastina, keratina şi fibroina. Sunt cunoscute de asemenea ca proteine fibrilare
,,pasive’’ şi sunt alcătuite din molecule rigide ce conţin un grad înalt de legături încrucişate inter- şi
intrapeptidice.
În contrast cu proteinele fibrilare, proteinele ,,active” sunt capabile de recunoaştere şi catalizare a
unor reacţii la nivel molecular. Din această categorie fac parte enzimele. Proteinele ,,active’’ care nu sunt
enzime au fost denumite emfori.
Este regretabil faptul că doar câteva proteine din insecte au fost obţinute în stare pură. Ca rezultat,
informaţia despre structura chimică a proteinelor din insecte este insuficientă.
STRUCTURA PROTEINELOR
Proteinele grupate după structură sunt fibroase sau insolubile şi globulare care au rol structural,
dar fără activitate enzimatică.
Studiile proteinelor fibroase sunt adesea complicate prin marea varietate de legături încrucişate, fie
între ele, fie cu alte componente.
Asemenea legături fac dificilă recunoaşterea şi izolarea precursorului subunitar, deci şi ca
examinarea structurii primare să fie foarte dificilă.
Structura proteinelor nu face excepţie de la regula generală şi anume că structura primară guvernează
structura tridimensională.
Prin digestia proteolitică a miozinei rezultă: meromiozina uşoară (LMM) şi meromiozina grea
(HMM). Meromiozina uşoară e o proteină fibroasă, în timp ce meromiozina grea este o proteină globulară.
Meromiozina grea este deasemenea o enzimă ATP-ază ce catalizează hidroliza adenozin trifosfatului
(ATP). Activitatea ATP-azei este stimulată de Ca2+ şi inhibată de Mg2+ şi este foarte sensibilă la pH. După
proteoliză, doar meromiozina reţine activitatea ATP-azei.
Aglomerarea legăturilor de miozină formează un complex uniform cu lungimea de 6000-7000 A cu
diametrul de 100-200 A şi greutatea particulei de 6,3ּ106 daltoni. Actina există în 2 forme şi anume:
monomerul globular G-actina şi polimerul fibros cu o greutate moleculară mare, F-actina.
În urmă cu câţiva ani, greutatea moleculară a muşchiului mamar G actina a fost considerată 5,5-
6ּ104 însă determinarile recente arată 4,3 la 4,7ּ104.
G-actina conţine 374 resturi ce indică o greutate moleculară de 4,1 la 4,2ּ105 daltoni. Acestă valoare e
similară cu valorile raportate la o varietate de animale de la păstrăv la nevertebrate ca amiba. G-actina
conţine câte un mol pe fiecare ATP şi Ca²+ (sau Mg²+) pe mol de actină. Îndepărtarea ATP, sau Ca²+ cu agenţi
de chelare ca EDTA duce la inactivare şi dimerizare, dar nu are loc nici o agregare ulterioară.
Dacă G-actina este expusă la sare 0,1 M conţinând Mg²+, polimerizează foarte rapid la F-actina. În
proces, ATP este hidrolizat la ADP (adenozin de fosfat) şi Pi. Pe când ADP în F-actina nu se schimbă uşor
cu ATP, actina nu poate fi considerată ATP-ază. Prin ultrasonicare sau rupere mecanică în prezenţa ATP,
reacţia poate fi reversibilă.
G-actina-ADP+ATP→G-actina-ATP+ADP.
151
În aceste condiţii artificiale, F-actina poate fi o ATP-ază. Nu este clar dacă hidroliza ATP-ului e
pentru polimerizarea G-actinei la F-actina. Structura F-actinei corespunde unui aranjament de dublu helix al
moleculelor de G-actină cu 30-50 de subunităţi pe tur de spiră de helix. Funcţiile Mg²+, Ca²+ alternând cu
nucleotidele schimbate de G-actină pot fi explicate de prezenţa unei afinităţi ridicate pentru Mg²+, Ca²+ în G-
actină, ocuparea sitului fiind necesară pentru a stabiliza complexul actină-nucleotide. Viteza de disociere a
ATP este mică când Ca²+ este legat.
Ca²+- G actină-ATP Ca²+ + Gactină-ATP
G actina-ATP → G-actină +ATP
Actomiozina este un complex molecular format din actină şi miozină. Este obţinut prin extracţie din
muşchi, întâi cu apă, pentru a îndepărta enzimele glicolitice şi apoi cu 0,6 M KCl. După extracţia cu al
doilea solvent, este obţinută o soluţie pură de actimiozină cu vâscozitate ridicată. Când soluţia este
pulverizată printr-o gaură îngustă, peste o soluţie diluată de sare, actomiozina precipită în formă de
filamente lungi. Aceste filamente, când sunt expuse la ATP în prezenţa de K+ ş Mg²+ se contractă în cel mai
dramatic mod în timp ce ATP-ul este hidrolizat la ADP.
Actomiozina insectelor se comportă exact că actomiozina vertebratelor, cu toate că diferiţi ioni la
pH=7 şi t=0º C sunt solubili în prezenţa concentraţiilor de KCl la 0,3M şi precipită între 28-32% sulfat de
amoniu în prezenţa de 0,5 M KCl, aşa cum face actomiozina de iepure. În prezenţa ATP-ului contracţia de
actomiozină sub formă de cocoloş în eprubete e numită superprecipitare. Actomiozina din insecte la 0,03-
0,11 M KCl la pH = 7 şi la t = 25º C arată superprecipitarea tipică.
De asemenea la actomiozina iepurelui, Mg²+ este necesar pentru superprecipitare.
Altă proteină din muşchi este tropomiozina A (paramiozina). Corespunde unui helix cu înălţimea de
2,2ּ105 şi o lungime de 130-140 mm. Tropomiozina B este un helix cu 2 lanţuri dublu spiralate, cu înălţime
de 6,3- 6,8ּ104 şi o lungime de 40 mm.
Molecula se separă în 2 unităţi identice în anumite condiţii. α-Actinina creşte activitatea
actomiozinei ATP-ază, în anumite condiţii creşte rata superprecipitării, intensifică tensiunea lanţurilor
actomiozinei. Proteina formează un complex cu F-actină a cărei formare e inhibată de tropomiozină.
Greutatea moleculară este de 1,8ּ105 cu un coeficient de sedimentare de 6,35.
Aparent o moleculă de α-actinină e legată de 10 molecule de G-actină şi tropomiozină concurează cu
α-actinină, legând situri. α-actinina este asociată cu linia Z.
Studii numeroase au arătat că actomiozina ATP-azei îi determină superprecipitarea acesteia şi necesită o
concentraţie scăzută de Ca²+.
Extracţia repetată a (NAM) atomiozinei naturale la ionicitate scăzută, îndepărtează factorii
responsabili de necesarul de Ca²+ şi rezultă un sistem cunoscut ca desensibilizat. Actomiozina (DAM),
începând cu activitatea ATP-azei nu mai este sensibilă la concentraţii scăzute de Ca.
Mioglobina care este prezentă în muşchii vertebratelor este absentă în muşchii insectelor şi este
înlocuită de un complement de traheole.
Elementele de bază în toate cazurile sunt filamentele groase şi subţiri.
Filamentele groase ale miofibrilei corespund în mod esenţial miozinei.
De când filamentul gros are o structură bipolară, moleculele de miozină sunt împachetate într-un mod
antiparalel în regiunea centrală şi paralel în restul filamentului.
Filamentele subţiri sunt compuse din actină, tropomiozină şi troponină.
Anticorpii dinaintea HMM se concentrează în centrul benzii A şi anticorpii dinaintea LMM se
concentrează în porţiunile benzii A. Când muşchii se contractă, cele 2 seturi de filamente subţiri şi groase
alunecă una peste alta sub influenţa ciclică a punţilor încrucişate şi corespund proiecţiei HMM.
Când muşchiul este relaxat, ataşamentul HMM de actină este inhibat; după aceasta ionii de Ca²+ sunt
realizaţi de reticulul sarcoplasmatic şi îndepărtează inhibiţia filamentelor subţiri.
Miozina poate forma punţi încrucişate la actină în filamentele subţiri.
Acest ataşament este urmărit de o schimbare în conformaţie a miozinei care generează tensiune în muşchi
urmărind realizarea punţilor încrucişate de la actină. Acest ciclu repetat al evenimentelor este asociat cu
destrămarea ATP-ului ce produce o sursă de energie.
152
Compoziţia aminoacizilor Phormia regina-G actina este foarte apropiată de actina muşchiului la
iepure, de asemenea conţine puţin mai mult acid glutamic; creşte în lizină şi nitrogen amidic, fac o
schimbare netă actinei insectelor similar cu alte nevertebrate. Miozina albinei este foarte asemănătoare
miozinei iepurelui cu lungimi ce variază între 1700 ş200 A. Activitatea ATP-azei miozinei din albină arată
că are aceleaşi caracteristici ca miozina iepurelui şi a insectelor din ordinul Lepidopterelor şi compoziţia
similară a aminoacizilor. Muşchiul scheletic dorsal Lethocerus conţine miozină în proporţie de 55% din
totalul proteinei miofibrilare.
Spectrul electroforetic al proteinelor din muşchiul de Lethocerus cordifanus, Lethocerus maximus şi
gândacul Heliocopris japetus este asemănătoare cu miofibrilele muştelor cu excepţia unui conţinut crescut
de paramiozina. Extracţia extensivă a miozinei şi actinei părăseşte doar banda Z, cu greutate moleculară de
95.000, component ce corespunde α-actininei.
Miozina L. cordifanus, L. maximus şi H. japetus are spectrul electroforetic similar cu miozina P.
regina cu greutate moleculară de 200.000 şi 2 greutăţi moleculare subunitare.
Tropomiozina a fost izolată din larvă şi adultul P. regina.
Coeficientul de sedimentare al proteinei din adult este de 2,53S în timp ce coeficientul de
sedimentare al proteinei din larve este de 2,62S.
Greutatea moleculară variază între 65,000 şi 84,000 la tropomiozina din larvă.
Aparent tropomiozina din larvă e mai mult polimerizată decât tropomiozina din adult; de asemenea
compoziţia de aminoacizi din tropomiozină din larvă şi adult este aproximativ identică, cu excepţia prolinei,
histidinei, fenilalaninei.
50 de peptide esenţiale sunt asemănătoare, dar peptidele de bază sunt prezente în digestia tipică a
tropomiozinei din larva şi nu se găsesc la adult.
Studiile făcute cu ajutorul microscopului electronic la actina din H. japetus arată filamentele
benzilor proteinei situate la 40nm.
Troponina din muşchii vertebratelor leagă filamentele actinei ce conţin tropomiozina şi care au aceeaşi
periodicitate.
Filamentele muşchiului de zbor din Sarcophaga bullata prezintă punţi încrucişate care sunt pe
filamentele de miozină în grupări care se repetă la 14,5 nm de-a lungul filamentului.
Fiecare punte încrucişată reprezintă o moleculă de miozină.
În ceea ce priveşte grupurile numite coroane, a fost estimat că este suficientă miozină pentru 6
molecule pe coroană în Sarcophaga şi Lethocerus.
Extractele nefracţionate ale proteinelor reglatoare ale muşchilor de zbor (tropomiozina, troponina) au un
efect inhibitor asupra desintetizării ATP-azei sau sinteza actomiozinei de la iepure.
Fracţionarea cu 40-80% sulfat de amoniu dă randament fracţiei, conţinând tropomiozină, iar
greutatea proteinelor moleculare este de 18.000, 27.000 şi 30.000kDa, ce corespund troponinei.
Aceste fracţionări produc Ca²+. Inhibiţia sensibilă şi doar greutatea proteinelor moleculare de 18.000
kDa îndrumă activarea Ca²+. .
Bullard şi Rudy (1973) au extras şi purificat paramiozina din muşchiul de zbor al L. cordifanus, L.
maximus, H. japetus şi Pachnoca ephippiata.
Greutatea moleculară a subunităţilor este estimată prin electroforeza gelului de poliacrilamidă în
prezenţa sulfatului de Na dodecil este 107.000kDa şi sedimentarea este 3,17S.
Molecula este caracterizată de un dicroism în 2 lanţuri pe bară. Compoziţia de aminoacizi a
paramiozinei seamănă cu paramiozinele din moluşte şi paramiozina anelidelor, iar proporţia de acid
glutamic şi aspartic este mai mare.
Aproximativ 6,3% din miofibrile sunt formate din paramiazina L. cordifanus şi 9,5% in Pachnoda.
Proporţia de miozină şi paramiozină în L. Cordifanus este de 8,2%.
Observaţiile despre proprietăţile contractile ale insectelor au fost adunate de Silemon în 1961. În
prezenţa 0,15 M KCl şi 1 M MgCl2 este observată actomiozina din albină.
Scăderea în vâscozitate la adăugarea ATP-ului şi constatarea ulterioară că ATP-ul adăugat e
hidrolizat a fost prima dată constatat la actomiozina din lăcuste.
153
Vâscozitatea intrinsecă a actiomiozinei insectei este de 2,7 fără adăugare de ATP şi 1,9 cu ATP şi
PH=7 şi la 20˚ C (1/2 şi 0,62) la gradientul de viteză mediu 100 sec ¹. Ultracentrifugarea clară indică faptul
că actomiozina insectelor e disociată în actină şi miozină la adăugare la actomiozina (30 s).
După adăugarea ATP-ului în prezenţa Mg²+, picul miozinei devine foarte ascuţit şi picul, fie
actomiozina, fie actina, se sedimentează foarte rapid.
Activitatea ATP-azei miozinei sau actomiozinei a fost studiată la insecte.
Reacţia arătată la Eq corespunde la adenosinetrifosfataza tipică:
ATP+H2O→ADP+Pi
De când cele mai multe actomiozine din insecte sunt complet pure, ATP-aza arată activitatea apirazei
mai degrabă decât cea a ATP-azei, în prezenţa adenilatkinazei:
ATP → AMP+Pi
AMP-ul format nu este transformat în IMP pe când adenilat deaminază nu este prezentă în
actomiozina din insect. Actomiozina ATP-azei din numeroase insecte se comportă ca enzima vertebratelor
(Cheshny ,1975).
Concentraţia mare de KCl este inhibitoare.
Temperatura optimă a ATP-azei muştei de casă este de 45ºC, asemănătoare cu a celorlalte specii.
Una din caracteristicile Ca²+ este activarea ATP-ază şi este dependentă de pH.
Activitatea prezintă o curbă difazică cu un pic la pH = 9 şi la alt pH = 6, de asemenea la muştele de
casă după Cheshny (1975) care a făcut un studiu extensiv de cinetică şi proprietăţi înrudite la Musca
domestica, activitatea maximă e observată doar la pH alcalin.
Aparent, dependenţa de pH poate fi datorată caracteristicilor subunităţilor uşoare sau grele ale
moleculelor miozinei.
Fenomenul substratului inhibitor al ATP-azei actomiozinei a fost bine studiat la insecte, cum ar fi
gândacul de apă L. Cordifanus, (Chaplain 1967). Inhibiţia ATP-azei poate fi obţinută la concentraţiile ATP
foarte scăzute, la 1,6 mM în muşchiul toracic şi la valoarea scăzută de 5 mM.
Valorile lui K ale ATP-ului sunt 0,2 mM.
ADP-ul inhibă APT-aza muşchilor insectelor (Cheshny 1975).
Ionii de Mg²+ sunt necesari pentru a activa ATP-aza, aşa cum arată L. maximus.
Activităţile maxime au fost obţinute la 1 mM Mg²+ în prezenţa a 2x 10-5 M Ca²+. Cu o concentraţie
constantă de Mg²+ există o activitate de 10-6 M Ca²+ dar inhibiţia este observată la 1 mM Ca²+.
Activitatea este inhibată de agenţii de chelare precum etilen glycol-bio (β aminoetileter), N, N acid
tetraacetic.
Din aceste observaţii ar apărea diferenţă între insecte şi vertebrate şi anume ATP-aza actomiozinei.
Nivelele de Ca²+ mai scăzute de 10-7M, doar activează muşchii insectelor şi ale fibrelor musculare
ale actomiozinei
Evidentă a fost prezenţa sistemului dual de Ca²+, reglarea în muşchii de Lethoarus asociat cu
filamentele subţiri şi cu miozina.
Este posibil ca la o concentraţie de Ca²+ să fie nevoie ca ATP-aza actomiozinei să fie prezentă la o
mărime redusă a reticulului sarcoplasmatic (Smith 1965).
Astfel, au fost arătate diferenţele existente între fibrele muşchilor zburători şi nonfibrelor muşchilor
picioarelor de gândac de apă L. Maximus.
Observaţii similare arată controlul gradual al ATP-azei de către concentraţiile de Ca care se găseşte
la alte tipuri de fibrile musculare, acele ale albinei şi gândacului, în timp ce muşchii nonfibrilari ai
gândacului au o sesibilitate mărită a Ca²+.
Degradarea tipică a fibrelor musculare de la L. Maximus conduce la o scădere a sensibilităţii ATP-
azei actomiozinei la Ca²+.
Adăugarea tropomiozinei iepurelui restaurează parţial sensibilitatea sistemelor, ulterior sugerează
faptul că tropomiozina-troponina sistemului reglator este operativ în muşchii insectelor. Aparent este mai
puţină tropomiozina în muşchii de zbor decât în cei de la picioare.
Inhibarea ATP-azei actomiozinei de către ADP, pare a fi cooperantă şi a fost interpretată
corespunzând unui fenomen alosteric (Chaplain, 1966).
154
L. Maximus şi L. Cordifanus au fost folosite pentru a demonstra acest fenomen. De asemenea inhibiţia ADP-
ului poate fi inhibată de prezenţa ATP-ului analog (β-ribofuranozilpurina 5 tri fosfat) la fel ca substratul pe o
cale adevărată.
Aceste observaţii sugerează prezenţa unor distanţe stereospecifice dintre situsurile receptorilor ATP-
azei actomiozinei.
ATP-aza actomiozinei poate exista în 2 stadii: unul cu afinitate scăzută pentru substrat şi celălalt cu
afinitate crescută, cel din urmă fiind inactivat catalitic. Actina schimbă echilibrul între afinităţi şi inhibă
ATP-aza spre starea activă, iar la concentraţie scăzută de Ca2+ starea inactivă devine mai greu accesibilă.
Tipul de inhibiţie produsă de ATP sugerează de asemenea prezenţa unui al treilea stadiu al ATP-azei, ce
prezintă o afinitate pentru ADP. De asemenea natura alosterică a ATP-azei actomiozinei insectelor a fost
învinsă, studiile cu fibre glicerinate arată acţiunea sinergică a Ca, prin activitatea ATP-azei.
Ambele curbe ale activităţii ATP-azei şi tensiunii crescute sunt bifazice dar ajung la un platou de 10-7
M Ca2+ ATP-aza rămâne la valoare ridicată la 10-4 M Ca2+, dar fibrele se relaxează complet.
Diferenţele în conformaţie şi tensiunea activităţii ATP-azei sugerează faptul că nu sunt implicate în
aceeaşi paşi curbele în secvenţele de reacţii. Tensiunea din muşchii fibrilari ai insectelor este generată mai
ales prin legarea ADP-ului. Este o evidenţă considerabilă ce schimbă în reticulul sarcoplasmatic
concentraţiile de Ca2+ (de la 0,01 la 1,0 μ M) în timpul contracţiei controlului ciclic, nu numai activităţile
ATP-azei miofibrilare, dar şi ale enzimei cheie, incluzând fosforilaza enzimei membranei mitocondriale
exterioare ( Ebashi şi Endo, 1968).
Schimbări similare în concentraţia de Ca2+ modifică activitatea enzimelor intramitocondriale, cum ar
fi piruvat dehidrogenaza. Mitocondria poate juca un rol complementar la reticulul sarcoplasmatic în
controlul schimbărilor concentraţiei intracelulare ale Ca2+. Aceste schimbări ale Ca2+ intramitocondrial în L.
Cordifanus şi Schistocerca Gregaria este reglată de NAD dependent de izocitrat dehidrogenază pentru a
controla formarea energiei în procesul contractil (Zammit şi Nerosholme, 1976). Izolarea miozinei, actinei şi
troponinei din muşchii fibrilari ai insectelor ( L. cordifanus, L. maximus, H. japetus) a arătat unele diferenţe
între proteinele de insecte şi cele ale muşchilor vertebratelor.
De asemenea, miozina de la ambele feluri de muşchi are aceeaşi greutate moleculară, subunităţi
uşoare cu compoziţii diferite, reconstituirea actomiozinei folosind miozine omoloage şi heteroloage,
indicând o activitate a ATP-azei scăzută a actomiozinei conţinând miozina insectei. Prin tropomiozina,
activitatea ATP-azei, cum s-a mai discutat în condiţiile în care aceasta poate fi datorată unor proprietăţi ale
miozinei insectei, ceea ce previne interacţiunea cu actina în absenţa tropomiozinei. Activarea de către
tropomiozina pare a face o diferenţă mare între vertebrate şi muşchii insectelor. În final diferenţele minore
existente între proteinele contractile ale insectelor şi vertebratelor, ţesuturile striate şi mecanismul lor de
acţiune este esenţial similar.
Modelul suprasimplificat descris aici lasă loc multor întrebări fără răspuns, dar oferă câteva indicaţii
despre cum un complex foarte sofisticat implică enzimele (ATP-azei) 2 seturi de proteine reglatoare
(tropomiozina şi troponina) şi o interacţiune între perechile proteinelor fibrilare (actina şi miozina) care
transferă energia realizată de hidroliza ATP-ului într-un mecanism ce funcţionează în muşchii insectelor
(Heilmeyer, 1976).
FIBROINELE
Cu părere de rău, până în prezent, este folosit numai firul de mătase obţinut de la Bombyx mori
(viemele de mătase). În natură există încă foarte multe specii de insecte, care produc fibroine, dar nu sunt
utilizate la justa lor valoare.
În acest mod, în viitor se vor descoperi încă multe materiale noi (nono-materiale), care vor juca un
rol important în viaţa omului. Noi, acum am început cercetări importante de obţinere a materialelor noi din
fibroine prezente în compoziţia ţesuturilor insectelor. În viitor, vor fi obţinute materiale noi pentru a înlocui
unele organe ale omului. Aşa spre exemplu, vor putea fi înlocuite vasele sanguine deteriorate cu altele noi
obţinute din unele componente ale ţesuturilor din unele specii de insecte. Este o direcţie foarte importantă
155
începută de către noi pentru prima dată. Din insecte se vor obţine şi mulţi coloranţi foarte importanţi, care se
vor utiliza în pictură.
Din informaţiile prezentate mai sus s-a demonstrat că în componenţa muşchilor insectelor există
SBA care pot îmbunătăţi activitatea muşchilor la om.
Noi am elaborat o serie de unguente pentru îngrijirea picioarelor, care au salvat multe persoane de
dureri infernale ale picioarelor, mai ales în timpul nopţii.
Miozina extrasă din insecte activează ATP-ul din ţesuturile membrelor la om, astfel că după
aplicarea unguentelor pentru îngrijirea picioarelor, circulaţia sângelui este stimulată şi produce o energie
intensă în muşchii membrelor. În componenţa SBA extrasă din insecte sunt incluse cantităţi mari de Ca, Mg
şi P, care intensifică funcţia muşchilor.
Este un început foarte bun şi sunt convins că în viitor pe baza datelor furnizate se vor elabora multe
preparate farmaceutice noi, care vor îmbunătăţi starea de sănătate şi vor mări longevitatea fiinţei umane.
STRUCTURA
Fibroina de mătase a fost bine cercetată de-a lungul timpului. Este cea mai interesantă, cu o structură
primară şi secundară. În acelaşi timp au fost studiate β-fibroinele şi colagenul. Mătasea de hymenopteranα
helix la albine, viespi, furnici este încă foarte puţin studiată. La toate acestea este prezentă fibroina de tipul
α-helix. În larvele de albină, mătasea este înmagazinată în lumenul glandelor tubulare, în tactoide
microscopice.
La nivelul microscopului optic şi electronic, aceste tactoide par a fi striate, răsucite ca şi când ar fi
compuse din filamente pe lungime şi filamente terminale. La bondari unele tactoide sunt prezente, ataşate în
interiorul pereţilor glandelor, dar de obicei aranjamentul este bine definit. Toţi fibronii de la insectele, care
aparţin familei Saturnudae au un conţinut ridicat de alanină, într-un fel, mici cantităţi de glicină şi serină.
Bombyx mori are mătasea cu o compoziţie diferită de aminoacizi. Mătasea acestui vierme a fost cea
mai studiată. În condiţii natural, fibrele conţin filamente duble de fibroine în care sunt incluse proteina
globulară şi serina.
Fibroina B. mori este o proteină, gogoaşă sintetizată şi secretată din partea posterioară a glandelor, ca
şi la bombicide. Fibroinele din genul Anaphe şi Hipsoides sunt de remarcat prin faptul că alanina şi glicina
reprezintă o mare parte din suprafaţa lor. 94% din fibroină la Anaphe moloney constă din 2 aminoacizi şi
materialul este un polimer esenţial al acestor 2 aminoacizi, astfel că sunt cele mai simple proteine cercetate
de Lucas et al, 1960. Fibroina oului tulpinii de Chrysopa sp, conţine 40% la serină.
Modelele fracţiei fibroinei la insecte variază în meridianul seriilor de reflecţie. La albine, bondar,
viespi coloniale şi alte specii, măsurătorile indică o perioadă axială de cel puţin 280 A. Filamentele mătasei
de Bombyx mori par a fi uniforme la 40Ă, cu nişte diferenţe, astfel fiecare filament constă în 2 bari de circa
20 Ă diametru.
Razele X fotografiate din câteva fibroine studiate arată modele de pete şi arcuri ce indică
faptul că o parte din lanţurile polipeptidice sunt aranjate reciproc, astfel încât formează cristale. Din aceste
măsurători de arcuri şi distanţe ale planurilor atomilor în cristale au fost calculate şi pe această bază,
fibroinele se pot divide în 5 grupuri, membrii fiecărui grup având aceleaşi distanţe. Aceste 2 grupe se pot
subdivide pe baza diferenţelor vizuale în intensitatea acestor 2 pete ecuatoriale.
Dimensiunile în cele 2 direcţii sunt aceleaşi pentru toate fibroinele.
Aceste direcţii sunt de-a lungul fibrelor axiale unde se repetă distanţa de 6,95Ă reprezentând 2 reziduri de la
un lanţ peptidic şi între 2 lanţuri care e direcţia legăturilor de hidrogen.
A treia dimensiune, este o direcţie proiectând lanţurile ce disting diferențele între aminoacizi şi
această dimensiune variază între 5 grupe de la 9,3 la 15,7Ă. Toate fibroinele de la Saturnidae aparţin
grupului razelor X (Lucas, 1960). Ele se pot divide în grupe 3a, 3b şi aparent reflectă diferenţele în
componentele alaninei.
Aşa cum a fost stabilit până acum fibroina din B. mori este neobişnuită prin compoziţia de
aminoacizi.
Un tip similar al fibroinei pare a fi produs de Bena parasinana.
156
Grupul 2a se găseşte de-a lungul toracelui la Thaumetopolal genera şi Hypsoides unde alanina este în
proporţie de 50%.
Grupul 2b se găseşte la Clania sp, un membru al Psychidae.
Mătasea păianjenului de la Nephila madagascariaensis şi Nephila senegalnsis sunt diferite în compoziţia de
aminoacizi şi grupa razelor X.
Aceasta e datorată diferitelor forme funcţionale ale fibroinelor care apar din diferite glande.
Fibroina din N. madagascariaensis e depănată din păianjen în timp ce fibroina din adultul N. senegalensis e
depănată din fibra oului cocon.
La mătasea de Bombyx mori fibroina indică faptul că molecula nu este omogenă, dar constă în
jumătatea cristalinului şi a doua fază amorfă care nu contribuie la realizarea modelului razelor X.
Un lanţ antiparalel, structura β a fost propusă pentru regiunile fibroinei de Bombyx.
Această structură se bazează pe ipoteza sugerată de evidenţa chimică cum că fiecare al doilea reziduu
la mătasea lanţului polipeptidic este glicina.
Lucas şi colaboratorii săi au izolat (Lucas et al., 1958, 1960) rezistenţa chimotripsinei (CTP),
fracţia din fibroină solubilizată despre care se crede că e derivată din regiunile cristalinului. Au propus
pentru această fracţie formula secvenţială aratată în Eq.
BIOSINTEZA
Scara largă de sinteză a proteinelor particulare este echivalentă cu o scală largă de expresie a genei
particulare. Gena expresivă poate fi controlată la diferite nivele. Dar, este interesant de aflat paşii
posttranscripţionali (selecţia ARN mesager, transportatori, stabilizatori) în fazele de translaţie şi
posttranslaţie (clivarea proteinei, asamblare, turn-over), un sistem implicat la scară largă, expresia unei gene
particulare poate permite identificarea şi izolarea ARNm, aşa cum s-a demonstrat cu hemoglobina, miozina
şi alte proteine la eucariote.
Experienţa a fost făcută pentru a obţine ARNm din insecte care direcţionează sinteza primară a
fibroinelor. O parte din glanda care sintetizează firul de mătase a fost fracţionată în coloane de celuloză.
Astfel, s-a determinat abilitatea ARN-ului direcţionat pentru încorporarea aminoacizilor în proteine,
modelând acest proces în bacteria Escherichia coli.
S-a observat că fracţia ARN obţinut din mătasea din mijlocul glandei este direcţionată către
încorporarea glicinei, alaninei şi serinei, dar procentajul acestor aminoacizi încorporaţi seamănă cu
procentajul sericinei mai degrabă decât fibroina.
Mătasea proteinei din B. mori conţine 45% glicina, reziduuri alternând predominant cu resturile de
alanină şi serină, aşa cum arată Sasahi şi Noda (1973).
Un calcul al preciziei acestor coduri ale predicţiei aminoacizilor, fibroina ARN mesager ar trebui să
fie cel putin 57% G + C, o valoare care este mai înaltă decât AND sau ARN ribozomal la B. mori.
Această creştere G+C a conţinutului ar trebui să conţină o creştere a conţinutului G de 40% a acestor
reziduuri de bază.
Prin adăugarea repetată a secvenţelor de aminoacizi ai fibroinei presupune o simplă repetare a secvenţei de
aminoacizi de ARNm.
Când larvele de vârsta a 5-a sunt marcate 24 de ore cu ortofosfat - P32 şi ARN sedimentează între
45S şi 65S e izolat, se găseşte în conţinutul de 59% al rezidurilor G+C şi 40% rezidurile G. ARN este
sintetizat foarte uşor şi este foarte stabil. 1,4% din ARN total din glanda posterioară corespunde fibroinei
ARN mesager.
Spectrele de oligonucleotide eliberate din ARN prin digestie pot fi comparate cu spectrul care poate
fi prezis printr-o secvenţă de bază de la fibroina mesager cunoscând secvenţa de aminoacizi şi folosind codul
corespunzător.
Produsul digestiei se apropie de această prezicere ca rezultat, neexistând nici o îndoială că ARN
izolat are o cantitate mai mare de fibroină pură decât ARNm, în care glicina e codată de GGU şi GGA,
alanina de GCU şi serina de UCA. Densitatea fracţionată cuplată cu hibridizarea moleculară a fost folosită
pentru a obţine informaţii pe lungimea ADN-ului (Lizardi şi Broron, 1974).
ARN-ul mesager al fibroinei este extras şi corespunde AND-ului fiind sintetizat pentru a folosi
transcripţia reversibilă. Pe lungimea ADN-ului la 6 x 10 6 daltoni dublu spiralat, ADN-ul aceasta se
compară cu mărimea ARN-ului mesager al fibroinei, la 5,5- 6 x 10 6 daltoni. Aceasta înseamnă că singură,
fibroina este gena structurală şi constă în 11 - 12· 10 6 daltoni.
O problemă relatată la coconul fibroinei este mecanismul utilizat de la vierme şi alte specii de
Lepidoptere. În acest scop celulele specializate se dezvoltă pentru a produce o ridicare a enzimei proteolitice
măsurate în cocon (Kafatos, 1972).
Enzima scoasă în afara suprafeţei întârziate în dezvoltarea adultului înainte de a o măsura poate fi
găsită ca un strat uscat semicristalin. La molii, 0,1 mg sau mai mult, poate fi colectat cu ajutorul forcepsului
la fiecare insectă.
Materialul constă virtual din euzină pură. În timpul măsurării, euzina este redizolvată la valoarea pH-ului
optim de 8,3 în bicarbonatul izotonic. Aceasta este secretată de altă glandă şi este adusă în contact cu
158
coconul, ajutând digestia sericinei şi legând fibrele de mătase împreună. Structura coconului se pierde şi
insecta găseşte drumul afară.
Celulele gliale la Antherea polyphemus produc coconi ca precursori inactivi.
Diferenţa acestor celule constă în controlul hormonal al ecdysonei şi hormonului juvenil. Ecdysona trasează
diferenţele, dar când hormonul juvenil este prezent, acesta diferenţiază şi inhibă celulele rămase în stadiul
caracteristic al pupei.
Sinteza coconului a fost studiată extensiv de Kafatos (1972). A fost arătată de ARN-ul mesager
pentru proteina noncocon, care are o viaţă mult mai scurtă - 1,5-2 ore, de obicei existenţa coconului
mesager fiind de cel putin 7 zile. Sinteza coconului începe frecvent, probabil folosind mesajul preexistent.
Coconul arată similaritatea chimică remarcabilă cu tripsina mamaliană şi alte serine proteaze. Greutatea
moleculară este de aproximativ 24.000, astfel proteinele din pupele de B. mori au greutatea moleculară de
aproximativ 20.000
Compoziţia aminoacizilor este foarte similară cu cea a tripsinei bovinei. Euzina are o reactivitate
încrucişată cu tripsina şi chimotripsina. Coconaza este diferită de euzina proteolitică a fluidului format, care
este secretat de celulele epidermale prin corpul insectelor cu scopul digestiei cuticulei vechi în timpul lizării.
Diferenţele între coconază şi topirea proteazei fluidului, indică ambele poziţii specifice ale ARN-ului
mesager.
PROTEINELE TEGUMENTULUI
159
Prin adăugarea proteinelor extrase din diferite specii de insecte deasemenea diferă.La Periplaneta
americana numărul benzilor electroforetice rezultate de la proteina cuticulară, variază de la 7 la 14
depinzând de stadiul de dezvoltare.
Fracţia proteinei globulare de la cuticula larvei de la Sarcophaga crassipalis se comportă ca un singur
component prin analiza sedimentară, cu o greutate moleculară de 7000-8000, altfel proteina este heterogenă.
Fracţia globulară de la cuticulele de Acheta domesticus a fost rezolvată în 5 componente şi toate
greutăţile moleculare care corespund multiplu de 7000. Solubilitatea proteinelor Schistocerea gregaria
larvae ocupă 6% din greutatea cuticulei uscate, în timp ce proteina reziduală se aranjează la 44-49% greutate
uscată.
La alte specii de insecte proteina solubilă variază la 13-23% greutate uscată, dar proteinele insolubile
sunt la fel ca în S. gregaria.
În cuticula larvei la Agrianome spinicollos (Coleoptera) este o mare diferenţă între diferite proteine.
Fracţia solubilizată în apă conţine 13 produse. Solubilizarea proteinei în KCl provoacă apariţia a 11 fracţii
de proteine. După solubilizarea proteinelor în uree, apar 20 de proteine. În proteinele solubilizate în NaOH
apar 11 proteine, cum se aşteaptă proteinele fracţionate în uree şi NaOH din agregate de proteine în soluţia
tampon cu pH=7. Caracterizarea e necesară pentru a funcţiona aceste proteine la fel de bine ca a elucida
biosinteza lor. În contrast cu fibroinele, proteinele cuticulare au din abundenţă aminoacizi agregaţi cu
legături pe suprafaţa altor structuri. Proteinele solubile aparent, nu prezintă proteine netăbăcite fără nici un
proces de tăbăcire, dar pot fi obţinute in vitro.
Aminoacizii raportează faptul că proteinele cuticulare sunt: acidul aspartic, glutamic, serina, glicina, alanina,
tirozina, valina , leucina, izoleucina, prolina, hidroxiprolina, lizina si triptofanul. Cisteina sau meticenina
sunt amândouă de asemenea prezente, dar în concentraţii mici în toate cuticulele insectelor.
Aminoacizii proteinelor cuticulare, indică anumite similarităţi în compoziţia cuticulei insectelor
Agrianieme (Coleoptera) şi Bombyx (Lepidoptera). Au cuticule cu proteine similare compoziţiei
aminoacizilor, dar diferă de cuticulele larvei de Lucilia (Diptera). Speciile de Drosophilla au aminoacizi
similari dar diferă de componentele pupele de la Calliphora şi Lucilia.
Proteinele cuticulei la diferite stadii de dezvoltare la Galleria mellonella arată procentaj mai mare de
glicină şi alanină. Alanina este prezentă în toate cuticulele pupelor. Un tip special de proteină cuticulară este
mai degrabă o proteină insolubilă numită rezilina care poate izola chitina. Compoziţia aminoacizilor
rezilinei este diferită de alte proteine structurale. Nici o structură nu a fost observată la microscopul
electronic. Rezilina este localizată în regiunile unde au loc mişcări arcuite. Articulaţia larvei S. gregaria
conţine 86% rezilină. Este posibil ca o parte din proteinele articulare să fie conjugate cu chitina şi
glicoproteinele. Natura legăturii între chitină şi proteină nu a fost elucidată.
COLAGENUL
Colagenul este cea mai importantă fibră insolubilă a ţesuturilor conective. Colagenul marchează inert
enzimele proteolitice în special statutul nativ şi se transformă în gelatină prin încălzirea cu apă sau alcalii.
Colagenul este întâlnit la multe insecte. Are o compoziţie neobişnuită de aminoacizi: 1-3 reziduri de glicină
şi alte 1-3 sunt prolina şi hidroxiprolina. La colagen sau tropocolagen (solubil sau extras) molecula constă în
3 legături, ce sunt identic sau diferit acordate la ţesuturi şi specii de la care provin.
Legăturile au aceeaşi polaritate şi asociate suprapunându-se pentru a forma fibrele de colagen, astfel
preparatele corespunzătoare microfotografiei electronice cu caracteristici specifice ale benzilor şi
antibenzilor. Legăturile polipeptidice ale moleculei de colagen sunt cunoscute ca α 1,22 şi α 3.
Diferitele tipuri de colagen sunt cunoscute ca fiind I, II şi III. Acest colagen a descris acele molecule
constând (a) în 3 aparenţe legături identice ca [( α 1 ) I ]3; [( α 1 ) II ] 3; [( α 1 ) III ]3; (b) 3 legături diferite
ca (α 1), (α 2), (α 3) sau (c) 2 legături identice sau diferite ca [( α 1)I]2α2.
Microscopul electronic şi difracţia razelor X sugerează faptul că acea componentă noncelulară a tecii
nervoase numită lamelă neurală, constă din matrix şi o parte care este introdusă în fibrele colagenului.
Colagenul ca material de asemenea formează o parte de stroma sistemelor nervoase ale insectelor. Colagenul
la gândac L. maderae şi Blaberus craniifer a fost demonstrat de o varietate de tehnici. Microscopul
160
electronic cu ajutorul căruia s-au efectuat cercetări asupra diferitor organe ale insectelor a arătat faptul că
ţesuturile conective fibrilare au legăturile caracteristice ale colagenului. Aparent, ţesuturile fibrilare
conective de la insecte arată variaţii considerabile a ultrastructurii ţesuturilor. Aceasta se referă la stabilirea
diametrului fibrelor şi periodicitatea axială. Valorile scăzute la 170Ă au fost determinate la anumite insecte
la periodicitatea axială că la G. mellonella. La gândacii de bucătărie periodicitatea de 500-600Ă este
caracteristică.
Analiza fracţiilor de aminoacizi din ţesuturi complexe corpora cardiaca şi corpora allata, arată că
apa reziduală conţine o semnificativă cantitate de hidroxilizină şi o cantitate mai mică de hidroxiprolină.
Aceşti 2 aminoacizi sunt marcaţi de prezenţa colagenului. Proteoliza poate fi realizată prin folosirea
colagenazei cu substanţe suplimentare, în prezenţa colagenului.
Compoziţia de aminoacizi a învelişului de colagen a fost obţinută din carcasele gândacilor de
bucătărie. Compoziţia carcasei de colagen a gândacilor de bucătărie e similară cu cea raportată de alte surse.
Numele de defensine din insecte a fost iniţial propus de Lambert şi asociaţii (1989) pentru 2
peptide 4-kDa, izolate din sângele larvelor infectate cu bacterii ale muştei Phornia terranovae care a
prezentat asemănare de frecvenţa cu defensinele din mamifere.
Într-un studiu independent, autorii şi colaboratorii au arătat că o linie de celule embrionare, NIH
Sape 4, derivată dintr-o altă specie de Diptera Sacrofaga pelegrina produce o defensină dintr-o insectă
izoformă, pe care ei au numit-o sapecina.
Multe din defensinele din insecte sunt active împotriva bacteriei gram-pozitive dar au o mică
activitate împotriva bacteriei gram-negative. Ele nu sunt hemolitice. Aceste molecule au o largă distributie
printre clasele de insecte. Prezenţa lor a fost raportată de alţii din Diptera, Caleoptera, Trichoptera,
Hymenoptera, Neuroptera, Hemiptera şi Odonata. Peptidele antimicrobiene cu secvenţe similare au fost de
asemenea găsite în scorpioni şi în molusca Mytilus edullis.
Din ultimele lucrări publicate, referitor la peptidele din insecte cu efect bactericid sau fungicid, pot
relata următoarele: în timpul morfogenezei, insectele parcurg patru faze de dezvoltare: ou ,larvă, pupa şi
adult. La fiecare fază de dezvoltare se modifică nu numai morfologic, dar şi biochimic. În componenţa
ouălor predomină proteinele, lipidele sunt pe locul doi, iar glucide sunt foarte puţine. În componenţa larvelor
(unica fază care se hrăneşte) există multe proteine şi lipide. Cea mai interesantă fază este cea de pupă. Aici
se petrec transformări extraordinare. Proteinele solubile se transformă în proteine insolubile - cheratina şi
chitina, care formează adultul, ouă sau spermatoizi, substanţa protectoare a ouălor, pentru a le proteja de
acţiunile nefavorabile ale mediului înconjurător. Aproximativ 90-93% din materia pupelor o constituie
materia inactivă.
De obicei, femelele sunt mai mari în volum şi greutate în comparaţie cu masculii, deoarece ele includ
cantităţi mari de ouă şi materie protectoare pentru protejarea ouălor. Adulţii de obicei sunt activi până la 5
zile. Numai pentru această perioadă ajunge energia acumulată. După împerechere, adulţii îşi încetează
activitatea şi decedează.
Procesul de cheratinizare al insectelor are loc diferit şi foarte rapid. Din acest punct de vedere, unele
specii de insecte sunt modele de cercetare a transformărilor de SBA în Substanţe Biologic Inactive. În
timpul acestor transformări apar multe enzime şi peptide care permit aceste transformări. În primul rând,
apar SBA (enzime şi peptide), care stopează sinteza proteinelor şi a acizilor nucleici, inhibând astfel
procesele vitale. În acest proces pot fi depistaţi şi izolaţi o serie de activatori şi inhibitori ai proceselor vitale.
Aici există multe tipuri de defensine (inhibitori). Peptidele inhibitoare a multiplicării unor organisme
patogene, care s-au depistat recent (defensine), despre care se vorbeşte mult, nu sunt altceva decât SBA de
stopare a sintezei proteinelor şi a acizilor nucleici.
pentru relatate mai sus pot să mă îndoiesc de prezenţa unor peptide cu structuri diferite.
Eu cred că în pupele insectelor apare un proces intens de cheratinizare sau chitinizare a ţesuturilor
nevertebratelor. Acest fapt îl putem dovedi prin cantitatea de proteine insolubile ce creşte rapid şi proteine
solubile (active) care scad evident. Lipidele şi glucidele în ultima fază a larvelor şi în pupe dispar, adică se
161
transformă într-un complex lipo-proteic. La aceste transformări iau parte peptide specifice, care stopează
sinteza proteinelor şi a acizilor nucleici specifici. În această situaţie nici patogenii nu se pot forma, mai ales
virusurile.
Am lucrat o viaţă cu Baculovirusuri, şi în faza de pupă virusurile dispar ca structuri morfologice.
Poate se integrează în genom, unde nu se pot depista? Substanţele biologic active extrase din insecte au efect
antiviral.
Depistarea SBA cu efect antiviral reprezintă o premieră mondială. Aceste preparate vor produce o
revoluţie în medicina contemporană. Proteinele extrase din anumite specii de insecte provoacă un mediu
străin pentru virusurile specifice vertebratelor.
PROTEINELE CROMOZOMALE
Proteinele cromozomale, în special histonele au fost incluse în structura proteinelor ştiindu-se faptul că joacă
un rol important în reglarea genelor.
Histonele - sunt proteine de bază asociate cu ADN. Sunt în general proteine structurale specializate
cu cromatină, dar se poartă ca represori ai activităţii. Histonele sunt proteine conservate la un nivel înalt, dar
avem o mică variaţie a secvenţelor de aminoacizi de la diferite surse. Ele sunt acetilate, metilate sau
fosforilate, dar secvenţele acestor modificări nu au fost înţelese în prezent. Histonele sunt clasificate în
legătură cu caracteristicile chimice (Elgin şi al, 1971). Structura primară a histonelor de la surse variate a
fost determinată şi detaliată de compoziţia şi secvenţa histonelor obţinute, ale insectelor, cu excepţia
Drosophilla.
Cantitatea de proteină diferă în funcţie de faza de dezvoltare şi în funcţie de specia de insecte (tab.1).
De exemplu:
La Omida păroasă a stejarului, în ouă, substanţa uscată este 91,27g/100g, din care proteine, 66,29
g/100g. În larve, substanţa uscată constitue 90,27 g/100; din care proteine 73,17 g/100g, lipide 11,78 g/100g
iar zahărul 0,556g/100g. În faza dezvoltare, la pupe, substanţa uscată constituie 93,19 g/100g din care
proteine 66,36 g/100g, lipide 23,50 g/100g şi zahăr 8,870 g/100g. La adult, substanţa uscată este 95,40
g/100g, proteine 55,54 g/100g, lipide 28,32 g/100g şi zahăr 1,90 g/100g.
La Euproctis hrisorhoea (omida cu codiţă roşie), substanţa uscată constituie 91,05 g/100g din care
proteine 78,83 g/100g, lipide 12,54 g/100g şi zahăr 2,010 g/100g. P.e.p. are 88,89 g/100g din care protein
55,86 g/100g, lipide 55,86 g/100g şi zahăr 3,64 g/100g.
La Bombyx mori pupe, substanţa uscată este 82,43 g/100g din care proteine 74,79 g/100g, lipide
16,36 g/100g şi zahărul 2,890 g/100g. La adult substanţa uscată este de 94,86 g/100g din care proteină 51,69
g/100g, lipide 18,46 g/100g şi zahăr 3,880 g/100g.
La Malacasoma Neustria adult substanţa uscată constituie 93,88 g/100g din care proteine 49,54
g/100g, lipide 26,94 g/100g şi zahăr 2,650 g/100g.
La Gândacul de Colorado larvă, substanţa uscată este 92,58 g/100g din care proteine 48,48 g/100g,
lipide 20,39 g/100g şi zahăr 4,6 g/100g. La Gândacul de Colorado adult, substanţa uscată este 90,36 g/100g
din care proteine 65,28 g/100g, lipide 6,57 g/100g şi zahăr 4,23 g/100g.
La Musca domestica larvă, substanţa uscată este 91,79 g/100g din care proteine 47,03 g/100g, lipide
22,24 g/100g şi zahăr 0 g/100g. La Musca domestica adult, substanţa uscată este 94,10 g/100g din care
proteine 53,21 g/100g, lipide 22,27 g/100g şi zahăr 4,28 g/100g.
La Galleria mellonella larve, substanţa uscată este 95,09 g/100g din care proteine 44,67 g/100g,
lipide 38,62 g/100g şi zahăr 5,4 g/100g. La Galleria mellonella adult, substanţa uscată este 91,48 g/100g din
care proteine 55,93 g/100g, lipide 9,02 g/100g şi zahăr 0 g/100g.
162
La Li, substanţa uscată este 97,07 g/100g din care proteine 45,20 g/100g, lipide 20,63 g/100g şi zahăr
4,4 g/100g.
La Mellolontha mellolontha, substanţa uscată este 97,12 g/100g din care proteine 50,09 g/100g,
lipide 20,92 g/100g şi zahăr 4,3 g/100g.
La substanţa protectoare (puf), substanţa uscată este 88,28 g/100g din care proteine 66,84 g/100g,
lipide 0 g/100g şi zahăr 2,2 g/100g.
La seminţe de struguri, substanţa uscată este 94,89 g/100g din care proteine 12,45 g/100g, lipide 8,4
g/100g şi zahăr 5,4 g/100g.
La oul de prepeliţă, substanţa uscată este 96,92 g/100g din care proteine 43,14 g/100g, lipide 29,5
g/100g şi zahăr 2,06 g/100g.
Tabelul 1. Analize cantitative a substanţelor biologic active extrase din diferite specii de
insecte la diferite faze de dezvoltare.
Nr. Specia Substanţa Proteine Lipide Zaharuri
crt. uscată g/100 g g/100g g/100g
g/100 g
1 L.d.O 91,27 66,29 16,91 2,380
2 L.d.(I) 90,27 73,17 11,78 0,556
3 L.d.(p) 93,19 66,36 23,50 8,870
4 L.d.I(at) 95,40 55,54 28,32 1,900
5 P.e.p(at) 88,89 55,86 23,62 3,640
6 P.e.p 91,05 78,83 12,54 2,010
7 B.m(p2) 82,43 74,79 16,34 2,890
8 Bm.I.(at) 94,86 51,69 18,46 3,880
9 M.n.I(at) 93,88 49,54 26,94 2,650
10 C(I) 92,58 48,48 20,39 4,600
11 C2(a) 90,36 65,28 6,57 4,230
12 Dm.I 91,79 47,03 22,24 -
13 Dm.I(m) 94,10 53,21 22,27 4,280
14 Gm.I(a) 95,09 44,67 38,62 5,400
15 Gm.F 91,48 55,93 9,02 -
16 Li 97,07 45,20 20,63 4,040
17 mm 97,12 50,09 20,92 4,030
18 P.u.f 88,28 66,84 - 2,200
19 Grape seeds 94,89 12,45 8,40 5,400
20 Pr(a)-quail egg 96,92 43,14 29,50 2,060
164
Tab.6. Analize cantitative – Musca domestica şi ou de Lymantria dispar în diferite condiţii
Nr Proba S.U. Prot Prot Lipide Lipide
crt g/100g g/100g g/100g g/100g g/100g
S.U. S.U.
1 DM atomizat 93.11 44.14 47.41 18.17 19.52
2 DM uscat la 91.47 53.48 58.47 10.37 11.34
etuva
3 DM larva 3 25.43 13.38 52.62 0.272 1.072
4 DM larva 3 22.62 11.66 51.58 0.277 1.22
5 DM larva 3 25.73 13.68 53.17 0.117 0.45
6 Ou 92.85 70.48 75.90 41.21 44.39
7 Ou atomizat 93.61 52.33 55.91 10.71 11.44
165
Ce este un spectru ?
166
167
168
169
170
171
ANALIZE SPECTROFOTOMETRICE LA DIFERITE SPECII DE INSECTE
172
La începutul cercetărilor structurii biochimice a ţesuturilor insectelor, care includ o sumedenie de
SBA, am inclus metoda spectrofotometriei diferenţiale, care este considerată cea mai exactă metodă de
analiză deoarece spectrul de absorbţie determină cu cea mai mare exactitate care fracţie de absorbţie există
într-o anumită soluţie. Fiecare component are o anumită absorbantă, care se exprimă printr-o curbă ce
formează diferite peakuri la anumite lungimi de undă. Este cea mai exactă metodă de analiză a compuşilor
organici şi poate fi comparată numai cu metoda de titrare a anumitor componente.
Metoda de cercetare şi analiză biochimică a SBA constă în faptul că suspensia trebuie să treacă
printr-o prismă specială cu un anumit volum de lichid. În anumite suspensii, amprenta spectrală produce
diferite imagini. Curba fotospectrometrică a diferitelor suspensii formează un spectru de absorbţie diferit.
Această imagine depinde de componenta speciei din care se extrag anumite substanţe şi de tipul solventului.
Pentru proteine, solvenţii principali care se utilizează sunt: apa distilată, serul fiziologic şi apa acidulată.
Lungimea de undă depinde de suspensia prin care poate trece unda spectometrică până la un anumit nivel.
Acest nivel este considerat ca un spectru de absorbţie ce caracterizează suspensia dată. Absorbţia depinde de
numărul de atomi din raza de lumină care poate penetra până la un anumit nivel, reducând intensitatea
luminoasă.
Pentru a clarifica mai exact rezultatele obţinute în cazul cercetărilor compoziţiei SBA, unde
predomină proteinele obţinute din insecte, am caracterizat solvenţii.
Cel mai bun solvent al proteinelor este apa distilată, care în amprenta spectrală formează o curbă
cu un peak individual cu lungimea de undă de 198,5 nm şi concentraţia (ABS) 1,222.(Fig.1).
Am efectuat amprentele spectrale a următoril solvenţi: NaCl (fig.2), NaOH(fig.3), HCl(fig.4), Cloroform
(fig.5), Metanol(fig.6),n-heptan(fig.7.), CCl4(fig.8), benzene (fig.9), eter de petrol(fig.10.), etanol(fig.11.),
amestec etanol-cloroform (fig.12).
Fig.1.
Spectru de absorbţie al apei
distilate. Apare un singur peak în
zona lungimilor de undă de 198,5nm cu
ABS 1,222.
Fig.2.
Amprenta spectrală a solventului
NaCl.
Fig.3.Amprenta spectrală a
solventului NaOH.
173
Fig.4
Amprenta spectrală a solventului
HCl.
Fig.5.
Amprenta spectrală a
solventului cloroform.
.
Fig.6Amprenta spectrală a
solventului metanol.
174
Fig.8.
Amprenta spectrală a solventului
CCl 4 .
Fig.9.
Amprenta spectrală a solventului
benzen.
Fig.10.
Amprenta spectrală a solventului
eter de petrol.
Fig.11.
Amprenta spectrală a solventului
etanol.
175
Fig.12.
Amprenta spectrală a glucozei
(standard) când curba spectrală
formeaza trei
peakuri destinse în zonele
specifice pentru polizaharide.
Fig.13.
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din Aloe Vera în apă
distilată.Amprenta formează
o curbă largă cu multiple peakuri
în zona lungimilor de
undă de 220.0nm-248.0nm şi
un peak în zona 276.6n
Fig.14.
Spectru de absorbţie a SBA extrase din
gel de Aloe Vera K
10/1 în apă distilată. Amprenta formează
ocurbă largă cu peakuri
în zona lungimilor de unda de
195.0nm, 220.0nm, 219.0nm,
240.0nm, 250.0nm - 288.7nm.
176
Fig.15.
Spectru de absorbţie a soluţiei extrase
din fructe de cătină în
(2mg+10ml cloroform).
Amprenta spectrală formează
trei peakuri în zona lungimilor
de undă de 200.0nm, 240.0nm
şi în zona 320.0nm
Fig.16.
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din ulei de seminţe de
struguri în acetonă. Amprenta
spectrală prezintă peakuri în
zona lungimilor de undă de
330.0nm, 370.0nm, 409.5nm,
473.2nm, 533.4nm. şi 665nm..
Zona în spectru infraroşu.
În majoritatea cazurilor, solvenţii formează curbe spectrale în zone specifice mai mici decât
lungimile de undă de 200nm. Ca exclusivitate, numai eterul de petrol, benzenul, cloroformul, CCL4 şi
NaOH formează peakuri nu mai mari de 200nm.
În cazul unei suspensii proaspete de SBA extrase din pupe de Lymantria dispar L, curba amprentei
formează mai multe peakuri în zonele lungimilor de undă de 230.0nm şi un alt peak în zona lungimilor de
undă de 281.3nm. Apoi, curba formează o invaginaţie în zona lungimilor de undă de 255,6nm cu ABS de
1,2113.
Fig.17.
Amprenta spectrală a SBA din pupe
de Lymantria dispar în extract apos
acid(dil). Curba formează mai multe
peakuri maximale situate în zona
lungimilor de undă 230,0nm şi un alt
peak specific proteinelor în zona
281,3nm.
177
Extractul apos (diluţie 1/50) formează o curbă în zona lungimilor de undă 197.7nm cu ABS 2,1422 specific
pentru pupele de L. dispar. Un alt peak minor apare în zona lungimilor de undă de 280 nm, (zonă specifică
pentru proteine).
Fig.18.
Amprenta spectrală a SBA din
pupe de Lymantria dispar în
extract apos acid(dil 1/50).
Curba formează un peak max în
zona lungimilor de undă de
197,7nm cu ABS 2,1422 şi un
peak min în zona de 288,3nm cu
ABS 0,4265.
Fig.19.
Amprenta spectrală specifică
a SBA extrase din pupe de
L.dispar în apă distilată
(10mg+10ml apa dist). Curba
formează un peak max în zona
lungimilor de undă de
210,7nm şi un peak min de
289,1nm.
Fig.20.
Amprenta spectrală a SBA
extrase din pupe de L.dispar
de o zi după formare. Soluţie
în apă distilată (20mg+10ml
apa dist). Curba formează mai
multe picuri în zona
lungimilor de undă de
235,0nm şi în zona 280,0nm.
178
Fig.21.
Spectru de absorbţie a
suspensiei de chitină în ser
fiziologic.Curba formează o
maximă în zona lungimilor de
undă de 213.0nm cu ABS 3.200.
Fig. 22.
Un test de analiză al
polizaharidelor îl reprezintă
analiza spectrală a chitinei.
Aceasta formează curbe în
zona lungimilor de undă 210.0-
240.0nm,
zonă caracteristică pentru
polizaharide un alt peak în
zona lungimilor de undă de
275.9nm şi un alt peak în
zona 340.5nm cu un ABS de 3.000.
Fig.23.
Spectru de absorbţie al
soluţiei extrase din chitosan
în acid acetic care formează
o curbă cu peakuri max situate
în zona lunigimilor de undă de
213nm şi min la 275,9nm şi
340,5nm. (concentraţii
diferite).
179
Fig.24.
Amprenta spectrală a SBA
extrase din pupe de Malacosoma
neustria în apă distilată
(20mg+10ml apă dist). Curba
formează mai multe peakuri max
în zona lungimilor de undă de
230,0nm şi un peak min în zona
280,0nm.
Amprenta spectrală obţinută din SBA extrase din Euproctis hrissorhea L în apă distilată,
formează o curbă evidentă în zona lungimilor de undă de 209.3nm cu ABS DE 2.4058 caracteristică pentru
polizaharide, şi o altă curbă mai puţin pronunţată în zona 262.6nm, zonă caracteristică pentru proteine.
Fig.25.Amprenta spectrală a SBA
extrase din pupe de Euproctis
hrissorhea L în apă distilată
(10mg+10ml apă dist).Curba
formează un peak în zona
lungimilor de undă de 209.3nm
cu ABS 2.4058 şi un peak în zona
262.6nm cu ABS 0.7877.
Fig.26.
Amprenta spectrală a SBA
extrase din pupe de
E.hrissorhea L în apă distilată
(20mg+10ml apă dist).Curba
formează un peak max în zona
lungimilor de undă de
230.0nm cu ABS 4.000
(concentraţie dublă faţa de cea
anterioară).
Ultimele două spectre SBA extrase din aceeaşi familie de insecte, indică la existenţa unor componente
identice în apă distilată.
180
Spectrul de absorbţie al albuminelor serice bovine (2mg+6ml NaCl 9%) formează o curbă cu un peak în
zona lungimilor de undă 222.0nm cu ABS 2.7823. Suspensia a fost obţinută în urma decantării acesteia din
fracţia 5.
Fig.28.
Spectru de absorbţie a soluţiei de
albumină serică bovină în ser
fiziologic. Curba formează două
peakuri evidente în zona lungimilor
de undă de 232.4nm si 277.8nm.
Fig.29.
Spectru de absorbţie a soluţiei de
albumină serică bovină, fracţia 5
standard, în ser fiziologic. Curba
formează un peak pronunţat în zona
lungimilor de undă de 224.5nm şi
unul în zona 280.0nm.
181
Fig.30.
Spectru de absorbţie a soluţiei de
albumină serică bovină în ser
fiziologic, la diferite concentraţii;
(1)2mg+5mlNaCl;
(2) 2mg+10mlNaCl;
(3) 2mg+20mlNaCl.
Fig.31.
Amprenta spectrală a
proteinelor extrase din icre de
peşte în apă distilată, diluţie de
200 ori. Apar mai multe
peakuri în zona lungimilor de
undă de 225.0nm cu ABS
3.1373 şi un peak mai puţin
pronunţat în zona de 268.0nm
cu ABS 0.9701.
Fig.32.
Amprenta spectrală a proteinelor extrase din carne de peşte în apă distilată.Apare un singur peak în zona
lungimilor de undă de 208.5nm cu ABS 2.1730. În zona lungimilor de undă caracteristică proteinelor nu se
evidenţiază prezenţa acestora.
Fig.33.
Amprenta spectrală
specifică a proteinelor
extrase din carne de peşte în
apă distilată. Apare un peak
max în zona lungimilor de
undă de 217.5nm şi un peak
min în zona 247.5nm.
182
Fig.34.
Amprenta spectrală a
suspensiei proteice din
carne de peşte delipidizată
în apă distilată. Curba
formează un peak max în
zona lungimilor de undă
de 225.0nm cu ABS
3.1373 şi un peak min în
zona 268.0nm cu ABS
0.9701.
Fig.35.
Amprenta spectrală
specifică suspensiei lipidice
extrasă din carne de peşte în
n-heptan. (10mg+10ml n-
heptan). Curba formează 3
peakuri evidente la 220.0
nm, 271.0 nm şi 307.5nm.
Fig.36.
Amprenta spectrală a
suspensiei de lipide extrasă
din peşte (macrou) în
ciclohexan (0,5mg+10ml
ciclohexan).Curba
formează mai multe
peakuri evidente cu
maxime în zona lungimilor
de undă de: 222.8nm,
233.1nm, 271.8nm,
308.5nm.
183
Fig.37.
Amprenta spectrală a
suspensiei proteice din
carne de curcan în apă
distilată. Curba formează un
peak dominant în zona
lungimilor de undă de 220.0
nm cu ABS 2.9788.
Fig.38.
Amprenta spectrală a
suspensiei proteice obţinute
din carne de pasăre în apă
distilată. Curba formează un
peak evident la 211.0nm cu
ABS 2.1639.
Fig.39.
Amprenta spectrală a
suspensiei de lipide extrasă
din grăsime de pui
înciclohexan. (0,5mg+10ml
ciclohexan).
Curba formează mai multe
peakuri pronunţate în zona
lungimilor de undă de
223.1nm,271.7nm,
308.6nm.
184
Fig.40.
Amprenta spectrală a
soluţiei din carne de
porc nedelipidată în apă
distilată. Curba
formează un peak
evident în zona
lungimilor de undă de
223.3nm cu ABS de
2.9083.
Fig.41.
Amprenta spectrală a
suspensiei de proteine din
carne (muşchi) de porc
delipidată, în apă distilată.
Apare un peak dominant în
zona lungimilor de undă de
212.5nm şi o ABS 2.6149.
Fig.42.
Amprenta spectrală a
suspensiei de lipide extrasă
din carne de porc în n-
heptan (10mg+10ml n-
heptan). Curba formează un
peak evident în zona
lungimilor de undă de
236.5nm cu o ABS de
2.3188.
Fig.43.
185
Amprenta spectrală a suspensiei de lipide extrasă din grăsime de porc în ciclohexan. (0,5mg+10ml
ciclohexan). Curba formează 3 peakuri evidente în zona lungimilor de undă de 222.8nm, 271.8nm, 308.7nm.
Fig.44.
Spectru de absorbţie al
soluţiei de lipide extrase din
carne de porc cu solventul
benzene (10mg+10ml
benzen). Curba formează
mai multe peakuri în zonele
lungimilor de undă de
200.0nm, 280.0nm şi
310.5nm.
Fig.45.
Spectrul de absorbţie al soluţiei de
lipide extrasă din carne de porc cu
tetraclorură de carbon (10mg+30ml
tetraclorură de carbon). Curba
formează mai multe peakuri.
Fig.46.
Spectru de absorbţie
specific soluţiei de lipide
extrasă din carne de porc în
eter de petrol (10mg+10ml
eter de petrol). Curba
formează mai multe
peakuri evidente în zona
lungimilor de undă de
235.5nm, 241.0nm şi
246.0nm.
186
Fig.47.
Spectru de absorbţie al
soluţiei de lipide extrasă din
carne de porc în solventul
cloroform (10mg+10ml
cloroform). Curba formează
mai multe peakuri în zona
lungimilor de undă de
270.0nm şi 309.5nm.
Fig.48.
Amprenta fotospectometrică a
proteinelor din carne de vită
(mânzat) extrase cu ser fiziologic.
Curba formează un singur peak în
zona lungimilor de undă de
211.0nm cu o ABS de 2.4448.
Fig.49
Amprenta spectrală a suspensiei de proteine obţinută din carne de vită de 4 ani în ser fiziologic. Curba
formează un peak dominant în zona lungimilor de undă de 222.5nm cu ABS 2.9905 şi un alt peak în zona
258.5nm cu o ABS de 0.7875.
Fig.50
Spectru de a absorbţie a
SBA extrase din carne de
vită în solventul cloroform,
la diferite concentraţii.
Curba formează mai multe
peakuri în zonele
lungimilor de undă de
200.0nm şi 310.7nm.
187
Fig.51
Amprentele spectrale ale
suspensiilor de lipide
extrase în ciclohexan din
grăsime de vită
(0,5mg+10ml ciclohexan) şi
pupă de L.dispar
(10mg+10ml ciclohexan).
Fig.52
Amprenta spectrală a
suspensiei de lipide extrase
din grăsime de vită în
solventul cloroform
(0,5mg+10ml cloroform).
Curba formează mai multe
peakuri în zona lungimilor
de undă de 200.0nm,
270.0nm şi 310.5nm.
Fig.53
Amprenta spectrală a lipidelor
extrase din ou de prepeliţă atomizat
în eter etilic. Curba formează un
peak maximal în zona lungimilor
de undă de 235.0nm şi alte peakuri
în zona lungimilor de undă de
267.8nm, 279.0nm şi
469,2nm.
Fig.54
Amprenta spectrală a lipidelor
extrase din ou de prepeliţă atomizat
in alcool etilic.Curba formează mai multe peakuri în zona lungimilor de undă de 230.0nm - 240.0nm şi alte
două peakuri în zona lungimilor de undă de 268.2nm şi 279.6nm.
188
Fig.55
Amprenta spectrală a
SBA extrase din ou de
prepeliţă în solventul
HCL 10%, nediluat.
Curba formează mai
multe peakuri în zona
lungimilor de undă de
200.0nm-240.0nm şi un
alt peak în zona
lungimilor de undă de
258.8nm şi 276.0nm.
Fig.56
Amprenta spectrală a
suspensiei de proteine
din hemolimfă de
Melolonta melollonta
(Mm) fracţia, diluată de
1500 de ori în ser
fiziologic. Curba
formează un peak
evident în zona 210.0nm
cu o ABS de 0.6602.
Fig.57
Spectrul de absorbţie a
suspensiei obţinute din insulină
umană retard diluată până la
60% în ser fiziologic. Curba de
absorbţie formează două
peakuri în zonele de 210.5 cu o
ABS de 1.8585.
189
Fig.58
Spectrul de absorbţie a
suspensiei de albumine şi
globuline din pulbere de
ou de L.atomizat în ser
fiziologic.
(1) albumine îngheţate;
(2) albumine proaspete;
(3) globuline îngheţate;
(4) globuline proaspete.
Fig.59.
Spectru de absorbţie al
suspensiei de proteine obţinută
din lipom uman diluat în ser
fiziologic. (50mg+24ml NaCl).
Curba amprentei formează un
peak în zona lungimilor de undă
220.5nm cu o ABS de 2.8674.
Fig.60.
Spectru de absorbţie al
suspensiei de lipide obţinută din
lipom uman diluat în n-heptan (10mg+10ml n-heptan). Curba formează trei peakuri evidente în zona
lungimilor de undă de 221.0nm, 271.0nm şi 307.5nm.
Fig.61.
Spectru de absorbţie al
suspensiei de proteine
obţinută din lipom uman
diluat în ser fiziologic la
diferite concentraţii:
(1)50mg+6mlser
fiziologic-peakuri în zona
lungimilor de undă de
237.5nm şi 272.5nm;
(2)50mg+12ml ser
190
fiziologic-peakuri în zona lungimilor de undă de 236.5 nm şi 273.0nm;
(3)50mg+24ml
ser fiziologic-peakuri în zona lungimilor de undă de 220.0nm
Fig.62.
Spectrude absorbţie al
extractului obţinut din materialul
de protecţie (puf) al ouălor de
Lymantria dispar în ser
fiziologic. Curba amprentei
formează trei peakuri în zonele
lungimilor de undă de 196.2nm,
235.0nm şi 288.3nm.
Analiza efectuată din corpul gras a larvelor de Galleria mellonella indică apariţia mai multor
peakuri bine diferenţiate la diferite lungimi de undă. Cele mai multe peakuri apar în zona lungimilor de
undă de 185.0nm până la 246.0nm şi la lungimile de undă de 296.0nm şi 303.0nm (0.5mg+10 ml NaCl).
Spre deosebire de alte ţesuturi a larvelor se diferenţiază peakuri la lungimile de undă de 335.0nm,343.0nm şi
354.0nm.
La aceeaşi specie s-a efectuat un spectru diferenţiat al capului insectelor. Curba spectrală indică la
prezenţa mai multor SBA în zona lungimilor de undă de 230.0nm cu ABS 3.1555 şi 249.0nm cu ABS
2.1499 (0.5mg+10 ml NaCl). În acest caz, proteinele sunt în minoritate deorece în zona specifică proteinelor
nu apare un peak specific.
În suspensia obţinută din intestine a G.mellonella, curba spectrală formează mai multe peakuri,
începând cu valorile de 193.0nm cu ABS 1.7064 până la 279.0nm cu ABS 3.4634 (0.5mg+10 ml NaCl ).
În suspensia obţinută din tegumentul de la G mellonella apare o curbă cu diferite peakuri care încep de la
valorile de 182.0nm, 197.0nm cu ABS 2.1080 până la lungimea de undă de 293.0nm cu ABS 3.5544
(0.5mg+10 ml NaCl).
Spectrele realizate din corp gras şi cantităţi mici de intestine din larvele de Tenebrio monitor
reprezintă o curbă cu mai multe valori la diferite zone a lungimilor de undă. Cea mai mică valoare reprezintă
187.0nm cu ABS 1.3166. Alte valori s-au evidenţiat în zona lungimilor de undă de 228.0nm cu ABS 3.5331
(0.5 mg+10 ml NaCl).
Suspensia obţinută din tegumentul larvelor de Tenebrio monitor (0.5mg+10ml NaCl) determină apariţia unei
curbe cu peakuri în zonele 224.0nm cu ABS 3.7800 până la 295.0nm.
Suspensia obţinută din zona capului (cu ochi) de la Tenebrio monitor (0.5mg+10ml NaCl) determină apariţia
unei curbe cu peakuri mai pronunţate în zona lungimilor de undă 213.0nm cu ABS 3.2418 până la 233.0nm
cu ABS 3.4056.(zona caracteristică polizaharidelor).
Lipidele din suspensia obţinută din cap (cu ochi) de la Galeria mellonella determină obţinerea unei curbe
spectral în zonele lungimilor de undă de 189.0nm cu ABS 0.1791 până la 243.0nm cu ABS 0.5644 ce
caracterizează prezenţa a mai multor tipuri de polizaharide. Proteinele, în acest caz nu se evidenţiază (0.2mg
+ 10 ml etanol-cloroform).
191
Suspensia obţinută din intestine de G.mellonella în etanol-cloroform include o serie întreagă de peakuri în
zonele lungimilor de undă de la 185.0nm cu ABS 0.3310 până la 244.0nm cu ABS 1.7404. (0.5mg+10 ml
etanol-cloroform).Un peak mai pronunţat apare în zona lungimilor de undă de 244.0nm cu ABS 1.7404.
În acest, caz proteinele nu se evidenţiază.
Spectrul de absorbţie a suspensiei obţinută din tegumentul de G.mellonella în etanol-cloroform
(0.7mg+10ml etanol-cloroform) provoacă apariţia unei curbe cu valori ale lungimilor de undă în zonele
187.0nm cu ABS 0.5563 până la 279.0nm cu ABS 2.7368.Curba spectrală a soluţiei obţinută din corpul gras
al G.mellonella (0.5+10ml etanol-cloroform) formează un peak mai pronunţat în zona lungimilor de undă de
251.0nm cu ABS 2.6515.
Spectrul de absorbţie a suspensiei obţinută din cap (ochi) de Tenebrio monitor (0.2mg+10ml etanol-
cloroform) demonstrează o curbă minoră cu valori ale lungimilor de undă de la 191.0nm cu ABS 0.2145
până la 270.0nm cu ABS 0.4818.
Spectrul de absorbţie a suspensiei obţinută din corpul şi din cantităţi minime de intestine de T.monitor
(0.5mg+10ml etanol-cloroform) formează o curbă cu peakuri în zonele lungimilor de undă de la 192.0nm cu
ABS 0.5167 până la 223.0nm cu ABS 0.4233 şi alte trei peakuri evidenţiate în zona lungimilor de undă de
245.0nm cu ABS 2.1339,272.0nm cu ABS 2.5206 şi 279.0nm cu ABS 2.4531.
Spectrul de absorbţie a suspensiei obţinută din tegumentul de la T.monitor (1.5mg+10ml etanol-cloroform)
rezultă o curbă cu peakuri în zona lungimilor de undă de 183.0nm cu ABS 0.9031 până la 232.0nm cu ABS
1.0336. şi mai multe peakuri pronunţate în zona lungimilor de undă de 257.0nm cu ABS 3.3893 până la
290.0nm cu ABS 3.0655. Analizele spectrale obţinute din diferite organe ale unor specii de insecte au
demonstrat prezenţa a mai multor compenente cele mai des întâlnite fiind proteinele incluse în tegument,
intestine, cap şi corp gras. Curba spectrală demonstrează prezenţa celor mai des întâlnite fracţii de
polizaharide şi proteine. Componentele apărute în suspensii de ser fiziologic se evidenţiază foarte bine în
zonele spectrale începând cu lungimile de undă de 200.0nm până la 350.0nm.
Prezenţa proteinelor specifice apare în zona lungimilor de undă de 211.0nm până la 279.0nm.
În zona cap-ochi a larvelor de Galleria predomină SBA cu lungimea de undă de 230.0nm şi 249.0nm.
În tegumentul larvelor de Galleria predomină proteinele cu lungimile de undă specific acestora.
În suspensia obţinută din tegumentul din larve de Tenebrio sunt incluse SBA care sunt localizate în zona
lungimilor de undă specifice.
Amprentele spectrale ale proteinelor extrase din diferite faze de dezvoltare ale insectelor
demonstrează o curbă cu un peak înalt în zonele lungimilor de undă de 200.0nm-250.0nm cu un alt peak mai
mic caracteristic pentru proteine în zonele lungimilor de undă 260.0nm-300.0nm. În fig. este prezentată
amprenta unei soluţii de proteine la diferite faze de dezvoltare pentru Musca Domestica, unde apar trei curbe
cu aceeaşi configuraţie. În cazul dat, se demonstrează faptul că la stadii diferite de dezvoltare (ou, larva,
pupa, adult) întâlnim acelaşi spectru de absorbţie.
Amprentele spectrale ale proteinelor sunt exprimate prin configuraţii diferite şi depind în mare măsură de
compoziţia chimică a ţesuturilor insectelor.
192
Fig. 1
Spectru de absorbţie a
suspensiei de proteine
extrase din Musca
domestica în apă
distilată(20mg+10ml
apă dist).
Amprenta formează o
curbă cu peakuri situate
în zona lungimilor de
undă de 220.0-230.0nm
şi în zona 280.0nm.
Fig. 2
Spectru de absorbţie a
proteinelor extrase din
M.domestica în apă
distilată(20mg+10ml apă
dist).
Amprenta formează o
curbă cu peakuri în zona
lungimilor de undă de
220.0nm şi în zona
lungimilor de undă de
260.0nm.
Fig. 3
Spectru de absorbţie a
suspensiei de proteine
delipidizate extrase
din M.domestica în
apă distilată
(10mg+10ml apă
dist).
Amprenta formează o
curbă în zona
lungimilor de undă de
210.0nm şi în zona
258.4nm.
193
Fig. 4
Spectru de absorbţie a
suspensiilor de proteine
extrase din :
(1) larvă, (2) pupă, (3)
adult de M.domestica în
NaCl (2mg+8ml NaCl,
diluate de 20 de ori).
Amprentele formează
curbe cu peakuri în zona
lungimilor de undă de
210.0-212.0nm(1) şi în
zona 246.0nm(2),
257.0nm(1) şi
280nm(3).
Fig.5
Spectru de absorbţie a
soluţiei de proteine
extrase
din M.domestica în
NaCl (20mg+10ml
NaCl).
Amprenta formează o
curbă în zona
lungimilor de undă de
210.0nm cu o ABS de
1.500.
Fig.6
Spectru de absorbţie a soluţiei
de proteine extrase din
M.domestica în NaCl.
(10mg+10ml NaCl).
Amprenta formează o curbă cu
un peak în zona lungimilor de
undă de 220.0nm şi un peak în
zona 270.0nm.
194
Fig.7
Spectru de absorbţie
a soluţiei de proteine
extrasă
din M.domestica în
10 ml apă distilată
+10 ml NaCl.
Amprenta formează
o curbă cu un peak
evident în zona
lungimilor de undă
de 210.0nm.
Fig.8
Spectru de absorbţie a
soluţiei de proteine
extrase din
M.domestica în NaOH,
ph 8,
(10mg+10mlNaOH).
Amprenta formează o
curbă cu un peak în
zona lungimilor de
undă de 223.0nm şi în
zona 262.6nm.
Fig.9
Amprenta spectrală a suspensiei de proteine extrase din larve de M.domestica în HCl 10%. Amprenta
formează o curbă cu un peak în zona lungimilor de undă de 225.9nm şi în zona 267.5nm.
195
Amprentă spectrală a soluţiei de proteine extrase din adult de M.domestica în HCl 10% (20mg+10ml HCl).
Amprenta formează o curbă cu
un peak în zona lungimilor de
undă de 223.8nm şi în zona
260.0nm.
Fig.11
Amprenta spectrală a soluţiei de
proteine delipidizate din
M.domestica în ciclohexan
(50mg+10ml ciclohexan).
Amprenta formează o curbă cu
mai multe peakuri distincte în
zona lungimilor de
undă de 241.5nm; 272.5nm; 308.3nm.
Fig.12.
Spectru de absorbţie a
soluţiei de proteine din
larve de M.domestica în
benzen.
Se observă trei peakuri în
zona lungimilor de undă
de 208.7nm; 210.0nm şi
în zona 284.9nm.
Fig.13
Amprenta
spectrală specifică
pentru suspensia
obţinută din larve de
ultimă vârstă de
Lymantria dispar L
(omida păroasă a
stejarului) în apă
distilată.
Apar două peakuri în
zona lungimilor de undă
de 208.8nm şi în zona
289.2nm.
196
Fig.14
Amprenta spectrală
specifică a suspensiei
proteice extrasă din
pupe de L.dispar L cu
apă distilată.Curba
formează un peak
dominant în zona
lungimilor de undă de
212.5nm şi un peak în
zona 280.0nm.
Imaginea dată poate fi
considerată drept
standard al compoziţiei
SBA din pupe de L
dispar.
Fig.15
Spectru de absorbţie a
suspensiei de proteine
extrase din pupe de
L.dispar L în HCl. Apare
configuraţia specifică a
compoziţiei din pupele
de Lepidoptere.Peakurile
se formează în zona
lungimilor de undă de
211.0nm; 218.2nm şi în
zona 289.1nm.
Fig.16
Spectru de absorbţie a soluţiei
de proteine extrase din pupe de
vârsta a doua de L.dispar.L în
HCl 10%. Amprenta formează o
curbă largă cu mai multe peakuri
în zona lungimilor de undă de
260.0nm-284.7nm. şi în zona
339.4nm.
197
Fig.17
Amprenta spectrală a
unei suspensii
obţinută din pupe
mature de L.dispar L.
în HCl 10%.
Amprenta formează o
curbă cu peakuri în
zona lungimilor de
undă de 220.0nm;
231.4nm şi în zona
280.4nm.
Fig.18
Spectru de absorbţie a
suspensiei de proteine
extrase din ouă de L.dispar.L
în NaOH, ph 8 (20mg+10ml
NaOH). Amprenta formează
o curbă largă cu peakuri în
zona lungimilor de undă de
220.0nm - 240.0nm şi în
zona 280.0nm.
Fig.19
Spectru de absorbţie a
suspensiei de proteine
extrase din pupe de
vârsta a doua de
L.dispar. L în NaOH
Ph 8
(10mg+10ml NaOH).
Amprenta formează o
curbă cu două peakuri
în zona lungimilor de
undă de 221.8nm şi în
zona 289.3nm.
Fig.21
Amprenta spectrală a extractului proteic delipidizat din larve de L.dispar.L în metanol. Curba amprentei
formează un peak în zona lungimii de undă de 193.9nm şi în zona 350.0nm.
198
Fig.22
Spectru de
absorbţie a
suspensiei de
proteine extrase din
ouă de L.dispar.L
în
NaCl (10mg+10ml
NaCl). Amprenta
formează o curbă
cu un peak în zona
lungimilor de undă
de 220.0-230.0nm
şi în zona 280.0nm.
Fig.23
Spectru de absorbţie a
soluţiei de proteine
extrase din ouă de
L.dispar.L în NaCl.
(1)albumina îngheţată;
(2)albuminaproaspătă;
(3)globulina îngheţată;
(4)globulina proaspătă.
Amprentele prezină
peakuri în zona
lungimilor de undă de
190.0nm;200.0nm
220.0nm şi în zona
280.0nm.
Fig.24
Amprenta spectrală a
unui extract de proteine
obţinute din ouă de
L.dispar.L în NaCl.
Curba amprentei
formează peakuri în
zona 190.0nm;
220.0nm şi în zona
277.3nm.
199
Fig.25
Spectru de absorbţie
a unui extract din şi
pupe de L.dipar.L. în
NaCl.
Curba amprentei
formează două
peakuri
caracateristice,
primul peak în zona
lungimilor de undă
de 237.1nm şi în
zona 288.7nm.
Fig.26
Spectru de absorbţie
a suspensiei de
proteine extrase din
pupe de L.dispar.L.
în NaCl.
(10mg+10ml NaCl).
Amprenta formează o
curbă cu două
peakuri distincte în
zona lungimilor de
undă de 220.0-
230.0nm şi în zona
280.0nm.
Fig.27
Amprenta spectrală
specifică soluţiei de
proteine obţinute din
pupe de L.dispar.L.
Curba formează o
configuraţie cu două
peakuri, unul în zona
lungimilor de undă de
211.0nm şi în zona
289.1nm.
200
Fig.28
Amprenta spectrală
a suspensiei de pupe
de L.dispar.L în
NaCl.
Amprenta formează
un peak dominant în
zona lungimilor de
undă de 212.5nm şi
un alt peak în zona
280.0nm.
Fig.29
Spectru de absorbţie
a suspensiei de
proteine extrase din
pupe de L.dispar.L.
(1) albumine în apă
distilată;
(2)globuline în
NaCl.
Fig.30
Spectru de absorbţie a
suspensiei de proteine extrasă
din ţesuturile larvelor de
Malacosoma neustria în
etanol 70%. Apare o
amprentă clasică cu două
peakuri, unul în zona
lungimilor de undă de
232.2nm şi în zona 264.4nm.
201
Fig.31
Spectru de absorbţie a
suspensiei de proteine
extrasă din M.neustria
în HCl 10%
(20mg+10ml HCl).
Amprenta formează o
curbă largă cu peakuri
situate în zona
lungimilor de undă de
220.0nm - 230.0nm şi
în zona 280.0nm.
Fig.32
Amprenta spectrală a
suspensiei de proteine
extrase din Galleria
Mellonella în apă
distilată. Amprenta
formează o curbă cu
multiple peakuri în zona
lungimilor de undă de
190.0 - 310.0nm.
Fig.33
Spectru de absorbţie a suspensiei de proteine din larve de G.mellonella
Fig.61
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din A.sambuchi.L. în
ciclohexan (2mg+10ml
ciclohexan). Amprenta
formează o curbă cu peakuri
în zona lungimilor de undă
de 220.7nm, 270.0nm şi în
zona 308.3nm.
202
Fig.62
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din A.sambuchi.L în n-
hexan.(2mg+10ml n-hexan).
Amprenta formează o curbă cu
peakuri în zona lungimilor de
undă de 225.5nm, 270.7nm şi
în zona 307.3nm.
Fig.63
Spectru de absorbţie a SBA extrase
din A.sambuchi L în metanol
(10mg+10ml metanol, diluat de
1:4).Amprenta formează o curbă cu
peakuri în zona lungimilor de undă
de 220.7nm, 271.1nm şi în zona
310.0nm.
Fig.64
Spectru de absorbţie a SBA extrase
din A.sambuchi.L în metanol
(20mg+10ml metanol). Amprenta
formează o curbă cu peakuri în zona
lungimilor de undă de 220.0nm şi în
zona 257.5nm.
203
Fig.65
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din
Philosamia recini L.(ou,
larvă vârsta 1, larvă
vârsta 5-înainte de
impupare, pupă de 10
zile, pupe de Bombyx)
în etanol-cloroform.
Amprentele prezintă
curbe similare cu
peakuri în zona
lungimilor de undă
200.0nm, 250.0nm-
313.0nm.
Fig.66
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din larve de
vârste diferite de
P.recini.L. în cloroform.
Amprenta prezintă curbe
asemănătoare cu peakuri
în zona lungimilor de undă
de 250.0nm şi 310.0nm.
Fig.67
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din ou, larvă, pupă şi
adult de P.recini.L în n-hexan
(2mg+10ml n-hexan). Amprenta
formează curbe similare cu
peakuri în zona lungimilor de
undă de 230.0nm, 271.3nm şi în
zona 308.2nm.
204
Fig.68
Amprente spectrale
comparative a
suspensiilor din larve
de P.recini L.în
ciclohexan (1mg+10ml
ciclohexan). Toate
curbele sunt identice.
Peakul dominant apare
în zona lungimilor de
undă de 220.9nm. Alte
peakuri apar în zonele
275.0nm şi în zona
310.0nm.
Fig.69
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din larve
de vârsta 1 de
P.recini.L în n-heptan
(8mg+10ml n-heptan).
Amprenta formează o
curbă largă cu peakuri
în zona lungimilor de
undă de 240.0nm,
274.8nm şi în zona
310.1nm.
Fig.70
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din larve de vârsta 3 de P.recini.L. în n-heptan. (5mg+10ml n-heptan). Amprenta formează o
curbă cu un peak dominant în zona lungimilor de undă de 220.0nm şi alte peakuri în zona 270.0nm şi
310.0nm.
Fig.71
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din larve
vârsta 5 de P.recini L. în
n-heptan. (5mg+10ml n-
heptan). Amprenta
formează o curbă cu un
peak dominant în zona
lungimilor de undă de
219.5nm şi alte peakuri în
205
zonele 260.0nm şi 310.0nm.
Fig.72
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din pupe de Bombyx
mori L în n-heptan
(5mg+10ml n-heptan).
Amprenta formează o curbă
cu trei peakuri evidente în
zona lungimilor de undă de
220.5nm, 265.0nm şi în
zona 307.5nm.
Fig.73
Spectru de absorbţie a SBA extrase
din pupe de B.mori L în ciclohexan
(5mg+10ml ciclohexan). Amprenta
prezintă un peak dominant în zona
lungimilor de undă de 221.1nm şi
alte peakuri în zonele 260.0nm şi
310.0nm.
Fig.74
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din pupe de B.mori
L în n-hexan (10mg+10ml
n-hexan). Amprenta
formează o curbă largă cu
peakuri în zona lungimilor
de undă de 254.9nm,
260.9nm, 268.6nm şi în
zona 307.5nm.
206
Fig.75
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din pupe de
B.mori L în metanol-
cloroform (10mg+10ml
metanol-cloroform).
Amprenta formează o
curbă largă cu peakuri
situate în zona lungimilor
de undă de 250.0nm şi în
zona 311.2nm.
Fig.76
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din pupe de
B.mori L.
în metanol(2mg+10ml
metanol). Amprenta
formează o curbă cu
peakuri în zona
lungimilor de undă de
220.0nm, 270.0nm şi în
zona 310.0nm.
Fig.77
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din pupe de B.mori L cu
eter etilic (2mg+10ml eter etilic).
Amprenta prezintă o curbă care
formează trei peakuri în zona
lungimilor de undă de 200.0nm,
250.0nm şi în zona 310.0nm.
207
Fig.78
Amprenta spectrală a
SBA extrase din
pupe de B.mori L. în
eter de
petrol.(1mg+10ml
eter de
petro).Amprenta
formează o curbă cu
peakuri în zona
lungimilor de undă
de 250.0nm.
Fig.79
Amprenta spectrală a SBA
extrase din pupe de B.mori L cu
eter - de petrol (100mg+10ml
eter de petrol).Amprenta
prezintă peakuri în zona
lungimilor de undă de 250.0 -
320 nm.
Fig.80
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din pupe de
B.mori L în cloroform
(2mg+10ml
cloroform).Curba prezintă
un peak în zona
lungimilor de undă de
250.0 - 330nm.
208
Fig.81
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din pupe de B.mori
L. în toluen (1mg+10ml
toluen).Amprenta formează
o curbă cu un peak în zona
lungimilor de undă de
310.8nm.
Fig.82
Spectru de absorbţie a suspensiei
obţinută din cărăbuşul Anoxiea
villosiea L de ultimă vârstă,
dehidratat la temp de 45 grade în
etuvă. Extracţia s-a efectuat cu eter
etilic. Curba prezintă un peak în
zona lungimilor de undă de
243.0nm şi un peak în 279.2nm.
Fig.83
Spectru de absorbţie a SBA extrase din A.villosiea L în ciclohexan (1mg+10ml ciclohexan). Amprenta
formează o curbă cu trei peakuri în zona lungimilor de undă de 225.3nm, 271.4nm şi
în zona 308,2nm.
Fig.84
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din
A.villosiea L în ciclohexan
(2mg+10ml ciclohexan).
Amprenta formează
peakuri în zona lungimilor
de undă de 222.5nm,
261.7nm, 268.9nm şi în
zona 308.3nm.
209
Fig.85
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din
A.villosiea L. în etanol
70% (10mg+10ml
etanol). Amprenta
formează o curbă largă cu
peakuri situate în zona
lungimilor de undă de
220.0nm, 273.0nm şi în
zona 307.5nm.
Fig.86
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din A.villosiea L în n-
hexan (10mg+10ml n-hexan).
Amprenta formează o curbă cu
peakuri în zona lungimilor de
undă de 230.0nm, 270.7nm şi în
zona 307.6nm.
Fig.87
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din A.vilosiea L în
n-heptan (10mg+10ml n-
heptan). Amprenta
formează o curbă cu
peakuri în zona
lungimilor de undă de
273.6nm şi în zona
307.9nm.
210
Fig.88
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din A.villosiea L în
eter de petrol (100mg+10ml
eter de petrol). Amprenta
prezintă mai multe peakuri
în zona lungimilor de undă
de 250.0nm şi în zona
307.2nm.
Fig.89
Amprenta spectrală a SBA
extrase din A.vilosiea L în
acetonă. Curba prezintă
vibraţii uniforme în zona
lungimilor de undă de
180.0nm-250.0nm.
Fig.90
Spectru de absorbţie a SBA extrase
din adult de A.villosiea L în
cloroform. Amprenta formează o
curbă cu două peakuri în zona
lungimilor de undă de 250.0nm-
280.0nm şi în zona 311.2nm.
211
Fig.91
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din A.villosiea L în
metanol-cloroform
(10mg+10ml metanol-
cloroform). Amprenta
formează o curbă cu peakuri în
zona lungimilor de undă de
250.0nm-317.0nm.
Fig.93
Amprenta spectrală a suspensiei
lipidice extrase din larve de
A.villosiea L
în metanol-cloroform
(2:1,v/v,10mg+10ml metanol-
cloroform). Apar peakuri în zona
lungimilor de undă de 250.0nm-
315.0nm.
Fig.94
Amprenta spectrală a SBA extrase din adulţi
de A.vilosia L în benzen (10mg+10ml
benzen). Curba spectrului prezintă multe
vibraţii în zona lungimilor de undă de 150.0-
280.0nm şi un peak major în zona 313.3nm.
Fig.95
Spectru de absorbţie a SBA extrase din A.villosia L în butanol (10mg+10ml butanol). Amprenta formează o
curbă largă cu peakuri în zona lungimilor de undă de 270.0nm şi în zona 320.0nm.
212
Fig.96
Spectru de absorbţie a SBA extrase
din A.villosia L în n-butanol
(5mg+10ml n-butanol) Amprenta
formează o curbă cu peakuri în
zona lungimilor de undă de
276.7nm şi în zona 313.3nm.
Fig.97
Spectru de absorbţie a SBA extrase
din A.villosia.L în acetat de etil
(5mg+10ml acetat de etil).
Amprenta formează o curbă cu
peakuri în zona lungimilor de undă
de 315.5nm.
Fig. 98
Spectru de absorbţie a SBA extrase din A.villosia L în xilen (10mg+10ml xilen). Amprenta formează o
curbă cu peakuri în zona lungimilor de undă de 311.0nm.
Fig.99
Amprenta spectrală a SBA
extrase din pupe de Euproctis
hrissorhea L extrase în eter de
petrol (100mg+10ml eter de
petrol). Apare o curbă cu
213
peakuri în zona lungimilor de undă de 250.0-320nm.
Fig.100
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din pupe de
E.hrisorhoea L în eter de
petrol. Apare o serie de
peakuri în zona
lungimilor de undă de
247.3nm-273.9nm.
Fig.101
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din pupe de
E.hrissorhoea L în eter de
petrol (1mg+10ml eter de
petrol). Apare o curbă cu
peakuri în zona lungimilor
de undă de 250.0 – 320 nm.
Fig.102
Spectru de absorbţie a SBA extrase
din pupe de E.hrissorhoea L în
benzen. Amprenta formează o
curbă cu peakuri în zona
lungimilor de undă de 280.0nm şi
în zona 319.4 – 350 nm.
214
Fig.103
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din E.hrissorhoea L
în ciclohexan (50mg+10ml
ciclohexan). Amprenta
formează o curbă cu
peakuri în zona lungimilor
de undă de 220.0nm,
223.4nm, 271.5nm şi în
zona 308.2nm.
Fig.104
Spectru de absorbţie a SBA
exrase din pupe de
E.hrissorhoea L în metanol
(2mg+10ml metanol).
Amprenta formează o curbă
largă cu peakuri în zona
lungimilor de undă de
230.0nm, 270.0nm şi în zona
310.0nm.
Fig.105
Spectru de absorbţie a SBA extrase din larve de vârsta 5 de E.hrissorhoea L în eter etilic (2mg+10ml eter
etilic). Amprenta formează o curbă cu peakuri în zona lungimilor de undă de 240.0nm, 270.0nm şi în zona
350.0nm.
Fig.106
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din pupe de
E.hrissorhoea L în eter
etilic. Amprenta formează o
curbă largă cu peakuri în
215
zona lungimilor de undă de 200.0nm-290.0nm.
Fig.107
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din larve de
E.hrissorhoea L în
cloroform, (2mg+10ml
cloroform). Amprenta
formează o curbă cu
peakuri în zona lungimilor
de undă de 250.0nm şi în
zona 320.0nm.
Fig.108
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din pupe de
E.hrissorhoea L în
cloroform (2mg+10ml
cloroform). Curba
formează un peak dominant
în zona lungimilor de undă
de 250.0-320nm.
Fig.109
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din pupe de
E.hrissorhoea L în etanol.
Amprenta formează o curbă
largă cu peakuri în zona
lungimilor de undă 251.1nm şi
în zona 271.3nm.
216
Fig.110
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din pupe de
E.hrissorhoea L atomizat, în
acetonă. Amprenta prezintă
o curbă cu multe peakuri în
zona lungimilor de undă de
210.0nm-220.0nm.
Fig.111
Amprenta spectrală a
lipidelor din larve de vârsta
3 de Malacosoma Neustria
L.Curba formează două
peakuri în zona lungimilor
de undă de 250.0nm-
330.0nm după extracţia cu
cloroform (10mg+10ml
cloroform). Peakul
dominant se situează în
zona 250.0nm-325.0nm.
Fig.112
Amprenta spectrală a
suspensiei lipidice extrase
din larve de ultima vârstă
de M. neustria L cu n-
hexan (10mg+10ml n-
hexan). Apar trei peakuri
dominante în zona
lungimilor de undă de
225.0nm, 271.0nm şi în
zona 307.7nm.
217
Fig.113
Amprenta spectrală a
lipidelor extrase din larve
de M.neustria L cu
ciclohexan (20mg+10ml
ciclohexan). Curba
formează mai multe peakuri
în zona lungimilor de undă
de 222.4nm, 261.2nm,
268.8nm şi în zona
308.3nm.
Fig.114
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din M.neustria L în
n-butanol (10mg+10ml n-
butanol). Amprenta
formează o curbă cu peakuri
în zona lungimilor de undă
de 270.0nm şi în zona
320.0nm.
Fig.115
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din larve de vârsta
3-4 de M.neustria L în xilen
(10mg+10ml xilen).
Amprenta formează o curbă
cu un peak slab în zona
lungimilor de undă de
200.0nm şi un peak
dominant în zona 312.1nm.
218
Fig.116
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din M.neustria L în
metanol-cloroform
(10mg+10ml metanol-
cloroform,2:1,v/v).Amprenta
formează o curbă largă cu un
peak dominant în zona
lungimilor de undă de
315.8nm.
Fig.117
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din larve de ultima
vârstă de M.neustria L în
metanol (10mg+10ml
metanol). Amprenta
formează o curbă largă cu
peakuri situate în zona
lungimilor de undă de
210.0nm-310.0nm.
Fig.118
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din M.neustria L în
n-heptan (10mg+10ml n-
heptan). Amprenta formează
o curbă cu mai multe
peakuri în zona lungimilor
de undă de 274.6nm şi în
zona 308.9nm.
219
Fig.119
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din larve de
M.neustria L în eter de
petrol (100mg+10ml eter de
petrol). Amprenta formează
o curbă specifică acestui
solvent cu peakuri situate în
zona lungimilor de undă de
250.0-350nm.
Fig.120
Spectru de absorbţie a SBA extrase
din larve de M.neustria L în etanol.
Amprenta formează o curbă cu un
singur peak în zona lungimilor de
undă de 212.4nm.
Fig.121
Spectru de absorbţie a SBA extrase
din M.neustria L în eter etilic diluat. Amprenta prezintă peakuri în zona lungimilor de undă de 212.5nm,
256.7nm, 266.3nm şi în zona 321.2nm.
220
Fig.122
Spectru de absorbţie a
suspensiei de lipide
extrase din larve de
M.neustria L cu benzen
(100mg+10ml benzen).
Curba amprentei
formează un peak în zona
lungimilor de undă de
200nm, caracteristic
pentru anumiţi solvenţi,
care nu depinde de specia
insectei, ci de solvent. Un
alt peak apare în zona
lungimilor de undă de
280.0nm-320.0nm.
Fig.123
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din
M.neustria L în benzen
diluat. Amprenta prezintă
mai multe peakuri în zona
lungimilor de undă de
150.0nm-281.0nm.
Fig.124
Spectru de absorbţie a SBA extrase din Aporia crataegi L în n-heptan (10mg+10ml n-heptan). Amprenta
formează o curbă cu peakuri în zona lungimilor de undă de 224.5nm.
Fig.125
Amprenta spectrală a
lipidelor de A.crataegi L în
cloroform (10mg+10ml
cloroform). Curba
amprentei formează mai
221
multe peakuri în zona lungimilor de undă de 250.0nm.
Fig.126
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din A.crataegi L în eter
de petrol (10mg+10ml eter de
petrol). Amprenta formează o
curbă cu mai multe peakuri în
zona lungimilor de undă de
240.5nm, 246.0nm, 270.5nm
şi în zona 307.0nm.
Fig.127
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din A.crataegi L în
benzen(10mg+10ml
benzen). Amprenta
prezintă un peak în zona
lungimilor de undă de
270.0nm şi un peak în zona
310.5nm.
Fig.128
Amprenta spectrală a SBA
extrase din Lyta vesicatoria L
adult(1), Lymantria dispar L
ou(2) şi Lymantria dispar L
larve eclozate(3) în acetat de
etil (2mg+10ml acetat de etil).
Amprentele sunt similare cu
222
toate că lipidele aparţin diferitelor specii de insecte.
Fig.129
Spectru de absorbţie a SBA extrase
din Lita vesicatoria L în
etanol.Amprenta formează o curbă
largă cu peakuri în zona lungimilor
de undă de 220.0nm-240.0nm şi un
peak în zona 282.5nm.
Fig.130
Spectru de absorbţie a SBA extrase în
L.vesicatoria L în etanol. Curba prezintă
peakuri în zona lungimilor de undă de
230.0nm ,238.0nm şi în zona 280.0nm.
Fig.131
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din L.vesicatoria L în
metanol-cloroform (10mg+10ml
metanol-cloroform, 2:1,v/v).
Amprenta prezintă un peak
maxim în zona lungimilor de
undă de 316.8nm.
223
Fig.132
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din L.vesicatoria L în
n-butanol (5mg+10ml n-
butanol). Amprenta formează
o curbă largă cu peakuri în
zona lungimilor de undă de
270.0nm şi în zona 314.2nm.
Fig.133
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din L.vesicatoria L
în toluen (2mg+10ml
toluen). Amprenta
formează o curbă cu
peakuri în zona lungimilor
de undă de 200.0nm şi un
peak maxim în zona
313.0nm.
Fig.134
Spectru de absorbţie a SBA extrase din L.vesicatoria L în xilen (10mg+10ml xilen). Amprenta formează o
curbă cu un peak minim în zona lungimilor de undă de 200.0nm şi un peak maxim în zona 310.6nm.
224
Fig.135
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din L.vesicatoria L
în eter de
petrol(100mg+10ml eter de
petrol). Amprenta formează
o curbă cu mai multe
peakuri în zona lungimilor
de undă de 235.2nm-
272.2nm şi în zona
306.9nm.
Fig.136
Spectru de absorbţie a
SBA extrase din
L.vesicatoria L în n-hexan
(10mg+10ml n-hexan).
Amprenta formează o
curbă largă cu peakuri în
zona lungimilor de undă de
210.0nm-268.7nm şi în un
peak in zona 307.6nm.
Fig.137
Amprenta spectrală a SBA extrase din L.vesicatoria L în n-heptan (10mg+10ml n-heptan). Amprenta
formează o curbă largă cu peakuri în zona lungimilor de undă de 240.0nm, 270.0nm şi în zona 308.4nm.
Fig.138
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din L.vesicatoria L
în ciclohexan (1mg+10ml
ciclohexan). Amprenta
formează o curbă specifica
solventului, cu peakuri
distincte, în zona lungimilor
de undă de 230.0nm,
225
271.7nm şi în zona 308.4nm.
Fig.139
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din Mellolonta
mellonta L în etanol 70%
(10mg+10ml etanol).
Amprenta formează o curbă
largă cu peakuri în zona
lungimilor de undă de
210.0nm, 230.0nm, 270.0nm
şi în zona 300.4nm.
Fig.140
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din M.mellolonta L în
etanol.Amprenta prezintă un
peak dominant în zona
lungimilor de undă de
212.4nm şi un peak minor în
zona 270.0nm.
Fig.141
Spectru de absorbţie a SBA extrase
din M.mellolonta L în etanol.
Amprenta formează o curbă largă cu
peakuri în zona lungimilor de undă
de 230.0nm-240.0nm, 260.0nm-
290.0nm.
226
Fig.142
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din M.mellolonta L
în cloroform (1mg+10ml
cloroform). Amprenta
formează o curbă largă cu
peakuri în zona lungimilor
de undă de 250.0nm-270.0nm şi un peak în zona 310.0nm.
Fig.143
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din M.mellolonta L în
metanol-cloroform
(10mg+10ml metanol-
cloroform, 2:1,v/v).
Amprenta formează o curbă
cu un peak major în zona
lungimilor de undă de
319.6nm.
Fig.144
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din M.mellolonta L în
metanol-cloroform
(10mg+10ml metanol-
cloroform,2:1,v/v). Amprenta
prezintă un peak major în
zona lungimilor de undă de
315.8nm.
Fig.145
227
Spectru de absorbţie a SBA extrase din M.mellolonta L în etanol-cloroform (2mg+10ml etanol-cloroform,
2:1,v/v). Amprenta formează o curbă largă cu trei peakuri dominante în zona lungimilor de undă de
240.0nm, 272.0nm şi în zona 315.0nm.
Fig.146
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din M.mellolonta L în
toluen (10mg+10ml toluen).
Amprenta prezintă o curbă cu
multe vibraţii şi un peak
dominant în zona lungimilor
de undă de 310.7nm.
Fig.147
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din M.mellolonta L
în benzen (100mg+10ml
benzen). Amprenta formează
o curbă cu un peak minor în
zona lungimilor de undă de
200.0nm şi mai multe
peakuri în zona lungimilor
de undă de 270.0nm -
310.0nm.
Fig.148
Amprenta spectrală a SBA
extrase din M.mellolonta L în
n-heptan (10mg+10ml n-
heptan). Amprenta formează
o curbă largă cu peakuri în
zona lungimilor de undă de
240.0nm, 275.7nm şi în zona
308.2nm.
228
Fig.149
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din M.mellolonta L
în ciclohexan (2mg+10ml
ciclohexan). Amprenta
formează o curbă cu patru
peakuri distincte în zona
lungimilor de undă de
215.5nm, 222.5nm,
271.3nm şi în zona
308.4nm.
Fig.150
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din M.mellolonta L în
n-hexan(10mg+10ml n-
hexan). Amprenta formează o
curbă cu patru peakuri în
zona lungimilor de undă de
220.0nm, 235.7nm, 270.0nm
şi în zona 307.4nm.
Fig.151
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din M.mellolonta L
în n-butanol(10mg+10ml n-
butanol). Amprenta
formează o curbă cu un
peak minor în zona
lungimilor de undă de
200.0nm şi un peak major
în zona 310.0nm.
229
Fig.152
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din ouă de L dispar L
în n-hexan (10mg+10ml n-
hexan). Amprenta formează o
curbă cu trei peakuri distincte
în zona lungimilor de undă de
239.2nm, 270.8nm şi în zona
307.5nm.
Fig.178
Spectru de absorbţie a SBA extrase
din pupe de L.dispar L în n-
hexan(10mg+10ml n-hexan).
Amprenta formează o curbă largă cu
peakuri în zona lungimilor de undă de
254.9nm, 260.9nm, 268.6nm şi în
zona 307.5nm.
Fig.179
Spectru de absorbţie a SBA extrase din ouă de L dispar L în n-heptan (10mg+10ml n-heptan). Curba
superioară reprezintă ou îngheţat atomizat, iar curba inferioară reprezintă ou proaspăt atomizat. Amprentele
sunt similare cu peakuri în zona lungimilor de undă de 230.0nm, 270.0nm şi în zona 308.1nm.
Fig.180
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din ouă de L dispar
L în n-heptan. Amprenta
superioară (ou integral
nemăcinat, 10mg+10ml n-
heptan) şi cea inferioară (ou
atomizat, 3mg+10ml n-
heptan) prezintă curbe
similare.
230
Fig.181
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din pupe de L dispar
L în n-heptan (5mg+10ml
n-heptan). Amprenta
formează o curbă cu
peakuri distincte în zona
lungimilor de undă de
220.5nm, 270.0nm şi
307.5nm.
Fig.182
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din ouă de L dispar
L în eter de petrol.
Amprenta formează o curbă
cu peakuri în zona
lungimilor de undă de
220.0nm-250.0nm şi în
zona 255.3nm şi 261.0nm.
Fig.183
AMPRENTE
SPECTRALE ALE
POLIZAHARIDELOR
231
Fig.1
Amprenta spectrală a SBA
extrase în acid acetic, diluată
în apă distilată, din învelişul
de pupe de Bombyx mori L.
Amprenta formează o curbă
cu o multitudine de peakuri
în zona lungimilor de undă de
200.0nm şi alte două peakuri
în zona 274.8nm şi în zona
340.5nm.
Fig.2
Spectru de absorbţie a SBA
extrase în acid acetic din
învelişul cheratinic al B.mori
L. Amprenta formează o curbă
cu mai multe peakuri în zona
lungimilor de undă de
200.0nm-230.0nm şi un alt
peak solitar în zona 275.9nm.
Fig.3
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din pupe de B.mori L
în hidroxid de sodiu 4% din
învelişul cheratinic. Amprenta
prezintă o curbă largă cu multe
peakuri în zona lungimilor de
undă de 210.0nm-235.0nm.
Fig.4
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din învelişul de
cheratina al pupelor de B.mori
L în eter de petrol. Amprenta formează o curbă specifica solventului cu peakuri în zona lungimilor de undă
de 250.0nm.
232
Fig.5
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din învelişul
cheratinic al pupelor de
B.mori L în ser fiziologic.
Amprenta formează peakuri
în zona lungimilor de undă de
235.0nm şi în zona 280.0nm.
Fig.6
Amprenta spectrală a SBA
extrase din învelişul
cheratinic al pupelor de
B.mori L în etanol. Amprenta
formează o curbă largă cu
peakuri în zona lungimilor de
undă de 220.0nm-280.0nm.
Fig.7
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din larve de
G.mellonella L în NaCl 9%
după spălări-cheratina.
Amprenta formează o curbă
cu un peak solitar în zona
lungimilor de undă de
210.0nm.
233
Fig.8
Spectru de absorbţie a
suspensiei de larve de
G.mellonella L în NaCl 9%-
cheratina. Amprenta formează
o curbă cu peakuri în zona
lungimilor de undă de
220.0nm şi în zona 270.0nm.
Fig.9
Spectru de absorbţie a
suspensiei din pupe de
G.mellonella L diluată în
NaCl 9%,după spălări-
cheratina. Amprenta
formează un peak solitar în
zona lungimilor de undă de
210.0nm.
Fig.10
Spectru de absorbţie a suspensiei obţinută din pupe de G.mellonella L. în NaCl 9%-cheratina. Amprenta
formează o curba cu două peakuri în zona lungimilor de undă de 220.0nm şi în zona 270.0nm.
234
Fig.11
Spectru de absorbţie a
suspensiei din adulţi de
G.mellonella L în NaCl 9%.
Curba formează peakuri în
zona lungimilor de undă de
210.0nm şi în zona 280.0nm.
Fig.12
Spectru de absorbţie a suspensiei din
adulţi de G.mellonella L în NaCl 9%-
cheratina. Amprenta formează o
curbă cu peakuri în zona lungimilor
de undă de 230.0nm şi în zona
280.0nm.
Fig.13
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din învelişul chitinic al
M.mellolonta L în NaCl 9%-
chitina. Amprenta formează o
curbă cu un peak individual în
zona lungimilor de undă de
205.5nm.
Fig.14
Spectru de absorbţie a
suspensiei de larve de
M.domestica în NaCl 9%-
235
chitina. Amprenta formează o curbă cu peakuri în zona lungimilor de undă de 230.0nm şi în zona 270.0nm.
Fig.15
Spectru de absorbţie a
suspensiei de larve de
M.domestica după spălare cu
NaCl 9% de 5ori-chitina.
Peakul apare în zona
lungimilor de undă de
210.0nm.
Fig.16
Spectru de absorbţie a
suspensiei din pupe de
M.domestica, diluată cu
NaCl 9%, până la spălare-
chitina. Peakurile apar în
zona lungimilor de undă de
181.0nm,195.0nm, 234.0nm
şi 284.0nm.
Fig.17
Spectru de absorbţie a
suspensiei din adulţi de
M.domestica cu diluţie de
NaCl 9%, până la spălare-
chitina. Peakurile apar în
zona lungimilor de undă de
194.0nm, 220.0nm, 225.0nm
şi în zona 410.0nm.
236
Fig.18
Spectru de absorbţie a
suspensiei din adulţi de
M.domestica , după spălare
cu NaCl 9%. Curba
formează mai multe peakuri
în zona lungimilor de undă
de 190.0nm,193.0nm şi în
zona 215.0nm.
Fig.20
Spectru de absorbţie a suspensiei din
larve de Tenebrio monitor în NaCl
9%, până la spălare-chitina. Curba
amprentei formează peakuri în zona
lungimilor de undă de 217.0nm,
225.0nm, 231.0nm şi 274.0nm.
Fig.21
Spectru de absorbţie a suspensiei din larve de T.monitor, larve spălate cu NaCl 9%-chitina. Au fost
înregistrate următoarele peakuri:189.0nm, 211.0nm, 288.0nm şi 336.0nm.
Fig.22
Spectru de absorbţie a
suspensiei obţinute din
pupe de T.monitor în
NaCl 9%-chitina. S-au
obţinut următoarele
peakuri:
215.0nm,217.0nm,
220.0nm,240.0nm,
277.0nm şi 292.0nm.
237
Fig.23
Spectru de absorbţie a
suspensiei obţinute din pupe
de T.monitor după spălare
cu NaCl 9%-chitina.
Amprenta formează o curbă
cu peakuri în zona
lungimilor de undă de
215.0nm, 252.0nm şi în
zona 336.0nm.
Fig.24
Spectru de absorbţie a suspensiei
obţinute din adulţi de T. monitor
după spălări cu NaCl 9%-chitina.
Amprenta formează o curbă cu
peakuri în zona lungimilor de
undă de 213.0nm, 225.0nm,
235.0nm, 238.0nm şi în zona
281.0nm.
Fig.25
Spectru de absorbţie a suspensiei
din adulţi de T.monitor după
spălări cu NaCl 9%-chitina. Amprenta formează o curbă cu peakuri în zona lungimilor de undă de 219.0nm,
222.0nm, 239.0nm, 279.0nm, 283.0nm şi în zona 292.0nm.
TEHNOLOGIE
Fig.1.
Spectru de absorbţie a SBA
extrase din crema O –PL în
benzen. Amprenta prezintă
vibraţii în zona lungimilor de
undă de 220.0nm-270.0nm.,
280.0nm.
238
Fig.2.
Spectru de absorbţie a SBA din
gel concentrat 10/1 diluat în apă
distilată. Amprenta formează o
curbă cu peakuri în zona
lungimilor de undă de 200.0nm-
250.0nm (cu multiple vibraţii) şi
în zona 257.0nm-281.0nm.
Fig.3.
Spectre de absorbţie a 0/PL(curba
inferioară) şi crema de mâini
(curba superioară) în benzen.
239
Bombix M
Nr. Proba S.U. Prot Prot Gluc Gluc Lipide Lipide
crt. g/100g g/100g g/100g g/100g g/100g g/100g g/100g
S.U. S.U. S.U.
1 P1 90.57 50.74 54. 23 1.0 1.07 31.29 33.44
2 P2 95.01 51.56 5427 1.0 1.05 31.56 33.22
3 P3 91.99 49.21 5350 1.026 1.011 30.18 32.81
4 P4 95.19 49.17 5165 0.92 0.97 30.97 32.56
241
Pentru prima dată, noi am demonstrat posibilitatea de a elimina formaţiunile nedorite de pe pielea
omului, adică s-au efectuat operaţii biologice, care nu provoacă dureri şi nici nu lasă urme nedorite pe corpul
oamenilor.
Acesta a fost prima metodă utilizată de noi în depistarea anumitor SBA care ulterior a fost utilizată în
biotehnologiile contemporane de utilizare a anumitor preparate în scopul tratării afecţiunilor grave ale
omului. Primele preparate parafarmaceutice elaborate de către noi au fost pentru eliminarea unor cheratite şi
cheratoze de pe ţesuturile cutanate ale oamenilor.
Unul din primele preparate biologice a fost KERATO-LIZ, destinat eliminării cheratozelor,
osteofitelor, cheratitelor şi bătăturilor. SBA a fost extrasă din ţesuturile unor specii de Lepidoptere în faza de
eliminare a cheratinei, adică în momentul când cheratina este eliminată din organismul insectelor.
Trebuie să ne amintim că orice ordin al insectelor are patru faze de dezvoltare: ou, larvă, pupă şi
adult (imago). În aceste cazuri o cantitate mai mare de cheratină apare în momentul formării pupelor, apoi
al adulţilor. Cheratina poate fi depistată şi în momentul năpârlirii insectelor, adică în momentul eclozării
larvelor din ouă, eliminării exzuviilor şi formării unui alt tegument. Dizolvarea cheratinei apare în câteva
faze de dezvoltare a insectelor. Primul moment de decheratinizare apare când se efectuează eclozarea
larvelor din ponte (ou). În acest moment apare un orificiu în învelişul oului de insecte prin care eclozează
larvele. În acest moment noi am colectat cantităţi importante de ouă de insecte înainte de eclozare, când
apare o SBA ce include anumite peptide şi enzime cheratolitice. Un alt moment când apare SBA cu efect
cheratolitic în învelişul pupelor prin care se elimină adulţii. În acest timp, în învelişul pupelor se
concentrează în cantităţi mult mai mari comparativ cu formarea orificiilor din oul pupelor şi apar astfel
orificii prin care eclozeaza adulţii în învelişul pupelor prin care se elimină adulţii. În acest moment, în zona
formării orificiului, se concentrează substanţele cheratolitice sub influenţa cărora apar cantităţi mai mari de
SBA cu efect cheratolitic pentru eliminarea adultului.
Trebuie de menţionat faptul că din acesta, SBA poate fi colectată înaintea eclozării adultului. SBA
sintetizate în pupe cu efect cheratolitic pot fi utilizate în preparate cosmetice pentru eliminarea ridurilor şi
cheratitelor din ţesutul cutanat.
Una din metodele cele mai exacte de depistare a anumitor SBA este spectrofotometria care în
cazul nostru a fost utilizată timp de 20 de ani.
Noi credem că acestă metodă este cea mai exactă şi uşor de utilizat. Materialele obţinute au
fost foarte greu interpretate, deoarece compuşii complecşi formează amprente variabile.
Proteinele, de obicei apar pe amprente în zona lungimilor de undă de 280 nm, glucidele în zona 200-
250 nm, lipidele apar în dependenţă de diferiţi solvenţi în mai multe zone, cele mai specifice fiind 300-315
nm în solvenţi precum cloroform, n-heptan, etanol-cloroform. Toate amprentele realizate sunt în spectrul
razelor UV.
În cursul studiului proteinelor, lipidelor şi hidraţilor de carbon am obţinut un număr enorm de
amprente care sunt prezentate în această lucrare. Poate că alţi specialişti vor putea depista şi alte interpretări
decât cele prezentate de autor. Amprentele spectrofotometrice ale ţesuturilor din insecte la anumite faze de
dezvoltare şi din anumite organe ale vertebratelor.
Astfel ne putem da seama de spectrul de absorbţie a SBA ale anumitor ţesuturi ale unor specii de insecte şi
a ţesuturilor diferitor organe ale vertebratelor şi insectelor sub acţiunea anumitor solvenţi.
Conform datelor din literatură, analizele făcute cu ajutorul metodei spectrofotometriei au demonstrat
că proteinele extrase din ţesuturile diferitelor specii de insecte se evidenţiază prin faptul că peakurile
curbelor amprentelor diferă de alte amprente spectrofotometrice ale proteinelor extrase din alte specii de
animale vertebrate şi plante.
De obicei, proteinele se localizează în zonele lungimilor de undă de 280nm şi 215nm. Proteinele
extrase din ţesuturile insectelor se localizează în zonele 200-250nm şi un alt peak de obicei mai mic de 250-
280nm. Puterea de absorbţie depinde de concentraţia proteinelor.
În cazul nostru, s-au luat amprentele albuminelor de bovină, care determină o amprentă cu un singur
peak în zona lungimilor de undă de 224 nm cu o absorbţie de 2,8. Proteina extrasă din ţesuturile de Bombyx
mori, pupe de 8 zile, formează o curbă cu un singur peak în zona lungimilor de undă de 193,5 cu o
concentraţie de 1,0726 Abs.
242
După o extracţie de proteine în apă, din pupe de 8 zile de PL (Lepidoptere), mojarate apoi sedimentate
timp de 24 de ore la temperatura de 4˚C, suspensia formează un sediment de culoare albă şi o suspensie de
culoare roz sau gri. Analizele fotospectrometrice s-au efectuat din sediment şi din supernatant, care pe
amprentele fotospectrometrice formează curbe identice. Din pupele de Lepidoptere se formează o amprentă
cu două peakuri. Suspensia din supernatant (proteina şi alte componente solubile în apă) formează un peak
mai pronunţat în zona lungimilor de undă de 215nm cu absorbţia de 2,980Abs, iar al doilea peak se
formează în zona lungimilor de undă de 277nm cu o absorbţie de 0,9413 Abs.
Proteinele din sedimentul suspensiei de B. mori formează un peak de o intensitate mai mică în zona
lungimilor de undă de 211,5 nm cu absorbţia de 0,9413 Abs în comparaţie cu cele ale sedimentului. Curba
obţinută din suspensia imago de MM (Coleoptere), diluată de 4 ori, determină o curbă în zona lungimilor de
undă, în zona 209,5 nm cu o absorbţie de 5,2 Abs. Curba cu un singur peak este obţinută din Md (Diptere).
Compoziţia aminoacizilor la diferite specii de insecte variază foarte mult, dar în multe cazuri predomină
acidul glutamic, lizina, arginina şi fenilamina.
244
DESCOPERIREA PEPTIDELOR DIN INSECTE
Insectele au fost prospere în evoluţie şi estimările curente. Acest lucru arată că ele reprezintă 3
pătrimi din toate speciile de animale existente. Cu excepţia majorităţii autorilor, care au studiat biochimia
insectelor, care ocupă aproape toate nişele ecologice de pe Terra. Ele sunt comparate cu alte organisme
patogene : bacterii, virusuri, fungi, protozoare şi viermi paraziţi. În timpul evoluţiei, insectele au elaborat
alte mecanisme de apărare faţă de patogenii specifici.
Studiile făcute de Metchnikow (1) şi de Cuenot(2) la sfârşitul secolului 19, reliefează rolul
hemolimfei în această rezistenţă. O imagine mai complexă a fost dezvoltată în anul 1920, când câţiva
cercetători au arătat că insectele pot fi imunizate împotriva dozelor letale de bacterii printr-o injecţie a
oricărei culturi atenuate prin căldura sau doze mici de culturi virulente (3). Protecţia indusă a fost vizibilă cel
mai devreme la 3 ore după injecţie. Este asigurat un spectru relativ larg al protecţiei şi aceasta a fost însoţită
de apariţia unei activităţi bacteriolitice termostabilă puternica în hemolimfă (4,5).
Surprinzător, aceste studii promiţătoare, aproape căzute în uitare şi domeniul defensiv al gazdei
nevertebratelor, au fost complet părăsite înainte de 1970, când H.G Boman şi asociaţii au început în
Stockholm câteva serii de investigaţii ale reacţiilor defensive ale Drosofilei şi mai târziu pe molia Sitotroga
(7).
Aceşti autori au observat că injecţia cu bacterii în pupa acestei molii are ca efect sinteza proteinelor
imune. Ei au purificat câteva din aceste proteine şi au caracterizat două clase noi de peptide antibacteriene
pe care le-au numit cecropine (7) şi atacine (8). Timpul a fost apoi copt pentru izolarea largă a
moleculelor imune induse în specii variate de insecte şi în anii care au urmat, o neaşteptată varietate de
peptide antimicrobiene induncibile care au fost izolate în câteva laboratoare din diferite specii de insecte
(numărul lor depăşind 150). Peptidele antimicrobiene au fost produse în corpul gras, un organ funcţional
echivalent ficatului mamiferelor. Aceste peptide, se presupune că se sintetizează în câteva ore după o
agresiune septică. Ele sunt secretate în hemolimfă justificând activitatea bacteriolitică evidenţiată de autorii
anteriori. Studiile recente au arătat că pe lângă această reacţie defensivă, este vorba acum de răspunsul imun,
in celulele epiteliului cuticulei, traheelor, intestinului şi altor tipuri de epitelii.
Părerea actuală este că apărarea insectei gazdă are multe aspecte şi implică, pe lângă sintezele rapide
de peptide mici antimicrobiene cationice, procesul de fagocitoză şi formaţiuni capsulare ce se produc în
celulele hemolimfei. Reacţiile defensive suplimentare din insecte sunt coagularea hemolimfei şi procesul de
melanizare.
Am reflectat asupra câtorva produşi de reacţie a celulelor unor lepidoptere la apariţia infecţiilor
bacteriene, ce provoacă apariţia peptidelor antimicrobiene în celulele hemolimfei şi în corpul gras.
Singurele peptide antimicrobiene inductibile la insecte, care conţin α- helixuri amfipatice sunt
cecropinele. Ele au de la 31 la 39 de resturi ale aminoacizilor lipsiţi de cisteina. Prezintă regiuni puternic
245
bazice N-terminale şi o lungă formaţiune hidrofobă în jumătatea C-terminală. Structura tridimensională a
cecropinelor, cum e dedusă din studiile rezonanţei magnetice nucleare (NMK) în apă cu trifluoretanol (16),
constă din 2 α-helixuri unite printr-o regiune conţinând dubletul glicina-prolina. α helixul N-terminal este
aproape perfect amfipatic. De la raportul iniţial asupra cecropinei din Hyalophora în 1981(7) până la 28
isoforme de cecropină, au fost izolate din hemolimfa insectelor agresate de bacterii, aparţinând speciilor
variate de Lepidoptera şi Diptera. În ciuda câtorva investigaţii detaliate, cecropinele nu au fost până acum
raportate la ordine de insecte. Cecropinele sunt foarte active concentraţii minimale inhibatorii, [(MIC3) cu
greutăţi moleculare mici împotriva câtorva bacterii gram-pozitive şi gram-negative. Recent o nouă cecropina
a fost izolată dintr-o linie celulară de Aedes albopicus ; secvenţa acestei molecule este semnificativ diferită
de toate celelalte cecropine raportate.
Insectele produc câteva tipuri de peptide antimicrobiene cu punţi disulfidice şi anume defensinele din
insecte.
Mai jos vom descrie Tanatina, o peptidă cu o singura punte disulfidică, Androctonina care conţine
2 punţi, defensinele insectelor, cu 3 punţi şi în final Drosomicina care are 4 punţi.
TANATINA
Este o peptidă antimicrobiană izolată din insecta hemiptera Podisus maculiventris. Tanatina nu are
nici o omologie de secvenţă cu moleculele de apărare ale altor insecte, dar are asemănări mari cu
brevininele, o familie de peptide antimicrobiene izolate din secreţiile de pe pielea de broască (33). Omologia
generală de secvenţă între tanatina şi brevinina este de 50% şi ambele conţin o buclă C-terminală de 6
(tanatina) sau 5 (brevinina) resturi de aminoacizi formată dintr-o punte disulfidică intramoleculară.
Această buclă poartă o puternică sarcină pozitivă în ambele molecule şi conţine un rest central de
treonină, care separă două subgrupe de electropozitivitate. Un aranjament similar (2 cistine C-terminale care
flanchează un grup de resturi încărcate separat de un rest Thr sau Ser) a fost descris în alte peptide
antimicrobiene de pe pielea de broască, de ex. esculentine, gaegumine şi ranalexine, şi molecula de la Rana.
Molecula de la insectă diferă de molecula de la Rana prin adăugarea unui rest de Asn în bucla (34).
Tanatina are un spectru larg de activitate împotriva bacteriilor gram-pozitive şi gram-negative şi
ciupercilor. Activitatea este observată la concentraţii de la 0,5 la 10 nM care corespund celor găsite în
sângele insectelor imunizate. La aceste concentraţii tanatina este atât bactericidă cât şi fungicidă. Tanatina
nu este hemolitică precum este în cazul brevininelor.
Rezultate preliminare indică faptul că membrana citoplasmatică nu este ţinta tanatinei şi că această
moleculă, spre deosebire de defensinele şi cecropinele din insecte, nu este o peptidă care formează pori. Mai
mult, rezultatele obţinute cu o tanatină sugerează faptul că este implicat mai mult de un mecanism de
activitate în omorârea bacteriilor şi fungilor prin tanatină (32).
Spectroscopia bidimensională H-RMN şi modelarea moleculară indică faptul că tanatina adoptă o
structură foaie β pliată antiparalelă de la restul 8 la capătul C-terminal (restul 21) inclusiv puntea -S-S-(35).
În ciuda prezentei a 2 resturi de prolină, se pare că este în mare grad de variabilitate în segmentul N-
terminal.
ANDROCTONINA
Recent, a 25-a rămăţită a peptidei antimicrobiene a fost izolată din sângele scorpionului Androctonus
australis(36). Această peptidă are 4 cestine prinse în 2 punţi disulfidice intramoleculare cu CYS 4 legat de
CYS 2 şi CYS 10 legat de CYS 16(tab 3).
Androctonina este înalt cationică cu o calculată Pi de 10,2 şi conţine 8 încărcături pozitive incluzând
un grup de 3 resturi ARG legate de 2 resturi GLY în partea centrală a moleculei.
246
În mod interesant, acest motiv este de asemenea observat în 2 defensine izolate din sângele
scorpionului Leiurus şi Androctomus. Androctonina nu are nici o secvenţă similară cu alte molecule
defensine. Cu toate acestea, arată o similaritate la înalt grad cu tahiplensinele, o familie de peptide
antimicrobiene cationice din crabul japonez, Tachypleus tridentatus (37). Pe lângă acestea, androctonina
prezintă câteva similarităţi structurale cu protegrinele, care sunt peptide antimicrobiene izolate din
leucocitele de porcine (38). Mulţimea disulfidică (Cys1-Cys4 şi Cys 2-Cys3) este identică cu cele 3 familii,
sugerând o structură tridimensională similară.
Androctonina este activă împotriva ambelor bacterii, atât gram-pozitive cât şi gram-negative şi de
asemenea expune un spectru larg al activităţii împotriva fungilor.
Chiar la concentraţii înalte (150γM) androctonina nu are activitate hemolitică împotriva celulelor
roşii din sângele bovinelor sau porcinelor.
Numele de defensine din insecte a fost iniţial propus de Lambert şi asociaţii (1989) pentru 2 peptide
4-kDa, izolate din sângele larvelor infectate cu bacterii ale muştei Phornia terranovae, care a prezentat
asemănare de frecvenţă cu defensinele din mamifere.
Într-un studiu independent, autorii şi colaboratorii au arătat ca o linie de celule embrionare, NIH
Sape 4, derivata dintr-o altă specie de Diptera Sacrofaga pelegrina produce o defensină de insectă izoformă
pe care ei au numit-o sapecina (30).
Multe din defensinele din insecte sunt active împotriva bacteriei gram-pozitive, dar au o mică
activitate împotriva bacteriei gram-negative. Ele nu sunt hemolitice. Aceste molecule au o largă distribuţie
printre clasele de insecte. Prezenţa lor a fost raportată de alţii, din Diptera, Coleoptera, Trichoptera,
Hymenoptera, Neuroptera, Hemiptera şi Ordonata. Peptidele antimicrobiene cu secvenţe similare au fost de
asemenea găsite în scorpioni şi în molusca Mytilus edulis.
O problemă foarte importantă este determinarea activităţii lipazice, care ne permite să determinăm
potenţialul de delipidizare a preparatelor biologice destinate eliminării unor tipuri de lipide. Acest lucru s-a
determinat în comparaţie cu activitatea lipazică a unor preparate standard.
A fost utilizat material biologic crud congelat. S-au făcut extracţii cu soluţie salină (clorura de sodium
0,9%) în raportul 1g material umed + 3 ml extractant. Materialul a fost triturat în prezenţa de nisip de quarz.
Probele au fost: pupe şi larve Galleria mellonella ( Lepidoptera) şi larve Musca domestica (Diptera)
şi Tenebrio monitor (Colioptera ).
Probele mojarate împreună cu extractantul au fost lăsate peste noapte în frigider şi apoi au fost
centrifugate 40 min. la 4000rpm.
Dozarea activităţii lipazice s-a făcut cu aparatul determinări rapide. Metoda constă în măsurarea
colorimetrică printr-o reacţie de culoare a cantităţii de acid oleic care rezultă prin hidroliza enzimatică a
trioleinei.
Acţiunea enzimatică nu are loc asupra lipidelor ca atare, ci ele trebuie emulsionate cu un emulgator.
Dealtfel şi în tubul digestiv al animalelor hidroliza grăsimilor se petrece în prezenţa unor emulgatori. În
cazul animalelor superioare lipaza pancreatică acţionează asupra lipidelor în prezenţa acizilor biliari.
În cazul aparatului pentru determinare rapidă utilizat de noi, substratul folosit este trioleină (se poate
utiliza şi ulei de măsline extravirgin) emulsionat cu Tween. Reacţiile sunt următoarele:
Lipaza H2 O
Lipaza H2O
Lipaza H2O
H2C – OH
│
Glicerina H C – OH
│
H2C – OH
Activitatea enzimatică se exprimă în μg/l extract. Extractele noastre au fost diluate în mod
corespunzător pentru a se încadra în domeniile de măsurare ale aparatului, astfel:
- extractul din pupe de Galleria mellonella diluat de 10 ori;
- extractul din larve de Galleria mellonella diluat de 20 ori;
- extractul din larve de Musca domestica L diluat de 10 ori.
Rezultatele au fost următoarele ( ţinând cont şi de diluţiile practicate):
- pupe Galleria mellonella : 1540 μg/l;
- larve Galleria mellonella : 6780 μg/l;
248
- larve Musca domestica : 410 μg/l.
Concluzie: activitatea lipolitică cea mai mare se întâlneşte în larvele de G. Mellonella,dar este de
aşteptat ca şi larvele altor specii de insecte să prezinte o activitate lipazică importantă.
249
ANTIBIOTICE PEPTIDICE
α-helix cu punţi disulfidice (β-sheet) bogate bogate
amfipatic 1 punte –S-S- 2 punţi –S-S- 3 punţi –S-S- 4 punţi –S-S- în prolină în glicocol
CECROPINE THANATINA ANDROCTONINA DEFENSINE DROSOMYCINA Hymenoptera, ATTACINE
31-39 AA Hemipterul scorpionul 4 kDa 44 AA Diptera, SARCOTOXINE
(Hyalophora Podisus Androctonus australis flesh fly Fungi: activ puternica Hemiptera, II
cecropia) maculiventris Gram + Nu Gram + Lepidoptera DIPTERICINE
28 izoforme în Gram + Gram – Phormia terranovae Gram + APIDAECINE Gram +
Lepidoptera şi Gram – Fungi Sapecina (Sarcophaga Ne-hemolitic 16-20 AA Gram –
Diptera Fungi Ne-hemolitic peregrina) β-helix + β sheet ABAECINE Nu sunt similare
Gram + Ne-hemolitic Diptera, 34-39 AA
Gram – Coleoptera,Trichoptera, Metchnikowina
2 α- helix Hymenoptera, Neuroptera, (Drosophila)
recent o formă Hemiptera, Odonata Gram +
nouă din Aedes 38 membri ai clasei Fungi
albopictus, defensine In Hemiptera:
diferită de 37-51 AA Metalnikowina
celelalte α-helix + β-sheet Gram –
Gram + Drosocina
Gram – (putin) (Drosophila)
Ne-hemolitic Pirrhoconicina
(hemipterul
Pyrrhococis)
Lebocine (Bombyx
mori)
Formaecine furnica
(Myrmecia gulosa)
250
X = 3,97 x 100 X = 397 mg/kg
Pentru concretizarea LD50 s-a calculat eroarea (m) după metoda Miller Tainter. După
dreapta I din grafic, se determină căror doze corespund probiturile 6 (84%) şi 4 (16%).
Diferenţa dintre ele este egală cu mărimea a 2 greşeli medii pătrate:
2 δ = LD84 - LD16
Sx - este greşeala LD50 iar Sx = 2 δ: rădăcina pătrată din 2N
N - numărul total al animalelor din grupele în care au decedat mai puţin de 6,7%
(probit 3,5) şi nu mai mult de 93,3%(probit 6,5).
LD84 = 520 mg, iar LD16 = 190
m = Sx Sx = 2δ / rădăcina pătrată din 2N
Sx = (520 - 190) : √ 2x 18 = 330 : 6 = 55
LD50 este egală cu M±m = 397 ± 55 mg/kg
Y = Ao +A1X
Suma XB/suma B ((suma YB) – (suma XbxA1)) + (suma X2B) A1 = suma XYB
43, 7:15, 52 (84, 89 – 43,7A1) +202,74A1 = 264, 33
2, 81 (84, 89 – 43,7A1) +202,74A1 = 264, 33
238, 54 – 122,8A1 + 202,74A1 = 264, 33
80,06A1 = 25, 79
A1 = 25, 79: 80, 06 A1 = 0, 32
Ao = (suma YB – suma XB A1): suma B
Ao = (84, 89 – 43, 7x0, 32): 11, 52
A0 = (84, 89 – 13, 98): 15, 52
A0 = 4, 57
Y1 = 4, 57 + 0,32x 0, 2 Y1 = 4, 63
Y2 = 4, 57 + 0,32x 1 Y2 = 4, 89
Y3 = 4, 57 + 0,32x 2 Y3 = 5, 21
Y4 = 4, 57 + 0,32x 3 Y4 =5, 53
Y5 = 4, 57 + 0,32x 4 Y5 = 5, 83
251
Y6 = 4, 57 + 0,32x 10 Y6 = 7, 77
Y = Ao + A1X
X = (Y + A0): A1
X = (5, 0 – 4, 57): 0, 32 X = 0,43: 0,32X = 1, 34
X = 1, 34 x 25 X = 33, 4 mg/kg
Pentru concretizarea LD50 s-a calculat eroarea (m) după metoda Miller Tainter. După
dreapta I din grafic, se determină căror doze corespund probiturile 6 (84%) ăi 4 (16%).
Diferenţa dintre ele este egală cu mărimea a 2 greşeli medii pătrate:
2 δ = LD84 – LD16
Sx – este greşeala LD50, iar Sx = 2 δ : rădăcina pătrată din 2N
N – numărul total al animalelor din grupele în care au decedat mai puţin de 6,7%
(probit 3,5) şi nu mai mult de 93,3% (probit 6,5).
LD84 = 110 mg, iar LD16 = 19
m = Sx Sx = 2 δ/ rădăcina pătrată din 2N
Sx = (110-19): √2x23 = 91: 6, 78 = 13.4
LD50 este egală cu M±m = 33,4 ± 13,4 mg/kg
Y = A0 + A1X
Suma XB/ suma B (suma YB) – (suma XbxA1)) + (suma X2B) A1 = suma XYB
28, 92: 11, 32 (47, 82 – 28,92A1) + 86,12A1 = 135, 74
2, 55 (47, 82 – 28, 92A1) +86,12A1 = 135, 74
122, 17 – 73,75A1 + 86,12A1 = 135, 74
12,37A1 = 13, 57
A1 = 13, 57: 12, 37 A1 = 1, 1
A0 = (suma YB – suma XB A1): suma B
A0 = (47, 82 – 28,92x 1, 1): 11, 32
A0 = (47, 82 – 31, 81): 11, 32
A0 = 1, 41
Y1 = 1, 41 + 1,1x 1 Y1 = 2, 51
Y2 = 1, 41 + 1,1x 2 Y2 = 3, 61
Y3 = 1, 41 + 1,1x 3 Y3 = 4, 71
Y4 = 1, 41 + 1,1x 5 Y4 = 6, 91
Y = A0 + A1X
X = (Y – A0): A1
X = (5, 0 – 1, 41): 1, 1 X = 3, 59: 1, 1 X = 3, 26
X = 3,26x 50 X = 163mg/kg
Pentru concretizarea LD50, s-a calculat eroarea (m) după metoda Miller Tainter. După
dreapta I din grafic, se determină căror doze corespund probiturile 6(84%) şi 4(16%).
Diferenţa dintre ele este egală cu mărimea a 2 greşeli medii pătrate:
2 δ = LD84 – LD16
Sx – Este greşeala LD50 iar Sx = 2δ: rădăcina pătrată din 2N
253
N - Numărul total al animalelor din grupele în care au decedat mai puţin de 6,7%
(probit 3,5) şi nu mai mult de 93,3 (probit 6,5).
LD84 = 193 mg, iar LD16 = 91
m = Sx Sx = 2 δ / rădăcina pătrată din 2N
Sx = (193 – 91): √2x 24 = 102: 6, 93 = 14, 7
LD50 este egală cu M ± m = 163 ± 14, 7 mg/kg
Y = A0 + A1X
Suma XB/ suma B ( (suma YB) – (suma XbxA1)) + (suma X2B)A1 = suma XYB
92,62 : 18,3 (93,4 – 92,62A1) + 785,9A1 = 541,05
5,06 (93,4 – 92,62A1) + 785,9A1 = 541,05
472,72 – 468,66A1 + 785,9A1 = 541,05
317,24 A1 = 68,33
A1 = 68,33 : 317,24 A1 = 0,22
A0 = (suma YB – suma XB A1) : suma B
A0 = (93,4 – 92,62x 0,22) : 18.3
A0 = (93,4 – 20,38) : 18.3
A0 = 3,99
Y1 = 3,99 + 0,22x 1 Y1 = 4,21
Y2 = 3,99 + 0,22x 2 Y2 = 4,43
Y3 = 3,99 + 0,22x 3 Y3 = 4,65
Y4 = 3,99 + 0,22x 10 Y4 = 6,19
Y5 = 3,99 + 0,22x 15 Y5 = 7,29
Y = A0 + A1X
X = (Y – A0) : A1
X = (5,0 – 3,99) : 0,22 X = 1,01 : 0,22 X = 4,59
X = 4,59 x 50 X = 229,5 mg/kg
Pentru concretizarea LD50, s-a calculat eroarea (m) după metoda Miller Tainter. După
dreapta I din grafic, se determină căror doze corespund probiturile 6(84%) şi 4(16%).
Diferenţa dintre ele este egală cu mărimea a 2 greşeli medii pătrate:
2δ = LD84 – LD16
Sx – este greşeala LD50, iar Sx = 2 δ : rădăcina pătrată din 2N
N – numărul total al animalelor din grupele în care au decedat mai puţin de 6,7%
(probit 3,5) şi nu mai mult de 93,3% (probit 6,5).
LD84 = 453 mg, iar LD16 = 144
m = Sx Sx = 2 δ/ rădăcina pătrată din 2N
Sx = (453 – 144) : √2x 17 = 308 : 5,83 = 52,8
254
LD50 este egală cu M±m = 229,5 ± 52,8 mg/kg
Y = A0 + A1X
Suma XB/ suma B ((suma YB) – (suma XbxA1)) + (suma X2B) A1 = suma XYB
7, 98: 7, 28 (36, 94 – 7,28A1) + 10,79A1 = 42, 63
1, 1 (36, 94 – 7, 28A1) +10,79A1 = 42, 63
40, 63 – 8,78A1 + 10,79A1 = 42, 63
2,01A1 = 2, 0
A1 = 2, 0: 2, 01 A1 = 0, 99
A0 = (suma YB – suma XB A1): suma B
A0 = (36, 94 – 7, 98X0, 99): 7, 28
A0 = (36, 94 – 7, 9): 7, 28
A0 = 3, 99
Y1 = 3, 99 + 0,99x 0,2 Y1 = 4,19
Y2 = 3, 99 + 0,99x 1 Y2 = 4, 98
Y3 = 3, 99 + 0,99x 2 Y3 = 5, 97
Y = A0 + A1X
X = (Y – A0): A1
X = (5, 0 – 3, 99): 0, 99 X = 1, 01: 0, 99 X = 1, 02
X = 1,02x 25 X = 25, 5 mg/kg
Pentru concretizarea LD50, s-a calculat eroarea (m) după metoda Miller Tainter. După
dreapta I din grafic, se determină căror doze corespund probiturile 6(84%) şi 4(16 %).
Diferenţa dintre ele este egală cu mărimea a 2 greşeli medii pătrate:
2δ = LD50 – LD16
Sx – este greşeala LD50 iar Sx = 2δ: rădăcina pătrată din 2N
N – numărul total al animalelor din grupele în care au decedat mai puţin de
6,7% (probit 3,5) şi nu mai mult de 93,3% (probit 6,5).
LD84 = 42,5 mg, iar LD16 = 15,5
m = Sx Sx = 2δ / rădăcina pătrată din 2N
Sx = (42,5 – 15,5) : 2√x6 = 27 : 3,46 = 7,8
LD50 este egală cu M±m = 25,5 ± 7,8 mg/kg
Y = A0 + A1X
Suma XB/ suma B ( ( suma YB) – (suma XbxA1)) + (suma X2B)A1 = suma XYB
23,08 : 15,24 (80,67 – 23,08A1)+62,66A1 = 139,09
1,51(80,67 – 23,08A1)+62,66A1 = 139,09
121,81 – 34,85A1+62,66A1 = 139,09
27,81A1 = 17,28
A1 = 17,28:27,81 A1 = 0,62
A0 = (suma YB – suma XBA1) : suma B
A0 = (80,67 – 23,08x0,62) : 15,24
A0 = (80,67 – 14,31) : 15,24
A0 = 4,35
Y1 = 4,35 + 0,62x 0,1 Y1 = 4,41
Y2 = 4,35 + 0,62x 0,5 Y2 = 4,66
Y3 = 4,35 + 0,62x 1,5 Y3 = 5,28
Y4 = 4,35 + 0,62x 2 Y4 = 5,59
Y5 = 4,35 + 0,62x 5 Y5 = 7,45
Y = A0 + A1X
X = (Y – A0) : A1
X = (5,0 – 4,35) : 0,62 X = 0,65 : 0,62 X = 1,05
X = 1,05 x 50 X = 52,4 mg/kg
Pentru concretizarea LD50, s-a calculat eroarea (m) după metoda Miller Tainter. După
dreapta I din grafic, se determină căror doze corespund probiturile 6 (84%) şi 4 (16%).
Diferenţa dintre ele este egală cu mărimea a 2 greşeli medii pătrate:
2δ = LD84 – LD16
Sx – este greşeala LD50 iar Sx = 2 δ : rădăcina pătrată din 2N
N – numărul total al animalelor din grupele în care au decedat mai puţin de 6,7%
(probit 3,5) şi nu mai mult de 93,3% (probit 6,5).
Y = A0 + A1X
256
Suma XB/ suma B ((suma YB) – (suma XbxA1))+(suma X2B)A1 = suma XYB
16,88: 8,44 (42,2 – 16,88A1) + 37,2A1 = 90,04
2,0 (42,2 – 16,88A1) + 37,2A1 = 90,04
84,4 – 33,76A1 + 37,2A1 = 90,4
3,44A1 = 5,64
A1 = 5,64 : 3,44 A1 = 1,64
A0 = (suma YB – suma XB A1) : suma B
A0 = (42,2 – 16,88x 1,64) : 8,44
A0 = (42,2 – 27,68) : 8,44
A0 = 1,72
Y1 = 1,72 + 1,64x 1 Y1 = 3,36
Y2 = 1,72 + 1,64x 2 Y2 = 5,0
Y3 = 1,72 + 1,64x 3 Y3 = 6,64
Y = A0 + A1X
X = (Y – A0) : A1
X = (5,0 – 1,72) : 1,64 X = 3,28 : 1,64 X = 2,0
X = 2,0x 250 X = 500 mg/kg
Pentru concretizarea LD50, s-a calculat eroarea (m) după metoda Miller Tainter. După
dreapta I din grafic, se determină căror doze corespund probiturile 6 (84%) şi 4 (16%).
Diferenţa dintre ele este egală cu mărimea a 2 greşeli medii pătrate:
2δ = LD84 – LD16
Sx – este greşeala LD50 iar Sx = 2δ : rădăcina pătrată din 2N
N – numărul total al animalelor din grupele în care au decedat mai puţin de 6,7%
(probit 3,5) şi nu mai mult de 93,3% (probit 6,5).
Y = A0 + A1 X
Suma XB/ suma B (( suma YB) – (suma XBx A1)) + (suma X2B)A1 = 48,62
11,01 : 8,4 (36,08 – 11,01A1) + 14,69A1 =48,62
1,31 (36,08 – 11,01A1) + 14,69A1 = 48,62
47,29 – 14,42A1 + 14,69A1 = 48,62
0,27A1 = 1,33
A1 = 1,33 : 0,27 A1 = 4,92
A0 = (suma YB – suma XB A1) : suma B
A0 = (36,08 – 11,01x 4,92) : 8,4
257
A0 = (36,08 – 54,16) : 8,4
A0 = - 2,15
Y1 = - 2,15 + 4,92x 1 Y1 =2,77
Y2 = - 2,15 + 4,92x 1,2 Y2 = 3,75
Y3 = -2,15 + 4,92x 1,4 Y3 =4,74
Y4 = - 2,15 + 4,92x 1,5 Y4 = 5,23
Y = A0 + A1X
X = (Y – A0) : A1
X = (5,0 – (-2,15) : 4,92 X = 7,15 : 4,92 X = 1,45
X = 1,45x 500 X = 725 mg/kg
Pentru concretizarea LD50, s-a calculate eroarea (m) după metoda Miller, Tainter.
După drepata I din grafic se determină căror doze corespund probiturile 6 (84%) şi 4 (16%).
Diferenţa dintre ele este egală cu mărimea a 2 greşeli medii pătrate:
2 δ = LD84 – LD16
Sx – este greşeala LD50 iar Sx = 2δ : rădăcina pătrată din 2N
N – numărul total al animalelor din grupele în care au decedat mai puţin de 6,7%
(probit 3,5) şi nu mai mult de 93,3% (probit 6,5).
LD84 = 830 mg, iar LD16 = 580
m = Sx Sx = 2 δ/ rădăcina pătrată din 2N
Sx = (830 – 580) : √2x 17 = 250 : 5,83 = 43
LD50 este egală cu M±m = 725 ± 43 mg/kg
Y = A0 + A1 X
Suma XB/ suma B ((suma YB) – (suma XbxA1)) + (suma X2B)A1 = suma XYB
33,54 : 12,82 (61,94 – 33,54A1) + 103,46A1 = 174,2
2,62 (61,94 – 33,54A1) + 103,46A1 = 174,2
162,05 – 87,87A1 + 103,46A1 = 174,2
15,59A1 = 12,15
A1 = 0,78
A0 = (suma YB – suma XB A1) : suma B
A0 = (61,94 – 33,54 x 0,78) : 12,82
A0 = (61,94 – 26,14) : 12,82
A0 = 2,79
Y1 = 2,79 + 0,78x 1 Y1 = 3,57
Y2 = 2,79 + 0,78x 2 Y2 = 4,35
Y3 = 2,79 + 0,78x 3 Y3 = 5,13
Y4 = 2,79+ 0,78x 5 Y4 = 6,69
Y = A0 + A1X
X = (Y – A0) : A1
258
X = (5,0 – 2,79) : 0,78 X = 2,21 : 0,78 X = 2,83
X = 2,83X 50 X = 141,7 mg/ kg
Pentru concretizarea LD50, s-a calculat eroarea (m) după metoda Miller, Tainter. După
drepata I din garfic se determină căror doze corespund probiturile 6 (84%) şi 4 (16%).
Diferenta dintre ele este egală cu mărimea a 2 greşeli medii pătrate:
2 δ = LD84 – LD16
Sx – este greşeala LD50 iar Sx = 2 δ : rădăcina pătrată din 2N
N – numărul total al animalelor din grupele în care au decedat mai puţin de 6,7%
(probit 3,5) şi nu mai mult de 93,3% (probit 6,5).
LD84 = 200mg, iar LD16 = 88mg
m = Sx Sx = 2 δ/ rădăcina pătrată din 2N
Sx = (200 – 88) : √2x 17 = 112 : 5,83 = 19.2
LD50 este egală cu M±m = 141,7 ± 19,2 mg/kg
Y = A0 + A1X
Suma XB/ suma B ((suma YB) – (suma XbxA1)) + (suma X2B)A1 = suma XYB
12,89 : 8,08 (40,4 – 12,89A1) + 22,41A1 = 68,44
3,83 (54,65 – 43,87A1) + 204,44A1 = 266,22
1,59 (40,4 – 12,89A1) +22,41A1 = 68,44
64,45 – 20,49A1 + 22,41A1 = 68,44
1,92A1 = 3,99
A1 = 3,99 : 1,92 A1 = 2,08
A0 = (suma YB – suma XB A1) : suma B
A0 = (40,4 – 12,89x 2,08) : 8,08
A0 = (40,4 – 26,79) : 8,08
A0 = 1,68
Y1 = 1,68 + 2,08x 1 Y1 = 3,76
Y2 = 1,68 + 2,08x 1,5 Y2 = 4,8
Y3 = 1,68 + 2,08x 2,5 Y3 = 6,88
Y = A0 + A1X
X = (Y – A0) : A1
X = (5,0 – 1,68) : 2,08 X = 3,32 : 2,08 X = 1,6
X = 1,6x 100 X = 160 mg/kg
Pentru concretizarea LD50, s-a calculat eroarea (m) după metoda Miller, Tainter. După
dreapta I din grafic se determină căror doze corespund probiturile 6 (84%) şi 4 (16%).
Diferenţa dintre ele este egală cu mărimea a 2 greşeli medii pătrate:
2 δ = LD84 – LD16
Sx – este greşeala LD50 iar Sx = 2 δ : rădăcina pătrată din 2N
259
N – numărul total al animalelor din grupele în care au decedat mai puţin de 6,7%
(probit 3,5) şi nu mai mult de 93,3% (probit 6,5).
LD84 = 200 mg, iar LD16 = 120 mg
m = Sx Sx = 2 δ/ rădăcina pătrată din 2N
Sx = (200-120) : √2x 12 = 80 : 4,9 = 16.3
LD50 este egală cu M±m = 160 ± 16,3 mg/kg
Y = A0 + A1X
Suma XB/ suma B (( suma YB) – (suma XbxA1)) + (suma X2B)A1 = suma XYB
20,32 : 8,44 (42,2 – 20,32A1) + 64,72A1 = 112,88
2,41 (42,2 – 20,32A1) + 64,72A1 = 112,88
101,6 – 49A1 + 64,72A1 = 112,88
15,72A1 = 11,28
A1 = 11,28 : 15,72 A1 = 0,72
A0 = (suma YB – suma XB A1) : suma B
A0 = (42,2 – 20,32x 0,72) : 8,44
A0 = (42,2 – 14,58) : 8,44
A0 = 3,27
Y1 = 3,27 + 0,72x 1 Y1 = 3,99
Y2 = 3,27 + 0,72x 2 Y2 = 4,71
Y3 = 3,27 + 0,72x 5 Y3 = 6,87
Y = A0 + A1X
X = (Y – A0) : A1
X = (5,0 – 3,27) : 0,72 X = 1,73 : 0,72 X = 2,4
X = 2,4x 50 X = 120mg/kg
Pentru concretizarea LD50, s-a calculat eroarea (m) după metoda Miller, Tainter. După
dreapta I din grafic se determină căror doze corespund probiturile 6 (84%) şi 4 (16%).
Diferenţa dintre ele este egală cu mărimea a 2 greşeli medii pătrate:
2 δ = LD84 – LD16
Sx – este greşeala LD50 iar Sx = 2 δ : rădăcina pătrată din 2N
N – numărul total al animalelor din grupele în care au decedat mai puţin de 6,7%
(probit 3,5) şi nu mai mult de 93,3% (probit 6,5).
LD84 = 184 mg, iar LD16 = 63
m = Sx ; Sx = 2 δ/ rădăcina pătrată din 2N
Sx = (184 – 63) : √2x 12 = 121 : 3,46 = 35 mg
LD50 este egală cu M±m = 120 ±35 mg/kg
260
Tabelul 36. Toxicitatea acută a substanţei IMspp (femele)
Doza N N % Loc Probi Coef.prob XB X2B YB XYB
mg/k anim dece dece doz t Y .B
g . s s ă pe
X
100 6 0 0 1 3,27 1,54 1,54 1,54 5,04 5,04
150 6 2 33 1,5 4,56 4,56 6,84 10,26 20,8 31,2
250 6 4 67 2,5 5,44 4,56 11,4 28,5 24,8 62,0
1
500 6 5 83 5 5,95 3,6 18,0 90,0 21,4 107
2
750 5 5 100 7,5 6,64 1,72 12,9 96,75 11,4 85,6
2
Suma 15,98 50,6 227,0 83,4 291,0
8 5 9 1
Y = A0 + A1X
Suma XB/ suma B ((suma YB) – (suma XbxA1)) + (suma X2B)A1 = suma XYB
50,68 ; 15,98(83,49 – 50,68A1) + 227,05A1 = 291,01
3,17 (83,49 – 50,68A1) + 227,05A1 = 291,01
264,78 – 160,65A1 + 227,05A1 = 291,01
66,4A1 = 26,23
A1 = 26,23 : 66,4 A1 = 0,39
A0 = (suma YB – suma XB A1): suma B
A0 = (83,49 – 50,68x 0,39) : 15,98
A0 = (83,49 – 20,02) : 15,98
A0 = 3,97
Y1 = 3,97 + 0,39x 1 Y1 = 4,36
Y2 = 3,97 + 0,39x 1,5 Y2 = 4,55
Y3 = 3,97 + 0,39x 2,5 Y3 = 4,94
Y4 = 3,97 + 0,39x 5 Y4 = 5,92
Y5 = 3,97 + 0,39x 7,5 Y5 = 6,89
Y = A0 + A1X
X = (Y – A0) : A1
X = (5,0 – 3,97) : 0,39 X = 1,03 : 0,39 X = 2,64
X = 2,64x 100 X = 264mg/kg
Pentru concretizarea LD50, s-a calculat eroarea (m) după metoda Miller, Tainter. După
dreapta I din grafic se determină căror doze corespund probiturile 6(84%) şi 4(16%).
Diferenţa dintre ele este egală cu mărimea a 2 greşeli medii pătrate:
2 δ = LD84 – LD16
SX – este greşeala LD50 iar Sx = 2 δ : rădăcina pătrată din 2N
N – numărul total al animalelor din grupele în care au decedat mai puţin de 6,7%
(probit 3,5) şi nu mai mult de 93,3%(probit 6,5).
LD84 = 417 mg, iar LD16 = 120
m = Sx ; Sx = 2 δ / rădăcina pătrată din 2N
Sx = (384 – 140) : √2x 22 = 2: 6,93 = 42,9
LD50 este egală cu M±m = 264 ± 42,9 mg/kg
261
Astfel, LD50 pentru substanţele cercetate la administrarea intraperitoneală la şoricei
(tab.37) şi şobolani (tab.38) a constituit:
Tabelul 37. LD50 pentru substanţele Hl-1, Hl-2, IM-2 şi IMspp la şoricei la
administrarea intraperitoneală
Substanţele Masculi şi femele
M±m (mg/kg)
Hl – 1 131,0 ± 39,0
Hl – 2 631,0 ± 51,0
IM – 2 302,0 ± 43,6
IMspp 397,0 ± 55,0
Tabelul 38. LD50 pentru substanţele Hl-1, Hl-2, IM-2 şi Imspp la şobolani la
administrarea intraperitoneală
Substanţele Masculi M±m Femele M±m Masculi si femele
(mg/kg) (mg/kg) M±m (mg/kg)
Hl – 1 25,5 ± 7,8 52,4 ± 12,2 33,4 ±13,4
Hl – 2 500,0 ± 86,7 725,0 ± 43,0 622,5 ± 45,5
IM – 2 141,7 ± 19,3 160,0 ± 16,3 163,0 ± 14,7
IMspp 120,0 ± 35,0 264,0 ± 42,9 229,5 ± 52,8
264
Tabelul 3. Modificarea numărului leucocitelor şi procentului formelor segmentate
La şobolani după 30 de zile de administrare a substanţelor cercetate
266
micşorează activitatea AsAT şi AlAT. În acelaşi timp, la şobolanii ce au fost pretrataţi cu
substanţa IMspp în doza de 100 mg/kg, s-a depistat o tendinţa spre micşorare a nivelului
AsAT (de la 1, 67+0, 07 la 1, 36+0, 09) şi AlAT (de la 3,14+0,15 la 2,7+0,17), iar la doza de
1000 mg/kg s-a constatat o reducere semnificativă a AsAT (de la 1,67+0,07 la 1,27+0,1) cu o
tendinţă spre diminuarea AlAT ( de la 3,14+0,15 la 2,79+0,24).
Astfel, substanţele Hl-1 şi IM-2 provocau o micşorare a activităţii transaminazelor, iar
IMspp doar o tendinţă de reducere a lor, în timp ce Hl-2 nu exercită influenţă asupra
parametrilor respectivi.
La cercetarea activităţii fosfatazei alcaline s-a constatat o creştere a nivelului enzimei
după pretratarea timp de o lună cu substanţele Hl-1 şi IM-2, în ambele doze, fără a manifesta
un caracter dozodependent. În acelaşi timp, la administrarea substanţelor Hl-2 şi Imspp,
conţinutul fosfatazei alcaline nu suferă modificări esenţiale în dozele studiate.
În urma studiului toxicităţii cronice a substanţelor Hl-1, Hl-2, IM-2 şi IMspp putem
concluziona:
Pe parcursul utilizării substanţelor cercetate timp de 30 de zile s-a constatat o creştere
ponderală puţin mai importantă la animalele pretratate decât la cele intacte;
Masa organelor interne reflectată prin indicele masa organului/ masa corpului, în
cazul cordului, plămânilor, ficatului, rinichilor, splinei, nu s-a modificat;
Substanţele cercetate pot diminua numărul leucocitelor şi formelor segmentate cu
creşterea în unele cazuri a limfocitelor;
Substanţele studiate nu modifică esenţial nivelul glucozei şi colesterolului;
Substanţele Hl-1 şi IM-2 cresc nivelul proteinelor totale;
Activitatea transaminazelor este micşorată de substanţele Hl-1 şi IM-2 şi mai puţin
influenţată de Hl-1 şi IMspp;
Substanţele Hl-2 şi IMspp nu influenţează asupra nivelului fosfatazei alcaline în timp
ce Hl-1 si IM-2 intensifică activitatea ei.
267
Tabelul 2.Modificarea nivelului glucozei, proteinelor totale şi colesterolului la utilizarea
timp de 30 de zile a substanţelor cercetate
Lotul Numărul de Glucoza mmol/l Proteinele Colesterolul
animale totale g/l total mmol/l
1. intact 6 3,93±0,07 51,75±1,13 1,6±0,15
2.Hl-1(100 8 4,19±0,1 60,29±1,55 1,72±0,08
mg/kg) P1-2>0,05 P1-2<0,05 P1-2>0,05
3.Hl-1(1000 8 4,19±0,21 61,92±3,53 1,85±0,15
mg/kg) P1-3>0,05 P1-3<0,05 P1-3>0,05
P2-3>0,05 P2-3>0,05 P2-3>0,05
4.Hl-2(100 8 3,47±0,23 53,01±0,07 1,52±0,07
mg/kg) P1-4>0,05 P1-4>0,05 P1-4>0,05
5.Hl-2(1000 8 3,74±0,14 47,0±1,63 1,54±0,15
mg/kg) P1-5>0,05 P1-5>0,05 P1-5>0,05
P4-5>0,05 P4-5>0,05 P4-5>0,05
6.IM-2(100 8 4,34±0,06 59,5±0,83 1,96±0,2
mg/kg) P1-6>0,05 P1-6<0,05 P1-6>0,05
7.IM-2(1000 8 4,24±0,2 61,37±1,64 1,62±0,07
mg/kg) P1-7>0,05 P1-7<0,05 P1-7>0,05
P6-7>0,05 P6-7>0,05 P6-7>0,05
8.IMspp(100 7 3,69±0,23 51,43±1,41 1,59±0,05
mg/kg) P1-8>0,05 P1-8>0,05 P1-8>0,05
9.IMspp (1000 8 3,59±0,24 52,65±1,93 1,66±0,08
mg/kg) P1-9>0,05 P1-9>0,05 P1-9>0,05
P8-9>0,05 P8-9>0,05 P8-9>0,05
268
Tabelul 3. Modificarea nivelului transaminazelor şi fosfatazei alcaline la utilizarea timp
de 30 de zile a substanţelor cercetate
Lotul Numărul de AsAT mmol/l AlATmmol/l Fosfataza
animale alcalină
mmol/s-l
1. intact 6 1,67±0,07 3,14±0,15 8256,7±674,7
2.Hl-1(100 8 1,01±0,06 2,03±0,12 21250,0±2610,7
mg/kg) P1-2<0,001 P1-2<0,001 P1-2<0,001
3.Hl-1(1000 8 0,88±0,03 1,77±0,07 19985,5±2259,9
mg/kg) P1-3<0,001 P1-3<0,001 P1-3<0,001
P2-3>0,05 P2-3>0,05 P2-3>0,05
4.Hl-2(100 8 1,68±0,11 3,14±0,23 7492,5±1074,1
mg/kg) P1-4>0,05 P1-4>0,05 P1-4>0,05
5.Hl-2(1000 8 1,67±0,12 3,14±0,21 9057,5±597,0
mg/kg) P1-5>0,05 P1-5>0,05 P1-5>0,05
P4-5>0,05 P4-5>0,05 P4-5>0,05
6.IM-2(100 8 0,71±0,06 1,45±0,13 23760,0±1648,7
mg/kg) P1-6<0,001 P1-6<0,001 P1-6<0,001
7.IM-2(1000 8 0,92±0,06 1,86±0,12 23958,7±1829,8
mg/kg) P1-7<0,001 P1-7<0,001 P1-7<0,001
P6-7>0,05 P6-7>0,05 P6-7>0,05
8.IMspp(100 7 1,36±0,09 2,70±0,17 10757,0±2121,0
mg/kg) P1-8>0,05 P1-8>0,05 P1-8>0,05
9.IMspp(1000 8 1,27±0,1 2,79±0,24 9847,5±1122,7
mg/kg) P1-9<0,05 P1-9>0,05 P1-9>0,05
P8-9>0,05 P8-9>0,05 P8-9>0,05
269
În ceea ce priveşte evoluţia greutăţii corporale, s-a înregistrat scăderea în greutate la
toate animalele care au supravieţuit. Scăderea în greutate, deşi generală, nu a fost întotdeauna
proporţională cu doza. Pierderile în greutate au fost de 1,2 – 2,0 g/cap; 0,6 – 2,3 g/cap; 0,2 –
3,0 g/cap, în cazul produselor Ll, Lp şi respectiv Tp. În acelaşi interval de timp (7 zile)
martorii (netrataţi) au crescut cu 2,0 g/cap.
La şobolani, cele trei produse au fost administrate oral, în doze unice, după cum
urmează: 250 şi 350 mg/kg pentru Ll, 300 mg/kg pentru Lp şi 500, 1500, 2500 ml/kg pentru
Tp.
Pe parcursul perioadei de observaţie, animalele au crescut în greutate, dar sporul a fost
mai mic decât acela de la martori la toate loturile care au primit Ll sau Tp.
Mortalitatea în proporţie de 20% s-a înregistrat numai în cazul produsului Ll, la doza
de 350 mg/kg, începând din a treia zi după administrarea unică.
270
Rezultatele sunt redate în schema alăturată:
Produsele Reacţia Reacţia Reacţia Instilare
testate oculară oculară oculară 3→54;5;6→
3 minute 1 zi după 2 zile 7 zile
Atomizat de 2/3 uşor 1/3 uşoară 1/3 ochi închis 1/3 lipsă
larve de eritem hiperemie (1) uşoară fenomene
Lymantria (LI) opacifiere inflamatorii
corneee(3) opacifiere
cornee(3)
Atomizat de 2/3 uşor 1/3 uşoară 1/3 uşoară 3/3 Normal
pupe de eritem secreţie secreţie (1)
Lymantria
(Lp)
Suspensie de Nu au fost observate reacţii oculare
larve de
Tenebrium
(Tp)
Material şi metodă
Studiul proprietăţilor cancerigene a PBA entomologice Nr.1, Nr.2, Nr.3 şi Nr.4 a fost efectuat conform
recomandărilor metodice despre cercetarea proprietăţilor cancerigene a substanţelor medicamentoase
descrise de către comitetul farmacologic al Ministerului Sănătăţii din Rusia (Moscova, 1998).
271
Testarea s-a efectuat pe 80 de şobolani albi, linia Vistar, cu masă corporală medie de 180 g.
Animalele au fost selectate de o vârstă (4 luni), menţinute în aceleaşi condiţii în vivariu. Şobolanii au
fost repartizaţi în patru loturi, în fiecare lot au fost incluşi câte 10 masculi şi 10 femele. Condiţiile de
întreţinere şi regimul alimentar al animalelor incluse în experiment au fost menţinute la nivel optim.
Calea de administrare a substanţei în studiul dat a fost determinată prin aplicarea pe derm (topic).
Regimul şi durata de administrare au fost stabilite de 3 ori pe săptămână, la aceeaşi oră, timp de 6 luni
de zile. În acest scop, în regiunea interscapulară, cu ajutorul foarfecelor, a fost înlăturat învelişul pilos,
pe un teritoriu de 2 x 2cm2.
Pentru aplicare a fost folosită suspensia din pulbere a 4 produse. De fiecare dată, în regiunea
pregătită au fost aplicate câte 5-10 picături de suspensii studiate. Schimbări ulterioare în cantitatea şi
regimul de dozare nu s-au efectuat. Pe parcursul experimentului, animalele au fost supuse
observărilor zilnice, cu determinarea masei corporale în dinamică. La sfârşitul studiului s-a efectuat
eutanasierea şobolanilor cu scopul studiului macroscopic al organelor interne şi realizarea ulterioară a
micropreparatelor pentru examinarea microscopica a pielii din regiunea aplicării substanţelor studiate.
Fragmentele de piele au fost fixate în soluţie de formalină timp de 48 de ore, apoi prelucrate după
metoda obişnuită cu hematoxilina-eozina. Secţiunile obţinute au fost studiate cu ajutorul microscopului
obişnuit (oc. 10x40).
Rezultatele obţinute:
Observările efectuate asupra comportamentului animalelor nu au determinat modificări
comparativ cu lotul martor. Alimentele şi apa au fost utilizate în aceeaşi cantitate. Pe parcursul
experimentului animalele au adăugat în masa corporală aproximativ 20g.
Examenul macroscopic al organelor interne nu a evidenţiat dereglări morfologice ţesuturilor
studiate:
- ficatul de dimensiuni normale, cu masa de 14g, suprafaţa netedă, semitransparentă. Pe
secţiune desenul păstrat, de culoare brună, fără modificări vizibile.
- plămânii de dimensiuni obişnuite, la palpare de consistenţă moale. Pe secţiune desenul
păstrat de culoare fină-roză. La comprimare de pe suprafaţă se scurge lichid sangvinolent.
- rinichii, cu o structură compactă sub forma de bob, de culoare cafenie - roşie, de
dimensiuni 17 x 10 x 9mm, sunt acoperiţi cu o capsulă densă de ţesut conjunctiv. Pe secţiune se
determină limita dintre stratul cortical, de culoare mai deschisă, situat la suprafaţă si stratul medular, mai
întunecat, situat interior. În ambii rinichi se determină câte o papilă renală. Mucoasa bazinelor este de
culoare pal-roză, se decapsulează usor.
Examenul regiunii de aplicare a preparatelor: pielea este acoperită cu înveliş pilos de culoare
obişnuită intactă, fără modificări externe vizibile.
Studiul microscopic al pielii din regiunea interscapulară detremină trei straturi : epidermal, dermul
şi stratul lipidic subcutan.
Epidermul prezintă un strat îngust. Se determină stratul cornos şi stratul malpigian cu celule
cilindrice. Dermul prezintă un strat bogat în ţesut conjunctiv bine vascularizat. Stratul subcutanat este
alcătuit din ţesut conjunctiv lax.
Modificări de structură nu s-au depistat.
Concluzie:
Produsele biologic active Nr-1 (Hl-1), Nr-2 (Hl-2), Nr-3 (IM-2) şi Nr-4 (IMspp) studiate, nu
provoacă dereglări în structura organelor. Examenul macroscopic al organelor interne nu a determinat
modificări structurale vizibile sau proliferări şi conglomerate atipice în ţesuturile organelor.
Microscopia determină păstrarea structurală a tuturor straturilor pielii.
272
STUDIUL ACŢIUNII EMBRIOTOXICE ŞI TERATOGENE A PBA
Material şi metodă
Cercetările pentru determinarea activităţii embriotoxice a PBA Nr-1, Nr-2, Nr-3 şi Nr-4 au fost
efectuate în conformitate cu indicaţiile metodice despre stadiul proprietăţilor embriotoxice a
substanţelor farmacologice şi acţiunea lor asupra funcţiei reproductive, descrise de către Comitetul
Farmacologic din Rusia (Moscova, 1986) sub conducerea profesorului A.P. Diban.
La toate grupele de şobolani, cu excepţia celui martor, a fost administrată suspensia în volum de 2 ml
din pulbere a substanţelor Nr-1-4, iar la cel martor soluţie NaCl de 0,9%. Pe parcursul exeprimentului,
animalele de laborator au fost supuse observaţiilor zilnice. Au fost efectuate observări asupra
comportamentului animalelor, folosirii alimentelor şi apei, stării tegumentelor, mucoasei şi învelişului
pilos. Regulat, o dată la 5 zile, femelele au fost supuse controlului masei corporale.
Rezultatele cercetărilor s-au apreciat după eutanasierea (prin dislocarea vertebrelor cervicale) şi
necropsia animalelor. Necropsia s-a efectuat la a 20 zi de graviditate. Iniţial a fost studiat indicele
mortalităţii preimplantaţionale ce determină diferenţa dintre numărul de locuri implantate şi numărul
de embrioni vii. La toţi nou-născuţii a fost determinată masa corporală şi dimensiunea craniocaudală.
Acţiunea teratogenă, iniţial a fost determinată prin depistarea embrionilor cu anomalii vizibile la
examinarea externă, mai apoi s-a efectuat studiul organelor interne ale embrionilor.
Rezultatele obţinute:
Nu s-au determinat devieri vizibile de comportament la femelele incluse în experiment, pe
parcursul perioadei de gestaţie, comparativ cu lotul martor.
După administrarea PBA, şobolanii deveneau putin agitaţi timp de 2-3 minute, cu restabilirea
ulterioară a comportamentului, consumul apei şi alimentelor a fost normal, la fel ca şi în lotul martor.
Examinarea externă a tegumentelor, mucoaselor şi învelişului pilos, nu a permis determinarea
schimbărilor patologice. Masa corporală a şobolanilor din toate loturile s-a mărit în medie cu 30 g.
273
La a 20 zi s-a efectuat necropsia femelelor şi studiul indicelui preimplantaţional,
postimplantaţional şi acţiunii teratogene (tab.2).
Tabelul 2.
Indicii Datele obţinute
Numărul de animale gestante studiate 70
Numărul de corpi galbeni(total/o femela) 234/3,9
Numărul de locuri implantate 234/3,9
Numărul de nou-născuţi vii (de la 20 femele) 234
Indicele preimplantaţional 0
Indicele postimplantaţional 0
Examinarea externă a nou-născuţilor a fost efectuată în laborator, cu iluminare de zi şi cu
ajutorul lentilelor macroscopice (tab.3).
Tabelul 3
Examinarea externă
Studiul a fost efectuat pe şobolani albinoşi, maturizaţi, linia Vistar. În experiment au fost incluse
50 de femele gestante, repartizate în cinci loturi. Pe parcursul studiului, animalele au fost întreţinute în
conditii optime de viaţă.
PBA studiate au fost administrate primelor 4 loturi de femele, a câte 10 şobolani, fiecare o dată pe zi, la
aceeaşi oră, din prima zi de gestaţie până la sfârşitul ei. PBA au fost administrate pe cale orală prin
intermediul unei sonde sub formă de suspensie. Şobolanilor din lotul cinci-martor (10 femele) pe
parcursul perioadei de gestaţie a fost administrată soluţia fiziologică NaCl în aceeaşi cantitate cu
substanţele studiate. În timpul administrării PBA au fost înregistrate comportamentul animalelor, masa
corporală în dinamică, durata perioadei de gestaţie, numărul de nou-născuţi.
Dezvoltarea postnatală a nou-născuţilor a fost studiată după 24 de ore de la naştere până la vârsta de 2
luni. Criteriile de studiu la această etapă au servit pentru aprecierea dezvoltării fizice a urmaşilor, s-au
efectuat observări asupra masei corporale în dinamică, erupţia dinţilor, apariţia învelişului pilos,
deschiderea ochilor, capacitatea de a se alimenta individual la a 25 zi de la naştere. S-au efectuat studii
asupra comportamentului şi coordonarii mişcărilor nou-născuţilor.
Examenul ulterior al urmaşilor a fost efectuat pe parcursul a 60 de zile. Observărilor au fost supuse câte
2 femele cu 5 nou-născuţi din patru grupe, în total 50 de şobolani. Pe parcursul acestei perioade toţi
şobolanii au rămas vii. Timpul apariţiei dinţilor şi a învelişului pilos la şobolanii studiaţi, corespunde cu
datele din lotul martor, deschiderea ochilor a fost aproximativ la a 15 zi. Comportamentul şobolanilor
supuşi studiului în această perioadă nu se deosebea de comportamentul celor din lotul martor. Toţi
şobolanii au fost opriţi de la alimentaţia naturală la a 26 zi de viaţă. Adaptarea la alimentele artificiale a
fost în primele ore. Datele obţinute sunt redate în tabelul 4.
274
Tabelul 4.
Indicii studiaţi Timpul apariţiei
Erupţia dinţilor 8 zi
Apariţia învelişului pilos 11 zi
Deschiderea ochilor 15 zi
Datele obţinute în urma studiului asupra masei corporale în dinamică sunt descrise în tabelul
5.
Tabelul 5.
Zilele de viaţă ale Numărul şobolanilor Masa corporală medie
şobolanilor studiaţi (g)
13 15 1,2
30 15 50,1
60 15 132,2
Concluzie:
PBA Nr. 1-4 în prima etapă (dezvoltarea antenatală a embrionilor) a studiului efectuat, nu provoacă
schimbări în comportamentul femelelor gestante pe tot parcursul perioadei. Studiul efectuat după
eutanasierea femelelor gestante nu determină dereglări în dezvoltarea intrauterină a embrionilor.
Numărul de urmaşi născuţi la femelele primare, este în medie de 3-4 indivizi, ceea ce corespunde cu
numărul de urmaşi născuţi de femelele din vivariu. Indicii studiaţi în perioada dezvoltării postnatale a
urmaşilor nu determină devieri de la lotul martor. Erupţia dinţilor, apariţia învelişului pilos, deschiderea
ochilor corespunde vârstei şobolanilor. Indicii masei corporale în dinamică determină o dezvoltare
normală a şobolanilor.
Pentru experiment s-au luat câte 5 mg şi 10 mg din substanţele menţionate. În prealabil a fost
cercetată solubilitatea acestor substanţe în dimetilformamidă, dimetilsulfoxidă, etanol (95º) şi în apă
sterilă distilată. Toate aceste 4 substanţe nu au fost solubile în nici un solvent utilizat. În comparaţie cu
solubilitatea în DMFA, DMSO şi etanol, toate substanţele au manifestat o solubilitate mai bună în apă
distilată caldă.
La proba substanţelor s-au adăugat câte 5 ml de apă. Concomitent, s-a efectuat experimentul de
control asupra studierii activităţii antibacteriene a furacilinei. S-au luat câte 5 mg şi 10 mg furacilină la
275
fiecare cultură de bacterii studiată. La furacilină s-a adaugat câte 5 ml apă distilată sterilă fierbinte (
90º).
S-au luat culturi bacteriene de 18 ore: Staphylococcus aureus (tulpina 209), Streptococcus faecalis,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli (tulpina 0+111), Proteus vulgaris.
Diluţia culturilor bacteriene de pe geloza peptonată din carne s-a introdus cu soluţie fiziologică, se
aduce la standardul bacterian de opacitate (10) până la conţinutul de 1 mld corpi microbieni într-un 1 ml
soluție fiziologică.
Culturile de microorganisme în volumul de 0,1 ml, se aplică pe suprafaţa gelozei peptonate din
carne în cutiile Petri, se împarte uniform pe toată suprafaţa gelozei cu ajutorul spatulei de sticlă.
Pe geloza cu culturile de bacterii semănate cu ajutorul sondelor din sticlă se efectuează loje
pentru fiecare substanţă şi pentru furacilină. În fiecare lojă se introduc câte 0,05 ml soluţiilor
substanţelor şi furacilina.
În aşa fel, în 0,05 ml I soluţii de furacilină (5 mg + 5 ml apă) există 50 mcg furacilină, dar în 0,05 ml II
soluţii (10 mg + 5 ml apă) există 100 mcg furacilină.
Însămânţările au fost incubate la t 37ºC timp de o diurnă. Peste 24 ore se remarcă prezenţa sau lipsa
zonelor de reţinere a creşterii bacteriilor în jurul lojelor.
Rezultatele experimentului au arătat că substanţele IMspp, IM2, Hl1, Hl2 nu au manifestat activitate
antibacteriană faţă de toate testele-culturile bacteriene cercetate. În jurul lojelor cu substanţe s-au
observat zone de stopare a creşterii bacteriilor, pe când în jurul lojei cu furacilină s-au observat zone
de stopare a creşterii bacteriilor în 2 doze (50mcg şi 100 mcg) către S. Aureus (t. 209), Str. Faecalis, E.
Coli (t. 0-111) şi în doza de 100 mcg către Pr. Vulgaris. Rezistenţa către furacilină a manifestat bacilul
piocianic (Ps. Aeruginosa), zone de creştere totală a bacteriilor s-au observat în ambele doze (50 mcg şi
100 mcg). Proteus (Pr. Vulgaris) s-a dovedit a fi rezistent la furacilină numai în doza de 50 mcg, în doza
de 100 mcg în jurul lojei s-a observat zona de oprire a creşterii bacteriilor.
Activitatea fungistatică şi fungicidă a substanţelor IMspp, IM2, Hl1, Hl2 a fost cercetată faţă de
fungii: Candida albicans, Aspergillus Niger, Aspergillus fumigatus, Penicillium.
Substanţele au fost dizolvate iniţial în apă distilată sterilă, caldă cu concentraţia de 10 mg/ml, iar
diluţiile ulterioare au fost efectuate prin utilizarea metodei de diluţie în serie în mediu nutritiv lichid
(bulionul Saburo).
Inoculatele au fost pregătite din culturi de şapte zile de fungi. După amestecarea inoculatelor cu
diluţiile substanţelor, tuburile au fost expuse în termostat la t-28ºC, pe parcursul a 14 zile (C. Albicans
pe parcursul 48 ore).
Activitatea fungistatică a fost determinată după lipsa creşterii fungilor în mediul nutritiv lichid.
Activitatea fungicidă se determină după lipsa creşterii fungilor la o însămânţare repetată pe geloza
Saburo, cu incubare timp de 7 zile (C. Albicans timp de 48 ore). Rezultatele experimentale sunt expuse
în tabel.
276
Tabel. Activitatea antifungică a substanţelor
Hl1 - N1 (entoheptin)
IM2 - N3 (imupurin)
Hl2 - N2 (imuheptin)
IMspp - N4 (adenoprosin)
277
Pentru evaluarea posibilei acţiuni toxice a fracţiilor substanţelor examinate s-a efectuat diluţia lor
în mediul Eagle MEM (mediu de cultivare a culturilor celulare) în limitele 1/5-1/80, testând apoi
substanţele nominalizate în culturile de celule RD şi HEp-2. Rezultatul evidenţierii posibilului efect
toxic asupra monostratului culturilor de celule este expus în tabelul 1.
Pentru testarea acţiunii antivirale a tuturor fracţiilor s-au efectuat diluţiile de lucru care n-au
demonstrat efect citopatic (0).
Acţiunea antivirală a produselor menţionate a fost determinată utilizând în calitate de tulpini virale
de referinţă virusul poliomielitic vaccinal (P) tip 1 (LSc2ab), tip 2 (P712 ch2ab), tip 3 (Leon 12ab) şi
virusul stomatitei veziculare (SV) - reprezentanţi ai virusurilor cu ARN şi virusul Herpes simplex tip 1
(H), care reprezintă virsurile cu ADN. Testarea cu utilizarea virusurilor vaccinale poliomielitice s-a
efectuat în cultura de celule RD, iar cu virusul stomatitei veziculare şi cel herpetic - în cultura de celule
HEp-2. În scopul excluderii efectelor nespecifice, testarea s-a efectuat prin diferite procedee metodice:
Contactul virusului cu substanţă (perioada de incubare - 2h la temperatura de 37 grade), apoi
suplimentarea suspensiei de celule cu incubarea plăcii de polisterol la 37 grade şi evaluarea zilnică a
rezultatelor.
Contactul virus+substanţă (perioada de incubare -2h la temperatura de 37 grade) cu inocularea acestui
amestec în monostratul celulelor deja format, urmat de microscopia zilnică a celulelor examinate.
Cultivarea celulelor în prezenţa substanţelor testate cu suplimentarea virusului în diluţii zecimale.
Testarea acţiunii antivirale a fracţiilor substanţelor enumerate în prezenţa virusurilor nominalizate a
demonstrat rezultate identice în cele 3 variante utilizate. Rezultatele studierii sunt expuse în tabele.
Fracţiile nr.1 şi nr. 2 ale substanţei Hl1 în diluţii 1/10, iar nr. 3 şi 4 în diluţii 1/80, n-au manifestat
activitate toxică asupra monostratelor de celule RD şi HEp-2 intacte.
Pentru substanţa Hl2, primele 3 fracţii n-au demonstrat efect toxic în diluţiile 1/10, iar a patra fracţie-în
diluţia 1/20.
Prima fracţie a substanţei IM2, începând cu diluţia iniţială 1/5 şi fracţiile nr.2 şi 3 ale substanţei
nominalizate, începând cu diluţiile 1/20, n-au manifestat acţiune toxică. A patra fracţie a substanţei IM2
a fost lipsită de efect toxic numai începând cu diluţia 1/80.
Pentru prima fracţie a substanţei Imspp, începând cu diluţia 1/10, efectul toxic a fost absent, fracţiile
nr.2 şi 3 ale substanţei menţionate, n-au demonstrat acţiune toxică începând cu diluţia 1/40. Ultima
fracţie-nr.4-a substanţei Imspp, n-a manifestat efect toxic, începând cu diluţia 1/20.
Concluzie: La compartimentul acţiune antivirală, probele de substanţe examinate în diluţiile
menţionate n-au demonstrat efect antiviral. Concomitent este necesar de menţionat că substanţele
nominalizate în diluţiile respective n-au fost inactivate şi nici tratate cu preparate antibacteriene, dar pe
tot parcursul investigării au fost libere de contaminare bacteriană sau cu levuri. Aceste circumstanţe
demonstrează posibila acţiune antibacteriană care necesită investigaţii speciale de rigoare într-un
laborator bacteriologic de referinţă.
278
Tabelul 1.Evidenţierea şi evaluarea acţiunii toxice a substanţelor HL1, HL2, IM2 şi
IMSPP
Denum.subst. Fracţiile 1/5 1/10 1/20 1/30 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80
1 4+ 0 0 0 0 0 0 0 0
H.L.1
2 4+ 0 0 0 0 0 0 0 0
3 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 0
4 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 0
1 2+ 0 0 0 0 0 0 0 0
H.L.2
2 4+ 0 0 0 0 0 0 0 0
3 2+ 0 0 0 0 0 0 0 0
4 4+ 4+ 0 0 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
J.M.2
2 4+ 4+ 0 0 0 0 0 0 0
3 4+ 4+ 0 0 0 0 0 0 0
4 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 0
1 4+ 0 0 0 0 0 0 0 0
J.M.Spp. 2 4+ 4+ 4+ 4+ 0 0 0 0 0
3 4+ 4+ 4+ 4+ 0 0 0 0 0
4 4+ 4+ 0 0 0 0 0 0 0
Control celule 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Remarcă : (4+) – acţiune toxică evident
(3+) – acţiune toxică
(2+) – acţiune toxică nesemnificativă.
279
Aşadar, etapele iniţiale (precoce) de dezvoltare în prostată a acestor două procese patologice necesită
concentrarea acţiunii curative la înlăturarea componentei inflamatoare, hipoxiei tisulare şi circulatorii a
colului vezicii urinare.
În general, se evidenţiază următoarele cauze de apariţie a prostatitei în adenomul de prostată:
1. - dereglarea sistemului de drenare a acinurilor;
2. - compresia ţesutului prostatic, colul vezicii urinare şi a ducturilor veziculelor seminale;
3.- dereglări în sistemul sanguin şi staza venoasă cu apariţia edemului pronunţat la nivelul bazinului;
4.- prezenţa hipoxiei cronice a parenchimului;
5.- micşorarea concentraţiei ionilor liberi de zinc;
6.- micşorarea imunoglobulinelor şi activităţii celulelor şirului monocitar-macrofagic.
Schema consecutivităţii de dezvoltare a proceselor inflamatorii în prostatita cronică la pacienţii cu
HBP poate fi următoarea:
- dereglarea microcirculaţiei,
- invazia microorganismelor,
- micşorarea nivelului de ATP,
- cumularea NO, oxigenului reactiv şi acidului uric,
- dereglarea structurilor celulare,
- răspunsul neprioritar al imunităţii,
- inflamaţia cronică.
Medicamentele elaborate în ultimii ani pentru tratamentul conservativ al HBP, care permite obţinerea
ameliorarii micţiei, iar multor pacienţi, în special cu afecţiuni asociate (recurente), de a evita tratamentul
chirurgical, sunt destul de puţine şi acestea în special de origine vegetală.
Se propune un produs biologic nou activ - ,, ADENOMO-LIZ’’ de origine entomologică,
adică obţinut din anumite ţesuturi a anumitor etape de dezvoltare (larve) ale insectelor, în cazul dat,
specia Lepidoptera. Particularitatea preparatului constă în aceea că produce o anumită inhibiţie a creşterii
nodului adenomatos, probabil datorită unor proprietăţi antiadrogene, el exercită acţiune antiinflamatoare
prin inhibiţia 5-lipooxigenazei, imunomodulatoare şi antioxidative, provocând o sclerozare a ţesutului
glandelor adenomului.
Este cunoscut, că rolul hotărâtor în evoluţia stărilor inflamatoare, distrofice şi degenerative, în
special în ischemia organului, care este pronunţată în HBP, aparţine activării proceselor de oxidare
peroxidă a lipidelor (OPL). Aceasta duce la consumul de bioantioxidanţi, ceea ce contribuie la reducerea
capacităţii de reglare a lipoperoxidării şi menţinerea alterării tisulare.
A prezentat interes de a studia starea OPL, activitatea antioxidativă, statusul imunităţii locale la
cei 44 pacienţi cu HBP, prostatita cronică şi asocierile lor până şi după tratamentul lor cu ,, ADENOMO-
LIZ’’, efectuat în România.
Pacienţii supravegheaţi posedau simptomocomplexul dizuric care se manifestă prin micţiuni
mai frecvente, adică o polachiurie nocturnă până la 5-6 ore pe noapte, micţiuni anevoioase, senzaţie de
eliberare incompletă a vezicii urinare sau chemări imperative (false) la micţie.
La toţi pacienţii, în medie după 6-7 săptămâni de la iniţierea tratamentului, s-a constatat
ameliorarea parametrilor urodinamici. Frecvenţa micţiei s-a normalizat la 36,3% din pacienţi, senzaţiile
imperative au încetat să deranjeze la 39,6 % pacienţi, senzaţia de golire incompletă a vezicii urinare a
dispărut la 52,6 % pacienţi. Polachiuria nocturnă s-a redus la 36% pacienţi. Aşadar, s-a constatat o
dinamică vizibilă a ameliorării, care s-a manifestat prin reducerea simptomelor obstructive, cât şi a celor
iritative.
Produsul biologic activ ,, ADENOMO-LIZ’’ autorizat în calitate de supliment, s-a
administrat în supozitoare rectale a câte 0,25g (250 mg) de substanţă, de 2 ori pe zi.
Modificări statistic veridice ale statusului oxidativ şi imun, după administrarea produsului, au fost
înregistrate după 8-12 săptămâni de administrare.
Este de menţionat, că toţi cei 44 de pacienţi nu au suspendat administrarea preparatului mai
devreme de 12 săptămâni, totodată, 32 de pacienţi au constatat un efect bun al tratamentului, iar 5
280
satisfăcător. Ca rezultat al tratamentului cu durata de 3 luni, parametrii IPSS s-au micşorat de la 18,42
puncte până la 8,96. Unul din parametrii de bază al eficacităţii tratamentului a fost aprecierea calităţii
vieţii (starea subiectivă generală, dispoziţia, activitatea vitală, satisfacţia în timpul şi după micţie,
activitatea sexuală);
- lipsa eficacităţii - 5,4% pacienţi;
- eficacitatea joasă-33,4%;
- suficientă-48,1%;
- înaltă-14,8%.
Indexul calităţii vieţii a crescut de la 4,4 până la 5,77,
- viteza maximă a jetului urinar s-a majorat de la 8,2 până la 12,4 ml/s,
- volumul urinei reziduale s-a redus de la 165 până la 95 ml.
La screeningul ultrasonor, la 39 de pacienţi s-a determinat micşorarea dimensiunilor prostatei în medie cu
8-10%, ce ar putea fi explicat prin micşorarea edemului prostatic.
La cercetarea stării oxidative, micşorarea activităţii de OPL s-a determinat de la săptămâna a
4-5 de administrare a preparatului, semnificaţia maximă s-a atins către săptămâna 7. În secretul prostatic,
la pacienţii cu HPB în asociere cu prostatita cronică, s-a semnalat micşorarea intensităţii proceselor de
OPI în faza heptanică. E232/220 de la 1,58±0,04 până la 0,94±0,02, în faza izopropanolică E232/220 de la
0,82±0,06 până la 0,48±0,05. Totodata, activitatea antioxidativă în serul sanguin a crescut de la 36,2±1,62
până la 43,31±1,21% în secretul prostatei - de la 40,5±3,72 până la 85,18±2,17%.
Într-o măsură mai mică şi în termenii mai tardivi s-a modificat şi statusul imun local. Aşa, concentraţia
IgG s-a micşorat de la 22,1±2,4 până la 20,2±1,8 mg/ml, IgG s-a majorat de la 0,71±0,12 până la
0,91±0,1 mcg/ml, IgA – de la 7,4±1,4 până la 10,2±1,4 mg/ml. Aceste rezultate vorbesc despre păstrarea
supresiei sistemului imun local la pacienţii cu HBP în asociere cu prostatita cronică. Mai puţin
semnificative, modificările pozitive s-au observat la pacienţii cu manifestări clinice ale HBP mai
pronunţate. La pacienţii cu manifestările clinice ale prostatitei cronice şi cu mărirea nepronunţată a
prostatei, parametrii statusului imun local, pe fundal de tratare cu ADENOMO-LIZ, au fost cei mai
apropiaţi de normal. Îndeosebi, aceste modificări au fost vădite la cercetarea C3 şi C4 componenţilor
complementului. Astfel, conţinutul componentului C3 s-a micşorat de la 42,4±6,01 până la 30,8±6,0 mg/l,
a componentului C4 de la 19,7±2,1 până la 12,3±2,4 mg/l.
Astfel, în baza rezultatelor obţinute au fost determinate următoarele acţiuni ale preparatului:
antiexsudativă, antiproliferativă, antiinflamatoare, analgezică, influenţa componentului mecanic,
ameliorarea microcirculaţiei în organele sistemului urogenital, intensificarea circulaţiei sanguine,
înlăturarea hipoxiei.
Acţiunea antiinflamatoare şi imunomodulatoare a ADENOMO-LIZ- ului este mai pronunţată
în HBP cu predominarea simptomelor prostatei cronice. Aceste rezultate au şi contribuit la efectuarea mai
detaliată a inofensivităţii produsului biologic activ entomologic-adenoprosin, pentru autorizarea
evaluărilor clinice respective.
281
plantelor şi animalelor. Astfel, în baza biotehnologiilor avansate au fost obţinute diverse antibiotice
biosintetice şi semisintetice, insulina, preparate hormonale, enzimatice, etc.
În prezent, 50% din arsenalul de medicamente utilizate în practica medicală mondială, sunt
obţinute pe baza plantelor, microorganismelor, animalelor şi practic lipsesc cele obţinute pe baza
insectelor. Cu medicamente din plante e puţin probabil să uimeşti pe cineva, dar insectele sunt o sursă
aproape neatinsă de obţinere a medicamentelor. Există aproximativ 250 mii de specii de plante, mai
mult de 3 mil. specii de insecte şi o diversitate imensă de microorganisme şi bacterii. Plantele şi
microorganismele de mult sunt folosite pentru elaborarea medicamentelor, dar insectele aproape că nu s-
au folosit.
Din marea diversitate a insectelor, omul a atras atenţia asupra câtorva specii: Albina
melifera, Bombyx mori, Drosofila mellifera şi în ultimul timp, Autografa californica, specii care sunt
utilizate în biotehnologia contemporană pentru recombinaţii, prin intermediul cărora pot fi obţinute
substanţe biologic active (SBA), cu proprietăți deosebite, de tipul vaccinurilor, interferonurilor,
insulinelor, interleuchinelor ş.a.m.d.
Este de menţionat cu regret, că până în prezent, există prea puţine lucrări ce ar putea fi
dedicate extragerii unor PBA din organismele insectelor. În procesul de morfogeneză, insectele nu-şi
schimbă numai forma, ci şi conţinutul lor în substanţe se schimbă complet. În stadiul de larvă, insectele se
hrănesc intensiv, acumulând lipide, în stadiul de pupă, când nu se hrănesc, lipidele se transformă, iar în
stadiul de adult predomină keratinele. Toate transformările însă sunt dirijate de un complex de enzime,
încă nestudiate.
Conform savanţilor francezi, este o neglijenţă (omitere) regretabilă, deoarece peste 3 mil. de
specii de insecte cunoscute ştiinţei pe parcursul a 500 mil. de ani ai istoriei sale, au creat unul din cele mai
complicate sisteme imune, capabil de a lupta cu bacteriile, virusurile şi alţi patogeni.
Unul din primele medicamente elaborate de firma (compania) Endomed SA (Strasbourg) este
ETD151, extras din larvele fluturelui austral (America de Sud) şi este potenţial fungicid. Acutalmente, în
Australia activează compania Endocosm, pentru efectuarea cercetărilor şi punerea pe piaţa farmaceutică a
medicamentelor obţinute din insecte.
Fluturii, termitele, libelulele (calul dracului), furnicile, miriapodele şi melcii sunt printre
organismele care sunt studiate de savanţi pentru a fi utilizate în medicină.
Scopul principal în aceste operaţiuni este de a obţine noi antibiotice sau chiar a
medicamentelor mai perfecţionate şi efective în multe maladii, inclusiv oncologice. O companie
biotehnologică franceză în colaborare cu savanţii chinezi, au început elaborarea medicamentelor din
larvele fluturilor. Cercetătorii americani de asemenea sunt preocupaţi de elaborarea preparatelor din
fluturi şi omizi. Aşadar, actualmente a luat amploare şi poate fi considerată ca o nouă direcţie (ramură) în
obţinerea preparatelor parafarmaceutice şi farmaceutice, entomologia tehnică, care până nu demult a
cunoscut o slabă dezvoltare. Această nouă direcţie de obţinere a produselor cosmetice, suplimente
alimentare, farmaceutice a început a fi aplicată în mai multe ţări occidentale şi orientale. Sensul acestei
direcţii noi pentru biotehnologia contemporană este utilizarea ţesuturilor insectelor pentru obţinerea
substanţelor biologic active.
La ora actuală, în domeniul entomologiei tehnice este prioritară direcţia de tehnologii avansate
care utilizează intens recombinaţiile baculovirusurilor, specifici numai insectelor, care au dat posibilitatea
obţinerii unor noi preparate de tipul interferonilor, vaccinurilor, insulinei, interleucinei etc.
În ultimul timp, s-a constatat că lipoproteinele care se depistează în ţesuturile unor stadii de
dezvoltare ale insectelor, induc imunitatea organismului uman.
Cercetări în domeniul ingineriei genetice cu realizarea ideii utilizării unor extracte din insecte pentru a
trata mai multe maladii ale omului, posibil a unei direcţii absolut noi în domeniul industriei faramaceutice
şi în premieră mondială, realizează Centrul Ştiintific Aplicativ ,,InsectFarm’’ (România,
Bucureşti). Acest centru are la ora actuală înregistrate 22 preparate propuse ca suplimente
nutritive şi cosmetologice, utilizate în tratarea hepatitelor, deficitului imun, micozelor, cheratozelor
etc.
282
Aceste suplimente sunt brevetate, înregistrate şi autorizate pentru producerea în România,
utilizate în maladii şi stări patologice, conform indicaţiilor respective. Proprietăţile curative ale
complexului lipo-proteic a acestui gen de produse biologic active entomologice au fost puse în evidenţă
pentru prima dată prin brevetul Nr. 10058, depus sub Nr. 200000581 în data de 06.06.2000. În
complexul lipo-proteic au fost depistate proteine imunomodulatoare care au şi efect antiviral pentru
virusurile hepatitei (Patent N165936/22.03.1001) şi antiherpetic (Patent N 2000-00580/118115).
Studiului preclinic i-au fost supuse 4 extracte (produse biologic active), obţinute de către
Centrul Ştiinţific Aplicativ ,,Insect Farm’’ S.A (România) din ţesuturile de insecte Lepidoptere, la diverse
stadii de dezvoltare.
Preparatele respective s-au obţinut conform unor tehnologii originale brevetate, care includ următoarele
etape:
1. Creşterea specială a insectelor în laboratoarele entomologice pe medii artificiale;
2. Extragerea PBA din ţesuturile diferitelor stadii (ouă, larvă, pupă, etc) de dezvoltare a
insectelor;
3. Eliminarea apei din PBA până la 5-6 % umiditate prin atomizare;
Extractul N1 – produs biologic activ, (entoheptin), obţinut din ouă de insecte Lepidoptere, specia
Lymantria.
Extractul N2 – produs biologic active, (imuheptin) obţinut din ouă şi pupe de Lepidoptere.
Extractul N3 – produs biologic activ, (imupurin) obţinut din pupe de Lepidoptere.
Extractul N4 – produs biologic active, (adenoprosin) obţinut din larvele insectelor Lepidoptere.
Obţinerea fracţiilor. Larvele, pupele şi ouăle acestor insecte au fost mărunţite cu un mojar de tipul PV-
50, la o viteză de 5000 rot/min, timp de 15 minute, până la formarea unei paste de culoare gri deschis.
Maceratul s-a filtrat printr-o pânză de evelină cu 200 de orificii/1cm2. Suspensia s-a filtrat în gradient de
zahăr, cu densitatea de 20-40-60-80/ 12.000 rot/min (viteza), timp de 30 minute, iar fracţiile obţinute s-au
separat şi s-au analizat separat . Analizele spectrale s-au efectuat după dizolvarea PBA în apă, în acetone,
în benzen şi în eter. Componenţa chimică a acestor produse a fost studiată atât pentru extractul natural, cât
şi a diverselor fracţiuni obţinute din el.
Insectele au ciclu de morfogeneză specific şi foarte complicat care include 4 etape de
dezvoltare şi anume: ou, larvă, pupă şi adult (imago).
La fiecare etapă de dezvoltare a insectei, se schimbă nu numai forma, dar şi compoziţia chimică. La
anumite faze de dezvoltare, o insectă, după extragerea apei, conţine până la 78% proteine, 12% lipide şi
2-3 % zahăr.
În ceea ce priveşte conţinutul biochimic în stadiul de ou predomină substanţele de natură
proteică, în stadiul de larvă predomină lipoproteinele, în stadiul de pupă predomină proteinele, iar în
stadiul de adult predomină keratinele.
Pentru extragerea complexului lipo-proteic este necesar să se cunoască stadiul de dezvoltare a insectei şi
ţesutului în care se acumulează acesta.
Amprentele spectrale ale extractelor de insecte în apă prezintă 2 peakuri, unul în zona
lungimilor de undă de 300 nm, cu o intensitate mai mare de 2 Abs şi unul în zona lungimilor de undă 280
nm, cu o intensitate de 0,3 Abs.
283
Dacă substanţele biologic active (SBA) se extrag în petrol, amprenta spectrală se modifică
total. În domeniul 150-250 nm apar o mulţime de vibraţii cu diferite intensităţi, iar în zona de 250-300 nm
apare un peak care ajunge la 0,4 Abs, apoi curba scade brusc.
SBA extrase în mediul acid (HCl 10%) prezintă o amprentă spectrală cu un peak de
intensitate de 4 Abs în zona lungimilor de undă de 200-250 nm şi un peak mai mic în zona lungimilor de
undă 280-300 nm.
Acelaşi complex lipo-proteic extras în alcool produce un alt tip de amprentă, peakul cu
intensitatea cea mai mare apare în zona de 250 nm, cu o variaţie puternică, ceea ce indică prezenţa unui
complex de SBA .
Miriapodele şi melcii sunt printre organismele care sunt studiate de savanţi pentru a fi utilizate în
medicină.
Cea mai mare variaţie a curbei apare după dizolvarea în acetonă.
În mediul alcalin, amprenta spectrală obţinută din extractul din ţesuturile chitinoase
demonstrează prezenţa SBA localizate în zona lungimilor de undă de 200-250 nm, cu un peak mai mic în
zona de 280 nm, fără variaţii.
Extractul lipoproteic al larvelor în benzen provoacă apariţia unei amprente spectrale cu trei
peak-uri, în zona lungimilor de undă de 200 nm, de 300 nm şi de 500 nm. Complexitatea cea mai mare se
evidenţiază în zona lungimilor de undă cuprinse între 200-300 nm. Extractul din ouă în mediu apos-acid
provoacă amprenta spectrală cu pic-uri în zona lungimilor de undă cuprinse între 150-220 nm.
S-au efectuat analize cantitative a SBA extrase din diferite etape de dezvoltare ale insectelor (ou,
larvă, pupă şi imago sau fluture).
Analizele au fost efectuate după aceleaşi principii, pentru a fi posibilă o comparaţie a rezultatelor obţinute
(tab.1). În tabelul 1 sunt prezentate rezultatele cantitative ale conţinutului de proteine, lipide şi zahăr în
conţinutul ouălor, larvelor, pupelor, imago (adulţi), reprezentanţi ai Lepidopterelor, Dipterelor şi
Coliopterelor, un reprezentant al mamiferelor (ouă de prepeliţă) şi unul din lumea vegetală (Aloe vera).
Cele două din urmă sunt intens folosite în medicină.
Tab. 1. Analize cantitative a SBA extrase din diferite stadii de dezvoltare al Lepidopterelor
(L), Coliopterelor (C) si Dipterelor (D).
SBA extrase Subst. uscată Proteine g/100g Lipide g/100g Zahar g/100g
din insecte
Ou L 91.27 66,26 16.91 2,380
Larva L 90,27 73,17 11,78 0,556
Pupa L 93,19 66,36 23,50 8,870
Imago L 91,48 55,93 9,02 -
Subst. 88,28 66,84 - 2,200
protectoare
Larva C 96,58 48,48 20,39 4,60
Imago C 90,36 65,20 6,57 4,200
Larva D 94,10 53,21 22,22 4,280
Imago D 95,00 44,67 38,62 2,060
Ou de prepeliţă 96,92 43,14 29,50 2,060
Aloe 94,89 12,45 8,40 5,400
O cantitate semnificativă de proteine se găseşte în larvele de Lepidoptere, unde sunt incluse până la
73,17g/100g în pupe şi în ou este inclusă aproximativ aceeaşi cantitate. În componenţa fluturelui, proteina
este mult mai puţină, în substanţa protectoare (materialul care înglobează ouăle depuse de fluturi) proteine
sunt destul de multe, însă lipsesc complet lipidele.
284
Compoziţia frunzelor de aloe diferă de cea a insectelor atât în conţinutul de proteine cât şi după cel de
lipide.
Conform datelor obţinute, în procesul de dezvoltare, conţinutul de proteine şi de lipide din
insecte se schimbă şi se transformă atât cantitativ cât şi calitativ, primul loc fiind ocupat de proteine (în
toate stadiile), iar cel de-al doilea, de lipide.
Rezultatele testării celor 4 extracte (produse biologic active) au demonstrat următoarea componenţă
chimică:
Deci, produsele respective includ întregul set de aminoacizi esenţiali şi mulţi semiesenţiali, adică a
celor ce se sintetizează în organism (acid asparagic, serina, acid glutamic, prolina, cisteina, glicina,
alanina, tirozina) şi a celor care nu se sintetizează în organism (treonina, valina, metionina, izoleucina,
leucina, fenilalanina, histidina, lizina, arginina, triptofan) în total 19 aminoacizi.
Aminoacizii, fiind elemente structurale ale proteinelor şi a altor structuri endogene, au o
importanţă fiziologică mare. Unii aminoacizi se prezintă în calitate de substanţe neuromediatoare (acizii
glutamic, asparagic, glicina, taurina, acidul y-aminobutiric etc.). Fenilalanina şi tirozina sunt precursori
(predecesori) în biosinteza dopaminei, noradrenalinei, adrenalinei); triptofan-precursor al serotoninei;
histidina-predecesori al histaminei. Derivaţi ai aminoacizilor sunt encefalinele, endorfinele, dinorfinele şi
alte neuropeptide, precum şi factorii eliberatori (rilizing-factorii) ai hipotalamusului, hormonii hipofizei.
Unii aminoacizi (glutamic, y-aminobutiric, metionina, glicina ş.a.m.d.) sunt utilizaţi de sine stătător, în
calitate de substanţe medicamentoase. Creşte lista medicamentelor noi, sintetizate în baza rămăşiţelor
(radicalilor) aminoacizilor (dalargin-fenilalanin, arginina, captopril-prolina).
Analizele proteinelor la nivelul acizilor aminici au demonstrat predominarea următorilor
aminoacizi: acidul glutamic, fenilalanina, lizina, leucina, acidul asparagic şi arginina.
286
REZULTATE PROPRII
287
Cu ajutorul substanţelor biologic active (SBA) extrase din insecte se pot trata ulcerele varicoase
Am preparat un gel special pentru tratarea paradontozelor.
O influenţă pozitivă o au unele SBA extrase din insecte asupra creşterii părului. Pe baza
acestor SBA am elaborat un şampon, o loţiune şi un balsam special. Creşterea părului este mult mai
rapidă şi în timp de 30 de zile lungimea părului creşte cu 5 cm.
Loţiunea şi balsamul fac ca părul să devină mai articulat, culoarea devine strălucitoare şi se evidenţiază
volumul.
SBA extrase din insecte s-au utilizat în creme, cosmetice pentru eliminarea ridurilor şi a
diferitelor tipuri de pete din pielea omului Pot fi eliminate cheratozele, cheratitele şi candidozele
unghiale. Am construit preparate parafarmaceutice sub formă de geluri pentru tratarea sinuzitelor, otitelor,
bronşitelor.
O direcţie absolut nouă o reprezintă utilizarea SBA cu proprietăţi antitrompice şi
antiembolice care se utilizează pentru tratarea varicelor şi arteritelor. Astfel se poate efectua profilaxia a
sistemului sanguin. Circulația sângelui se îmbunătăţeşte, dispar necrozele în cazul arteritelor obliterante şi
se pot salva multe cazuri de amputare a picioarelor.
Ţesuturile insectelor, conform datelor noastre (Ciuhrii 2002, 2003, 2005), au demonstrat că
predomină următorii aminoacizi: acid glutamic, aspartic, leucina, lizina, arginina, fenilalanina.
În ouăle de insecte apare un aminoacid foarte rar întâlnit (tri-metilhistidina) acesta având un rol specific.
Astfel, compoziţia chimică a ţesuturilor insectelor, în timpul ontogenezei, se schimbă rapid (Ciuhrii
2005), de aceea unele date prezentate de către diferiţi autori, sunt valabile numai pentru o anumită fază de
dezvoltare a insectelor. În acest caz este necesar de menţionat la ce fază de dezvoltare a insectelor s-au
făcut analizele.
288
289
Datele noastre de analiză a proteinelor cu ajutorul metodelor spectrofotometrice şi
electroforetice, au demonstrat că proteinele din insecte se deosebesc de alte proteine ale altor
organisme prin faptul că predomină o cantitate mai mare de peptide cu greutăţi moleculare
foarte mici. Se presupune că aceste peptide posedă proprietăţi antivirale, antibacteriene,
antimicotice, antitumorale şi proprietăţi cheratolitice. Suntem convinşi că după apariţia
informaţiilor noastre, vor apărea lucrari absolut noi în utilizarea insectelor pentru producerea
preparatelor farmaceutice în farmacologia contemporană. Aşteptăm apariţia unei noi revoluţii
pe baza insectelor în industria farmaceutică ce va permite rezolvarea unor procese vitale ale
290
omului, mai ales stoparea infecţiilor virale care la ora actuală reduce durata existenţei fiinţei
umane.
291
DETERMINAREA INOFENSIVITĂŢII PBA ENTOMOLOGICE
292
BIBLIOGRAFIE
293
24. Ciuhrii, M. (2002) Substanţele biologic active extrase din insecte utilizate în producţia de
preparate cosmetice. Expoziţie şi Simpozion: Performanţe în chimia mileniului 3, Bucureşti,
România.
25. Ciuhrii, M. (2002) Utilizarea substanţelor biologic active extrase din insecte în cosmetologie
şi dermatologie. RSCC Magazine 2,3.
26. Ciuhrii, M. (2006) Entomoterapia - o nouă direcţie în medicina modernă. Al 2-lea Congres
de Medicină integrată.
27. Ciuhrii, M. (2003). Entomoterapia - o nouă direcţie în medicina alternativă. A 7-a Conferinţă
Internaţională de Terapii Complementare. (Ed. Anatecor) Arad, România.
28. Ciuhrii, M. (2004) Imunologie şi medicină complementară. A 8-a Conferinţă Internaţională
de Terapii Complementare. (Ed. Anatecor), Arad, România.
29. Ciuhrii, M. ( 2006) Operaţii biologice efectuate cu substanţe biologic active. Expoziţie şi al
10-lea Simpozion jubileu : Performanţe în chimia mileniului 3, Bucureşti, România.
30. Ciuhrii, M. Patent No 878/14.10.2005. Loţiune pentru îngrijirea părului.
A 34-a sesiune a Salonului Internaţional de Invenţii, Geneva, Elveţia.
31. Ciuhrii, M. Patent No 876/14.10.2005.Substanţa biologic activă pentru stimularea memoriei.
32. Ciuhrii,M. Patent No 707/25.08.2003.Preparat biologic pentru tratarea hemoroizilor,
adenomului de prostată şi fibromului uterin : proceduri şi modul de utilizare a substanţelor
biologic active.
33. Ciuhrii, M. (2002) Chirurgie efectuată cu substanţe biologic active extrase din insecte.
Expoziţie, Târgovişte România.
294
45). Proteinele si peptidele in transformarea cimpului (undelor) de torsiune in
fenomen functional.
Vidul fizic este destul de bogat din punct de vedere al numarului de elemente
care îl compun si dupa structura sa. Vidul fizic, ca si câmpul de torsiune primar,
contine niste structuri circulare turbionare care, de asemenea, nu transfera energie
si în care perturbatia se propaga momentan, adica cu o viteza egala cu infinit.
Printre proprietati ale vidului fizic trebuie sa fie continuta informatia ce determina
mecanismul de nastere din acesta a unor perechi virtuale de particule si
antiparticule concrete, nu la întâmplare. Aceste particule, nascute din vidul fizic,
formeaza urmatorul nivel al ierarhiei realitatii, care este plasma. Proprietatile unui
ansamblu de particule, cum ar fi electronul, protonul si neutronul, cât si
proprietatile vidului fizic cu care acestea intra în interactiune, determina aparitia
unor atomi concreti, si nu la întâmplare, care sunt formati din particulele indicate
mai sus. Acesti atomi, cât si moleculele formate din acestia, în diferite stari de faza,
compun urmatoarele trei niveluri ale realitatii - gaze, lichide si corpuri solide.
obiectul de studiu în cadrul directiilor standard ale fizicii. Doua niveluri superioare
au fost denumite de catre acesta drept fizica subiectiva. O serie de rezultate teoretice
si experimentale arata ca aceste doua niveluri, împreuna cu nivelul vidului fizic,
raspund nu numai pentru multe procese si fenomene fizice, dar, în acelasi timp,
joaca un rol primordial în constiinta omului. Este probabil faptul ca "Nimicul"
Absolut reprezinta nivelul legat de manifestarea globala a Spiritului ca factor
cosmic. Nivelul Spiritului trebuie sa aiba un început creator si unul volitiv. Este
iminenta existenta esentei creatoare a Spiritului si aceasta se defineste prin aceea ca
toata structura verticala si proprietatile tuturor nivelurilor orizontale trebuie sa fie
întâi "formulate" la nivelul "Nimicului" Absolut. Inevitabilitatea esentei volitive a
spiritului nivelului "Nimicului" Absolut se defineste prin aceea ca trebuie sa existe
un impuls care ar declansa mecanismul de creare a nivelurilor amintite ale
realitatii. În concluzie, reiese faptul ca teoria vidului fizic, ca si modelele fizice
construite, nu ne dau doar bazele de creare a unei fizici a constiintei, dar ne permit
sa ne apropiem de reprezentarile fizice ale rolului Spiritului.
În toate cazurile indicate mai sus este vorba de câmpuri de torsiune care iau
nastere la nivelul substantei, al materiei. Însa, potrivit teoriei vidului fizic, exista
câmpuri de torsiune primare, care sunt generate de catre "Nimicul" Absolut. În
acelasi mod în care materialul initial al lumii materiei - particulele elementare - se
nasc din vidul fizic, la rândul sau, vidul fizic se naste din câmpul de torsiune primar.
de rotatie. În zonele indicate sub forma de conuri apare un câmp de torsiune axiala
(Ta), iar în disc - un câmp de torsiune radiala (Tr). Fiecare din aceste câmpuri de
torsiune poate fi din dreapta (TaR, TaL) si din stânga (TrR, TrL).
7. Câmpul static de torsiune are raza finala de actiune g0, în intervalul careia
intensitatea câmpului de torsiune ramâne aproape constanta. Radiatia de torsiune
turbionara nu este limitata de intervalul g0, iar intensitatea acesteia nu depinde de
distanta.
12. Câmpurile de torsiune trec prin medii naturale fara a suferi pierderi.
Acest fapt reprezinta un factor natural, daca tinem cont ca în calitate de cuante ale
câmpurilor de torsiune figureaza neutrino.
13. Viteza undelor de torsiune din punct de vedere teoretic este egala cu
infinit. Vitezele mult mai mari decât cea a luminii nu reprezinta ceva neobisnuit
pentru fizica. Acestea au fost prezente în teoria gravitatiei a lui Newton. Vitezele
mai mari ca a luminii au fost observate experimental pentru prima data de catre
N.Kozârev, mai târziu au fost confirmate de catre alti doi colegi, iar la nivel cuantic
de catre Zeilinger. Este util de remarcat faptul ca perturbatiile de spin într-un
mediu de spin se propaga în asa fel, încât ele nu pot fi ecranate. În acest caz apare
posibilitatea de creare de comunicatii subacvatice si subterane, cât si de legaturi
prin alte medii naturale.
14. Toate corpurile din natura vie si din cea moarta se compun din atomi,
dintre care majoritatea au spinii atomici sau nucleari clasici care nu sunt nuli.
Ţinând cont ca toate corpurile se afla în câmpul magnetic al Pamântului, de
prezenta momentelor magnetice ale atomilor si nucleelor, care reprezinta urmari
ale prezentei spinilor si sarcinilor clasice indicate, ia nastere o procesiune care
genereaza radiatia de torsiune turbionara. În felul acesta, toate corpurile
poseda câmpuri de torsiune (radiatii) proprii.
sau cuanta, calorifer sau caldura, muschi sau miscare, mancare sau digestie s.a.m.d..
Mai mult decat atat, dicteaza si asigura cel putin doua categorii de proportii si
echilibre si/sau relatii si raporturi responsabile de viata si evolutia, trairea si
existenta oricarei entitati din natura si univers, cum sunt cele dintre morfologie si
functie si dintre integritate si integrare.
Desi undele si campurile de torsiune sunt aceleasi oriunde si oricand, in functie de contextul gen
actiune prezinta propriile unde si campuri de torsiune si ansamblul lor poate fi
numit, pe palierul nonlinear, semnatura spectrala. Aceste semnaturi sunt unice si
aceleasi indiferent de context. Cu alte cuvinte un joc de table este joc de table
indiferent daca este practicat in evul mediu sau postbelic, intre adolescenti, asiatici
sau europeni, pe plaja, in cabana sau in fata blocului, un scaun este un scaun
indiferent daca e dimineata sau seara, daca este de plastic sau de lemn, o minge este
minge indiferent daca este de tenis sau de handbal, un efect de piramida este acelasi
indiferent daca piramida este din metal, lemn, hartie sau sfoara. Pe baza acestor
semnaturi spectrale se pare ca recunoastem o persoana, o casa, o bicicleta chiar
daca au trecut anii peste ele. Tot undele si campurile de torsiune individuale se
presupune ca sunt responsabile de coordonarea miscarilor in alergat, dans, sofat,
cantat, etc.
Articolele viitoare vor aborda doua directii: una despre cum pot fi folosite in
practica medicala semnaturile spectrale de tiroida sau cerebel, patrunjel sau
spirulina, aspirina sau nitroglicerina, furie sau melancolie, hepatita sau
ateroscleroza si alta despre o teorie ortoesentiala care sa confere o coerenta intre
relativitate si cuantica, intre big-bang si nimicul absolut, intre medicatie si educatie
s.a.
303
Din cele relatate mai sus se pot trage concluzii foarte importante. Dacă o să
credem în legile privind istoria dezvoltării civilizaţiei, atunci, nimerind într-o stare
de criză globală, omenirea în mod obligatoriu va acumula noi cunoştinţe. Problema
constă în aceea, cât timp îi va trebui omenirii pentru a putea fi elaborate unele
tehnologii de vârf, bazate pe principii fizice noi.
304
Putem constata cu satisfacţie că noua paradigmă fizică a fost deja creată şi, la
ora actuală, este în desfăşurare procesul de creare a unei sume de tehnologii de vârf.
Pe parcursul ultimelor trei sute de ani, ştiinţa a cunoscut două câmpuri universale
cu acţiune pe distanţă mare. Acestea sunt: câmpul gravitaţional şi câmpul
electromagnetic.
În ultimii trei sute de ani nu s-a reuşit descoperirea nici unui câmp universal
cu acţiune la mare distanţă, care ar putea să ofere o sferă atât de impresionantă în
privinţa diversităţii utilizărilor sale practice cum este cazul electromagnetismului.
Ce înţelegem prin vid fizic, folosind una dintre cele mai simple interpretări?
Să ne imaginăm un volum limitat de spaţiu din care este îndepărtat aerul. Într-o
interpretare tradiţională, în acest volum nu mai există nimic, deci, este un vid. Însă,
într-o tratare modernă, acesta reprezintă un vid tehnic, întrucât acest volum, într-
un sens fizic strict, nu este gol.
Dar şi în acest caz, din punct de vedere al fizicii moderne, nu se poate afirma
că volumul în discuţie este gol. În acest volum de spaţiu, în nişte puncte arbitrare,
apar aşa numitele perechi virtuale de electroni-pozitroni. Ca obiecte din substanţă,
aceste perechi electrono-pozitronice nu pot apărea din nimic.
Acestea pot fi generate numai de către materie şi, dacă noi nu reuşim să le
fixăm nemijlocit în volumul indicat, din care se nasc acele perechi virtuale, prin
urmare, acestea reprezintă o materie specifică ce nu se observă într-o stare
obişnuită.
Ierarhia realitatii
Cel mai înalt nivel al ierarhiei realităţii este "Nimicul" Absolut şi acesta
reprezintă nivelul care, în cadrul teoriei vidului fizic, nu are o descriere analitică
riguroasă.
Acestui nivel următor al realităţii i-a fost dată denumirea, de către G.Şipov,
de câmp de torsiune primar.
Vidul fizic este destul de bogat din punct de vedere al numărului de elemente
care îl compun şi după structura sa. Vidul fizic, ca şi câmpul de torsiune primar,
conţine nişte structuri circulare turbionare care, de asemenea, nu transferă energie
şi în care perturbaţia se propagă momentan, adică cu o viteză egală cu infinit.
Printre proprietăţi ale vidului fizic trebuie să fie conţinută informaţia ce determină
mecanismul de naştere din acesta a unor perechi virtuale de particule şi
antiparticule concrete, nu la întâmplare.
iar în disc - un câmp de torsiune radială (Tr). Fiecare din aceste câmpuri de
torsiune poate fi din dreapta (TaR, TaL) şi din stânga (TrR, TrL).
o Toate corpurile din natura vie şi din cea moartă se compun din
atomi, dintre care majoritatea au spinii atomici sau nucleari clasici care nu sunt
nuli. Ţinând cont că toate corpurile se află în câmpul magnetic al Pământului,
de prezenţa momentelor magnetice ale atomilor şi nucleelor, care reprezintă
urmări ale prezenţei spinilor şi sarcinilor clasice indicate, ia naştere o
procesiune care generează radiaţia de torsiune turbionară. În felul acesta, toate
corpurile posedă câmpuri de torsiune (radiaţii) proprii.
NOTE BIBLIOGRAFICE
Arrell DK, Elliott ST, Kane LA, Guo Y, Ko YH, Pedersen PL, Robinson J,
Murata M, Murphy AM, Marban E, Van Eyk JE. Proteomic analysis of
pharmacological preconditioning: novel protein targets converge to mitochondrial
metabolism pathways. Circ Res. 2006; 99: 706–714.[
Loscalzo J. Proteomics in cardiovascular biology and medicine. Circulation.
2003; 108: 380–383.
Domon B, Aebersold R. Mass spectrometry and protein analysis. Science.
2006; 312: 212–217.[
Kim N, Lee Y, Kim H, Joo H, Youm JB, Park WS, Warda M, Cuong DV,
Han J. Potential biomarkers for ischemic heart damage identified in mitochondrial
proteins by comparative proteomics. Proteomics. 2006; 6: 1237–1249.
McComb ME, Huang H, Huang H, Skelton TP, Steinberg MH, Chui DHK,
Lim A, Prokaeva T, Connors LH, Skinner M, Cohen R, and Costello CE. Probing
protein cysteine post-translational modifications. Proceedings of the 52nd ASMS
Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics; 2004 May; Nashville:
available at http://www.asms.org/aspfolder/ASMSAbstracts.html.
Li H, Xiao YB, Gao YQ, Yang TD. Comparative proteomics analysis of
differentially expressed phosphoproteins in adult rat ventricular myocytes subjected
to diazoxide preconditioning. Drug Metabol Drug Interact. 2006; 21: 245–258
Yellon DM, Alkhulaifi AM, Pugsley WB. Preconditioning the human
myocardium. Lancet. 1993; 342: 276–277.
Downey JM, Cohen MV. Reducing infarct size in the setting of acute
myocardial infarction. Prog Cardiovasc Dis. 2006; 48: 363–371.
Halestrap AP. Calcium, mitochondria and reperfusion injury: a pore way to
die. Biochem Soc Trans. 2006; 34: 232–237.[
Arrell DK, Elliott ST, Kane LA, Guo Y, Ko YH, Pedersen PL, Robinson J,
Murata M,Murphy AM, Marban E, Van Eyk JE. Proteomic analysis of
pharmacological preconditioning: novel protein targets converge to mitochondrial
metabolism pathways. Circ Res. 2006; 99: 706–714.
Loscalzo J. Proteomics in cardiovascular biology and medicine. Circulation.
2003; 108: 380–383.
316
showing that animals treated with JAK2 inhibitors have increased numbers of
mature DCs, increased T cell priming by DCs and have increased surival when the
inhibitor was combined with a DC vaccine.
Seeger, J. M. et al. The proteasome inhibitor bortezomib sensitizes melanoma
cells toward adoptive CTL attack. Cancer Res. 70, 1825–1834 (2010).
Hahnel, P. S. et al. Targeting AKT signaling sensitizes cancer to cellular
immunotherapy. Cancer Res. 68, 3899–3906 (2008).
Steinman, R. M. & Mellman, I. Immunotherapy: bewitched, bothered, and
bewildered no more. Science 305, 197–200 (2004).
Greenwald, R. J., Freeman, G. J. & Sharpe, A. H. The B7 family
revisited. Annu. Rev. Immunol. 23, 515–548 (2005).
May, K. F. Jr, Chen, L., Zheng, P. & Liu, Y. Anti-4-1BB monoclonal
antibody enhances rejection of large tumor burden by promoting survival but not
clonal expansion of tumor-specific CD8+ T cells. Cancer Res. 62, 3459–3465 (2002).
Melero, I. et al. Monoclonal antibodies against the 4–1BB T-cell activation
molecule eradicate established tumors. Nature Med. 3, 682–685 (1997).
Miller, R. E. et al. 4-1BB-specific monoclonal antibody promotes the
generation of tumor-specific immune responses by direct activation of CD8 T cells
in a CD40-dependent manner. J. Immunol. 169, 1792–1800 (2002).
Mitsui, J. et al. Two distinct mechanisms of augmented antitumor activity by
modulation of immunostimulatory/inhibitory signals. Clin. Cancer Res. 16, 2781–
2791 (2010).
Keir, M. E., Butte, M. J., Freeman, G. J. & Sharpe, A. H. PD-1 and its
ligands in tolerance and immunity. Annu. Rev. Immunol. 26, 677–704 (2008).
Li, B. et al. Anti-programmed death-1 synergizes with granulocyte
macrophage colony-stimulating factor-secreting tumor cell immunotherapy
providing therapeutic benefit to mice with established tumors. Clin. Cancer Res. 15,
1623–1634 (2009).
Hodi, F. S. et al. Immunologic and clinical effects of antibody blockade of
cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 in previously vaccinated cancer
patients. Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 3005–3010 (2008).
319
T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107,
4275–4280 (2010).
A. Aziz et al. " Laminarin elicits defense responses in grapevine and induces
protection against Botrytis cinerea and Plasmopara viticola", Mol Plant Microbiol
Interac 16, pp 1118-28 (2003)
JA. Baur, Sinclair DA ," Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo
evidence" Nature Drug Discovery, 5, pp 493-506 (2006)
D. Delmas et al., " Resveratrol a protecting agent against vascular alterations
and ageing", Mol Nut Fd Res 49 pp 377-395 (2005)
PM. Kris-Etherton, et al. " Evidence that the antioxidant flavonoids in tea
and cocoa are beneficial for cardiovascular health." Curr Opin Lipidol, 13,pp 41-9
(2002)
A. Russo, et al., " Red wine micronutrients as protective agents in Alzheimer-
like induced insult", Life Sci., 72, pp :2369-79 (2003)
Y. Surh, " Molecular mechanisms of chemopreventive effects of selected
dietary and medicinal phenolic substances", Mutat Res., 428, pp 305-27 (1999
N. Latruffe et al., " Molecular analysis on the a chemopreventive properties
of resveratrol, a plant polyphenol microcomponent", Int J Mol Med 10, pp 755-60
(2002)
JA. Parker et al., " Resveratrol rescues mutant polyglutamine cytotoxicity in
nematode and mammalian neurons", Nature genetics 37, pp 349-50 (2005)
D. Blache et al., "Gas chromatographic analysis of resveratrol in plasma,
lipoproteins and cells after in vitro incubations", J Chromatog B Biomed Appl 702,
pp 103-10 (1997)
KT. Howitz et al., " Small molecule activators of sirtuins extend
Saccharomyces cerevisiae lifespan", Nature, 425, pp 191-6 (2003)
SC. Renaud et al., " Alcohol and mortality in middle-aged men from eastern
France" Epidemiology 9, pp184-8 (1998)
D. Bagchi et al., "Benefits of resveratrol in women's health", Drugs Exp
Clin Res, 27, pp 233-48 (2001)
BB. Aggarwal, Shishodia, "Resveratrol in health and diseases", eds pp 475-
497, Taylor & Francis, CRC Press, ISBN 0-8493-3371-7
331
Kuleshov V*, Xie D*, Chen R*, Pushkarev D*, Ma Z, Blauwkamp T, Kertesz
K, Snyder M. Whole- Genome Haplotyping Using Long Reads and Statistical
Methods. Nat Biotechnol. 2014. (Accepted as Cover story)
Mias GI*, Chen R*, Zhang Y, Sridhar K, Sharon D, Xiao L, Im H, Snyder
MP, Greenberg PL. Specific Plasma Autoantibody Reactivity in Myelodysplastic
Syndromes. Sci Rep. 2013. PMID: 24264604.
Kolker E, Özdemir V, Martens L, Hancock W, Dumbill E, Anderson N,
Aynacioglu S, Baranova A, Campagna S, Chen R, et al. Towards More Transparent
and Reproducible Omics Studies through a Common Metadata Checklist and Data
Publications. OMICS / BIG DATA. 2013. (Accepted)
Menon R, Im H, Zhang E, Wu S, Chen R, Snyder M, Hancock W, Omenn
G. Distinct Splice Variants and Pathway Enrichment in the Cell Line Models of
Aggressive Human Breast Cancer Subtypes. J Proteome Res.
2013. PMID: 24111759 (Epub Ahead of Print)
Chen R*, Giliani S*, Lanzi G, Mias GI, Lonardi S, Dobbs K, et al. Whole-
Exome Sequencing Identifies Tetratricopeptide Repeat Domain 7A (TTC7A)
Mutations for Combined Immunodeficiency with Intestinal Atresias. J Allergy Clin
Immunol. 2013;132(3):656-664.e17. PMID: 23830146. (Second co-first author is
collaborator PI)
Highlighted as Editors’ Choice. Identified TTC7A as the causal gene for the
rare Mendelian disease Combined Immunodeficiency with Multiple Intestinal Atresia
(CID-MIA) with whole exome sequencing and analyses.
Clark MJ, Chen R, Snyder M. Exome Sequencing by Targeted Enrichment.
Curr Protoc Mol Biol. 2013 April;Chapter7:Unit7.12. PMID: 23547016.
Liu S, Im H, Bairoch A, Cristofanilli M, Chen R, Deutsch EW, et al. A
Chromosome-Centric Human Proteome Project (C-HPP) to Characterize the Sets of
Proteins Encoded in Chromosome 17. J Proteome Res. 2013;12(1):45-57. PMID:
23259914.
Chen R, Snyder M. Promise of Personalized Omics to Precision Medicine.
Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2013;5(1):73-82. PMID: 23184638.
335
Article Featured by publisher on the Wiley Life Sciences Blog (WiSci) (Click
Here).
Chen R, Snyder M. Systems biology: personilized medicine for the future?
Curr Opin Pharmacol. 2012;12(5):623-628. PMID: 22858243.
Sun N, Yazawa M, Liu J, Han L, Sanchez-Freire V, Abilez OJ, Navarrete
EG, Hu S, Wang L, Lee A, Pavlovic A, Lin S, Chen R, et al. Patient-specific induced
pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Sci Transl
Med. 2012;4(130):130ra147. PMID: 22517884.
Chen R*, Mias GI*, Li-Pook-Than J*, Jiang L*, Lam HY, Miriami E, et al.
Personal omics profiling reveals dynamic molecular and medical phenotypes. Cell.
2012;148(6):1293-307. PMID: 22424236.
Featured as the only research paper in the March 16th, 2012 special issue of
Cell, and selected as the “Genome Advance of the Month” by the National Human
Genome Research Institute. Selected into Cell -- Best of 2012. 166 Citations as of
06/30/2013. F1000Prime RECOMMENDED.
Lam HY, Pan C, Clark MJ, Lacroute P, Chen R, Haraksingh R, et al.
Detecting and annotating genetic variations using the HugeSeq pipeline. Nat
Biotechnol. 2012;30(3):226-9. PMID: 22398614.
Paik YK, Jeong SK, Omenn GS, Uhlen M, Hanash S, Cho SY, Lee HJ, Na K,
Choi EY, Yan F, Zhang F, Zhang Y, Snyder M, Cheng Y, Chen R, et al. The
Chromosome-Centric Human Proteome Project for cataloging proteins encoded in
the genome. Nat Biotechnol. 2012;30(3):221-3. PMID: 22398612.
Clark MJ*, Chen R*, Lam HY, Karczewski KJ, Euskirchen G, Butte AJ, et al.
Performance comparison of exome DNA sequencing technologies. Nat
Biotechnol. 2011;29(10):908-14. PMID: 21947028.
F1000Prime RECOMMENDED.
Sharon D*, Chen R*, Snyder M. Systems biology approaches to disease marker
discovery. Dis Markers. 2010;28(4):209-24. PMID: 20534906.
Yin G*, Chen R*, Alvero AB, Fu HH, Holmberg J, Glackin C, et al. TWISTing
stemness, inflammation and proliferation of epithelial ovarian cancer cells
through MIR199A2/214. Oncogene. 2010;29(24):3545-53. PMCID: 2889129.
Alvero AB, Montagna MK, Chen R, Kim KH, Kyungjin K, Visintin I, et al. NV-
128, a novel isoflavone derivative, induces caspase-independent cell death
through the Akt/mammalian target of rapamycin pathway. Cancer.
2009;115(14):3204-16. PMCID: 2757274.
Chen R, Alvero AB, Silasi DA, Kelly MG, Fest S, Visintin I, et al. Regulation of
IKKbeta by miR-199a affects NF-kappaB activity in ovarian cancer cells.
Oncogene. 2008;27(34):4712-23. PMCID: 3041589.
Chen R, Alvero AB, Silasi DA, Steffensen KD, Mor G. Cancers take their Toll--
the function and regulation of Toll-like receptors in cancer cells. Oncogene.
2008;27(2):225-33. PMID: 18176604.
Silasi DA, Alvero AB, Mor J, Chen R, Fu HH, Montagna MK, et al. Detection of
cancer-related proteins in fresh-frozen ovarian cancer samples using laser
capture microdissection. Methods Mol Biol. 2008;414:35-45. PMID: 18175810.
Silasi DA, Alvero AB, Illuzzi J, Kelly M, Chen R, Fu HH, et al. MyD88 predicts
chemoresistance to paclitaxel in epithelial ovarian cancer. Yale J Biol Med.
2006;79(3-4):153-63. PMCID: 1994803. PMID: 17940625.
Kelly MG, Alvero AB, Chen R, Silasi DA, Abrahams VM, Chan S, et al. TLR-4
signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian
cancer. Cancer Res. 2006;66(7):3859-68. PMID: 16585214.
Chen R, Gao ZZ, Zhan SX, et al. Cloning and structural analysis of the full-
length cDNA of two rice flowering-related MADS-box genes. J. Fudan University
(Nat. Sci.). 2003;42(4):570-576. [Article in Chinese, no PMID]
Gao ZZ, Chen R, et al. Detecting the expression of a flower development MADS-
box gene in rice. J. Fudan University (Nat. Sci.). 2002;41(1):52-56. [Article in
Chinese, no PMID]
Chen R*, Mias GI*, Jenks JA, Lyu S, Runyon S, Li-Pook-Than J, Euskirchen G,
Lacroute P, Nadeau K, Snyder M. An Omics View of Asthma through
Discordant Monozygotic Twins.
Mias GI*, Im H*, Jiang L*, Mitsunaga E*, Chen R, et al. Network Inference,
Integrative Dynamic Omics and Personalized Medicine.
339
340