"AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA CORRUPCIÓN E

IMPUNIDAD"

CROMATOGRAFÍA GASEOSA - GC
“CASOS DE ESTUDIO PARA LA DETERMINACIÓN POR
CROMATOGRAFÍA DE GASES DE DIVERSAS
SUSTANCIAS EN ESCENAS DE CRÍMENES”
Docente:
Quím. Sugey Melissa Velásquez Soto
Integrantes:
PAREJA ACUÑA, Yuri Martin
NIZAMA SALAZAR, Yessenia Stefania
ACUÑA SOLIS. Dianira
FLOREANO MERCEDES, Katerine Jhovana
FLORES SOTO, Yovana Rosalía

LIMA -PERU
2019
 INDICE

1. OBJETIVOS………………………………………………………………... Pág. 04
2. ALCANCE…………………………………………………………………... Pág. 04
3. MARCO TEÓRICO………………………………………………………… Pág. 04
3.1 CROMATOGRAFIA…………………………………………………… Pág. 04
3.2 ESPECTROMETRÍA DE MASA……………………………………… Pág. 05
3.3CROMATOGRAFIA GASEOSA ACOPLADA A ESPEC-
TROMETRÍA DE MASA…………………………………………………… Pág. 06
3.4 QUÍMICA FORENSE…………………………………………………. Pág. 06
3.5 METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN EN MEDICINA LEGAL. Pág. 06
3.6 APLICACIÓN DEL CROMATÓGRAFO DE GASES EN EL ÁREA
MEDICINA LEGAL…………………………………………………………. Pág. 07
3.6.1 Patología Forense…………………………………………………. Pág. 07
3.6.2 Prueba de la escena del crimen…………………………………. Pág. 08
3.6.3 Investigación de incendios………………………………………… Pág. 08
4. Ejecución……………………………………………………………………. Pág. 09
4.1 PATOLOGÍA FORENSE
Caso 1: “MÉTODO DE ANÁLISIS DE MONÓXIDO DE CARBONO
EN SANGRE HUMANA MEDIANTE UNA JERINGA DE GAS
HERMÉTICO - CROMATOGRAFÍA DE GASES -
ESPECTROMETRÍA DE MASAS (AGS-GC-MS): RELEVANCIA
PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENVENENAMIENTO
POSTMORTEM” ………………………………………………………... Pág. 09
Caso 2: “UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA EFICAZ Y DE ALTO
RENDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE PLAGUICIDAS EN
ORINA HUMANA MEDIANTE EXTRACCIÓN CON PIPETA
DESECHABLE Y CROMATOGRAFÍA DE GASES-
ESPECTROMETRÍA DE MASAS” ………..…………………………… Pág. 22

pág. 2
 Caso 3: “ESTANDARIZACIÒN Y VALIDACION DEL METODO POR
CROMATOGRAFIA DE GASES ACOPLADO A ESPECTOMETRIA
DE MASA (GC- MS), PARA EL ANÁLISIS DE TRES
BENZODIACEPINAS Y SUS METABOLITOS EN MUESTRAS
BIOLÓGICAS DE INTERES FORENSE EN EL INSTITUTO Pág. 39
NACIONAL DE MEDICINA LEGAL Y CIENCIAS FORENSES” …….

4.2 PRUEBA DE LA ESCENA DEL CRIMEN

Caso 4: “ANÁLISIS FORENSE DE MUESTRAS DE COCAÍNA Pág. 59
PRODUCIDAS EN COLOMBIA: I. PERFIL CROMATOGRÁFICO DE
MUESTRAS DE CLORHIDRATO DE COCAÍNA” ……………..…….

4.3 INVESTIGACIÓN DE INCENDIOS Pág. 65

Caso 5: “UNA INVESTIGACIÓN DE INCENDIOS MEDIANTE EL
USO DE CROMATOGRAFÍA DE GAS BIDIMENSIONAL Pág. 72
INTEGRAL-ESPECTROMETRÍA DE MASAS CUADRUPOLO” …… Pág. 72
5. CONCLUSIONES…………………………………………………………. Pág. 72
6. RECOMENDACIONES…………………………………………………… Pág. 72
7. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………. Pág. 75
8. ANEXOS…………………………………………………………………...

pág. 3
CASOS DE ESTUDIO PARA LA DETERMINACIÓN POR CROMATOGRAFÍA
DE GASES DE DIVERSAS SUSTANCIAS EN ESCENAS DE CRÍMENES
1. OBJETIVOS:

➢ Determinar la importancia del análisis por cromatografía de Gases

en diversas sustancias en escenas de crímenes.
➢ Explicar con ejemplos prácticos la aplicación de la cromatografía
de gases en escenas de crímenes.

2. ALCANCE

En medicina Legal, la cromatografía de gas se utiliza para el análisis de

sustancias provenientes de la escena del crimen ayudándonos así a
determinar si una persona ha estado bajo los efectos del alcohol, alguna
droga o estupefaciente antes de morir o cometer un delito, así mismo nos
permite determinar si se empleó algún veneno o líquidos inflamables. Esta
información es crucial al determinar el suceso de los hechos así mismo
como la responsabilidad del sospechoso.

3. MARCO TEÓRICO

3.1 CROMATOGRAFIA:
La cromatografía es un método fisicoquímico de separación en el cual los
componentes a ser separados son distribuidos entre dos fases, una de las
cuales es estacionaria mientras la otra se mueve en una dirección
definida. Los componentes son separados por sus diferentes tazas de
migración (IUPAC). La cromatografía puede ser clasificada por su utilidad
y en base al material que se utilice como eluyente para separar los solutos.
De acuerdo a su utilidad la cromatografía se clasifica en: analítica,
utilizada para determinar los químicos presentes en una mezcla y en que
concentración; y preparativa, utilizada para purificar grandes cantidades
de químicos.

pág. 4
 3.2 ESPECTROMETRÍA DE MASA:
La espectrometría de masas (MS) es una de las técnicas analíticas más
completas que existen. Recientemente, esta técnica se utiliza no sólo en
investigación, sino también en análisis de rutina de los procesos
industriales, en control de calidad, etc. Sus principales cualidades son:
- Capacidad de identificación de forma prácticamente inequívoca, ya que
proporciona un espectro característico de cada molécula.
- Cuantitativa: permite medir la concentración de las sustancias.
- Gran sensibilidad: habitualmente se detectan concentraciones del orden
de ppm o ppb y en casos específicos se puede llegar hasta ppt e incluso
ppq.
- Universal y específica.
- Proporciona información estructural sobre la molécula analizada.
- Suministra información isotópica.
- Es una técnica rápida: se puede realizar un espectro en décimas de
segundo, por lo que puede monitorizarse para obtener información en
tiempo real sobre la composición de una mezcla de gases. Dentro del
espectrómetro de masas, se procede a la ionización de la muestra
mediante diferentes métodos. El sistema de ionización más frecuente es
el de impacto electrónico que bombardea las moléculas con electrones de
una cierta energía, capaces de provocar la emisión estimulada de un
electrón de las moléculas y así ionizarlas. Además de moléculas ionizadas
o iones moleculares (M+) también se forman iones fragmento debido a la
descomposición de los iones moleculares con exceso de energía. El tipo
y proporción relativa de cada uno de estos fragmentos es característico
de las moléculas analizadas y de las condiciones del proceso de
ionización. Una vez ionizadas las moléculas, se aceleran y se conducen
hacia el sistema colector mediante campos eléctricos o magnéticos. La
velocidad alcanzada por cada ión será dependiente de su masa. La
detección consecutiva de los iones formados a partir de las moléculas de
la muestra, suponiendo que se trate de una sustancia pura, produce el
espectro de masas de la sustancia, que es diferente para cada compuesto
químico y que constituye una identificación prácticamente inequívoca del
compuesto analizado. El espectro de masas puede almacenarse en la

pág. 5
 memoria del ordenador para compararse con los espectros de una
colección de espectros (o librería) y proceder a su identificación o puede
estudiarse para averiguar la naturaleza de la molécula que le dio origen,
etc.

3.3 CROMATOGRAFIA GASEOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA

DE MASA:
La cromatografía gaseosa separa primero los componentes de una
muestra que ha sido disuelta en un solvente, proceso que se realiza una
columna de separación de acuerdo a la volatilidad de cada uno de esos
compuesto, peso molecular y polaridad. Luego cada fracción separada se
ioniza en el espectro de masa de manera que se forman fragmentos con
carga eléctrica estos fragmentos se tienen en cuenta según su relación
masa carga para la identificación e interpretación de la composición
química de la muestra.

3.4 QUÍMICA FORENSE:

En química forense se utiliza este método con la finalidad de identificar
residuos (líquidos generalmente) de los que pueda obtenerse un registro
luego de la colección de muestras en el lugar del siniestro. Es una técnica
ampliamente usada para detectar solventes que hayan acelerado un
proceso de combustión o incendio intencional. En el proceso es necesario
aumentar la concentración de la muestra a analizar a través de la
adsorción de los componentes en tiras de carbón activado.
Posteriormente se disuelve el analito en un solvente que permita utilizar
la muestra para el análisis cromatográfico.

3.5 METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN EN MEDICINA LEGAL

Dentro de la medicina Legal se tienen ramas como la criminalística en la
cual existen aplicaciones clásicas, como fotografía, planimetría, balística,
química, huellografía y dactiloscopía, mecánica, urbanismo y paisajismo,
ecología e informática, entre otras. Gracias a la criminalística, la
investigación policial se ve avalada por técnicas reconocidas e
irrefutables, basadas en el conocimiento y experimentación científica.

pág. 6
 Los principios fundamentales del proceso criminalístico incluyen:
• Protección del lugar de los hechos.
• Observación del lugar de los hechos.
• Fijación del lugar de los hechos. (Es decir, descripción escrita,
fijación fotográfica y planimetría de los indicios encontrados=:
• Levantamiento de indicios.
• Suministro de indicios al laboratorio.
• Cadena de custodia
• Confección del informe pericial
Los estudios criminalísticos se apoyan en métodos y técnicas propias del
trabajo de diferentes disciplinas, ciencias auxiliares y laboratorios
periciales.

3.6 APLICACIÓN DEL CROMATÓGRAFO DE GASES EN EL ÁREA

MEDICINA LEGAL:
Los aportes de la cromatografía de gases son valiosos para la medicina
legal, principalmente porque a través de la utilización de esta técnica se
logra identificar los tipos de sustancias que se encuentran en la escena
de un crimen, en casos de suicidio o que de manera accidental o
deliberada han sido tomados por las personas generando con ello un
grave deterioro de la salud, como son los casos de ingesta de alcohol,
sustancias psicotrópicas, o medicamentos mal formulados.
Las muestras de la escena del crimen tal como sangre y fibras se pueden
también analizar con cromatografía de gas para ayudar a la investigación
e incluso Harrington sugirió en 2007 que la cromatografía de gas se podría
utilizar para descubrir los líquidos inflamables que se han utilizado en
incendio provocado (1).
La cromatografía de gases tiene múltiples aplicaciones, pero dentro de la
Medicina Legal se encuentran principalmente en este campo tenemos en
3 aplicaciones:

3.6.1 Patología Forense:

Dado que la cromatografía de gases es útil para identificar los
elementos individuales y las moléculas presentes en un

pág. 7
 compuesto, se ha aplicado en patología forense para determinar
qué fluidos y compuestos están presentes dentro de un cuerpo
humano después de la muerte. Esto es vital para determinar si la
persona fue intoxicada por abuso de alcohol o drogas en el
momento de la muerte, o si existe algún veneno u otra sustancia
dañina en su cuerpo. Por supuesto, este es un conocimiento
imperativo para determinar la causa de la muerte y el posible motivo
y culpable en el caso de juego sucio.

3.6.2 Prueba de la escena del crimen:

La cromatografía de gases también se puede usar para analizar
muestras encontradas en una escena del crimen, ya sean
muestras de sangre o de fibra de ropa o otros materiales. Esto
permite a los científicos identificar exactamente que (y quizás
quien) estuvo presente en la escena del crimen, e incluso puede
permitirles desarrollar teorías sobre donde había estado el
sospechoso (o la victima), según la variedad de material
encontrado. La cromatografía de gases es increíblemente útil para
identificar con precisión sustancias sin margen de error, lo que, en
los tribunales, es comprensiblemente imperativo.

3.6.3 Investigación de incendios

La investigación de incendios en la ciencia forense es una disciplina
muy importante. Debido a que la mayoría de los incendios se inician
con un cóctel de cientos de compuestos y componentes diferentes,
y estos varían en términos de fuerza y concentración, puede ser
difícil determinar qué fue exactamente lo que inició el incendio. Este
problema se ve agravado por el hecho de que muchos compuestos
se disuelven durante el incendio, lo que altera la composición del
incendiario original. Por ello la investigación de incendios estudia
los residuos dejados en los incendios y explosiones; lugar de la
detonación, composición de la carga, etc., mediante el uso de la
cromatografía de capa fina, la cromatografía de gas-líquido o la

pág. 8
 cromatografía de alto rendimiento que permite determinar la
sustancia utilizada para llegar a tal fin.

4 Ejecución:
La cromatografía de gases tiene múltiples aplicaciones en este trabajo nos
centraremos en la determinación por cromatografía de gases de diversas
sustancias en escenas de crímenes en los tres siguientes campos de
aplicación.

4.1 PATOLOGÍA FORENSE

Caso 1:

“MÉTODO DE ANÁLISIS DE MONÓXIDO DE CARBONO EN SANGRE

HUMANA MEDIANTE UNA JERINGA DE GAS HERMÉTICO -
CROMATOGRAFÍA DE GASES - ESPECTROMETRÍA DE MASAS
(AGS-GC-MS): RELEVANCIA PARA EL DIAGNÓSTICO DE
ENVENENAMIENTO POSTMORTEM”

Resumen

El monóxido de carbono es uno de los contaminantes tóxicos del aire más

abundantes. Los síntomas por intoxicación de CO no son específicos, lo
que lleva a un alto número de casos de intoxicación por CO mal
diagnosticados que faltan en las estadísticas de la enfermedad. La
naturaleza química de la molécula lo hace difícil para detectarlo en
períodos largos y en niveles bajos, lo que requiere un método muy preciso
y sensible. Los métodos actuales capaces de análisis precisos y sensibles
están disponibles, sin embargo, se informa con frecuencia una la
inconsistencia entre los resultados y los síntomas.

Por lo tanto, un método mejorado para el análisis de monóxido de carbono

en sangre por headspace (HS) del tubo de muestreo con el uso de una
jeringa de gas hermética - Cromatografía de Gases - La espectrometría
de masas (AGS-GC-MS) se presenta y valida aquí, para Concentraciones

pág. 9
 de CO en un rango de 10-200 nmol / mL HS (2-40 μmol / mL de sangre).
LOQ analítica es encontrado a 0.9 nmol / mL HS (0.18 μmol / mL de
sangre) y LOD a 0.1 nmol / mL de gas. Aplicación a Las muestras
intoxicadas de autopsias y la comparación con los métodos publicados
anteriormente muestran que este método es más apropiado, ya que se
realiza bajo condiciones totalmente controladas. Resultados muestran
mayores concentraciones de CO en comparación con los enfoques
anteriores, lo que indica que los resultados sobre la verdadera carga de
CO en sangre podrían haber estado subestimando. Por lo tanto, este
enfoque tiene la potencial para ayudar a reducir los casos mal
diagnosticados y la brecha entre la medición y diagnóstico de
intoxicaciones por CO.

Además, este método podría ser de gran importancia para explicar

numerosos casos en los que los niveles de% de COHb informados no se
correlacionan con los síntomas mostrados por pacientes intoxicados, con
aplicaciones tanto en el campo clínico como en el forense, aunque es
necesario investigar más sobre este enfoque. ser realizado para la
confirmación. Además, para la aplicabilidad y validez en casos clínicos, la
validación de este método con un rango de calibración más bajo y con
muestras clínicas reales también debe completarse

2. Materiales y métodos

2.1 Productos químicos y reactivos

Estándar de calibración: el ácido fórmico (grado de reactivo, pureza ≥95%)
se adquirió de Sigma-Aldrich (St Louis, EE. UU.). Todas las soluciones de
ácido fórmico se prepararon diariamente para prevenir la degradación.
El gas CO (99%) de Multigas ( Domdidier , Suiza)Estándar interno: el
ácido fórmico (13C, 99%) se obtuvo de Cambridge Isotope Laboratorios
(Cambridge, Reino Unido).
El ácido sulfúrico (≥97.5%) era de Fluka ( Buchs , Suiza).
La sangre bovina obtenida en una carnicería local se utiliza como matriz
en blanco para la calibración.

pág. 10
 2.2 Materiales
Las cubetas de CO-oxímetro de sangre total Avoximeter 4000 se
adquirieron de International Technidyne Corporation – ITC (Edison, EE.
UU.). S- Monovettes de los siguientes tipos: 2.6 ml de K3E, 3 ml de 9NC,
2.7 ml de FE, 2.6 ml de KH, se obtuvieron de Sarstedt ( Nürnbrecht ,
Alemania).
Las jeringas para gas de muestreo de precisión equipadas con una válvula
de botón de presión con capacidad de 500 µL para diluciones y 2 ml para
inyecciones fueron de VICI (Baton Rouge, LA, EE. UU.).

Tapas de aluminio de Milian (Vernier, Suiza). Todas las extracciones de

espacio de cabeza se llevaron a cabo en viales de 20 ml de espacio de
cabeza de Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EE. UU.).

Preparación de las muestras

Fortificación de sangre
La fortificación de la sangre bovina en blanco se llevó a cabo burbujeando
los tubos que contenían sangre bovina en blanco con gas CO puro durante
un cierto tiempo. Los niveles de saturación de COHb % se verificaron en
intervalos de 10 minutos con el oxímetro de CO hasta que se alcanzó el
nivel de % de COHb inicial deseado. Para asegurar la homogeneización,
las botellas se agitaron durante 20 minutos después de la fortificación y
la concentración final de COHb se midió posteriormente mediante CO-
oximetría. Debido a que no se produce enrojecimiento después de la
extracción de sangre de pacientes intoxicados, este paso no se planificó
en el diseño experimental por ser el más representativo de la fisiopatología
del CO.

Estándar de Calibración
Se utiliza como matriz para la calibración una alícuota de sangre bovina
recién muestreada, que se analizó previamente con un oxímetro de CO
para garantizar la ausencia de CO antes de su uso. Se prepararon
diariamente soluciones frescas del ácido fórmico estándar de calibración

pág. 11
 de trabajo (87 nmol/µL) y ácido fórmico marcado isotópicamente estándar
de trabajo (84 nmol/µL) con agua desionizada para evitar la
degradación. Los puntos de calibración se establecieron en un rango de
trabajo entre 0-208 nmol/mL HS, congruentes con la saturación de CO en
un rango relevante para muestras postmortem (según los resultados
obtenidos de muestras postmortem reales disponibles), con puntos en 6.5,
13, 26, 52, 104, 156 y 208 nmol / mL HS (equivalente a 2.6, 5.2, 10.4,
20.8, 31.2 y 41.6 µmol/mL en sangre). Los efectos de la matriz se
evaluaron preparando una muestra en blanco con la matriz sin ningún
reactivo. Se agregaron 10 µL de la solución estándar interna de trabajo a
cada muestra de calibración antes de la extracción, lo que llevó a una
concentración final de 42 nmol de 13 CO/µL. Todos los estándares fueron
almacenados en +4°C cuando no esté en uso.

Controles de calidad (CC)

Las muestras de control de calidad se prepararon diariamente con ácido
fórmico obtenido de un lote diferente. Se obtuvieron cinco soluciones de
CC a concentraciones de 10, 25, 80, 150 y 200 nmol / mL HS (2, 5, 16, 30
y 40 µmol / ml de sangre) a partir de ácido fórmico diluido
con agua desionizada.
Además, la validez del método se probó con un control externo, que se
preparó por dilución de gas CO puro a dos niveles de concentración, bajo
y alto, respectivamente 20 y 150 nmol / mL HS.

Se introdujeron 100 µl de sangre en un vial de 20 ml

de HS, seguido de alícuotas de las diversas
soluciones de calibración de ácido fórmico y una
solución estándar interna de 10 µL
Posteriormente, primero se llenó una tapa
Procedimiento de
de aluminio de 11 mm (Id) con 100 µL
extracción
de ácido sulfúrico y luego se introdujo con cuidado en
el vial de HS. El vial se selló herméticamente de
inmediato con tapones magnéticos de PTFE / septo de

pág. 12
 silicona de 20 mm (Id) y luego se agitó vigorosamente
con vórtex, para asegurar la mezcla completa de los
líquidos contenidos en el vial.
Después de la preparación de todos los viales, la
extracción se completó calentando a 100°C durante 60
minutos.
*Con respecto a las muestras reales, se realizaron dos análisis por tubo:
análisis de CO en el HS antes de la apertura del tubo para medir una
eventual liberación de CO durante el almacenamiento y otro análisis de
CO en la sangre después de abrir el tubo y tomar muestras de sangre
para el HS. Para el análisis de CO solo se insertaron el estándar interno
y el ácido sulfúrico en el vial de HS para el análisis de CO.

Instrumentos y GC-MS condiciones

Para el análisis espectrofotométrico, se utilizó el oxoxímetro de sangre
total Avoximeter 4000 de ITC. Se siguieron las pautas del fabricante para
obtener los análisis de COHb.

Para el análisis cromatográfico de gases las condiciones fueron:

CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO DE GASES
Cromatógrafo de gases 7890A equipado con un detector
Equipo
espectrómetro de masas con cuadrupolo 5975C
Marca Agilent Technologies
Columna capilar Agilent 6890 N GC (Palo Alto, EE. UU.).
Tipo de columna Equipada con un HP Molecular Sieve 5 Å; obtenida
de Restek (Bellefonte, EE. UU.)
Medidas de la columna 30 m x 0,32 mm x 0,30 µm de espesor de película
Gas portador Helio
Flujo 40mL/min
Temperatura 50°C
Temperatura del horno
Tiempo 5 min
Modo Splitless
Puerto de Inyección
Temperatura 180°C
Retraso de disolvente 1,8 minutos.

pág. 13
 CONDICIONES DE ESPECTRÓMETRO DE MASAS
Interfaz: 230°C
Para la detección, se utilizó el espectrómetro de masas Agilent 5973 (Palo Alto, EE.UU.),
Que funcionaba en modo de ionización electrónica (EI) a 70 eV. Se usó el modo de
Monitoreo Iónico seleccionado (SIM) para adquirir la señal de CO en m/z 28 y 13CO en
m/z 29.

Procedimiento de análisis

Se tomaron muestras de aproximadamente 50-100 µl de sangre del

tubo y se insertaron en una cubeta de oxímetro de sangre
CO-
oxímetro completa Avoximeter 4000, que luego se introdujo en eloxímetro
de sangre total Avoximeter 4000 para su análisis.
Se tomaron muestras de 250 µl de sangre del tubo de cerrado HS y
se insertaron en un frasco de HS de 20 mL preparado previamente
CO en HS
con estándar interno. Posteriormente, se tomaron muestras de 1 ml
y se inyectaron en la GC-MS para su análisis.
Se tomaron muestras de 1 ml HS del vial de 20 ml de HS que contenía
el extracto y se inyectaron en la GC-MS para su análisis. Para
CO
en sangre garantizar que la contaminación por CO contenida en el aire no
afectara las mediciones, también se analizó una muestra de aire en la
sala de análisis.

Validación procedimiento: Los experimentos de validación se realizaron con

calibradores y muestras de control de calidad en tres días no consecutivos (p =
3) y en dos semanas separadas. El enfoque se basó en el uso de una tolerancia
de intervalo de expectativa β del 80%, lo que significa que los intervalos para
cada punto experimental contienen un promedio del 80% de los valores totales.

Selectividad No se observaron picos de interferencia para ninguno,

de los otros gases con una relación CO m / z de 28
o 13 CO m / z relación de 29 (ver Figura B.1), lo que
indica que el método es suficientemente selectivo para
la determinación de CO.

pág. 14
 Función de Las curvas de calibración se prepararon en tres días no
respuesta consecutivos ( p = 3 ), por triplicado ( n = 3) y en siete
(calibración niveles de concentración ( k = 7): 6.5, 13, 26, 52, 104,
curva) 156 y 208 nmol / mL HS (equivalente a 1.3, 2.6, 5.2,
10.4, 20.8, 31.2 y 41.6 µmol / mL en sangre). Las
concentraciones calculadas para cada punto de
calibración se compararon con los valores objetivo y se
encontraron dentro de ± 20%. Se determinó una
relación lineal entre la concentración de CO de
muestras enriquecidas con ácido fórmico y la respuesta
medida. La tabla A.2 (I) muestra los resultados de
validación para las curvas de calibración.
Linealidad En cada día no consecutivo ( p = 3), se controló las
muestras en cinco concentraciones diferentes ( k=
5 ), es decir , 10, 25, 80, 150 y 200 nmol / mL HS (2, 5,
16, 30 y 40 µmol / mL de sangre), se midieron por
triplicado ( n = 3). Las concentraciones de las muestras
de control se calcularon utilizando la curva de
calibración determinada para cada día de
análisis. Como se representa en la Tabla A.2 (II), se
obtuvo una linealidad satisfactoria, con una pendiente
de 0.9887 y un coeficiente de regresión de 0.989 en el
rango de 10 a 200 nmol / mL HS (2-40 µmol / mL de
sangre).
Veracidad También conocida como sesgo, se encontró que era
inferior a los criterios de aceptación (dentro de ± 15 del
valor de referencia aceptado y dentro del 20% del
LOQ), como se puede ver en la tabla A.2 (III) y, por lo
tanto, se define como satisfactoria para la
determinación de CO.
Precisión: Se evalúa calculando la repetibilidad (precisión intra-
repetibilidad e día) y la precisión intermedia (precisión inter-día) para
intermedia, cada muestra de control. La varianza de la repetibilidad

pág. 15
 precisión se estableció al calcular la varianza intra-día (S 2 r) y la
precisión intermedia se determinó mediante la suma de
las varianzas intra e inter-día (S² IP ). Como puede
verse en la Tabla A.2 (IV), la RSD para la repetibilidad
y la precisión intermedia están en un rango entre 0.95%
y 11.95%. los criterios de validación se encontraron por
debajo de 10 nmol / mL HS (2 µmol / mL de sangre). Por
lo tanto, se confirma que el método es exacto dentro
del rango de 10 y 200 nmol / mL HS (2-40 µmol / mL de
sangre), considerado como el rango relevante para los
análisis postmortem. El LOQ analítico se determinó
más tarde a 0.9 nmol / mL HS (0.18 µmol / mL de
sangre)
Exactitud y límite El perfil de precisión para CO, que se muestra en la
de cuantificación Figura B.2, expresa la capacidad del método de
proporcionar resultados analíticos utilizando errores
tanto sistemáticos como aleatorios, con un riesgo
establecido en α = 5% para cada nivel de concentración
Límite El LOD se determinó mediante el análisis de muestras
de detección que contenían ácido sulfúrico y cantidades
decrecientes de ácido fórmico y se evaluó utilizando
una relación señal / ruido de S / N> 3. El ruido era
estimado midiendo 15 muestras en blanco. El LOD
resultante para la cuantificación de CO se encontró a
0.1 nmol / mL de gas

Análisis de postmortem muestras

Se analizaron tres muestras de sangre postmortem para evaluar el
rendimiento del método y su aplicabilidad en muestras de sangre humana
real de personas sometidas a intoxicación mortal por CO. Los cambios
debidos al almacenamiento se investigaron volviendo a analizar cada
muestra después de un período de un mes, en el que la muestra se
almacenó a -20 ° C con diferentes conservantes
(EDTA, NaF , heparinato , citrato). Los resultados se presentan en la

pág. 16
 Tabla 3. Los resultados obtenidos para los tres casos postmortem
también se compararon con los resultados obtenidos de la fortificación de
sangre en blanco con CO en el rango de 60% -80% COHb, según lo
obtenido por análisis de CO-oximetría (Figura B.3).
Tabla A.1: Resumen de información relevante sobre un conjunto de casos reales
postmortem
Muestra Tipo de Edad Sexo Modo de muerte
Muestra
1 Sangre Cardiaca 22 F Víctima de fuego
y Periférica
2 Sangre Cardiaca 67 M Víctima de fuego
y Periférica
3 Sangre Cardiaca 44 M Suicidio por
y Periférica intoxicación por CO

Table A.2: Parámetros de Validación

(I)
Response function [6.5-208 nmol/mL HS] (k = 7, n= 3, p = 3)
Día 1 Día 2 Día 3
Slope 0.0252 0.0219 0.0214
Intercepto 0.4698 0.5803 0.4528
r² 0.9892 0.9864 0.9920

(II)Linealidad [10-200 nmol/mL HS] ( k = 5, n = 3, p= 3)

Slope 0.9887
Intercept -0.5322
r² 0.9962

(III) Veracidad (sesgo relativo%) ( k = 5, n = 3, p = 3)

Niveles [nmol/mL HS] Veracidad
(%)
10 -12
25 0
80 -2
150 -3
200 -5

(IV) Precision (RSD%) ( k = 5, n = 3, p = 3)

Niveles [nmol/mL HS] Repetibilidad Precision intermedia
10 0.951 0.952
25 4.001 4.326
80 5.980 5.980
150 8.364 11.347
200 4.046 8.630

pág. 17
Tabla A.3: Resumen de los datos de los análisis de tres casos reales postmortem
con sospecha de intoxicación por CO, analizados por CO-oximetría y AGS-GC-
MS
Muestra Preservante COHb [%] CO en Sangre [nmol/mL
CO-oximetria HS] (µmol/mL blood)
AGS-GC-MS
Día Día Día 0 Día 30
0 30
EDTA >75 142.45 80.00 (16.00)
1 >75
NaF >75 (28.49) 78.04 (15.61)
CB
LiH >75 93.15 (18.63)
Cit >75 77.73 (15.55)
EDTA 57,1 49.7 89.92 68.80 (13.76)
NaF 44.9 (17.98) 87.33 (17.47)
1
PB LiH 61.8 62.38 (12.48)
Cit 55.3 47.57 (9.51)
EDTA >75 70.7 68.77 95.55 (19.11)

2 NaF 64.8 (13.75) 108.10

CB (21.62)
LiH 70.5 79.75 (15.95)
Cit 71 57.10 (11.42)
EDTA 69.5 65.1 100.62 119.50
(23.90)
(20.12)
2 NaF 47.5 136.21
PB (27.24)
LiH 64.7 81.94 (16.39)
Cit 64.8 52.15 (10.43)
3* NaF NA NA 50.48 47.60 (9.52)
CB (10.10)
3* NaF >75 70.8 113.09 64.15 (12.83)
PB (22.62)

* Para la muestra 3, los segundos análisis se realizaron después de 52 días;

Muestras: sangre cardíaca (CB), sangre periférica (PB); conservantes: ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA), fluoruro de sodio (NaF), heparina de litio (LiH),
citrato trisódico (Cit)

pág. 18
 Figura B.1: Cromatogramas de iones extraídos para relaciones m
/ z 28 (superior) y 29 (inferior), correspondientes a CO y 13CO,
respectivamente, para pruebas de selectividad.

pág. 19
Figura B.2: Perfil de precisión para la determinación de CO usando un modelo
de regresión lineal simple dentro del rango de 10-200 nmol / mL HS (2-40 µmol
/ mL de sangre). La línea continua representa la veracidad (sesgo), las líneas
discontinuas representan los límites de aceptación establecidos en ± 30% y las
líneas de puntos son los límites de precisión superior e inferior relativos.

Figura B.3: Gráfica de correlación entre la concentración total de CO en nmol /

mL HS (medida por AGS-GC-MS) versus la saturación de COHb en% (medida
mediante CO-oximetría) medida en sangre para dos grupos de muestras: real
Muestras de casos (n = 5) y muestras fortificadas con CO almacenado en la
sangre (n = 18).

pág. 20
 Conclusiones

El método AGS-GC-MS para la cuantificación de la cantidad total de CO

en la sangre de los casos de envenenamiento por CO, el método fue
validado de acuerdo con el perfil de precisión del 'intervalo de tolerancia
de expectativa de β' recomendado por el SFSTP(
Sociedad Francesa de Ciencias y Técnicas Farmacéuticas). El método
presenta una sensibilidad mejorada (menor LOD y LOQ) y menores
costos debido a las cantidades reducidas de reactivos en comparación
con otros estudios publicado previamente, además, el método es preciso
y confiable (± 30%) para mediciones de concentraciones de CO en un
rango de 10-200 nmol / mL HS (2-40 µmol / mL de sangre) dato relevante
en envenenamiento post mortem.

Lo más resaltante en este estudio es la consideración de la totalidad del

CO presente en la sangre, que incluye el CO unido a la Hb, así como el
CO disuelto en la sangre y el CO liberado en el HS del tubo de muestreo.
No se realiza el lavado de los calibradores, lo que está de acuerdo con los
principios fisiológicos. Los resultados informados sugieren que el método
AGS-GC-MS podría ser una alternativa válida al uso de COHb como un
biomarcador para las exposiciones al CO, con este último posiblemente
estimar el verdadero papel desempeñado por el CO en tal intoxicación ya
que este enfoque tiene potencial para aumentar el número y la calidad de
los diagnósticos de envenenamiento por CO.

pág. 21
 Caso 2:

“UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA EFICAZ Y DE ALTO

RENDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE PLAGUICIDAS EN ORINA
HUMANA MEDIANTE EXTRACCIÓN CON PIPETA DESECHABLE Y
CROMATOGRAFÍA DE GASES-ESPECTROMETRÍA DE MASAS”

Resumen

En este documento, se propone por primera vez el uso de la extracción

con pipeta desechable (DPX) para la determinación de pesticidas en orina
humana en posibles casos de intoxicación. Los pesticidas estudiados
fueron oxamilo, propoxur, carbofurano, 3-hidroxicarbofurano, carbarilo,
metiocarb, terbufos, paratión metilo, malatión, clorpirifos y endosulfan. La
punta de la pipeta utilizada para la extracción de estos compuestos se
adquirió comercialmente. Tiene una capacidad de 5 ml y contiene 20 mg
de material sorbente (estireno divinilbenceno). La optimización de los
principales parámetros que pueden influir en la eficiencia de extracción de
esta técnica de preparación de muestras se realizó con enfoques
univariados y multivariados. Los analitos se separaron e identificaron
mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
(GC-MS). Las condiciones óptimas de extracción fueron 5 ciclos de
extracción de 30 s y 5 ciclos de desorción de 15 s con 250 μl de acetato
de etilo. La elución del extracto se realizó en un vial que contenía 100 mg
de sulfato de sodio anhidro. El método desarrollado fue validado,
proporcionando coeficientes de correlación superiores a 0.9955 para
todos los analitos, límites de detección (LOD) de 0.76 a 1.52 μg L− 1, límites
de cuantificación (LOQ) de 2.5 a 5.0 μg L− 1, recuperaciones relativas de
63 a 118%, precisión intra-día de 0.7 a 15.3% y precisión inter-día de 4.9
a 13.1%. Se desarrolló con éxito un método eficaz y rápido para el análisis
de la orina humana para la identificación de posibles casos de intoxicación
por plaguicidas.

pág. 22
 1. Introducción

Los pesticidas son compuestos químicos que son ampliamente utilizados

en el mundo para el control de plagas agrícolas que ha permitido el
mejoramiento de los cultivos. Sin embargo, esta expansión en la
comercialización de pesticidas ha causado un aumento intencionado y no
intencionado de envenamiento por contacto, siendo reportado por la OMS
como uno de los más comunes.
En todos estos casos, se requiere un análisis químico para investigar la
sustancia que causó el envenenamiento. En este sentido, los laboratorios
forenses enfrentan un desafío difícil porque en la mayoría de los casos no
hay información sobre la sustancia involucrada en la intoxicación por lo
que recurren a la literatura científica donde se encuentran métodos para
su análisis en sangre, orina, plasma, suero y cabello. Y entre los grupos
químicos más frecuentes en los análisis toxicológicos tenemos a los
organofosforados, cloruros orgánicos y carbamatos.

Las matrices biológicas son muestras muy complejas por lo que a menudo
es necesario un paso de preparación de la muestra antes de la inyección
a un instrumento analítico. Entre las técnicas de extracción tenemos la
extracción liquido-liquido (LLE), la extracción en fase sólida (SPE) y la
microextracción en fase sólida (SPME). Recientemente, una técnica
llamada Extracción de Pipeta Desechable (DPX) se ha utilizado
ampliamente para la determinación de pesticidas en residuos de
alimentos y muestras ambientales. Sin embargo, no se ha informado
ningún estudio en la literatura que use DPX en el análisis de pesticidas en
muestras biológicas.
La técnica DPX se basa en la extracción en fase sólida y fue desarrollada
por el Dr. William E. Brewer en la Universidad de Carolina del Sur en 2003.
Esta técnica implica una modificación de la técnica SPE convencional con
una cantidad reducida de material sorbente utilizado como fase de
extracción. En general, el tiempo de extracción aplicado en DPX es más
corto y el volumen de disolventes utilizados para la etapa de elución es
menor en comparación con los enfoques de SPE clásicos. Una

pág. 23
 modificación muy reciente adoptada en DPX es el uso de una punta de
pipeta convencional con una capacidad de 1 o 5 ml, que contiene una
cantidad conocida de material absorbente colocado entre dos filtros: uno
insertado en el extremo inferior y el otro en el extremo superior de la punta
de la pipeta. El tipo de material absorbente utilizado en el procedimiento
DPX depende de las características del analito y una amplia gama de
diferentes materiales está disponible comercialmente. Para la extracción
de pesticidas, es apropiado el uso de DPX-RP (fase inversa), que
contiene estireno-divinilbenceno como material absorbente, ya que
esta fase de extracción se recomienda para la extracción de compuestos
no polares y ligeramente polares.

El objetivo de este estudio fue llevar a cabo el desarrollo, optimización y

la validación interna de un método rápido y directo para la determinación
de 11 plaguicidas (oxamilo, propoxur, carbofuran, 3-hidroxicarbofurano,
carbaril, metiocarb, terbufos, paratión metilo, malatión, clorpirifos y
endosulfán) en orina humana por DPX con separación / detección
realizada por GC – MS.

2. Parte Experimental

2.1 Materiales y Reactivos

- Estándares analíticos: contienen una mezcla de pesticidas de
carbamatos (oxamilo, propoxur, carbofuran, 3-hidroxicarbofuran, carbaril
y metiocarb) a concentración de 100 mg L-1 en metanol.
- Estándares analíticos de Terbufos, paratión metilo, malatión, clorpirifos
y endosulfán. A partir de estos estándares se prepararon soluciones
individuales de cada analito a concentraciones de 100 mg L-1 en metanol.
- A partir de estas soluciones, se preparó una solución de trabajo que
contenía una mezcla de todos los analitos, con 5 mg L-1 de los analitos
de carbamato y 10 mg L-1 de los otros analitos, en metanol (grado HPLC).
- Sulfato de sodio anhidro (marca Vetec)
- Puntas de pipeta (1 ml de 20 mg de DPX-RP y 5 ml sin sorbente)
- Microjeringa de 10 μL

pág. 24
 - Jeringas desechables de 5 ml.
- Agua ultrapura

2.2 Muestras de orina

Inicialmente, los ensayos de optimización se realizaron con muestras de

agua ultrapura añadidas a los analitos en concentraciones de 150 y 300
μg de L -1. Más tarde, después de haber optimizado todos los
parámetros, el método se validó con muestras de orina en blanco
donadas por voluntarios sanos de nuestro grupo de investigación de 22
a 23 años. No se asociaron molestias ni riesgos con la recolección de la
muestra. Estas muestras se recolectaron en botellas de vidrio de 40 ml
y se almacenaron durante un día bajo refrigeración a 4 ° C hasta el
análisis. Las extracciones se realizaron utilizando 100 µl de la muestra
de orina, que se diluyó con la adición de agua ultrapura al vial hasta un
volumen final de 5 ml. El análisis se realizó a temperatura ambiente.

2.3 Condiciones instrumentales y cromatográficas.

CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO DE GASES
Equipo
Marca
Tipo de columna
Medidas de la columna
Gas portador
Temperatura del inyector
Temperatura del horno
Tipo de inyección
Volumen de inyección
Cromatógrafo de gases GC-MS-QP 2010 Plus acoplado a
espectrometría de masas
Shimadzu (Kyoto, Japón)
Columna capilar Restek (Torrance, CA, EE. UU.) Modelo
Rtx®-5MS
30 mx 0,25 mm x 0,25 µm de espesor de película
Helio ultrapuro (flujo constante 1 ml min-1)
250 °C
50 ° C durante 1 minuto, se incrementó a 200 ° C a una
velocidad de 10 ° C min-1 y luego se aumentó a 255 ° C a
una velocidad de 7 ° C min − 1, totalizando 24 min de
corrida cromatográfica.
Manual
1 μL en modo splitless

pág. 25
 CONDICIONES DE ESPECTRÓMETRO DE MASAS
Modo de ionización electrónica (EI) a 70 eV. La temperatura de la fuente de iones se
ajustó a 230 ° C y la interfaz a 280 ° C, con un tiempo de corte de disolvente de 2,5 min.
La cuantificación de los analitos se realizó en el modo de monitoreo de iones
seleccionados (SIM) utilizando el ión de mayor intensidad.

2.4 Preparación de las puntas de pipeta DPX.

Para el desarrollo de la metodología, se usó una punta de pipeta de 5 ml
que no contenía material absorbente. En primer lugar, el filtro superior se
retiró de esta punta de pipeta y luego se transfirieron 20 mg de material
sorbente obtenido de una punta de pipeta comercial de 1 ml de DPX-RP
a la punta de pipeta de 5 ml. Después de este paso, el filtro que se retiró
previamente se insertó en la posición superior de la punta de la pipeta de
5 ml. Posteriormente, la punta se unió a una jeringa desechable de 5 ml
para ser utilizada en las extracciones.

2.5 Optimización del procedimiento DPX propuesto

Se adoptaron los siguientes parámetros:
La etapa de extracción se realizó con 5 ml de agua ultrapura enriquecida
−1
con analitos a una concentración de 150 μg L para los pesticidas de
carbamato y 300 μg L − 1 para los demás analitos
La etapa de desorción se realizó utilizando 250 μl de disolvente orgánico.

Los parámetros de optimización que podrían afectar las etapas de

extracción y desorción líquida de los compuestos objetivo se investigaron
en el siguiente orden:

pág. 26
I) Modo de II) El III) Número de IV) Número de V) Etapas de
ciclo: las disolvente de ciclos y tiempo ciclos y tiempo limpieza y
extracciones la desorción de extracción: de desorción: acondicionamient
se realizaron líquida: Los estos estas variables o: se utilizaron
con dos disolventes de parámetros se también se metanol y acetato
modos de ciclo desorción se estudiaron con investigaron con de etilo.
diferentes que investigaron un diseño de un diseño de Estudiado como
variaron solo con un diseño Doehlert, el Doehlert, el solventes para
los tiempos de de celosía número de número de ciclos esta optimización
extracción simple ciclos se varió varió
utilizando de 1 a 5 y el de 1 a 5 y el
acetonitrilo, tiempo de tiempo de
metanol y extracción se desorción del
acetato de investigó en el líquido estudiado
etilo rango de 0 a 60 en un rango de
s 15 a 45 s

2.6. Método desarrollado.

La validación del método se basó en el SOFT / AAFS – Forensic Guía de
Laboratorios de Toxicología (versión 2006). Por lo tanto, las curvas de
calibración se obtuvieron con 5 puntos mediante el trazado del área del
pico cromatográfico frente a la concentración de analitos agregados a las
muestras de orina, por triplicado.

3. Resultados y discusión

3.1. Optimización de condiciones DPX.

3.1.1. Optimización del modo ciclo de extracción.
El modo de ciclo de extracción es un factor importante en términos de
obtención de la máxima eficiencia de extracción de los analitos.

Se han informado dos modos de ciclo de extracción en la literatura. En

la primera, y la más común, una alícuota (de volumen conocido) de la

pág. 27
 muestra se retira en la punta de la pipeta y luego se desecha después de
la aspiración de una nueva muestra de la misma muestra. El segundo
procedimiento consiste en la aspiración de todo el volumen de muestra en
la punta de la pipeta y luego se desecha en el mismo matraz y se usa para
nuevas aspiraciones en varios ciclos.

Los métodos A, B y C se realizaron en el primer modo y los métodos D, E

y F en el segundo modo, y para cada modo se aplicaron tres tiempos de
equilibrio diferentes.
Aunque en la Figura 1 puede verse que la E y F tienen las mejores áreas
de picos normalizados, el error en ellos es muy alto. Dado esto es que se
elige al método B como el más satisfactorio.

3.1.2. Optimización del disolvente de desorción.

Los disolventes investigados fueron acetonitrilo, metanol y acetato de
etilo. La Fig. 2 muestra que el acetato de etilo exhibió la mayor eficiencia
de desorción de los analitos. Cabe aclarar que esto debido que entre los
tres disolventes es el que presenta menor polaridad.

pág. 28
 3.1.3. Optimización del tiempo de extracción y número de ciclos.
El período de tiempo en que la muestra que contiene los analitos se
mantiene en contacto con el material absorbente, es decir, el tiempo de
extracción, se puede optimizar para obtener una alta eficiencia de
extracción.
La optimización de la etapa de extracción se estudió utilizando un diseño
de Doehlert, variando el número de ciclos de extracción y el tiempo de
extracción.
En la Fig. 3 se puede observar que 5 ciclos de extracción con 30 s de
tiempo de extracción mostraron un rendimiento excelente

pág. 29
 3.1.4. Optimización del tiempo de desorción y número de ciclos.
Para garantizar la desorción completa de los analitos de la fase de
extracción, la etapa de desorción líquida es extremadamente importante
y requiere optimización. Esto también se realizó con una optimización
multivariable a través de un diseño Doehlert, con el tiempo de desorción
y el número de ciclos como variables. La superficie de respuesta obtenida
en este experimento se muestra en la Fig. 4 y se puede observar que hay
dos áreas máximas, 5 ciclos de 15 s y 5 ciclos de 45 s. Por lo tanto, se
eligieron 5 ciclos de 15 s para que el procedimiento de desorción se
combinara con un mayor rendimiento de análisis.

pág. 30
 3.1.5. Pasos de limpieza y acondicionamiento.
Antes de comenzar el paso de extracción con un material absorbente, es
importante activar el material para obtener el mayor rendimiento de
extracción

En esta etapa, se evaluaron los solventes metanol y acetato de etilo y en

la Fig. 5 se puede observar que se obtuvo un resultado muy satisfactorio
con 3 tres ciclos de limpieza con metanol.

Por lo tanto, se utilizaron 3 ciclos de 10 s con 500 μL de metanol para la

limpieza y el acondicionamiento de la fase de extracción.

** Este procedimiento de limpieza para la reutilización de la punta de la

pipeta se llevó a cabo solo con fines de investigación

pág. 31
 3.2. Efecto de la adición de sal al vial de inyección.
La formación de dos fases se observó en el extracto obtenido después de
la etapa de elución debido a la baja solubilidad del acetato de etilo
(disolvente de desorción) en la fase acuosa (agua u orina).

Para minimizar este problema, se insertaron 100 mg de sulfato de sodio

anhidro en el vial de elución para secar la fase acuosa, permitiendo la
inyección de la fase orgánica solamente.

Antes de la inyección, el vial de elución se dejó reposar durante 5 minutos

para el proceso de secado de la fase acuosa.

pág. 32
 3.3. Procedimiento optimizado para la determinación de plaguicidas
utilizando DPX.

5 ciclos de extracción. Cada uno compuesto

por 1 ml de la muestra, seguido de aspiración
Procedimiento de extracción
por aire, equilibrio durante 30 segundos y la
elución de la muestra al residuo.
5 ciclos, comprendiendo cada ciclo la
aspiración de 250 μL de acetato de etilo
presente en un volumen pequeño, seguido de
Procedimiento de desorción líquida
aspiración por aire, equilibrio durante 15
segundos y elución del disolvente en el
mismo vial.
Después del quinto ciclo de desorción, el extracto completo estaba en otro matraz que
contenía 100 mg de sulfato de sodio anhidro para su posterior análisis por GC-MS después
de 5 minutos de secado.
El tiempo total del procedimiento de preparación de la muestra fue de aproximadamente 9
minutos, con las pruebas cromatográficas. Completado en 24 min.

pág. 33
3.4. Parámetros de validación **
Coeficientes de correlación (r) de las
>0.9955
curvas de calibración
Los valores de LOD (Límite de
Entre 0.76 a 1.52 μg L − 1
Detección)
Los valores de LOQ (Límite de
Entre 2.5 a 5.0 μg L – 1
Cuantificación)
Recuperación relativa Entre 63 y 118%.
Precisión intra-día (Repetibilidad) Entre 0.7 a 15.3%
Precisión inter-día (Repetibilidad
Entre 4.9 a 13.1%
intermedia)
**anexo 2 y 3

Los resultados obtenidos al aplicar el método propuesto se compararon

con los de otros estudios publicados previamente en la literatura para la
determinación de pesticidas en muestras biológicas utilizando diferentes
técnicas de preparación de muestras, como se muestra en la Tabla 4.
Como se puede observar en esta tabla, en el método desarrollado en este
estudio, el volumen de muestra requerido es menor en relación con los
otros métodos

Otro factor importante es el tiempo total de preparación de la muestra;

el método descrito aquí requiere solo 9 minutos para realizar este paso,
mientras que los otros métodos citados requieren un rango de 15 minutos
a más de 2 horas.

4. Conclusiones
La metodología propuesta en este estudio para la determinación de los
pesticidas en muestras de orina humana que utilizan la técnica de
extracción de pipetas desechables se optimizó con éxito y mostraron un
rendimiento analítico muy satisfactorio con alto rendimiento y eficiencia.
Se obtuvieron valores más bajos para el LOD y LOQ, se usa un volumen
de muestra más pequeño en el análisis y se requiere un tiempo más corto
para la preparación de la muestra utilizando la metodología propuesta en

pág. 34
 comparación con la mayoría de los métodos reportados en la literatura
para el análisis de pesticidas en fluidos biológicos.

pág. 35
Anexo I

pág. 36
Anexo II

pág. 37
Anexo III

pág. 38
 Caso 3:

“ESTANDARIZACIÒN Y VALIDACION DEL METODO POR

CROMATOGRAFIA DE GASES ACOPLADO A ESPECTOMETRIA DE
MASA (GC- MS), PARA EL ANÁLISIS DE TRES BENZODIACEPINAS Y
SUS METABOLITOS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS DE INTERES
FORENSE EN EL INSTITUTO NACIONAL DE MEDICINA LEGAL Y
CIENCIAS FORENSES”

Resumen:
Los benzodiacepinas son medicamentos ampliamente conocidos para
manejar la ansiedad, el insomnio, la epilepsia, los espasmos musculares y
algunos trastornos psiquiátricos. En muchos países, son las sustancias que
más se utilizan con fines delictivos, dada la capacidad de poner a la víctima
en incapacidad de resistir. Los benzodiacepinas son fármacos depresores
del Sistema Nervioso Central, ansiolíticos, sedantes e hipnóticos.
Importantes en el ámbito forense debido a su participación activa, en delitos
sexuales y hurtos, donde se convierten en las sustancias de elección para
poner en estado de indefensión a las personas, muy a pesar de ser
controladas.
Este proyecto pretende validar el método de extracción y la técnica
instrumental para el análisis de Benzodiacepinas (análisis cualitativo de las
muestras de orina por Cromatografía de Gases acoplado a Espectrometría
de Masas) utilizada en el laboratorio de Toxicología Forense del Instituto
Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses Regional
Occidente(Colombia), para que pueda ser introducido como prueba en
procedimientos penales, administrativos, contravencionales de familia y otros
bajo el Sistema Penal Acusatorio.

pág. 39
 1. Objetivo.

• Estandarizar y validar la metodología para la confirmación de tres

Benzodiacepinas y sus metabolitos en muestras de interés forense
empleando Cromatografía de Gases Acoplado a espectrometría de Masas
(GC-MS).

2.Marco teórico.

BENZODIACEPINAS.
Químicamente están constituidas por un sistema anular heterocíclico
formado por la unión de un anillo bencénico (A) y un anillo (B) que contiene
dos átomos de nitrógeno (ver figura 1), este es el anillo diacepínico, los
benzodiacepinas importantes contienen un sustituyente 5 arilo en el anillo C,
(5-aril-1,4 benzodiacepinas).

Alprazolam.
Benzodiacepina Ansiolítica, formula C17H13ClN4 =308,8 g/mol, Un
polvo cristalino blanco. Punto de fusión 228 °C a 228.5 °C.
Prácticamente insoluble en agua, poco soluble en alcohol y en
acetona; soluble en cloroformo y diclorometano.

pág. 40
 Clobazam.
Ansiolíticos, anticonvulsivo, tranquilizantes, formula C16H13ClN2O2 =
300,7 g/mol Polvo cristalino blanco. Punto de fusión 166 °C a 168 °C.
Prácticamente insoluble en agua, poco soluble en etanol; libremente
soluble en acetona y cloroformo.

Diazepam.
Ansiolítico, tranquilizante, formula C16H13ClN2O = 284,8 g/mol. Polvo
cristalino blanco o amarillo. Punto de fusión 125 °C a 126 °C.
Ligeramente soluble en agua, soluble en 1 de cada 25 de etanol, 1 en
2 de cloroformo, y 1 de cada 39 de éter.

3.Metodología.
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y ESTÁNDARES DE TRABAJO.

Se prepararon soluciones patrones individuales para cada una de los

benzodiacepinas a una concentración de 100 mg/L en metanol. Las
soluciones Patrón luego se almacenaron a 4 ºC hasta su uso. A partir de
estas soluciones se prepararon soluciones estándares de trabajo a varias
concentraciones diluidas en metanol en un rango de concentración
establecido en ppm.

DETERMINACIÓN SOLVENTE DE EXTRACCIÓN

Para la determinación del solvente de extracción se realizarán varias

extracciones de una mezcla de los benzodiacepinas utilizando diferentes
solventes como son cloroformo puro y una mezcla de solventes Cloroformo:
Isopropanol (9:1) y Acetonitrilo: Hexano (9:1) esta determinación se realizará
por triplicado, además se realizarán tres (3) extracciones con β-
Glucoronidasa y tres (3) extracciones sin β-Glucoronidasa y su posterior
análisis cromatográfico.

pág. 41
 Hidrolisis básica.
Adicionar en un tubo de ensayo con capacidad de
15 mL una cantidad 2 mL de la muestra biológica de
interés (orina), posteriormente adicionar 100 μL de
β-glucoronidasa y 1 mL de solución saturada de
tetra borato de sodio, agitar y confirmar pH de la
solución (entre 9 y 10), incubar a 37ºC por 2 horas
en baño maría.
Extracción con solventes.
Luego de realizar la hidrólisis básica, dejar enfriar
cada tubo a temperatura ambiente; adicionar a cada
tubo 3,5 mL de Cloroformo, llevar al roto mezclador
MÉTODO DE a 40 rpm por 20 min, seguida de centrifugación a
EXTRACCIÓN: 2000 rpm por 10 min, separar la fase orgánica en un
tubo limpio de la fase acuosa, seguidamente
adicionar a la fase acuosa otros 3,5 mL de
Cloroformo, de igual manera llevar a roto mezclado
por 20 min a 40 rpm seguido de centrifugación a
2000 rpm durante 10 min, juntar las dos fases
orgánicas, se lleva la fase orgánica a sequedad a 56
ºC con agitación a 40 rpm.
Derivatización.
Al finalizar la extracción de solventes reconstituir
con 80 μL de BSTFA + TMS (99:1), tapar cada tubo
con papel parafilm y calentarlos a 65 ºC por 25 min
con agitación de 24 rpm (si se evapora
completamente reconstituir con tolueno entre 30 y
80 μL); llevar la muestra de cada tubo a viales con
insertos e inyectar en método cromatográfico.

pág. 42
 CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO DE GASES
Cromatógrafo de gases 7890A equipado con un detector
Equipo
espectrómetro de masas con cuadrupolo 5975C
Marca Agilent Technologies
Columna HP DB-5-MD (95% Dimetilpolixilosano-5% de
Tipo de columna
Fenil)
Medidas de la
30 mx 0,25 mm x 0,25 µm de espesor de película
columna
Gas portador Helio
Tiempo de corrida 23.5 Min.
Temperatura Tiempo
Temperatura del T inicial 120°C 1 min
horno Aumenta 10°C/Min
T final 295 °C 5min
Modo Split
Puerto de Inyección Presión 11.618 psi
Relación de división 2:1

pág. 43
 Figura 2. Cronograma de una muestra de orina de las soluciones control para
cada Benzodiacepina.

pág. 44
 Tabla 2. Fragmentaciones moleculares de los compuestos de interés.

IDONEIDAD DEL SISTEMA CROMATOGRÁFICO.

El cálculo de idoneidad del sistema cromatográfico se realizó con el software
del equipo y la hoja de cálculo Excel La cual se estableció a partir de 20
inyecciones de cada concentración de benzodiacepina. Coeficiente de
variación menor al 5%, factor de capacidad mayor de 2 y resolución mayor
de 2.

Tabla 3. Idoneidad del sistema cromatográfico.

pág. 45
 LINEALIDAD DEL MÉTODO-SISTEMA.
La linealidad del método se comprobó con soluciones entre 5 y 30 ppm para
las Benzodiacepinas, cada una de ellas a partir de patrones de 100 ppm.
Verificar 5 niveles de concentración con cuatro repeticiones por nivel, rango
establecido 25% y el 200% de la concentración terapéutica al menos 5
niveles de concentración y analizarlas por triplicado.

Tabla 4. Linealidad del sistema cromatográfico.

PRECISION
Precisión intermedia. La precisión intermedia fue desarrolla por dos
analistas para dos niveles de concentración los cuales se encontraban en el
rango de las curvas con 3 repeticiones por nivel para cada benzodiacepina.
Los resultados de tiempos de retención de cada una de los benzodiacepinas
se observan a continuación.

pág. 46
 Tabla 5. Precisión intermedia de Alprazolam

Tabla 6 Precisión intermedia de Clobazam

pág. 47
 Tabla 7. Precisión intermedia de Diazepam

SELECTIVIDAD.
en la figura 6 se muestran los benzodiacepinas Alprazolam, Clobazam en presencia
de barbital, benzoilecgonina, cocaína, escopolamina y morfina. Cada compuesto de
los mencionados es identificado por el equipo utilizando el método de extracción y
los parámetros descritos en la metodología.

pág. 48
 Figura 3. Cromatograma completo benzodiacepinas e interferencias.

El alprazolam en presencia de las interferencias es identificado a un tR 19,930min.

pág. 49
 Figura 4. Espectro de masa Iones característicos Alprazolam.

El Clobazam en presencia de las interferencias es identificado a un tr 16,596min.

Figura 5. Espectro de masa Iones característicos Clobazam.

pág. 50
El Barbital como interferencia es identificado a un tr 7,078min.

pág. 51
 Figura 6. Espectro de masas Iones característicos barbital.

.Benzoilegonina como interferencia es identificada a un tr 17,839min.

pág. 52
 Figura 7. Espectro de masas Iones característicos Benzoilecgonina.

Cocaína como interferencia es identificada a un tr 13,331min.

pág. 53
 Figura 8. Espectro de masas Iones característicos cocaína.

pág. 54
 Figura 9. Espectro de masas Iones característicos morfina como interferente.

Escopolamina como interferencia es identificada a un tr 14,542min.

pág. 55
 Figura 10. Espectro de masas Iones característicos escopolamina.

pág. 56
 ESTABILIDAD.
La estabilidad para las benzodiacepinas se desarrolló por tres días
consecutivos, para una mezcla de las benzodiacepinas que contiene
alprazolam, Dextrometorphan, Diazepam y Flunitrazepam teniendo una
mezcla de estas en refrigeración y otra a temperatura ambiente a una
concentración de 20 ppm.

Tabla 8. Estabilidad Temperatura ambiente Alprazolam.

Tabla 9. Estabilidad refrigeración 4ªC Alprazolam.

pág. 57
 Tabla 10. Estabilidad Temperatura ambiente Diazepan.

Tabla 11. Estabilidad refrigeración 4ªC Diazepam.

4. Conclusiones.
• Se estandarizo y valido una metodología de extracción y de identificación
de benzodiacepinas y sus metabolitos en fluidos de interés forense
empleando dicha metodología para cualificar las benzodiacepinas en
muestras de orina.
• En presencia de interferencias o sustancias las cuales pueden ser
consumidas junto con las benzodiacepinas, el método propuesto permite
identificar las benzodiacepinas de manera clara al igual que las
potenciales interferencias.
• Los resultados obtenidos en la validación del método permiten asegurar
que es confiable y preciso, ya que este cumple con los criterios de
validación.
• La metodología desarrollada para la determinación de las
benzodiacepinas por GS/MS permite la cualificación de varias
benzodiacepinas, en sangre y fluidos biológicos de interés forense.

pág. 58
 4.2 PRUEBA DE LA ESCENA DEL CRIMEN:

Caso 4:
“ANÁLISIS FORENSE DE MUESTRAS DE COCAÍNA PRODUCIDAS EN
COLOMBIA: I. PERFIL CROMATOGRÁFICO DE MUESTRAS DE
CLORHIDRATO DE COCAÍNA”

Resumen:
En este estudio, se perfilan cromátograficamente sesenta y cinco (65)
muestras decomisadas de clorhidrato de cocaína. Se les determina la pureza
y se hace análisis cualitativo de adulterantes, diluyentes y solventes
residuales ocluidos. En las muestras se detecta la presencia de tropacocaína,
norcocaína, cis-cinnamoilcocaína, trans-cinnamoilcocaína, benzoilecgonina,
así como de los adulterantes: cafeínas, fenacetina, levamisol e hidroxicina.
En el análisis cuantitativo se encuentra que la pureza de cocaína más baja
fue del 64.58% y la más alta del 95.83%. En cuanto a solventes residuales,
se detectan 136 compuestos de esta naturaleza, algunos de los cuales fueron
identificados preliminarmente. Los anteriores resultados aportan al
conocimiento de la química forense y del potencial toxicológico de muestras
de clorhidrato de cocaína producidas e incautadas en Colombia.

1. Materiales y métodos:
Muestras de clorhidrato de cocaína: muestras:
Se definió un grupo conformado de sesenta y cinco muestras de clorhidrato
de cocaína, provenientes de diferentes regiones del país, suministradas por
los Laboratorios de la Fiscalía General de la Nación. Cada una provenía de
un decomiso de bloques de 1.0 kg de peso aproximado (tamaño promedio 20
x 15 x 3 cm). Normalmente esta presentación es empleada para abastecer el
mercado internacional. Las muestras se codificaron aleatoriamente,
identificándolas de la 101 a la 165.

pág. 59
 • TECNICAS UTILIZADAS:

I. DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LAS IMPUREZAS

ALCALOIDALES Y DILUYENTES

Preparación de muestras
La determinación cualitativa de las impurezas alcaloidales y diluyentes, se
obtuvo preparando soluciones de 10 mg de muestra en 2 mL de etanol,
cada una de las cuales se analizó en modo splitless, apagando el detector
entre 9.78 y 9.85 min, tiempo de elución de la cocaína.

CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO DE GASES

Equipo
Marca
Tipo de columna
Medidas de la columna
Gas portador
Tiempo de corrida
Temperatura del horno
Puerto de Inyección
CONDICIONES DE ESPECTRÓMETRO DE MASAS
Temperatura fuente de iones: 230ºC
Temperatura cuadrupolo: 150ºC
Temperatura interfase: 280ºC
Rango de masas: 20-400
Cromatografía de gases (Agilent HP 6890), acoplado a un detector
selectivo de masas HP 5973, con automuestreador.
Agilent Technologies
Columna ZB-1
30 m x 0.25 mm x 1.0 µm
Helio
23.5 Min.
A 200 ºC por 0.5 min, a 20°C/min hasta 230°C por 5 min y
calentamiento a 30°C/min hasta 310°C, durante 6 min.
Modo Split (20:1) y splitless
Volumen de inyección 1 μL
Temperatura del puerto de
260ºC
inyección

pág. 60
 II. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA COCAÍNA

Preparación de muestras:
Para cuantificar se empleó la curva de calibración en el rango de 100 a 700
ppm de cocaína, con la adición de tetracosano, como estándar interno, a una
concentración de 400 ppm.

CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO DE GASES

Cromatografía de gases con detector de ionización de llama (CG-
Equipo
FID)-, Modelo 4400.
Marca VARIAN
Tipo de columna Columna ZB-1
Medidas de la
30 m x 0.25 mm x 1.0 µm
columna
Gas de Arrastre Nitrógeno

Tº inicial 250°C por 1 min, calentamiento a 20°C/min hasta

Temperatura del horno 290°C, manteniendo por 5 min y calentamiento a 5°C/min hasta
310°C, manteniendo por 2 min.
Flujo 2 mL/min
Modo Split (20:1)
Volumen de inyección 1 μL
Puerto de Inyección
Temperatura del puerto de
280ºC
inyección
Temperatura del detector 280ºC

III. DETERMINACIÓN DE DISOLVENTES RESIDUALES

Preparación de muestras:
En un vial para headspace se pesó el equivalente a 30 mg de cocaína pura.
Se añadieron 10 mL de solución acuosa de sulfato de sodio al 22%, se selló

pág. 61
 el tubo, se agitó y analizó por CG-FID el efluente del espacio de cabeza. Los
análisis se realizaron por triplicado.
CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO DE GASES
Cromatógrafo de gases CP-8200 con automuestreador Combi pal
Equipo
(módulo headspace), con detector de ionización de llama.
Marca VARIAN
Tipo de columna Columna AT-1
Medidas de la columna 60 m x 0.25 mm x 1.0 μm
Gas de Arrastre Helio UAP

Tº inicial 35°C por 12 min, calentamiento a 7°C/min hasta 130 °C y

Temperatura del horno
calentamiento a 30°C/min hasta 200°C, durante 5 min.
Flujo 2 mL/min
Modo Split (5:1)
Volumen de inyección 1 μL
Puerto de Inyección
Temperatura del puerto de
200ºC
inyección
Temperatura del detector 200ºC
CONDICIONES DEL HEADSPACE
Temperatura del horno: 80ºC
Temperatura de la jeringa: 100ºC
Tiempo de Incubación: 30 min.
Velocidad de llenado: 100 μL/s.

2.Resultados:
En la tabla 1 se presentan los analitos detectados en cada muestra y el
porcentaje de muestras en las que aparece cada uno de ellos, así como el
porcentaje de pureza de cocaína. La identificación de los analitos se hizo
teniendo en cuenta el criterio cromatográfico (tiempo de retención) y el criterio
espectral (comparación de los espectros de masas con la biblioteca NIST).

pág. 62
pág. 63
 Al someter cada muestra, por triplicado, al análisis de solventes residuales,
se encontró que en las 65 muestras en total había 136 señales
cromatográficos. Al superponer las 3 lecturas de las muestras, estas
presentaron reproducibilidad entre ellas, véase en la siguiente imagen:

3. Conclusiones:
Con el análisis cualitativo por CG-EM se logró el reconocimiento de los
alcaloides tropacocaína, norcocaína, cis-cinnamoilcocaína, trans-
cinnamoilcocaína, benzoilecgonina, así como de los adulterantes: cafeína,
fenacetina, levamisol e hidroxicina, todos ellos a nivel de trazas.
En el análisis cuantitativo de las muestras se encontró que la pureza de
cocaína más baja fue del 63.82% y la más alta del 95.83%. El 84% de las
muestras tenían una pureza en el rango de 71 a 90%, y tan solo el 11%
de éstas presentaron una pureza superior al 90%.
Mediante análisis por HS-CG-FID, se logró la determinación de solventes
residuales ocluidos en las muestras incautadas de clorhidrato de cocaína,
teniendo como población de estudio 65 de ellas. Se estableció la presencia
de 136 picos cromatográficos diferentes, algunos de ellos con muy baja
frecuencia de aparición en la población estudiada.

pág. 64
 4.3 INVESTIGACIÓN DE INCENDIOS
CASO 5
“UNA INVESTIGACIÓN DE INCENDIOS MEDIANTE EL USO DE
CROMATOGRAFÍA DE GAS BIDIMENSIONAL INTEGRAL-
ESPECTROMETRÍA DE MASAS CUADRUPOLO”

Resumen

Una práctica común de los incendiarios es el uso de materiales inflamables y

acelerantes; donde los acelerantes son fluidos inflamables. Los acelerantes
utilizados son generalmente líquidos de hidrocarburos, es decir, queroseno,
diesel o gasolina

Los escombros de presuntos incendios se analizan de forma rutinaria en

busca de trazas de cantidades de aceleradores de hidrocarburos. Las
muestras de residuos suelen ser sellado en la escena del incendio, en un
recipiente hermético de aluminio o vidrio que garanticen la conservación de
sus propiedades fisicoquímicas originales.

El análisis se realiza en tres etapas. La primera etapa consiste en la

concentración y extracción de las muestras. La segunda etapa involucra el
análisis instrumental de las muestras concentradas extraídas. Finalmente, la
última etapa implica la interpretación y análisis de resultados

Por otro lado, la extracción con disolventes. es rápido; sin embargo, los
componentes indeseables pueden extraerse de la Matrices que interfieren
con el análisis.

1. Objetivo:

Desarrollar una nueva herramienta para la investigación de aceleradores de

hidrocarburos

pág. 65
 2. Materiales y métodos:

Preparación de muestras:

Se prepararon muestras de gasolina, queroseno y diesel diluyendo 0,09 g de

cada muestra en 10 mililitros de cloruro de metileno. Las muestras de
incendio se extrajeron con cloruro de metileno. A propósito, seleccionamos
extracción por solventes. Como se dijo anteriormente, esta técnica de
extracción y concentración de muestras es bastante sensible, pero
problemática. El solvente puede extraer compuestos indeseables de la matriz
que pueden interferir con el análisis

CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO DE GASES

El sistema GC / MS utilizado fue un Shimadzu QP 2010 Ultra.
Esta es una plataforma de cromatógrafo de gases cuádruplo.
Como regla general, los espectrómetros de masas de
cuádruplo tienen una velocidad de exploración relativamente
lenta y esto se ha convertido en un factor limitante para el uso
de cuádruplos en GCXGC-MS. Las velocidades máximas
Equipo permitidas de adquisición de datos han sido 30 Hz. Esto es
demasiado lento para proporcionar puntos suficientes para
los picos ultra agudos generados por GCXGC integral. Sin
embargo, este instrumento está equipado con un firmware,
Advanced Scanning Speed Protocol (ASSP) y un algoritmo
de recolección de datos rápido, que permite de recolección
más rápidas.
Marca Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Columbia, MD
Se montó un modulador de bucle térmico de dos etapas
(Zoex Corp. Lincoln, NE) en la parte superior del horno GC
para proporcionar capacidades completas de cromatografía
Modulador de Bucle
de gases bidimensional. Este sistema emplea dos chorros de
gas, un frío y un chorro caliente. El único chorro frío enfría
dos diferentes. Segmentos de la segunda columna,

pág. 66
 atrapando los compuestos en las dos secciones de la
segunda columna. El chorro caliente, colocado perpendicular
al frío, libera los compuestos atrapados.
Modulador Periodo 4.0 s. Con1: 330ºC
La primera columna se seleccionó con una fase de alta
polaridad
BPX50, SGE Analytical Sc.
Primera columna Tipo de Columna Austin, TX (Phenyl
Polysilphenylene siloxane)
30 m X 0.25 mm X 0.50 µm,
Medidas de la columna
50%
La segunda columna fue no polar
BPX1, SGE Analytical Sc.,
Segunda columna Tipo de Columna Austin, TX (100%
Polydimethylsiloxane)
Medidas de la columna 2 m X 0.1 mm X 0.1 µm
40ºC por 2 min.
Temperatura del
40-325ºC (5ºC/min)
horno
Mmantener a 325ºC por 30 min
Modo Split (10:1)
Volumen de inyección 1 μL

Puerto de Inyección Temperatura del puerto

325ºC
de inyección

Presión 70.1 kPa

La separación se produjo a través de una interacción polar por volátil con las
muestras. Por lo tanto, las muestras se separaron por polaridad en el eje x y por los
tiempos de retención del eje y del punto de ebullición.

pág. 67
 Table 1: GC Experimental Parameters.

pág. 68
 Patrón de huella dactilar de los iones diagnósticos selectivos asociados. con
aceleradores de hidrocarburos se pueden utilizar para el cribado y
Identificación de un acelerante particular. Los iones diagnósticos que se
encuentran. utilizados para estos tipos de identificaciones se dan en la tabla
2.

Componentes m/za
Alcanos 57, 71, 85, 99
C1 a C4 alquilbencenos 91, 105, 114
Hidrocarburos alicíclicos y olefínicos. 55, 69, 83, 97
Benceno, alquilbencenos de C1 a C3 78, 92, 106, 120
Alquilbencenos C4 a C5 119, 134, 148, 162
Alquilnaftalenos 128, 142, 156, 170
a Los iones en negrita son los iones seleccionados

Table 2: Iones característicos para la identificación del patrón acelerante.

Los conjuntos para alcanos (57, 71, 85, 99) m / za, alquilbencenos (91, 105,
119, 134) m / za y alquilnaftalenos (128, 142, 156, 170) m / za se utilizaron en
esta investigación. Se dan los cromatogramas de iones selectivos para estos
conjuntos de iones para gasolina, queroseno, Diesel y la muestra de
sospecha de incendio. en las figuras 5-16. A partir de los cromatogramas de
iones selectivos, fue posible Para visualizar el patrón de huella dactilar de un

pág. 69
 acelerante en el caso sospechoso. muestra de incendio. Se observó una
coincidencia bastante estrecha entre el Diesel y

La muestra sospechosa de incendio. Las porciones de luz de los

cromatógrafos son ligeramente diferentes. Los componentes de bajo punto
de ebullición de los acelerantes suelen ser los primeros en ser consumidos
por el fuego. Por lo tanto, fue posible confirmar positivamente la presencia de
acelerante (posiblemente diésel) en la muestra de sospecha de incendio.

pág. 70
 3.Conclusiones

Los aceleradores de hidrocarburos y una posible muestra de incendio se

analizaron mediante cromatografía de gases bidimensional integral:
espectrometría de masas cuadrupolo (GCXGC-qMS). GCXGC-qMS tiene la
ventaja de usar dos columnas cromatográficas de gases ortogonales. El
primero era una columna polar y el segundo una columna no polar, el detector
era un espectrómetro de masas de cuadrupolo de exploración rápida.
Mediante el uso de SIM, se logró una separación bidimensional de las
muestras. Claramente, al utilizar SIM de iones objetivo selectivos, podemos
generar patrones de huellas dactilares que pueden ser útiles para identificar
acelerantes en muestras de desechos de incendios.

5 CONCLUSIONES
➢ La cromatografía de gases es una técnica muy útil para de separación y
determinación de diversas sustancias en escenas de crímenes, estas
sustancias tienen que ser compuestos orgánicos volátiles y semivolátiles
térmicamente estables. Acoplada a la espectrometría de masas, permite
una identificación inequívoca de los distintos componentes separados sin
necesidad de disponer de patrones de los mismos. A la vez podemos
cuantificar los analitos para lo cual se requiere preparar curvas de
calibración.
➢ Se expusieron ejemplos prácticos de a aplicación de la cromatografía de
gases en escenas de crímenes donde llegamos a la conclusión que en

pág. 71
 gran parte los trabajos desarrollados se emplea el cromatógrafo de gases
acoplado al MS incrementando así la sensibilidad y selectividad del analito
en estudio.

6 RECOMENDACIONES

➢ Se recomienda fomentar el desarrollo de métodos analíticos que permitan optimizar,

implementar o actualizar aquellos métodos desarrollados poco selectivos o sensibles,
➢ Fomentar la atención, revisión e implementación de nuevos métodos desarrollados en
cuanto a la evaluación de sustancias en escenas de crímenes.
➢ La recopilación bibliográfica realizada muestra la carencia de artículos peruanos publicados
referentes al tema, por ello se recomienda poner más énfasis en la investigación y
publicación de artículos, tesis y demás referente al tema.

7 BIBLIOGRAFÍA

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https://www.chromatographytoday.com/news/gc-mdgc/32/breaking-
news/how-is-gas-chromatography-used-in-forensics/30185, (Obtenido
16 de marzo del 2019).

2. Método físico de análisis instrumental en la investigación criminal.

http://www.unilibre.edu.co/revistaingeniolibre/revista8/articulos/Metod
os-fisicoquimicos-de-Analisis-Instrumental.pdf (Obtenido 26 de marzo
del 2019)

3. Detección de sustancias combustibles en incendios relacionados con

hechos criminales.
https://www.inacif.gob.gt/index.php/therapies/k2-blog/item/19
deteccion%20de-sustancias-combustibles-en-incendios-
relacionados-con-hechos criminales, (Obtenido 16 de marzo del 2019)

pág. 72
 4. Caso de asesinato de la colonia Aarey: expertos forenses de Mumbai
utilizan "instrumentos de alta gama" para detectar rastros tóxicos
https://www.freepressjournal.in/mumbai/aarey-colony-murder-case-
mumbai-forensic-experts-using-high-end-instruments-to-detect-
intoxicant traces/1289394(Obtenido 16 de marzo del 2019)

5. Determinación por cromatografía de gases, el valor del cociente:

etanol en humor vitreo/sangre en cadáveres necropsiados de la
Morgue del Cusco
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1727-
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6. Método de análisis de monóxido de carbono en sangre humana
mediante una jeringa de gas hermético - Cromatografía de gases -
Espectrometría de masas (AGS-GC-MS): relevancia para el
diagnóstico de envenenamiento postmortem
https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2018.05.019 , (Obtenido el 21 de
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7. Una metodología analítica eficaz y de alto rendimiento para la

detección de plaguicidas en orina humana mediante extracción con
pipeta desechable y cromatografía de gases: espectrometría de
masas
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S157002321830829
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8. Estandarización y validación del método por cromatografía de gases

acoplado a espectrometría de masa (gc- ms) para el análisis de 4
benzodiacepinas y sus metabolitos en muestras biológicas de interés
forense en el instituto nacional de medicina legal y ciencias forenses.

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 https://core.ac.uk/download/pdf/71397735.pdf (Obtenido el 5 de abril
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9. Análisis forense de muestras de cocaína producidas en colombia: i.

perfil cromatográfico de muestras de clorhidrato de cocaína
http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0121-
40042009000200007.(Obtenido el 30 de marzo del 2019).

pág. 74
 ANEXOS

pág. 75
pág. 76
pág. 77
pág. 78
pág. 79
pág. 80