Unidade: Pesquisa de bactérias dos Grupos Coliforme e Coliforme Fecal pela

Técnica do Número Mais Provável

Objetivos de ensino:

1. Conhecimentos

• Metodologia de determinação do Número Mais Provável (NMP) de bactérias dos

grupos coliforme e coliforme fecal numa amostra de alimento.

2. Habilidades

• Expressar resultados através do uso de uma tabela de Número Mais Provável

3. Atitudes

• Rigor científico

Microbiologia de Alimentos 1
CONTAGEM DE BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME E COLIFORMES FECAIS PELA
TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)

1. INTRODUÇÃO

Bactérias do grupo coliforme

O termo habitual “coliforme” compreende a bactéria Escherichia coli e diversas espécies

pertencentes a outros gêneros da família Enterobacteriaceae. Praticamente falando, os
“coliformes” são os microrganismos que se detectam pelas “provas para coliformes”. Este
grupo de bactérias apresentam as seguintes características em comum: são bactérias na
forma de bastonete, Gram-negativas; não esporuladas, que fermentam a lactose com
produção de gás em 48 h a 35 °C.

Tabela - Gêneros detectados e não detectados nas provas para coliformes, seus habitats
fecais ou não fecais e sua enteropatogenicidade potencial para o homem.
Gênero Predominantemente Geralmente detectado Tipicamente
de origem fecal nas provas para enteropatogênicos
coliformes” para o homem
Escherichia Sim Sim Não
Edwarsiella Sim Não Não
Citrobacter Não Sim Não
Salmonella Sim Não Sim
Shigella Sim Não Sim
Klebsiella Não Sim Não
Enterobacter Não Sim Não
Hafnia Não Não Não
Serratia Não Não Não
Proteus Não Não Não
Yersinia Sim Não Não
Erwinia Não Não Não

Nos alimentos naturais e nas superfícies de utensílios e equipamentos nas indústrias de

alimentos, vários tipos de bactérias da família das Enterobacteriaceae permanecem mais
tempo que a Escherichia coli.

As espécies de Erwinia e Serratia estão associadas com vegetais e não indicam

contaminação fecal. Isso explica porque E. Coli é o único microrganismo índice válido
para análise de vegetais frescos.

Nos alimentos frescos ou naturais de origem animal, a maior parte das

enterobacteriáceas procede de contaminações de origem fecal e sua presença em grande
número pode indicar uma manipulação não higiênica e/ou armazenamento inadequado.
Nos alimentos que receberam um tratamento para garantir sua sanidade, a presença de
níveis consideráveis de Enterobacteriaceae ou de coliformes indica:

• Tratamento inadequado e/ou contaminação posterior ao tratamento, mais

freqüentemente a partir de matérias-primas, equipamentos sujos ou manipulação não
higiênica;

• Multiplicação microbiana que poderia ter permitido o crescimento de toda uma série
de microrganismos patogênicos e toxigênicos.

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Coliformes de origem fecal

Os “coliformes fecais” compreendem um grupo de microrganismos selecionados de

inóculos procedentes de caldos de enriquecimento de coliformes a temperaturas de
35 °C. Tais cultivos de enriquecimento contém geralmente uma alta porcentagem de
Escherichia coli tipo I e II e são, por isso, indicadores de uma provável contaminação de
origem fecal do alimento.

Esse método para a quantificação de coliformes fecais, baseado na fermentação da

lactose em temperatura elevada (44 - 45 °C), apresenta algumas deficiências, pois outros
coliformes termotolerantes além da E. coli, principalmente Klebsiella, os quais por não
serem de origem exclusivamente fecal, comprometem a utilização do subgrupo
coliformes fecais como indicadores de contaminação fecal. Em decorrência disto, as
tendências atuais, em termos de desenvolvimento de metodologia analítica, se
direcionam para a detecção específica de E. coli.

Técnica do Número Mais Provável (NMP)

A técnica do NMP é uma forma de se estimar o número de microrganismos presentes na

amostra. É baseada na probabilidade estatística de certo número de microrganismos
estarem presentes na amostra quando um série de resultados positivos ocorrem.

Esta estimativa é obtida pelo preparo de diluições decimais sucessivas da amostra e a

transferência de alíquotas destas diluições para uma série de três ou cinco tubos
contendo meio de cultura adequado.

No caso da análise de coliformes, o resultado positivo é evidenciado pela presença de gás

no interior do tubo invertido (tubo de Durhan), contido no interior do tubo com meio de
cultura.

O método do NMP é portanto uma forma indireta de medida, em contraste com a técnica
de plaqueamento que pode ser considerada como um método direto.

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2. MATERIAL

• Alça de 3 mm de platina ou níquel-cromo nº 25 em cabo de Kolle;

• Pipetas bacteriológicas de 1,0 e 10,0 mL com graduação decimal;
• Banho-maria de precisão regulado a 44,5 ± 0,2 °C com agitação;
• Estufa bacteriológica regulada a 36 ±1 °C;
• Frasco Erlenmeyer de 500 mL, contendo 225 mL de solução salina a 0,85% estéril, ou
frasco de diluição, contendo 90 mL de solução salina a 0,85% estéril;
• Tubos de ensaio contendo 10 mL de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubo de
Durhan invertido;
• Tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo Lactosado Bile Verde Brilhante a 2% com
tubo de Durhan invertido;
• Tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo EC com tubos de Durhan invertidos;
• Culturas padrão de E. Coli e de Enterobacter aerogenes.

3. MEIOS DE CULTURA

3.1 .Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST)

Composição Concentração (g/L)

triptona 20
lactose 5,0
cloreto de sódio 5,0
lauril sulfato de sódio 0,1
fosfato dibásico de potássio 2,75
fosfato monobásico de potássio 2,75
pH final 6,8 ± 0,2

MODO DE AÇÃO:

Os nutrientes presentes no meio e o tampão fosfato, permitem o rápido crescimento e

produção de gás de microrganismos que fermentam a lactose, mesmo aqueles que
fermentam lentamente. O lauril sulfato apresenta ação seletiva, inibindo o crescimento
de microrganismos indesejáveis.

3.2. Caldo Lactosado Bile Verde Brilhante

Composição Concentração (g/L)

peptona 10,0
lactose 10,0
bile de boi desidratada 20,0
verde brilhante 0,0133
pH final 7,2 ± 0,1

MODO DE AÇÃO:

A presença de verde brilhante e bile, inibe o crescimento de microrganismos

indesejáveis.

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3.3. Caldo EC

Composição Concentração (g/L)

triptona 20,0
lactose 5,0
sais biliares 1,5
fosfato dibásico de potássio 4,0
fosfato monobásico de potássio 1,5
cloreto de sódio 5,0
pH final 6,9 ± 0,1

MODO DE AÇÃO:

A presença de lactose favorece o crescimento de microrganismos que fermentam a

lactose. Os sais biliares inibem o crescimento de bactérias Gram-positivas e de
microrganismos não adaptados ao ambiente intestinal.

3.4. Ágar Eosina Azul de Metileno (EAM)

Composição Concentração (g/L)

peptona 10,0
fosfato dibásico de potássio 2,0
lactose 10,0
Eosina amarela 0,4
azul de metileno 0,065
ágar 15,0
pH final 7,0 ± 0,2

MODO DE AÇÃO:

A combinação de eosina e azul de metileno possibilita a diferenciação entre colônias de

Escherichia coli e Enterobacter aerogenes.
Característica do crescimento:
As colônias de Escherichia coli, apresentam-se com um diâmetro de 2 a 3 mm, centro
negro e brilho verde metálico. Algumas vezes o brilho metálico pode estar ausente ou ser
pouco visível.
As colônias de Enterobacter apresentam-se com um diâmetro de 4 a 6 mm, centro
variando de cinza à marrom, aparência mucóide e não apresentam brilho metálico.
Bactérias que não fermentam a lactose, como por exemplo, a maioria das espécies de
Salmonella e Shigella, apresentam-se, translúcidas e incolores.

4. METODOLOGIA

4.1 Preparo da amostra

• pesar 25 g (ou 10 g) da amostra de forma asséptica;

• transferir para um triturador (ou saco do Stomacher) e adicionar 225 mL (ou 90 mL)
de solução salina 0,85%, estéril;
• homogeneizar durante dois minutos em velocidade máxima;
• preparar diluições decimais seriadas (1:100; 1:1000), adicionando 10 mL da diluição
anterior em 90 mL de solução diluente (solução salina 0,85%) estéril;
• agitar os frascos vinte vezes antes de cada retirada de amostra.

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4.2. Teste presuntivo para coliformes

• Inocular 3 tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo lauril sulfato triptose, com 1 mL

da primeira diluição;
• Repetir a mesma operação para as diluições subsequentes;
• Incubar os tubos por 24 e 48 ± 2 h a 36 ± 1 °C;
• Após 24 h verificar os tubos com produção de gás. Reincubar os tubos negativos por
mais 24 h;
• Para cada diluição, anotar o número de tubos com produção de gás no período de
48 ± 2 h.

4.3. Teste confirmativo para coliformes

• Transferir uma alçada (com o auxílio da alça de inoculação) de cada tubo positivo do
teste presuntivo para outro tubo contendo 10 mL de caldo lactosado bile verde
brilhante;
• Incubar os tubos por 24 e 48 ± 2 h a 35 ± 0,5 °C;
• Após 24 h verificar os tubos com produção de gás. Reincubar os tubos negativos por
mais 24 h;
• Para cada diluição, anotar o número de tubos com produção de gás no período de
48 ± 2 h;
• Verificar na tabela o NMP de coliformes;
• Expressar o resultado como NMP de coliformes por mL ou g de amostra, conforme o
caso.

4.4. Teste para coliformes fecais

• Transferir uma alçada (com o auxílio de uma alça de inoculação) de cada tubo
positivo do teste presuntivo para outro tubo contendo 10 mL de caldo EC;
• Incubar a 44,5 ± 0,2 °C por 24 h;
• Verificar o número de tubos com produção de gás, somente considerar os resultados
confiáveis quando os controles apresentarem crescimento com gás para Escherichia
coli e ausência de crescimento ou crescimento sem gás para Enterobacter aerogenes;
• Verificar na tabela o NMP de coliformes;
• Expressar o resultado como NMP de coliformes fecais por mL ou g de amostra.

4.5. Teste para verificar a presença de Escherichia coli

• Selecionar os tubos positivos do caldo EC e semeá-los , por estrias em ágar EAM;

• Incubar a 35 °C por 24 h;
• Verificar a presença de colônias típicas de E coli, colônias negras com brilho verde
metálico.

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5. TABELA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)

Tabela: Índice NMP e limite de confiança para várias combinações de resultados

positivos quando são usados três tubos com as seguintes diluições, 10-1, 10-2 e 10-3.
Combinação de NMP por grama limite de 95%
tubos positivos ou mL Inferior Superior
0-0-0 <3 - -
0-1-0 3 <1 17

1-0-0 4 <1 21
1-0-1 7 2 27
1-1-0 7 2 28
1-2-0 11 4 35

2-0-0 9 2 38
2-0-1 14 5 48
2-1-0 15 5 50
2-1-1 20 7 60
2-2-0 21 8 62

3-0-0 23 9 130
3-0-1 39 10 180
3-1-0 43 10 210
3-1-1 75 20 280
3-2-0 93 30 380
3-2-1 150 50 500
3-2-2 210 80 640
3-3-0 240 90 1400
3-3-1 460 100 2400
3-3-2 1100 300 4800
3-3-3 > 1100 - -
Referência: APHA, Compendium of Methods of the Microbiological Examination of Foods.
1992, p. 112.

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 TABELA. Índice NMP (Número Mais Provável) para
3 tubos com as diluições 10-1, 10-2 e 10-3.

10-1 10-2 10-3 NMP

0 0 0 <3
0 0 1 3
0 0 2 6
0 0 3 9
0 1 0 3
0 1 1 6
0 1 2 9
0 1 3 12
0 2 0 6
0 2 1 9
0 2 2 12
0 2 3 16
0 3 0 9
0 3 1 13
0 3 2 16
0 3 3 19
1 0 0 4
1 0 1 7
1 0 2 11
1 0 3 15
1 1 0 7
1 1 1 11
1 1 2 15
1 1 3 19
1 2 0 11
1 2 1 15
1 2 2 20
1 2 3 24
1 3 0 16
1 3 1 20
1 3 2 24
1 3 3 29
2 0 0 9
2 0 1 14
2 0 2 20
2 0 3 26
2 1 0 15
2 1 1 20
2 1 2 27
2 1 3 34
2 2 0 21
2 2 1 28
2 2 2 35
2 2 3 42
2 3 0 29
2 3 1 36
2 3 2 44
2 3 3 53
3 0 0 23
3 0 1 39
3 0 2 64
3 0 3 95
3 1 0 43
3 1 1 75
3 1 2 120
3 1 3 160
3 2 0 93
3 2 1 150
3 2 2 210
3 2 3 290
3 3 0 240
3 3 1 460
3 3 2 1100
3 3 3 >1100
Fonte: Jacobs and Gerstein’s. Handbook of
microbiology. Princeton, New Jersey, 1960.

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 Fixando Conceitos – Roteiro de Estudo

1. Que outros organismos, além de coliformes apresentam resultado positivo no teste

presuntivo?

2. Porque não se realiza a pesquisa de Salmonella spp em amostras de água e

alimentos através do teste do NMP para coliformes fecais? (afinal de contas, ela é
um microrganismo entérico).

3. Como se utiliza a Tabela de NMP caso não se inoculem as diluições –1, -2 e –3, mas
sim diluições maiores como, por exemplo –3, -4 e -5?

4. Admitindo-se a presença de coliformes numa amostra de alimento, em quanto

tempo um laboratório pode fornecer os resultados das seguintes análises, admitindo-
se o uso da técnica do Número Mais Provável?
a) Coliformes totais – teste presuntivo
b) Coliformes totais – teste confirmatório
c) Coliformes totais – teste completo
d) Coliformes fecais

5. Um teste presuntivo positivo significa que uma água está imprópria para consumo
humano? E para a utilização na fabricação de alimentos? Justifique.

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