Fundamentos de Ingeniería Bioquímica 2010

Fundamen 23 de noviembre

2010
tos de
Ingeniería
Bioquímica
Estimación on-line de biomasa, glucosa y etanol en cultivos de
Saccharomyces Cerevisiae usando fluorescencia de múltiples
longitudes de onda y sensores software in-situ

1 Estimación on-line de biomasa, glucosa y etanol en cultivos de Saccharomyces

Cerevisiae usando fluorescencia de múltiples longitudes de onda y sensores software
in-situ
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1. Resumen

Cultivos en bioreactores batch usando SC en condiciones de alta (190-305 gl-1 de

glucosa) o baja (21-25 gl-1 de glucosa) gravedad fueron monitoreadas de manera on-line
usando fluorescencia de longitud de onda múltiple (MWF) y sensores de monitoreo
standard. Modelos de mínimos cuadrados parciales fueron calibrados para la predicción
del peso seco de una célula (CDW), y el consumo de glucosa y etanol, usando los dos
tipos de datos de forma separada. Los cultivos de baja gravedad (LGCs) consistieron de
dos fases (consumo de glucosa con producción de etanol concomitante seguido del
consumo de etanol después del agotamiento de la glucosa), que probó ser difícil para
modelar usando uno y el mismo modelo para ambas fases. Modelamiento segmentado,
usando diferentes modelos para las dos fases, mejoraron significativamente las
predicciones. Los modelos de predicción calibrados en los datos standard del proceso en
línea mostraron un error similar o menor que el error medio cuadrado hecho en la
predicción (RMSEP), en comparación con los modelos de fluorescencia.los mejores
modelos de predicción para cultivos de gravedad alta (HGCs) tuvieron un RMSEP de 1.0
gl-1 CDW, 1.8 gl-1 de etanol y 5.0 gl-1 de glucosa consumida, correspondiente al 4%, 2%
y 2% de los respectivos intervalos de concentración. Los valores obtenidos en los
modelos de baja gravedad fueron de 0.3gl-1 CWD, 0.7 gl-1 de etanol y 1.0 gl-1 de glucosa
consumida, correspondiente al 4%, 8% y 4% de los respectivos intervalos de
concentración.

Integrantes:
Cristobal Arismendi
Marion Juri Z.
Carolina Oyarzun V.

Profesor: Dr. Sergio Almonacid

Ayudante: Fiona Lancellotti

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2. Introducción

Los cultivos microbianos son procesos complejos, que comprenden una

combinación de fenómenos de tipo biológico, químico y de transporte. Para un control
eficiente de los bioprocesos, es esencial un monitoreo en tiempo real de las variables del
proceso. Sin embargo, mediciones de forma directa de variables críticas, como por
ejemplo la concentración de masa celular, sustratos y productos a menudo faltan, y el
estado en que se encuentra el proceso debe ser estimado a través de mediciones de
pH, tasa de evolución del dióxido de carbono (CER), la tasa de absorción de oxigeno
(OUR), etc. Claramente existe una necesidad de establecer nuevos métodos confiables
para un monitoreo directo de los componentes de un bioproceso en tiempo real, de
manera de permitir futuras mejoras en el desarrollo y control de los procesos.

Un método ideal para el monitoreo de estos procesos biológicos, debería ser

rápido, que no haya necesidad de tener que extraer muestras del bioreactor, y además
debería ser capaz de analizar múltiples componentes de forma simultánea. Métodos
ópticos, como el uso de la Espectroscopia de múltiples longitudes de ondas fluorescentes
(MWF) y Espectroscopia cercana a la infrarroja (NIRS), han sido propuestos como
buenos candidatos para cumplir con las expectativas de los criterios mencionados
anteriormente. MWF ha sido aplicada en combinación con modelación multivariable para
monitoreo in situ, para varios bioprocesos. El método está limitado a mediciones de
componentes fluorescentes; es por eso que MWF ha sido ampliamente utilizado para el
monitoreo de biomasa.

En la literatura existen numerosos ejemplos de modelos de predicciones indirectas

de variables que son inherentemente “no medibles” con la tecnología óptica. Estos se
basan en correlaciones entre los datos de la trayectoria del componente disponible, por
ejemplo, el consumo de un sustrato puede ser modelado en base a señales relacionadas
con el crecimiento de la célula. Dichos modelos de predicciones, deben disponer de
información fisiológica bien definida, donde las correlaciones entre los substratos y los
productos son constantes (factores de rendimiento). Predicciones imprecisas suelen
ocurrir en situaciones donde estas correlaciones cambian a lo largo del proceso, como se
observó en el presente estudio. Se desarrollaron modelos de predicción indirecta, a
pesar de que las concentraciones de los componentes en el caldo de cultivo analizado se
encontraban correlacionadas. También se utilizan sensores, donde se usa información

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fácilmente accesible para la predicción de variables “no medibles” a través de modelos
matemáticos. Se debe notar que el modelo usado para los sensores puede ser
solamente determinístico o simplemente como una caja negra, o incluso una mezcla de
ambos (modelo hibrido) usando, por ejemplo, una red neuronal artificial (ANN) o un
análisis de componentes principales (PCA). Los autores, en este caso, han reportado
buenos ajustes para los modelos y una predicción baja de errores (< 1 g kg-1) para un
amplio rango de concentraciones (>40 g kg-1).

En muchos procesos microbianos, el metabolismo del microorganismo pasa por

uno o más cambios de fases a través del cultivo, resultando en por ejemplo, el consumo
secuenciado de sustratos, limitación de disponibilidad de oxigeno o la acumulación de
compuestos inhibidores del crecimiento, como el etanol (producido y acumulado en el
medio de cultivo). Procesos donde hay cambios de fase aumentan la complejidad del
seguimiento, por lo que asignar sólo un modelo, en muchos casos, no puede ser
considerado para todo el proceso. Para mejorar el modelo del proceso con cambios de
fase, se ha estudiado un modelo segmentado, donde fueron aplicados distintos modelos
de calibración múltiple a distintos intervalos de tiempo del proceso. La identificación de
cambios de fase de un proceso en tiempo real, facilitan el cambio in situ de varios
modelos en el monitoreo de este.

En el presente trabajo, modelos de predicción multivariables para biomasa, etanol

y glucosa en cultivos de la levadura SACCHAROMYCES CEREVISIAE, estos fueron
desarrollados y caracterizados con su respectiva complejidad y exactitud. Dentro de las
aplicaciones de esta levadura, se pueden destacar, en la industria del pan. La especie de
levadura que más veces se utiliza para la fermentación del pan normal es
Saccharomyces cerevisiae, aunque se utilizan también otros microorganismos para
influir sobre el aroma y sabor del pan. Los más frecuentes son bacterias del género
Lactobacillus y algunas levaduras. Otras levaduras implicadas en la fabricación del pan
son: Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces ellipsoideus, Mycoderma cerevisiae,
Torula utilis y muchas otras con las que se obtienen diferentes resultados. Otra
aplicación es su acción fundamental en el proceso de elaboración de etanol. La
fermentación alcohólica consiste en la transformación de la glucosa en dos moléculas de
alcohol etílico y dos de CO2. El proceso de degradación de la glucosa es común a la
glucólisis hasta el estado de ácido pirúvico, pero, a partir de aquí, éste se descarboxila
pasando a aceta-aldehído, el cual se reduce posteriormente a alcohol etílico.
La reacción global de la fermentación alcohólica será:

Glucosa + 2 ATP + 2 ADP  2 alcohol etílico + 2 CO2 + 2 ATP

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La fermentación alcohólica la llevan a cabo enzimas especiales contenidas en
levaduras del género Saccharomyces, que son anaeróbicas facultativas. Dependiendo de
la especie, se puede llegar a cerveza, whisky, ron (Saccharomyces cerevisiae), vino
(S.ellypsoideus) y sidra (S.apiculatus).

El objetivo de la investigación es comparar la calibración de los modelos de

predicción usando MWF a través de sensores, y también poder comparar modelos de
predicción directa e indirecta. Los sensores consistían en modelos de PLS usando datos
in situ de un bioreactor batch como variables de entrada. Dos tipos de condiciones de
cultivos fueron usadas, para así ilustrar distintas situaciones durante la construcción del
modelo. El cultivo de alta concentración de glucosa involucra un alto grado de estrés
osmótico por tener altas concentraciones iniciales de glucosa, y también por acumular
altas concentraciones de etanol (inhibidor de crecimiento). Esto complica el
modelamiento de la información de manera directa, ya que el metabolismo de los
microorganismos se ve afectado severamente por las condiciones de crecimiento
cambiantes a través del tiempo de duración del cultivo. Las células de levadura se ven
sometidas a varios tipos de estrés a medida que las condiciones del medio cambian,
tanto en situaciones naturales como durante procesos industriales. Tanto el daño
provocado por el estrés como la respuesta de la levadura al mismo, depende del tipo y
grado del que se este realizando, y del estado de desarrollo de la levadura al momento
en que ocurre el estímulo. Sin embargo, en general, las condiciones adversas a las que
se enfrenta este organismo afectan principalmente a las estructuras celulares (e.g. las
membranas) y a las diferentes macromoléculas, especialmente lípidos, proteínas y
ácidos nucleicos, las cuales sufren modificaciones estructurales que dañan su función.
Para hacer frente a estas situaciones desfavorables, la levadura responde rápidamente
sintetizando moléculas que le permiten atenuar o reparar el daño causado por el estrés.
Entre las moléculas mejor caracterizadas en esta respuesta están las llamadas
“proteínas de estrés”. Su estudio ha evidenciado que la respuesta a nivel transcripcional
es importante para la supervivencia celular y ha llevado a la descripción de varias vías
de transducción de señales y factores de transcripción involucrados en esta respuesta.

El segundo tipo de cultivo (de baja concentración) presenta un cambio de fase

(cambio de sustrato), por lo que incorpora complejidad cuando se calibra un modelo que
va a cubrir el total del proceso. El enfoque del modelo segmentado fue aplicado para
manejar de mejor manera los cambios de fase, y su desempeño se comparo con el
enfoque de un modelo PLS solo. Además, modelos de predicción cuantitativa, PCA y el
análisis de factor paralelo (PARAFAC), fueron utilizados para análisis estadísticos de los
datos, y la detección de cambios de fase fue verificada usando este enfoque.

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Las aplicaciones de estos sistemas en línea, en el país y en el mundo, hoy en día,
tienen un gran avance, debido a la mejora de métodos creados para el monitoreo, como
por ejemplo por espectrofotometría, creación de nuevos sistemas de control de
variables, al igual que la técnica de perfiles térmicos, que también parece ser una
competencia de vigilancia. La técnica es, en principio, aplicable a cualquier proceso
microbiano de crecimiento con generación de calor significativo.

Estudios a escala en el país se desarrollan principalmente en las universidades,

con el objetivo de mejorar tecnologías existentes, como es el caso del diseño de
softwares aplicables a los monitoreos in-situ.

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3. Proceso

Descripción General

En este estudio se describe la fermentación de azúcares con Saccharomyces,

donde procede de la siguiente reacción bioquímica:

C6H12O6 + H2O + X  nX + CO2 + C2H5OH

Azúcar (Glucosa) más agua da CO2 más alcohol (etil-alcohol) más otros
compuestos en menor proporción. El crecimiento microbiano y la multiplicación de
células (X  nX), es la respuesta natural de estos organismos a las condiciones
fisicoquímicas del ambiente en que se encuentran. El crecimiento es el resultado del
cambio del tamaño celular y de su división. En un medio nutricionalmente adecuado,
estos organismos extraen nutrientes desde el medio y los convierten en componentes
biológicos. Estos nutrientes son usados para la generación de energía, biosíntesis de
metabolitos y formación de productos.

Diagrama de Flujo

Para conseguir los objetivos planteados en la investigación, se estudia un sistema

batch en 2 situaciones de nutrientes en el medio, a bajas concentraciones de glucosa y a
concentraciones más elevadas. A continuación se detallan la metodología.

➢ Precultivo

Una sola colonia vegetativa de S. Cerevisiae (CEN.PK.113-7D) se cultiva en un

plato YPD y luego fue usada para inocular 500 ml en un frasco con agitación junto con
100 ml de un medio definido que contiene (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4-7H2O, trazas de
metal en solución, solución vitamínica y glucosa, con un pH ajustado a 6,5.

➢ Cultivo en el Bioreactor

El precultivo fue usado para inocular un bioreactor de 3 litros (MBR, Suiza), con
un volumen de trabajo de de 2,81 litros. El medio de cultivo se definió en dos tipos. El
primero de ellos contiene diversos nutrientes esenciales y 20-24 gl-1 de glucosa (cultivos

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denominados de baja densidad o LGCs) y el segundo contiene una concentración inicial
de glucosa de 190-305 gl-1 (cultivos de alta densidad o HGCs). Se determino la densidad
óptica adecuada para cada caso. La temperatura, aireación, condiciones aeróbicas y tasa
de agitación se mantuvieron constantes y la menor tensión de oxigeno disuelto (DOT) se
registro a un valor de saturación del 65%.

➢ Análisis indirectos

Las muestran fueron retiradas desde el bioreactor a iguales intervalos de tiempo.

La concentración de biomasa fue cuantificada mediante de una cantidad filtrada conocida
del caldo de cultivo a través de un filtro de pre-secado de poros, que se lavó y se seco
en un horno para finalmente pesar el filtro seco. Las concentraciones de glucosa, glicerol
y etanol se determinaron usando una columna especializada para compuestos más un
refractómetro deferencial.

➢ Colección de datos in situ

En los gases de escape se monitoreo el CO2 y el O2 con un analizador de gases. La

tensión de oxigeno disuelto (DOT) se monitoreo con la sonda de oxigeno de un
biorreactor standard (Suiza). La tasa de adición de base fue cuantificada con un registro
on-line de la pérdida de peso del matraz de NaOH usado para el control de pH. La toma
de muestras para el analizador de gas se hizo cada 5 [min], mientras que para el DOT y
la adición de base fue de 1 [min].

El espectro de la fluorescencia de múltiples longitudes de onda se recolecto cada

10 [min] usando un espectrómetro de fluorescencia BioView. Todas las veces que se
hizo recolección, se consiguió el espectro completo, esto con un rango de excitación de
la longitud de onda entre 270 a 550 [nm] en pasos de 20 [nm], y un rango de emisión
de longitud de onda de 310 a 590 [nm], también a intervalos de 20 [nm].

➢ Construcción del modelo Quimiométrico y Manejo de Información

Toda la modelación quimiométrica se realizo usando la aplicación PLS Toolbox del

programa MatLab. Para el modelamiento de PCA y PLS, los datos tridimensionales de
MWF (muestra, excitación, emisión) fueron llevados a una matriz bidimensional
(muestra, excitación/pares de emisión). Para el modelamiento del PARAFAC y N-PLS, se
retuvo la información tridimensional original. Los datos insitu consisten en 8 procesos
variables: rapidez de bombeo de base, cantidad total de base añadida, tensión de
oxigeno disuelta (DOT), la tensión de oxigeno acumulativa, CO2 y O2 en los gases de
escape, cantidad total de CO2 liberada y O2 consumido durante el batch cada vez.

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Bioproceso

Teoría

Durante tiempos muertos en cultivos por lotes o durante el arranque o

cuando se presentan perturbaciones en reactores de flujo continuo, las poblaciones de
células crecen en un estado transciente. Diferentes tipos de modelos cinéticos pueden
ser necesarios para describir diferentes situaciones de crecimiento transciente.

Figura 1. Crecimiento típico para cultivos batch.

En un proceso batch el número de células vivas varia con el tiempo, como se

muestra en la Figura 1.Después de la fase de latencia, donde ningún aumento en el
número de células es evidente, sobreviene un período de rápido crecimiento, durante el
cual el número de células aumentan de forma exponencial con el tiempo llamado
crecimiento exponencial. Naturalmente en un recipiente cerrado, las células no pueden
multiplicarse indefinidamente, y una fase estacionaria sigue el período de crecimiento
exponencial. En este momento la población alcanza su tamaño máximo. Con el tiempo
una disminución del número de células se produce durante la fase de muerte. Aquí una
disminución exponencial en el número de población que vive a menudo se observa.

Múltiples fases de latencia a veces pueden ser observadas cuando el medio

contiene múltiples fuentes de carbono. Este fenómeno, conocido como el crecimiento
“diauxic”, es causada por un cambio en los patrones metabólicos en el medio de
crecimiento. Después de que un sustrato de carbono se agota, la célula debe desviar sus
energías de crecimiento para "rediseñar" el suministro de la nueva fuente de carbón.

Al final de la fase de latencia la población de microorganismos se encuentra bien

ambientada al medio, las células pueden multiplicarse rápidamente y la masa celular o
el número de células vivientes regularmente se dobla con el tiempo.

dx/dt = µx ó (1/x)·(dx/dt) = µ (1)

La ecuación presentada anteriormente con X (tlag) = Xo describe el incremento

celular durante este periodo. De la forma integrada de la ecuación anterior se obtiene:

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µ·(t-tlag)
X = Xo · ℮ , con t > tlag (2)

De esta última expresión se puede deducir el tiempo de duplicación (tiempo para

doblar la población microbiana).

td = (ln 2) / µ (3)

Como el crecimiento estado estacionario en un CSTR, sólo un parámetro único (td

o µ) es necesario para caracterizar la población durante el crecimiento exponencial.

Análisis de datos
En este estudio se realizo la cinética de crecimiento celular de la Saccharomyces
fermentando azúcar en un proceso batch, utilizando métodos de obtención de
parámetros relevantes directos como indirectos. Con estos métodos (descritos
anteriormente) se obtuvieron las cinéticas de crecimiento más parámetros de
rendimiento y concentraciones iniciales.
En la figura 2 se observa los perfiles de concentración de la población microbiana
(en el Anexo A se detallan los perfiles para la concentración de glucosa y etanol para los
dos casos mencionados), para los dos tipos de medios preparados (A es glucosa, en baja
concentración; B, alta).

Figura 2. Perfil de concentración celular en 2 situaciones de concentración de nutrientes.

Con estos perfiles se puede determinar el tiempo de duplicación de estos casos y

más datos del estudio sobre rendimientos de producción (Anexos) y la concentración
inicial se puede generar una estimación para un posible diseño de un proceso
estacionario en un reactor CSTR. De la literatura se obtiene que para la S. Cerevisiae se
maneja un KS de 25 mg/L.

Para el caso de baja concentración se obtiene un tiempo de duplicación de 14,45

horas y para el caso de alta concentración se obtiene un valor de 5,1 horas. Luego
aplicando la ecuación 3 se obtiene la tasa de crecimiento para ambos casos (0,048 h-1 y
0,14 h-1).

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En la Figura 3 se muestran los gráficos para CSTR que relaciona el factor de
dilución D, con la concentración de Sustrato y Población Microbiana.

Figura 3. Perfil de concentraciones para un reactor CSTR versus Factor de Dilución.

Con las graficas generadas y la metodología aplicada en clases, se podría llegar a

entregar parámetros de diseño para un reactor continuo operando en estado
estacionario.

1. Perspectivas

Del presente trabajo es posible concluir que la fluorescencia de múltiples

longitudes de onda (MWF) sirve para la predicción de concentración de determinados
analitos como la biomasa, glucosa y etanol, en tiempo real. De acuerdo con los modelos
y estudios realizados, los errores obtenidos fueron mínimos; para el HGCs se tuvo
1,0±0,4 gl-1 con el MWF y 1,7±0,0 gl-1 con el software, mientras que para el LGCs los
errores fueron de 0,6±0,2 y 0,5±0,2 gl-1 para el MWF y los sensores respectivamente.

Se debe destacar que la modelación segmentada ayudó a mejorar los modelos de

predicciones de la glucosa y el etanol consumido. Y además el balance de carbono sirve
para darle consistencia a los datos.

De acuerdo con la información encontrada en la literatura, el uso de MWF es

especialmente importante dentro de la industria biofarmaceútica, así como para la
industria alimenticia, puesto que desde que la FDA o US Food and Drug Administration
lanzó la Tecnología Analítica de Procesos (PAT), es posible medir la calidad del producto
y su eficiencia de mejor manera y también los atributos críticos del proceso. De esta
manera es posible asegurar que el producto cumplirá a cabalidad con los estándares
existentes.

El campo de la bioquímica y medicina, es donde más aplicaciones de esta técnica

es posible encontrar. Las moléculas biológicas pueden ser marcadas con grupos
químicos fluorescentes llamados fluorocromos a través de una reacción simple, lo que
permite una detección sensible y cuantitativa de la molécula. Algunos ejemplos son la
microscopía de fluorescencia de tejidos, células o estructuras subcelulares, lograda al
marcar el anticuerpo con un fluorocromo; secuenciación automática de ADN a través del
método de terminación de cadena; detección de ADN con la visualización de la
localización de fragmentos de ADN con el método de electroféresis en geles de agarosa;

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inmunología, al unir un grupo químico fluorescente al anticuerpo específico los sitios de
unión de éste pueden ser vistos e incluso cuantificados; determinación de la estructuray
conformación del ADN, entre otros.

2. Anexos

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