Laboratorio de Microbiología 5.
De las diluciones 10-3 , 10-5 , 10-6 y 10-7 tomar 1 ml y agregarlo a una placa
1. Una empresa desea producir enzimas hidrolíticas, para lo cual instala un
laboratorio de investigación para obtener el producto mediante el uso de
herramientas biotecnológicas. Explique mediante el uso de un diagrama
de flujo el proceso completo de aislamiento de Mo. amilolíticos hasta la
producción de la enzima. Explique el fundamento de la técnica en cada
paso.
PROCEDIMIENTO
PARTE I
Enriquecimiento in situ
1. Seleccionar en un jardín un área de 1 m2 (1 m de lado).
2. De existir pasto en el área seleccionada proceder a retirarlo.
3. Remover el suelo hasta 8 cm de profundidad.
4. Agregar uniformemente en toda el área 100 g de almidón.
5. Mezclar completamente con el suelo hasta 8 cm de profundidad.
6. Humedecer con agua.
7. Mantener el área húmeda (pero no anegada) durante 15 días.
8. Cada 4 días agregar 500 g de almidón y repetir los pasos 5 a 7.
Muestreo
1. Elegir un frasco de boca ancha, lavarlo bien y enjuagarlo cuidadosamente con
alcohol (incluyendo la tapa).
2. Con una espátula o cuchara desinfectada con alcohol, tomar suelo (debajo de
los primeros 2 cm) hasta un total mínimo aproximado de 100 g.
3. Colocar la tapa y guardar el frasco en un lugar fresco, pero no refrigerado.
Aislamiento
1. Mezclar cuidadosamente la muestra de suelo.
2. Pesar 10 g de la muestra y agregarlos al frasco o Erlenmeyer que contiene 90
ml de agua destilada estéril y rotularlo como dilución 100 .
3. Agitar el frasco durante 10 min.
4. Realizar las diluciones indicadas en el esquema siguiente:
Petri estéril.
6. Adicionar a cada placa Petri aproximadamente 15 ml de agar de aislamiento.
7. Incubar las placas a 30°C durante 5-7 días.
8. Proceder con la parte II
Parte II
1. Colocar las placas Petri dentro de una caja de vidrio o plástico (con tapa
hermética) conteniendo yodo metálico hasta que el medio adquiera un color
morado.
2. Las colonias de microorganismos amilolíticos presentarán un halo incoloro.
3. Elegir la colonia que presente el mayor halo de hidrólisis (incoloro).
4. Realizar un trasplante de la colonia elegida a dos tubos en cuñas de APD.
Incubar los tubos a 30° C hasta la siguiente sesión de prácticas.
5. Realizar una observación microscópica de la colonia elegida. En base a la
observación realice un intento de identificación.
Parte III
Inóculo
Agregue 3-5 ml de agua destilada estéril a uno de los tubos en cuñas de agar con
el microorganismo aislado. Realice una suspensión y determine la concentración
de esporas (ver anexo).
Cultivo sumergido
1. Inocule 6 x 106 esporas del microorganismo correspondiente a un Erlenmeyer
conteniendo 80 ml del medio de producción.
2. Incube el Erlenmeyer en un baño con agitación a 30°C y 140 movimientos por
minuto por 7 días.
3. Filtre cuidadosamente el contenido del matraz utilizando papel de filtro de
paso medio pre-presado para retener la biomasa (la determinación de biomasa se
realizará por diferencia de peso seco). Coloque el papel filtro en una placa Petri y
deje secar por 120 minutos a 85º C.
4. Coloque el filtrado en un frasco o tubo estéril y guarde en congelación hasta el
momento de realizar los análisis.
Parte IV
Determinación de la actividad de amilasa (prueba de Fehling) 1. En un tubo de
ensayo agregar 2ml del reactivo de Fehling A y 2ml del reactivo de Fehling B. 2.
Verter 3ml del filtrado a temperatura ambiente. 3. Introducir el tubo en baño
maría durante 3 minutos. 4. Observar y dibujar los resultados.
9. Marque V o F según corresponda
 La proliferación de una capa de Echerichia Coli en un medio de cultivo con
porcentaje de agua del 60% en condiciones neutras es menor en
comparación con la misma cepa cultivada en una concentración de agua del
75% bajo las mismas condiciones de pH. (F)
 Los Mo. productores de enzimas hidrolíticas constituyen un grupo
microbiano llamado zimógeno. (F)
 Los Mo. son excelentes productores de amilasa. En el caso de bacterias se
emplean especies del género Bacillus; y en el caso de hongos, especies
principalmente el Aspergillus. (V)
 Las estructuras llamadas conidióforos, esporangióforos, conidios e hifas
cenocíticas son consideradas partes del talo reproductivo. (F)
 El colorante utilizado para la observación de las estructuras fúngicas es el
azul de lactofenol (V)
 En la producción del inoculo microbiano para la obtención de compuestos
biotecnológicos, se utiliza medios de cultivo ricos solo en insumos
nitrogenados. (V)
 La calidad de un alimento se considera importante porque los Mo. solo
pueden ser causantes de enfermedades conocidas como enfermedades
transmitidas por los alimentos. (F)
 Los Mo. de alerta son Echerichia coli, coliformes tolerantes, hongos,
aeróbicos mesófilos, psicrófilos, termófilos, anaeróbicos mesófilos y
termófilos. (F)
 La mayoría de las bacterias autóctonas del agua son bacterias acuáticas
gram negativas de los géneros Pseudomonas, Flavobacterium. (V)
 Listeria monocytogenes es clasificada como un Mo. de carácter imperativo.
(V)
 son considerados como Mo. de alerta ya que constituyen peligrosos
patógenos transmitidos por los alimentos. (F)
 La contaminación fecal del agua ocurre en la presencia de la Clostridium
perfringens. (V)
10. Como parte del control de calidad de un producto alimenticio
industrializado se debe hacer el análisis microbiológico de Aeróbicos
mesófilos y coliformes totales. Para tal efecto se dispones de una
muestra representativa de 50g, 117mL de solución salina estéril al
0.85%, 100mL de Agar Papa Dextrosa a 35°C, 80mL de Agar Plate
Count a 45°C, 81mL de caldo EC 81mL de caldo Brilla. Asumiendo
que se tiene la cantidad exacta de todo el material de laboratorio:
a. Mencione y describa la técnica a seguir para la determinación y
cálculos de los respectivos agentes microbianos arriba
mencionados usando de un diagrama de flujo.
b. ¿A cuál de los Mo. arriba mencionados se le denomina como un
Mo. alerta? ¿Por qué?
c. ¿Cómo determina el recuente de coliformes totales? ¿y bajo que
característica indicativa?
d. Determinar el numero de Mo. denominado como alerta.
Dato: En el caldo EC se obtuvo la combinación 2-1-0 en tubos
positivos, en el caldo brilla se obtuvo la combinación 3-1-0 en tubos
positivos, en la placa de mayor dilución se obtuvo 220 colonias en el
respectivo conteo de dicho Mo.
11. Para la producción del nuevo pan de trigo se ha levantado una
nueva planta a las fueras de Huachipa, con fines económicos se ha
visto favorable la obtención del agua del subsuelo para dicha
producción.
a. ¿Cuál sería el Mo. de higiene determinante para su muestra?
b. Describir el método de análisis microbiológico desde el muestreo
y determinar la cantidad de este Mo.
 Dato: En el caldo EC se obtuvo la combinación 0-1-2 en tubos
positivos, en el caldo brilla se obtuvo la combinación 2-0-1 en tubos
positivos, se obtuvo 1,2x105 UFC en el respectivo conteo de dicho
Mo.
c. Que consecuencias tendría utilizar el agua contaminada en la
elaboración de los alimentos.

12. Dibuje 4 diferentes géneros de hongos ambientales post cosecha e

indique el género que corresponde cada uno de ellos y con el uso de
flechas señale las diferentes partes morfológicas que presentan y
sus características. Además, explique las causas del deterioro de los
alimentos por esos dos Mo.

13. Defina:
- Cultivo sumergido -Enriquecimiento in sito -Hifa Cenocítica
- Mo. de alerta - Aerobios
mesófilos
- Mo. de carácter o criterio imperativo - Caldo EC
- Mo. zimógeno - Penicillium - Mucor
- Medio de aislamiento - Calidad de los alimentos