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pour le grade de
présentée par
Anaïs MICHAUT
Préparée dans l’Unité de Recherche INSERM UMR 991
« Foie, Métabolismes et Cancer »
Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques
Je souhaite également remercier toutes les personnes extérieures avec qui j’ai pu
travailler, Nicolas Mouchet, Medjda et Jacques Le Seyec. Merci à toute l’équipe
d’enseignants, Michelle Lesimple, Céline Raguenes-Nicol, Claire Piquet-Pellorce, Thierry
Guillaudeux, Patricia, Pascale, Colette...
AVANT-PROPOS ................................................................................................................ 9
INTRODUCTION
A. Introduction.............................................................................................................. 11
1. L’obésité ................................................................................................................... 11
1. Introduction .............................................................................................................. 15
2. Epidémiologie ........................................................................................................... 16
B. Le CYP2E1 ...................................................................................................................... 30
C. Le CYP3A4 ..................................................................................................................... 45
A. Introduction .................................................................................................................. 56
2. Pharmacologie .......................................................................................................... 57
4. Données pharmacocinétiques.................................................................................. 58
B. Métabolisme ................................................................................................................. 60
2
D. Prise en charge médicale de l’intoxication au paracétamol ........................................ 83
1. Symptômes ............................................................................................................... 83
2. Traitements .............................................................................................................. 84
3. Diagnostic ................................................................................................................. 85
ARTICLE 1 ......................................................................................................................107
ARTICLE 2 ......................................................................................................................119
BIBLIOGRAPHIE ..............................................................................................................179
3
4
LISTE DES PRINCIPALES ABREVIATIONS
5
SULTs Sulfotransférases
TNFα Tumor Necrosis Factor-α
TRIB3 Tribbles Pseudokinase 3
UGTs UDP-Glucuronosyltransférases
6
INDEX DES FIGURES ET TABLEAUX
Figure 2: Répartition des niveaux d’IMC des personnes de plus de 18 ans en France en 2012
(selon l’étude ObEpi). ............................................................................................................... 13
Figure 7: Les principaux CYPs des familles 1, 2 et 3 impliqués dans le métabolisme des
médicaments utilisés en clinique ainsi que les facteurs influençant la variabilité de ces
enzymes.................................................................................................................................... 28
Figure 10: Les principales voies métaboliques du paracétamol après administration d’une
dose thérapeutique.. ................................................................................................................ 61
Figure 12: Lésions mitochondriales et stress oxydant induits par le NAPQI. .......................... 73
Figure 13: Activation de la voie de la c-jun-N-terminal kinase (JNK) par les ERO suite à une
intoxication au paracétamol. ................................................................................................... 77
Figure 14: Différences morphologiques entre la mort cellulaire par apoptose et par nécrose
observées après coloration à l’hématoxyline-éosine de coupes de foie de souris.. ............... 79
7
Figure 15: Réponse innée au cours de l’intoxication hépatique au paracétamol.. ................. 82
Figure 17: Facteurs pouvant moduler le risque et la sévérité de l’hépatotoxicité induite par le
paracétamol dans un contexte d’obésité et de NAFLD. ......................................................... 96
Tableau 1: Classification des CYPs en fonction de leur classe de substrat majoritaire ........... 26
Tableau 3: Régulation du CYP2E1 par les AG dans des hépatocytes humains in vitro............ 39
Tableau 6: Régulation du CYP2E1 par les AG dans des hépatocytes humains in vitro............ 53
8
AVANT-PROPOS
9
10
I/ Obésité et complications associées
A. Introduction
1. L’obésité
% d’adultes
12
Figure 2: Répartition des niveaux d’IMC des personnes de plus de 18 ans en France en 2012
(selon l’étude ObEpi).
13
stéatose qui correspond à une accumulation de lipides dans le foie. Bien que bénigne à court
terme, la stéatose peut cependant évoluer à long terme en stéatohépatite ou en cirrhose,
voire en carcinome hépatocellulaire chez certains patients (Farrell and Larter, 2006; Larter et
al., 2010; McPherson et al., 2014; Starley et al., 2010). La physiopathologie de la stéatose et
de la stéatohépatite sera développée plus en détail dans la section suivante.
Enfin, il est important de souligner que les sujets obèses consomment en moyenne
plus de médicaments par rapport aux sujets non obèses, notamment pour le traitement de
leur obésité et des pathologies associées telles que les dyslipidémies et le diabète de type 2
(Finkelstein et al., 2009; Stuart et al., 2008; Trasande and Chatterjee, 2009). Plusieurs études
rapportent également chez les sujets obèses une consommation importante d’anti-
inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et d’analgésiques incluant le paracétamol, en
particulier pour le traitement des maladies ostéoarticulaires (Amundsen et al., 2010; Kit et
al., 2012; Narbro et al., 2002).
14
B. Stéatoses et stéatohépatites non alcooliques
1. Introduction
Décrites pour la première fois chez les sujets obèses par Ludwig en 1980, les maladies
hépatiques stéatosiques non-alcooliques (Nonalcoholic Fatty Liver Diseases ou NAFLD pour
les anglo-saxons) couvrent un large spectre de lésions hépatiques incluant la simple
stéatose, la stéatohépatite non alcoolique (Nonalcoholic Steatohepatitis ou NASH) et la
cirrhose (Ludwig et al., 1980). Ces lésions surviennent en dehors de toute consommation
excessive d’alcool et peuvent évoluer chez certains patients en carcinome hépatocellulaire
(Jiang et al., 2014). La présence de NAFLD est également associée à un risque accru de
développer un diabète de type 2, une dyslipidémie et une hypertension artérielle (Adams et
al., 2009).
15
présence d’une stéatose microvésiculaire au cours de la NAFLD pourrait refléter une maladie
hépatique plus sévère (Söderberg et al., 2011; Tandra et al., 2011).
Les lipides hépatiques stockés dans les vacuoles sont principalement des
triglycérides, espèces lipidiques étant considérées comme non délétères pour les
hépatocytes (Puri et al., 2007). Cependant, d’autres types de lipides peuvent s’accumuler au
cours de la NAFLD, tels que les diacylglycérols (DAG, ou diglycérides) qui pourraient avoir un
rôle pathogénique important (Magkos et al., 2012; Puri et al., 2007). En effet, les DAG sont
impliqués dans la physiopathologie de l’insulinorésistance, non seulement dans le foie mais
aussi dans d’autres tissus comme le muscle et le tissu adipeux (Byrne and Targher, 2014;
Perry et al., 2014). Enfin, il est important de noter que les vacuoles lipidiques sont
recouvertes à leur surface de protéines qui semblent jouer un rôle important dans leur
maturation et leur métabolisme. Les plus abondantes de ces protéines sont la périlipine
(codée par le gène PLIN1), l’adipophiline (codée par le gène PLIN2) et TIP47 (Tail Interacting
Protein of 47 kDa, codée par le gène PLIN3) (Fujii et al., 2009; Pawella et al., 2014).
2. Epidémiologie
Dans certains pays occidentaux tels que les Etats-Unis, on estime que la prévalence
des NAFLD dans la population générale est comprise entre 20% à 30% chez les adultes et
10% chez les enfants et adolescents (Berardis and Sokal, 2014; Lazo et al., 2013; Smith and
Adams, 2011). La plupart des études épidémiologiques réalisées pour estimer la prévalence
des NAFLD utilise l’échographie hépatique pour le diagnostic. Cependant, cette technique
semble sous-estimer les chiffres et de plus, elle ne permet pas de faire la distinction entre la
simple stéatose et la NASH. En réalité, cette distinction ne peut se faire que grâce à l’analyse
anatomopathologique d’une biopsie hépatique (Brunt et al., 2011; Brunt and Tiniakos,
2010). L’étude de Minervini en 2009 sur des ponctions-biopsies hépatiques réalisées chez
des patients apparemment sains révèle que plus de 50% des sujets présentent une NAFLD,
et parmi eux 1/3 sont au stade de NASH (Minervini et al., 2009).
Concernant la distribution par sexe, les études montrent que les NAFLD seraient
légèrement plus fréquentes chez les hommes. La moindre prévalence chez les femmes
pourrait être due, au moins en partie, à l’action protectrice des hormones féminines telles
que les œstrogènes. Les NAFLD sont décrites à tout âge mais la prévalence augmente au
cours de la vie et en particulier après la ménopause chez les femmes (Clark, 2006). Enfin, des
différences ethniques sont rapportées. Ainsi, aux Etats-Unis, les personnes d’origine
hispanique sont plus prédisposées à développer une NAFLD que celles d’origine caucasienne
ou afro-américaine (45%, 33% et 24% de NAFLD respectivement parmi ces trois populations)
(Browning et al., 2004).
Les deux principaux mécanismes de l’accumulation des lipides hépatiques chez les
sujets obèses sont l’augmentation de la lipogenèse de novo et l’entrée accrue des acides
gras libres dans le foie. Ces deux évènements sont en fait intimement liés à la présence
d’une insulinorésistance qui s’établit usuellement chez les sujets obèses dans différents
tissus, principalement tissu adipeux, muscles et foie (Begriche et al., 2013; Postic and Girard,
2008; Tamura et al., 2005; Wieckowska et al., 2007).
17
HSL (Hormone Sensitive Lipase) (Hsiao et al., 2013; Jocken et al., 2007). Ainsi, la libération
des AGL dans la circulation aboutit à une redistribution de ces dérivés entre le tissu adipeux
et le foie. Les AGL pénètrent en effet librement dans les hépatocytes grâce à différents
transporteurs membranaires « non saturables » tels que les FATPs (Fatty Acid Transport
Proteins) et la FAT/CD36 (Fatty Acid Translocase). Après estérification (conversion des AGL
en triglycérides), les triglycérides sont stockés sous forme de gouttelettes lipidiques dans les
hépatocytes ou sécrétés dans le sang sous forme de VLDL (Very Low Density Lipoprotein).
• Transition stéatose/NASH
Comme il a été mentionné plus haut, la stéatose peut progresser à long terme en
NASH chez environ 10 à 20% des patients. De très nombreuses investigations expérimentales
et cliniques ont été réalisées afin de connaître les mécanismes de cette transition. Même si
de nombreux facteurs ont pu être identifiés, les principaux mécanismes impliqués dans la
18
physiopathologie de la NASH semblent être le stress oxydant et la peroxydation lipidique
(générant des aldéhydes toxiques tels que le malondialdéhyde et le 4-hydroxynonénal), les
dysfonctions mitochondriales ainsi que la surproduction de cytokines proinflammatoires et
profibrotiques comme TNFα (Tumor Necrosis Factor-α), IL6 (Interleukine-6) et TGFβ
(Transforming Growth Factor-β) (Begriche et al., 2013; Fabbrini et al., 2010; Tilg and
Moschen, 2010). La présence de prédispositions génétiques explique aussi probablement
pourquoi certains sujets ont plus de risques de développer une NASH. Parmi les nombreux
gènes de susceptibilité étudiés, PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase domain-containing 3) est
le plus fréquemment retrouvé dans plusieurs études indépendantes avec notamment la
présence d’un polymorphisme particulier (rs738409/I148M) qui augmente le risque de
survenue de la NASH (Anstee and Day, 2013; Cohen et al., 2011; Verrijken et al., 2013). De
façon intéressante, ce polymorphisme semble favoriser non seulement l’accumulation des
triglycérides mais également le stress oxydant (Min et al., 2014; Smagris et al., 2015). Il est à
noter aussi qu’un polymorphisme particulier dans le gène CYP2E1 (« allèle c2 ») a été associé
à un risque accru de NASH dans une étude effectuée chez des femmes obèses (Varela et al.,
2008).
19
au cours de son cycle catalytique. Cette surproduction d’ERO par le CYP2E1 semble non
seulement être impliquée dans la progression de la stéatose en NASH mais également dans
le développement de l’insulinorésistance. En effet, la surexpression hépatocytaire du CYP2E1
perturbe la signalisation insulinique avec notamment une diminution de la phosphorylation
des IRS (Insulin Receptor Substrates) 1 et 2 et de la protéine kinase B (PKB/Akt) (Kathirvel et
al., 2010; Kathirvel et al., 2009; Schattenberg et al., 2005). Inversement, les souris KO
(Knockout) pour le CYP2E1 sont protégées vis-à-vis du développement de l’insulinorésistance
secondaire à une alimentation riche en graisses (Abdelmegeed et al., 2012; Zong et al.,
2012).
1. Cycle catalytique
Les CYPs sont des apoprotéines d’environ 500 acides aminés et de masse moléculaire
comprise entre 45 et 62kDa. Ils appartiennent à la famille des hémoprotéines. Le
groupement prosthétique de l’hème est composé de 4 azotes (protoporphirine IX) liés à un
atome de fer, lui-même coordonné à la chaine polypeptidique par un groupement thiol
d’une cystéine (Fig. 4). La sixième position de coordination du fer est libre et permet la
fixation de l’oxygène au cours du cycle catalytique.
21
A l’état de « bas spin », l’atome de fer est sous forme ferrique (Fe3+) et possède 6
liaisons, le centre actif de l’enzyme est plan et ne consomme pas d’énergie. La fixation d’un
substrat (RH dans la Fig. 5) provoque un changement conformationnel, ce qui transforme
l’état « bas spin » en état « haut spin », et l’enzyme devient alors fonctionnelle. L’électron
apporté par le système donneur d’électrons à partir du NAD(P)H et d’une réductase permet
la réduction du fer ferrique en fer ferreux (Fe2+), laissant la 6ème position de coordination du
fer libre de fixer l’oxygène. On obtient ainsi un complexe oxygéné. L’apport d’un autre
électron va ensuite permettre une réduction du complexe. Cette réaction initie l’étape
catalytique et l’activation de l’oxygène, conduisant à la libération du substrat hydroxylé, si
l’on prend l’exemple d’une réaction d’hydroxylation (Fig. 5). Pour résumer, l’oxygène
moléculaire va être réduit, formant l’entité peroxy-ferrique Fe3-OO- qui, par protonation,
donne ensuite un complexe hydroperoxo Fe3-OOH. Une seconde protonation provoque la
rupture de la liaison O-O, libérant ainsi une molécule d’eau et le composé Fer-oxo
hautement oxydant, qui peut transférer son atome d’oxygène au substrat. Après libération
du produit, l’enzyme est retrouvée libre sous forme ferrique, à l’état de « bas spin » (Lewis,
2003).
Dans certains cas particuliers, les CYPs s’affranchissent de l’apport d’un second
électron en utilisant des agents oxydants tels que les peracides ou les hydroperoxydes. Ce
cycle court est appelé « peroxyde shunt » (Guengerich and Munro, 2013). La synchronisation
entre les CYPs et leurs partenaires redox est primordiale. En effet, lorsque le couplage n’est
pas réalisé, les CYPs entrent dans des voies abortives conduisant à la décomposition du
complexe fer-oxygène et la production soit d’eau, soit d’espèces réactives de l’oxygène
(ERO) telles que le peroxyde d’hydrogène (H2O2) ou l’anion superoxyde (O2.-). La fréquence
de ces réactions indésirable dépend de nombreux paramètres dont la vitesse de transfert
d’électrons ou de protons, le mauvais positionnement des substrats dans le site catalytique,
ou encore la qualité de la reconnaissance et des interactions entre le CYP et ses partenaires
redox.
22
Figure 5: Représentation shématique du cycle catalytique des CYPs. La fixation d’un
substrat RH sur le CYP en état de « bas spin » rend l’enzyme fonctionnelle. Un électron
permet la réduction du fer ferrique (Fe3+) en fer ferreux (Fe2+), permettant ainsi au métal de
fixer l’oxygène. L’apport d’un second électron va permettre une réduction du complexe
oxygéné. L’oxygène moléculaire va être réduit, formant l’entité peroxy-ferrique Fe3-OO-. Une
première protonation donne ensuite un complexe hydroperoxo Fe3-OOH, puis une seconde
protonation provoque la rupture de la liaison O-O, libérant ainsi une molécule d’eau et le
composé Fer-oxo hautement oxydant, qui peut transférer son atome d’oxygène au substrat.
Après libération du produit, l’enzyme est retrouvée libre sous forme ferrique, à l’état de «
bas spin ». D’après Lewis, 2003 (LS : Low-spin; HS : High-spin ; RH: substrat ; ROH :
métabolite hydroxylé).
2. Nomenclature et classification
23
α-déméthylation du lanostérol, un intermédiaire dans les premières phases de la chaine de
synthèse des stérols (Nelson et al., 1996).
Les CYPs doivent leur nom à leur propriété d’absorbance à 450 nm. En effet, en 1962,
Sato et Omura ont appelé « pigment 450 » le composé responsable du pic d’absorbance à
450 nm qui apparaît lorsqu’on sature en monoxyde de carbone une préparation
subcellulaire de glandes surrénales (Omura and Sato, 1962).
La nomenclature utilisée pour désigner les différents CYPs repose sur la règle
suivante : l’abréviation CYP (pour cytochrome P450) est suivie d’un chiffre arabe désignant la
famille, puis d’une lettre désignant la sous famille, et enfin d’un nombre désignant les
variants alléliques d’un gène (Nebert et al., 1987; Nelson et al., 1996).
- Pour faire partie d’une même famille, les CYPs doivent présenter au moins 40%
d’homologie entre leurs séquences primaires en acides aminés constitutifs.
- Pour appartenir à la même sous-famille, il faut une homologie de séquence
supérieure à 55%.
- Les CYPs présentant une divergence inférieure à 3% sont considérés comme variants
alléliques.
Les CYPs font l’objet d’une classification internationale et leur nombre augmente
chaque année. En 2009, Nelson dénombrait 11 294 séquences différentes dont 3 282 chez
les animaux. Trois ans plus tard, ces chiffres sont passés à 18 687 séquences dont 5 442 chez
l’animal (http://drnelson.uthsc.edu) (Nebert et al., 2013).
24
Comme rappelé précédemment, les CYPs ont besoin pour leur activité catalytique
d’une source d’électrons transférés à partir du NAD(P)H (Nicotinamide Adénine Dinucléotide
Phosphate) par une protéine partenaire, une réductase. Il existe 4 classes de CYPs basées sur
leur système donneur d’électrons et suivant leur localisation microsomale ou mitochondriale
(Aguiar et al., 2005; Guengerich and Munro, 2013; Hannemann et al., 2007; Lamb and
Waterman, 2013).
- La classe I comprend les CYPs bactériens et mitochondriaux qui utilisent une chaine
d’électrons à 2 composants : une ferrédoxine réductase (FDR) à flavine FAD (Flavine-
Adénine Dinucléotide) et une ferrédoxine à centre fer-souffre Fe2S2 (Fdx). Chez les
eucaryotes, la FDR et la Fdx sont associées à la membrane interne des mitochondries.
Cette classification est la plus connue et est admise par toute la communauté
scientifique. Néanmoins, il existe des cas particuliers, notamment pour les CYPs bactériens.
Ainsi, Hannemann a proposé une nouvelle classification plus précise, mais toujours basée sur
le transfert d’électrons (Hannemann et al., 2007).
25
3. Rôle physiologique des CYPs
Une des caractéristiques des CYPs est le grand nombre et la diversité des classes
chimiques de leurs substrats. C’est ainsi que les 57 CYPs actuellement découverts chez
l’Homme peuvent métaboliser des xénobiotiques (polluants, toxiques, médicaments…) mais
également participer au métabolisme de nombreuses molécules endogènes (hormones
stéroïdes, acides gras, acides biliaires, vitamine D3…) (Tab. 1) (Guengerich and Cheng, 2011).
26
parent inchangé) est transporté à travers la membrane cellulaire via des protéines de phase
III afin d’être éliminé par la bile ou l’urine (Fig. 6).
Même si la plupart des réactions dans lesquelles interviennent les CYPs sont des
processus de détoxification, certains composés peuvent devenir toxiques à la suite du
métabolisme du composé d’origine. C’est notamment le cas du paracétamol, métabolisé par
le CYP2E1 et le CYP3A4 en N-Acétyl-p-benzoquinone-Imine (NAPQI), dérivé hautement
réactif capable de former des adduits aux protéines et à l’ADN (Corcoran et al., 1985; Jollow
et al., 1973; Rogers et al., 1997; Streeter et al., 1984). De plus, l’activité même de certains
CYPs génère la production d’ERO, délétères pour les cellules, comme c’est le cas pour le
CYP2E1. Enfin, il est à noter qu’il existe des variations interindividuelles importantes dans
l’expression des CYPs, liées à différents facteurs endogènes (sexe, âge, pathologies,
hormones, et facteurs génétiques) ou exogènes (médicaments, polluants, alcool,
27
alimentation..) et pouvant affecter significativement le métabolisme des médicaments
(Zanger and Schwab, 2013).
Figure 7: Les principaux CYPs des familles 1, 2 et 3 impliqués dans le métabolisme des
médicaments utilisés en clinique ainsi que les facteurs influençant la variabilité de ces
enzymes (d’après Zanger and Schwab, 2013). Les CYPs sont responsables de la majorité des
réactions de biotransformation des médicaments. Chez l’Homme, les CYP1, CYP2 et CYP3
constituent les familles les plus importantes dans le métabolisme des agents
pharmacologiques. Des changements et des différences dans l’activité des CYPs peuvent
affecter la biodisponibilité, l’efficacité ou la toxicité des xénobiotiques. Des facteurs
génétiques et environnementaux peuvent causer des différences intra-individuelles et
interindividuelles dans la biotransformation des médicaments, pouvant affecter l’équilibre
entre la détoxification et la toxicité.
Les CYPs, essentiellement des familles 4 à 51 (Tab. 1), sont impliqués dans la
biosynthèse et la métabolisation de molécules endogènes telles que le cholestérol, les acides
biliaires, les acides gras, les hormones stéroïdiennes, les eicosanoïdes et les vitamines (Fig. 8)
(McLean et al., 2012; Nebert et al., 2013). Les CYPs qui participent à cette voie de
métabolisation de molécules endogènes sont très sélectifs pour leur substrat. Néanmoins,
certains des CYPs métabolisant les xénobiotiques, beaucoup moins spécifiques pour leurs
28
substrats, peuvent également métaboliser des molécules endogènes, comme c’est le cas
pour le CYP2E1 et le CYP3A4.
Figure 8: Les CYPs impliqués dans le métabolisme de molécules endogènes (d’après Zanger
and Schwab, 2013). A. la biosynthèse des hormones stéroïdiennes. L’aldostérone, le cortisol
et la corticostérone sont synthétisés dans les glandes surrénales, la testostérone dans les
testicules et les œstrogènes dans les ovaires. D’autres CYPs participent au catabolisme des
hormones stéroïdiennes, notamment le CYP3A qui réalise la 6-β-hydroxylation des stéroïdes
et la 16-α-hydroxylation de la testostérone, permettant leur élimination urinaire après
conjugaison. B. la synthèse des eicosanoïdes à partir de l’acide arachidonique. C. la
biosynthèse du cholestérol et des acides biliaires. Cette voie est exclusivement hépatique
D. la transformation de la vitamine D3. Pour être active, la vitamine D3 doit être hydroxylée
en 25-hydroxy-vitamine D3 au niveau hépatique puis en 1-α, 25-dihydroxy-vitamine D3 au
niveau rénal. Outre ces 4 grandes voies métaboliques, les CYPs de la famille 4A réalisent l’ω-
hydroxylation des acides gras permettant leur dégradation et leur élimination.
29
B. Le CYP2E1
Le gène humain du CYP2E1 a été cloné et séquencé en 1988. Il est situé sur le
chromosome 10 en position 10q24.3. Sa partie codante comporte 9 exons et exprime une
protéine de 493 acides aminés (Umeno et al., 1988). Ce cytochrome P450 est principalement
exprimé au niveau du foie où il représente 6 à 10% des CYPs totaux, mais il a également été
mis en évidence au sein d’autres organes tels que le poumon (Hukkanen et al., 2002), le
colon (Plewka et al., 2014), le cœur (Sidorik et al., 2005) et le cerveau (Dutheil et al., 2009;
Upadhya et al., 2000) et le tissu adipeux (Ellero et al., 2010) chez l’Homme.
30
sa localisation, le CYP2E1 est fonctionnel et inductible (Loeper et al., 1993; Pahan et al.,
1997; Robin et al., 1997; Wu and Cederbaum, 1992).
31
Takahashi et coll. (2014) ont étudié l’effet du le miR-223 sur le CYP2E1 et ont démontré qu’il
inhibait l’activité du CYP2E1 sans affecter l’expression protéique de l’enzyme. Cette
inhibition de l’activité se ferait via l’inhibition de l’expression protéique de la protéine du
cytochrome b5 (Takahashi et al., 2014).
Bien qu’il y ait un grand polymorphisme au niveau du gène CYP2E1 (Carrière et al.,
1996), il n’existe pas de polymorphisme connu conduisant à un CYP2E1 inactif chez l’Homme
ou d’autres espèces animales (Gonzalez, 2007). Cependant, certains polymorphismes chez
l’Homme peuvent modifier significativement l’efficacité de la transcription (e.g. CYP2E1*5B)
ou l’efficacité catalytique de l’enzyme (e.g. CYP2E1*6) (Hayashi et al., 1991). McCarver et
coll. (1998) ont quant à eux étudié une mutation par insertion dans le gène du CYP2E1,
présente chez 31% des patients étudiés. Ils ont observé une corrélation entre augmentation
de l’activité du CYP2E1 et la mutation seulement chez les patients obèses ou ayant
consommé de l’alcool. Il semblerait également que cette mutation soit plus fréquente chez
les patients d’origine afro-américaine (31%) que chez les caucasiens (6.9%) (McCarver et al.,
1998). Une étude récente a également montré chez l’Homme que des mutations dans la
partie N-terminale du CYP2E1 modifiaient de façon importante l’adressage mitochondrial du
CYP2E1 (Bansal et al., 2013).
32
2. Les substrats endogènes et exogènes du CYP2E1
• Le paracétamol
33
• La chlorzoxazone
• Obésité et NAFLD
Chez l’Homme, 9 études réalisées chez des patients souffrants de NAFLD ont montré
une corrélation nette entre le degré de stéatose hépatique et l’expression et/ou l’activité du
35
CYP2E1 (Tab. 2) (Baker et al., 2010; Chalasani et al., 2003; Chtioui et al., 2007; Donato et al.,
2006; Emery et al., 2003; Kohjima et al., 2007; Mitsuyoshi et al., 2009; Varela et al., 2008;
Videla et al., 2004; Weltman et al., 1998). Dans l’étude la plus récente de 2010, Bell et coll.
ont constaté chez des patients obèses ayant subi une chirurgie bariatrique une diminution
de l’expression protéique du CYP2E1 hépatique en corrélation avec l’amélioration de la
dyslipidémie (Bell et al., 2010).
36
(19.8% d’huile de maïs, 19.8% de lard et 24.1% de sucrose). Bien que le premier régime riche
en sucrose (HF1) induise une accumulation plus importante de triglycérides et d’acides gras
libres intra-hépatiques que le second régime (HF2), il ne modifie pas l’expression protéique
du CYP2E1, contrairement au second régime qui l’induit (Osabe et al., 2008). De façon
intéressante, grâce à l’utilisation de souris wild-type et de souris génétiquement obèses des
deux sexes, Aubert et coll. (2012) ont montré que l’activité du CYP2E1 hépatique n’était
augmentée significativement que chez les souris db/db femelles, alors que le degré de
stéatose hépatique chez ces souris était moindre comparé aux souris ob/ob du même sexe.
L’ensemble de ces résultats suggère que ce n’est pas la quantité globale de lipides qui joue
un rôle dans l’augmentation de l’expression et/ou de l’activité du CYP2E1 mais le type
d’acides gras s’accumulant dans les hépatocytes (Aubert et al., 2012).
Certaines études in vitro ont été réalisées sur des cellules hépatiques humaines et
animales traitées par différents types d’acides gras. Cependant, les protocoles
expérimentaux (durée d’incubation, concentrations des acides gras…) sont très variables et il
est difficile donc de tirer des conclusions définitives quant aux espèces lipidiques qui
pourraient être responsable de l’induction du CYP2E1. Par exemple, Zangar et Novak (1997)
ont étudié sur des hépatocytes de rat l’effet d’acides gras saturés à chaine courte ou
moyenne (C6-C10), ainsi que l’effet de l’acide palmitique, et n’ont constaté aucun effet de ces
acides gras sur l’expression des ARNm du CYP2E1 (Zangar and Novak, 1997). Quatre études
in vitro sur des cellules hépatiques humaines ont évalué l’effet individuel de certains acides
gras sur l’expression du CYP2E1 (Tab. 3). L’acide oléique et l’acide palmitique semblent
isolément augmenter l’expression (ARNm ou protéines) du CYP2E1 (Sung et al., 2004 ; Raucy
et al., 2004 ; Anthérieu et al., 2011) (Anthérieu et al., 2011; Raucy et al., 2004; Sung et al.,
2004). En revanche, en mélange, ces deux acides gras diminueraient les ARNm et l’activité
de l’enzyme ( Donato et al., 2007). Il est à noter que l’activité du CYP2E1 n’a pas été mesurée
dans les études montrant une augmentation de l’expression de ce CYP (Anthérieu et al.,
2011; Raucy et al., 2004).
37
Auteurs Conditions physiopathologiques investigations ARNm Protéines Activité
Patients obèses versus patients sains
O’shea et al., 1994 Mesure In vivo (1) - - ↗
(NAFLD non précisée)
NASH (50% de sujets obèses) versus foies sains
Weltman et al.,
Immunohistochimie - ↗ -
1998 (IMC des patients non précisé)
Patients obèses versus patients sains
Lucas et al., 1998 Mesure In vivo - - ↗ ca 40%
(NAFLD non précisée)
Patients souffrant d’obésité morbide et à ↗
Emery et al., 2003 Mesure In vivo(2) - -
différents stades de NAFLD versus patients sains
Chalasani et al., Patients obèses non-diabétiques souffrant de ↗
Mesure In vivo (2) - -
2003 NASH versus patients obèses sans NAFLD
↗ ns 70% ↗ ns
Patients obèses souffrants de stéatose ou NASH
steatose stéatose
Videla et al., 2004 versus patients sains Microsomes -
↗ ca 142% ↗ ca 52%
NASH NASH
Patients obèses souffrants de NASH versus
Chtioui et al., 2007 patients obèses souffrants de stéatose Mesure In vivo (1) - - ↗
Donato et al., 2006 Foies stéatosés versus foies sains (IMC des
Microsomes - - →
patients non précisé)
Foies stéatosés ou au stade NASH versus foies
Kohjima et al., 2007 Homogénat total ↗ ca 14X - -
sains (IMC des patients non précisé)
↗ ns
Varela et al., 2008 Patients obèses non-diabétiques souffrant de stéatose
Mesure In vivo (1) - -
NAFLD versus patients obèses sans NAFLD ↗ ca 35%
NASH
↗ ca 22%
Foies stéatosés ou au stade NASH versus foies stéatose
Fisher et al., 2009 microsomes - -
sains (IMC des patients non précisé) ↗ ca 45%
NASH
↘ ca 50%
stéatose
Homogénat total - -
↘ ca 80%
NASH
→ ↗ ns
Mitsuyoshi et al., Patients non obèses souffrants de stéatose ou stéatose stéatose
Microsomes -
2009 NASH versus patients sains ↘ ca 40% →
NASH NASH
↗ ca 8X
stéatose
Homogénat total - -
↗ ca 6.2X
NASH
Patients obèses souffrants de NASH versus
Baker et al., 2010 Homogénat total ↗ 2.17X - -
patients sains
Patients obèses ayant suivis une chirurgie
Bell et al., 2010 bariatrique : comparaison avant leur perte de Immunohistochimie - ↗ -
poids
Tableau 3: Régulation du CYP2E1 par les AG dans des hépatocytes humains in vitro. C16:0
acide palmitique ; C18:1 acide oléique ; C18:2 acide linoleïque ; C18:3 acide linolénique ;
C22:6 DHA (acide docosahexaénoïque) ; * : protéines non quantifiées ; ns: non significatif.
39
l’expression protéique en CYP2E1 par un mécanisme qui ne dépend pas uniquement de la
réduction de la prise alimentaire (Leclercq et al., 2000). Des travaux suggèrent également
que la leptine semble importante pour l’importation du CYP2E1 dans le compartiment
mitochondrial (Robin et al., 2005). Enfin, une étude montre que l’expression du CYP2E1
hépatique est augmentée chez des souris déficientes en adiponectine tandis qu’elle est
diminuée chez des souris surexprimant l’adiponectine (Kamada et al., 2007).
Bien que ces études in vivo suggèrent un rôle de l’insuline sur l’expression et l’activité
du CYP2E1, il est possible que d’autres facteurs liés au diabète puissent être impliqués tels
que l’hyperglycémie et l’augmentation des corps cétoniques (hypercétonémie) secondaire
au catabolisme accru des acides gras. Concernant l’hyperglycémie, l’étude de Wang et coll.
(2003) effectuée chez des sujets présentant un diabète de type 1 ou de type 2 montre une
corrélation significative et positive entre l’activité du CYP2E1 et la glycémie (Wang et al.,
2003). De plus, l’étude de Aubert et coll. (2012) a montré chez des souris db/db femelles que
la forte activité du CYP2E1 hépatique est corrélée positivement et significativement (p<0.01)
à la glycémie, qui est particulièrement élevée chez ces souris diabétiques (Aubert et al.,
2012). Il est enfin intéressant de noter que l’administration de sulfate de vanadyl à des rats
40
prétraités par la streptozotocine est capable de réduire la glycémie et de diminuer
l’expression du CYP2E1 hépatique (Kataoka et al., 2005).
L’ensemble de ces études suggère ainsi que la moindre sécrétion d’insuline (ou une
signalisation insulinique défectueuse) et/ou d’autres anomalies hormonales et métaboliques
associées pourraient jouer un rôle important dans l’induction du CYP2E1 hépatique. Dans ce
cadre, il est à noter que des investigations réalisées sur des cellules hépatiques de rat ont
montré que l’insuline inhibait l’expression du CYP2E1 en diminuant la stabilité des ARNm du
41
CYP2E1 (Moncion et al., 2002; Shukla et al., 2013; Woodcroft and Novak, 1999a; Woodcroft
et al., 2002), dont la demi-vie passe de 8,5h sans insuline à 3,3h en présence d’insuline (De
Waziers et al., 1995). Une séquence de 16 nucléotides au niveau de la région 5’ proximale de
l’ARNm du CYP2E1 interviendrait dans la régulation du CYP2E1 par l’insuline (Moncion et al.,
2002), mais les protéines se liant à ces séquences restent à identifier (Truong et al., 2005). A
l’inverse, il a été montré que le glucagon était capable d’augmenter l’expression du CYP2E1
grâce à la voie de signalisation impliquant l’AMPc et la protéine kinase A (PKA) (Woodcroft
and Novak, 1999b). A notre connaissance, une seule étude a évalué sur des hépatocytes
humains l’effet de l’insuline sur l’expression du CYP2E1. Dans cette étude, Raucy et coll.
(2004) ont montré que l’insuline n’altère pas significativement l’expression des ARNm dans
des hépatocytes primaires humains en culture, bien que les valeurs montrent une tendance
à la diminution. Il est important de noter cependant que dans toutes ces investigations les
effets de l’insuline ont été évalués sur des temps relativement courts (en général moins de
48 h et 4 jours pour une étude) et surtout, que l’activité du CYP2E1 n’a jamais été mesurée
(Raucy et al., 2004).
42
L’éthanol fait donc partie des composés inducteurs du CYP2E1 tout en étant un substrat de
l’enzyme. Cette augmentation de l’activité du CYP2E1 chez les sujets alcooliques joue un rôle
majeur dans la physiopathologie des maladies alcooliques du foie, en particulier en
favorisant le stress oxydant et la nécro-inflammation (Cederbaum et al., 2009; French, 2013;
Oneta et al., 2002; Song, 1996; Zhukov and Ingelman-Sundberg, 1999). De façon
intéressante, des travaux récents suggèrent que le CYP2E1 pourrait également jouer un rôle
dans la stéatose hépatique induite par l’intoxication alcoolique (Chen et al., 2014; Wu et al.,
2010). Cette induction du CYP2E1 explique également pourquoi les sujets alcooliques
présentent un risque accru d’hépatotoxicité au paracétamol, même en absence de
surdosage (Emby and Fraser, 1977; Jaya et al., 1993; Manchanda et al., 2013). En effet, dans
ce contexte toxicologique, une plus grande quantité de NAPQI est générée par le CYP2E1
hépatique. Néanmoins, une étude de 2007 suggère que l’ingestion d’alcool de façon
concomitante à un surdosage en paracétamol est associée à un risque plus faible
d’hépatotoxicité induite par ce médicament (Waring et al., 2008). Cela pourrait s’expliquer
par la moindre production de NAPQI due à une compétition entre l’alcool et le paracétamol
pour le CYP2E1.
• Autres facteurs
Inflammation et cytokines
Médicaments
44
C. Le CYP3A4
Le gène humain du CYP3A4 a été séquencé en 1993. Il est situé sur le chromosome 7
en position q22.1. Il est composé de 13 exons et code pour une protéine de 503 acides
aminés (Hashimoto et al., 1993; Inoue et al., 1992; Jounaïdi et al., 1994; Lamba et al., 2002).
Il est à noter que les CYPs correspondant au CYP3A4 humain sont chez la souris et le rat le
Cyp3a11 et le Cyp3a2, respectivement.
Le CYP3A4 est le principal CYP au niveau hépatique puisqu’il représente 60% des CYPs
totaux dans le foie (Guengerich, 1999). Il est également retrouvé dans la prostate, le sein, le
colon, le petit et le gros intestin et dans certaines régions du cerveau (Dutheil et al., 2009;
Huang et al., 1996; Kolars et al., 1994; Lown et al., 1997; Shimada et al., 1994).
Dans le foie, le CYP3A4 est exprimé majoritairement dans les hépatocytes entourant
les veines centrales (Hata et al., 2010). C’est une enzyme microsomale localisée dans le
réticulum endoplasmique (Paine et al., 1999). Cependant, Jeon et coll. (2008) ont mis en
évidence une activité catalytique de cette enzyme dans la fraction cytoplasmique suite à
l’ajout d’un partenaire redox (CPR et b5). D’après ces auteurs, il s’agirait d’une forme de
CYP3A4 délété en partie N-terminale (Jeon et al., 2008). Le CYP3A4 n’est pas exprimé dans le
foie fœtal (Betts et al., 2015; Lacroix et al., 1997). Chez l’adulte, une grande variabilité
interindividuelle a été décrite dans la population générale (Hata et al., 2010; Ozdemir et al.,
2000), et par exemple une étude a rapporté que l’expression hépatique de la protéine
CYP3A4 pouvait varier de 5 à 376 pmol/mg de protéine microsomale (Lin et al., 2002). Cette
variabilité contribue à des différences importantes concernant les effets thérapeutiques et
toxiques des xénobiotiques. Près de 90% de cette variabilité sont accordés à des facteurs
génétiques (Ozdemir et al., 2000). Il est à noter qu’un faible nombre d’allèles altère
l’expression du CYP3A4 (Horsmans et al., 1992; Lamba et al., 2002) et que son activité
enzymatique présente une variabilité inter-ethnique (Ahsan et al., 1991; Krishna and Shekar,
45
2005; Shimada et al., 1994). Par exemple, Ashan et coll. (1991) ont remarqué une activité
réduite chez des individus originaire d’Asie du Sud vivant en Grande Bretagne comparé à des
descendant britanniques, et ce indépendamment du régime alimentaire différent (Ahsan et
al., 1991).
Les modifications transcriptionnelles du CYP3A4 (et des CYPs homologues chez les
rongeurs) sont relativement bien connues, notamment sa régulation par les facteurs de
transcription HNF-4α (Hepatocyte Nuclear Factor-4α) (Jover et al., 2001; Kamiyama et al.,
2007), PXR (Pregnane X Receptor), CAR (Constitutive Androstane Receptor) (Krishna and
Shekar, 2005; Luo et al., 2002; Martínez-Jiménez et al. , 2007), et PPARα (Peroxisome
Proliferator-Activated Receptor α) (Thomas et al., 2013). Le promoteur du gène du CYP3A4
contient de nombreux sites de fixation de facteurs de transcription tels que HNF-4α, Oct-1
(Octamer-Binding Protein 1), un élément de réponse aux glucocorticoïdes (GRE) ainsi que
des séquences d’éléments de réponse aux récepteurs des œstrogènes (Hashimoto et al.,
1993; Itoh et al., 1992). Il est à noter que HNF-4α peut interagir avec PGC-1α (Proliferator-
Activated Receptor γ Coactivator-1α) au niveau du promoteur du Cyp3a11 et que cette
interaction peut être diminuée par SREBP-2 (Sterol Regulatory Element Binding Protein-2),
un facteur de transcription qui est activé lorsque les niveaux cellulaires de cholestérol sont
faibles (Inoue et al., 2011). De façon intéressante, une étude a montré que l’expression du
CYP3A pouvait être aussi contrôlée par SREBP-1, un facteur de transcription activé au niveau
hépatique par l’insuline (Roth et al., 2008). En particulier, la surexpression de SREBP-1 inhibe
la transcription du CYP3A4 via son interaction directe avec CAR et PXR. Ainsi, l’expression
génique du CYP3A4 peut être régulée directement ou indirectement par de nombreux
facteurs comme des hormones, des dérivés endogènes et des xénobiotiques, ce qui peut
46
expliquer, en plus du polymorphisme génétique, la grande variabilité interindividuelle de
l’activité du CYP3A4.
Les régulations post-transcriptionnelles quant à elles sont peut élucidées, mis à part
l’inhibition de l’expression du CYP3A4 par certains microARNs (Koturbash et al., 2012; Wei et
al., 2014). Takagi et coll. (2008) rapportent par exemple que le CYP3A4 serait indirectement
régulé par miR-148a, qui contrôlerait la régulation du facteur de transcription PXR (Takagi et
al., 2008). Une étude récente de 2014 a également mis en évidence que le miR-223 était
capable de réduire l’activité du CYP3A4 dans des cellules HepG2 surexprimant ce microARN
sans affecter l’expression protéique du CYP3A4. Cette inhibition de l’activité se ferait via
l’inhibition de l’expression protéique du cytochrome b5 (Takahashi et al., 2014). Lamba et
coll. (2014) identifient de plus miR-34a comme étant un microARN régulant fortement
l’expression (ARNm) du CYP3A4 et de différents facteurs de transcription hépatiques comme
HNF4α. Ils suggèrent que miR-34a peut réguler directement ou indirectement l’expression
du CYP3A4. Dans cette étude, ces auteurs ont de plus observé que les hommes exprimaient
plus fortement le miR-34a hépatique, et avaient une activité du CYP3A4 moindre comparés
aux femmes (Lamba et al., 2014). Enfin, grâce à une modélisation mathématique et des
approches expérimentales complémentaires, Wei et coll. (2014) ont montré que le CYP3A4
pourrait être également régulé dans le foie de façon post-transcriptionnelle par hsa-miR-
577, hsa-miR-1, hsa miR-532-3p et hsa miR-627 (Wei et al., 2014).
47
capable de métaboliser des dérivés endogènes tels que les stéroïdes naturels comme la
testostérone et la progestérone (Guengerich, 1999; Pelkonen et al., 1998).
• Le paracétamol
• La testostérone
De nombreuses études sur microsomes de foies humains ont démontré que des
inhibiteurs sélectifs du CYP3A4 diminuaient l’hydroxylation de la testostérone en 6β-
hydroxytestostérone (Bourrié et al., 1996; Newton et al., 1995; Wrighton et al., 1989). Des
anticorps anti-CYP3A4 ont également été utilisés pour démontrer la relation entre l’activité
du CYP3A4 et cette hydroxylation de la testostérone. En effet, l’utilisation d’un anticorps
monoclonal anti-CYP3A4 diminue très fortement l’hydroxylation de la testostérone en 6β-
hydroxytestostérone (Mei et al., 1999; Shou et al., 2000). De nombreux travaux in vitro
utilisent ainsi la biotransformation de la testostérone en 6β-hydroxytestostérone comme
marqueur d’activité du CYP3A4 (Racha et al., 2003).
48
Tableau 4: Médicaments substrats du CYP3A4 (stéroïdes inclus) (d’après Guengerich, 1999).
49
3. Altération de l’expression et/ou de l’activité du CYP3A4 en conditions
physiopathologiques
• Obésité et NAFLD
Concernant les investigations cliniques, les auteurs ont constaté en général une
diminution de l’expression protéique et de l'activité du CYP3A4 (Brill et al., 2012; Donato et
al., 2007; Fisher et al., 2009; Kolwankar et al., 2007; Weltman et al., 1998). Certaines de ces
études rapportent des diminution d’activité du CYP3A4 dans des foies stéatosiques pouvant
atteindre 50% par rapport à des foies sains (Donato et al., 2007; Kolwankar et al., 2007). En
revanche, Niemelä et coll. (2000) ont observé par immunohistochimie une augmentation
protéique du CYP3A4 chez des patients obèses ou diabétiques par rapport à des sujets en
phase précoce de maladie alcoolique du foie. Cependant, il est à noter que ces résultats sont
difficiles à interpréter car les auteurs n’ont pas inclus dans l’étude des sujets sains (Niemelä
et al., 2000).
50
TNFα (Ghose et al., 2011). Par contre, Li et coll. (2011) ont quant à eux observé une nette
augmentation des ARNm du Cyp3a2 hépatique chez des rats nourris par un régime riche en
graisses (Li et al., 2011). La discordance de cette étude avec les autres pourrait être due à
différents facteurs comme la composition du régime riche en graisse et la durée d’exposition
à ce régime.
Homogénat total → - -
Foies stéatosés ou au stade NASH versus
Fisher et al., → →
foies sains (IMC des patients non
2009 stéatose stéatose
précisé)
Microsomes -
↘ ns ↘ ns
NASH NASH
Patients obèses ayant suivis une
Bell et al.,
chirurgie bariatrique : comparaison Immunohistochimie - → -
2010
avant leur perte de poids
51
D’autres études ont été effectuées avec des modèles expérimentaux d’obésité et de
stéatose plus particuliers. Par exemple, Su et coll. (1999) ont étudié des rats nourris avec un
régime standard ou un régime riche en sucrose, supplémenté ou non en l’acide orotique,
connu pour induire une stéatose microvésiculaire. Dans cette étude, seul le régime riche en
sucrose supplémenté en acide orotique induisait une accumulation intrahépatique de lipides
(phospholipides, triglycérides et cholestérol) qui était accompagnée d’une réduction de
l’activité hépatique du Cyp3a2 (Su et al., 1999). Vornoli et coll. (2014) ont quant à eux
travaillé sur un modèle de rats nourris avec un régime riche en graisses supplémenté en
streptozotocine, rendant ainsi ces rats obèses et diabétiques. Ces auteurs ont observé une
tendance à l’augmentation protéique et de l’activité du Cyp3a2 chez ces rats (Vornoli et al.,
2014).
Enfin, concernant les investigations in vitro, 4 études sur hépatocytes humains ont
évalué l’effet individuel de certains acides gras sur le CYP3A4 (Tab. 6). Madec et coll. (2011)
ainsi que Hu et coll. (2014) ont montré que l’acide linoléique augmentait l’expression des
ARNm ou l’activité du CYP3A4 (Hu et al., 2014; Madec et al., 2011).En revanche, alors que
l’acide oléique semble diminuer les ARNm du CYP3A4 dans l’étude d’Anthérieu et coll.
(2011), il augmente l’activité de l’enzyme dans l’étude de Hu et coll. (2014) (Anthérieu et al.,
2011; Hu et al., 2014). Ainsi, ces résultats semblent indiquer que le CYP3A4 pourrait être
régulé de façon différentielle en fonction du type d’acides gras, avec notamment certains
acides gras qui induiraient son expression tandis que d’autres pourraient la diminuer. Il est à
noter à ce sujet que l’augmentation de l’expression du CYP3A4 par certains acides gras (ou
certains lipides) pourrait être la conséquence d’une activation de PPARα (Thomas et al.,
2013). On ne peut pas exclure cependant que les différentes conditions de culture
(notamment des concentrations différentes d’insuline et de DMSO) aient pu également
influencer l’expression et/ou l’activité du CYP3A4 dans les différentes études citées ci-
dessus. Ainsi, d’autres études seraient nécessaires afin de mieux caractériser les effets des
acides gras et d’autres types de lipides sur l’expression et l’activité du CYP3A4.
52
Auteurs Models Acides gras temps Concentration ARNm Proteines Activité
sans 50µM → - -
HepaRG
Madec et al. DMSO 100µM ↗ ns - -
C18:2 24h
2011 5µg/ml
200µM ↗ ca 50% - -
insuline
Hépatocyte 0,06µg/ml Mélange de 500µM total ↘ ns - ↘ ns
Donato et al.
s primaires insuline C18:1/C16:0 14h 1mM total ↘ ca 30% - ↘ ca 40%
2006
humains (10-8M) (2:1) 2mM total - - ↘ ca 50%
250µM ↘ ns - -
24h
Anthérieu et HepaRG 2%DMSO 500µM ↘ ca 38% - -
al. 5µg/ml C18:1 48h 500µM - → -
2011 insuline 14 250µM ↘ ns - -
jours 500µM ↘ ns ↗ ca 30% -
50µM - - ↗ ca 20%
C16:0 100µM - - ↗ ca 23%
200µM ↗ ca 110% ↗ ca 70% ↗ ca 24%
100µM - - ↗ ca 15%
HepG2 C18 :0
Sans 48h 200µM - - ↗ ca 57%
insuline 50µM - - →
Hu et al. C18 :1 100µM - - ↗ ca 35%
2014 200µM ↗ ca 62% ↗ ca 57% ↗ ca 36%
100µM - - ↗ ca 15%
C18:2
200µM - - ↗ ca 44%
C16:0 - - ↗ ca 75%
Fa2N-4 Sans C18:0 - - ↗ ca 60%
48h 200µM
insuline C18:1 - - ↗ ns
C18:2 - - ↗ ca 115%
Tableau 6: Régulation du CYP2E1 par les AG dans des hépatocytes humains in vitro. C16:0
acide palmitique ; C18 :0 acide stéarique ; C18:1 acide oléique ; C18:2 acide linoleïque ;
ns :non significatif.
53
l’activité du Cyp3a11 pour des souris db/db, accompagnée d’une augmentation de PXR et
CAR (Oh et al., 2012; Patoine et al., 2014). Par contre, une diminution de l’activité du
Cyp3a2est rapportée chez des rats Zucker par Zaluzny et coll. (1990) (Zaluzny et al., 1990).
Concernant le diabète de type 1, plusieurs études ont rapporté les effets du diabète
de type 1 sur le CYP3A chez des rongeurs traités par la streptozotocine. Ces études ont
montré globalement une augmentation de l’expression (ARNm ou protéine) et de l’activité
du Cyp3a11 chez des souris (Chatuphonprasert et al., 2012; Patoine et al., 2014) et du
Cyp3a2 chez le rat (Hu et al., 2011; Shimojo et al., 1993).
L’ensemble de ces études réalisées principalement chez les rongeurs suggère que le
glucose et/ou l’insuline pourraient modifier significativement l’expression du CYP3A.
Cependant, il existe peu de données concernant les effets de ces facteurs sur l’expression et
l’activité du CYP3A4, ou de ses homologues chez les rongeurs. Hu et coll. (2014) ont mis en
évidence que le glucose diminuait l’activité du CYP3A4 dans des hépatocytes humains alors
que l’insuline ne semblait pas modifier l’expression et/ou l’activité de cette enzyme (Hu et
al., 2014; Woodcroft and Novak, 1997). Néanmoins, Roth et coll. (2008) a montré que
l’insuline induit l’expression des ARNm du Cyp3a11 dans des hépatocytes primaires de souris
(Roth et al., 2008). Enfin, il est à noter que l’étude de Hu et al. (2014) a montré que
l’incubation d’hépatocytes humains avec du sérum de rats diabétiques entraine une
augmentation de l’activité du CYP3A4 (Hu et al., 2014). Clairement, d’autres études seraient
nécessaires afin de mieux connaitre les effets du glucose et de l’insuline sur l’expression et
l’activité du CYP3A et de déterminer s’il existe des différences entre les espèces.
L’expression hépatique du CYP3A4 semble être altérée lors des maladies alcooliques
du foie. Niemelä et coll. (2000) ont montré une induction protéique du CYP3A4 dans des
foies de patients alcooliques (Niemelä et al., 2000). Une étude sur hépatocytes primaires
humains montre également une induction des ARNm du CYP3A4 par l’éthanol (Kostrubsky et
54
al., 1995). Cependant, l’activité hépatique de l’enzyme ne semble pas altérée chez des
patients consommant de l’alcool modérément (Liangpunsakul et al., 2005).
Lors de l’inflammation et de l’infection, certaines cytokines sont responsables de
l’inhibition de l’expression et/ou l’activité du CYP3A4 (Aitken et al., 2006; Fardel and Le Vée,
2009). En effet, L’IL-6 et IL-1β diminue l’expression et l’activité catalytique du CYP3A4 in vitro
(Bachour-El Azzi et al., 2014; Rubin et al., 2015). L’inhibition du CYP3A4 par l’IL-6 semble
nécessiter le facteur de transcription PXR (Yang et al., 2010). Une étude chez des patients
après un stress chirurgical montre une corrélation négative entre l’induction d’IL-6 et
l’activité du CYP3A4 mesurée par une méthode non invasive (Haas et al., 2003). En revanche,
Il-18, IL-2 et IL-23 ne semble pas influencer l’expression et l’activité du CYP3A4 (Nguyen et
al., 2015; Rubin et al., 2015).
55
III/ Le paracétamol
A. Introduction
56
2. Pharmacologie
S’il est clair que le paracétamol agit au niveau du système nerveux central, son
mécanisme d’action complet n’est toutefois pas encore élucidé, et ce, plus d’un siècle après
sa découverte et de sa mise sur le marché. Il a été souvent associé à celui des anti-
inflammatoires non stéroïdiens (AINS), dont l’aspirine et l’ibuprofène de par ses propriétés
analgésiques et antipyrétiques, mais il s’en distingue par sa faible activité anti-inflammatoire
et antiplaquettaire.
3. Galénique et posologies
57
Dose thérapeutique Dose maximale recommandée
par 24 heures par 24 heures
Adultes et enfants de plus de 15 4g en 4 prises espacées de 6
3 x 1g espacés de 4 heures
ans (≥ 50kg) heures
Entre 38-50kg 3 x 1g espacés de 6 heures 3g
60 mg/kg/jour en 4 prises
Enfants et nourissons (≤38kg) soit 15 mg/kg toutes les 6 heures 80 mg/kg
ou 10 mg/kg toutes les 4 heures
4. Données pharmacocinétiques
L’absorption du paracétamol par l’intestin grêle après ingestion orale est rapide et
presque totale, avec une biodisponibilité d’environ 80%. La paracétamolémie thérapeutique
se situe entre 8 et 30 mg/l et les concentrations plasmatiques maximales sont atteintes 30 à
60 minutes après ingestion. Cependant, selon les formulations et le mode d’administration,
la biodisponibilité ainsi que le temps nécessaire pour atteindre la concentration plasmatique
maximale peuvent légèrement varier. Le paracétamol se distribue rapidement dans tous les
tissus avec un volume de distribution proche de 1l/kg et les concentrations sont
comparables dans le sang, la salive et le plasma. Du fait de sa faible liposolubilité et de sa
faible liaison aux protéines plasmatiques, son imprégnation dans le tissu adipeux semble
être relativement faible. Le paracétamol est connu pour traverser la barrière hémato-
encéphalique et le placenta.
58
Il est intéressant de noter que certaines études ont comparé la pharmacocinétique
du paracétamol entre des patients adultes obèses et non obèses (Abernethy et al., 1982;
Abernethy and Greenblatt, 1982). Dans ces travaux, le volume de distribution et la clairance
sont augmentés. Une autre étude, réalisée chez des enfants obèses pour qui une
stéatohépatopathie a été diagnostiquée, ne montre en revanche pas de différences
pharmacocinétiques avec des enfants sains, en particulier concernant la clairance (Barshop
et al., 2011).
59
B. Métabolisme
60
Figure 10: Les principales voies métaboliques du paracétamol après administration d’une
dose thérapeutique. Le paracétamol (APAP) est métabolisé dans le foie principalement par
conjugaison à des groupements glucuronides (50 à 70% de la dose administrée) et sulfates
(25 à 35%). Ces réactions sont catalysées respectivement par les UDP-
glucuronosyltransférases (UGTs) et les sulfotransférases (SULTs). Une faible portion du
paracétamol est prise en charge par les cytochromes P450 (CYPs), principalement le CYP2E1
et le CYP3A4, qui, par oxydation, forme le N-acétyl-p-benzoquinone imine (NAPQI). Ce
métabolite très réactif est rapidement détoxifié par conjugaison au glutathion (GSH) par la
glutathion-S-transférase (GST) pour former le 3’(S-glutathionyl)paracétamol qui est éliminé
dans les urines. D’autres métabolites hépatiques peuvent être formés tels que le 3’-hydroxy
ou 3’-méthoxy-paracétamol. L’excrétion biliaire des conjugués paracétamol-glucuronides
(APAP-glucuronide) et sulfates (APAP-sulfate) est dépendante des transporteurs MRP2
(Multidrug resistance-associated protein 2) et BCRP (Breast cancer resistance protein)
localisés au pôle apical des hépatocytes. L’excrétion biliaire du NAPQI-GSH requiert
également MRP2. L’excrétion basolatérale vers les sinusoïdes sanguins dépend plutôt de
MRP3 pour le paracétamol-glucuronide et de MRP2 / MRP4 pour le paracétamol-sulfate.
Une autre voie métabolique, en partie responsable de l’activité analgésique, est la formation
dans le cerveau du N-arachidonoylphénolamine (AM404). Après désacétylation hépatique
du paracétamol en p-aminophénol, ce dernier est conjugué à un acide arachidonique par la
fatty acid amide hydroxylase (FAAH) pour former l’AM404.
61
1. Les réactions de phase 1 et les cytochromes P450
Les réactions de conjugaison, ou réactions de phase 2, ont pour but de neutraliser les
groupements réactifs (thiol, amine, aldéhyde) d’une molécule ou de son métabolite, issus
d’une réaction de phase 1) et de rendre cette molécule plus hydrophile et donc facilement
éliminable par les liquides biologiques. Ces réactions sont catalysées par des enzymes de
phase 2 qui transfèrent un groupement polaire d’origine endogène sur un groupement
fonctionnel du xénobiotique, du substrat endogène ou de son métabolite. Les groupements
de conjugaison peuvent être des substrats hydrophiles (acide glucuronique, sulfurique ou
acétique), des acides aminés (glutamine, glycocolle), ou d’autres substrats tels que le
glutathion (GSH) ou la carnitine. Ces réactions sont catalysées par différentes transférases.
62
Le métabolisme du paracétamol fait intervenir trois types de conjugaison : la
glucuronoconjugaison, la sulfoconjugaison et la conjugaison au glutathion.
• La glucuronoconjugaison
L’expression des UGTs peut être régulée selon différents facteurs : le sexe, le poids
et/le statut nutritionnel, l’exposition à des polluants environnementaux ou à des
médicaments. Certains de ces facteurs seront discutés plus en détail ci-dessous.
63
fumeurs mais également via l’activation des facteurs de transcription CAR (Constitutive
Androstane Receptor) et PXR (Pregnane X Receptor) chez des patients traités par des
inducteurs enzymatiques de type phénobarbital, phénytoïne ou rifampicine (Bock and Bock-
Hennig, 2010).
• La sulfoconjugaison
64
Chez l’Homme, la sulfatation du paracétamol sur le groupement hydroxyle est
principalement due à SULT1A1, SULT1A3/4, SULT1E1 et SULT2A1 avec un Km de 2,4 mM, 1,5
mM, 1,9 mM et 3,7 mM, respectivement (Adjei et al., 2008).
• La conjugaison au glutathion
65
Certaines études ont montré que les stéatohépatopathies liées à l’obésité peuvent
être également associées à une réduction des taux intra-hépatiques de glutathion, surtout
lorsque cette pathologie est au stade de la NASH (Begriche et al., 2013; Videla et al., 2004).
Cependant, au cours de la NASH, il semble que la déplétion en glutathion soit moins sévère
comparée aux autres situations physiopathologiques citées plus haut.
3. Le métabolisme de phase 3
Lors de la NASH, l’expression de ces transporteurs peut être modifiée (Cheng et al.,
2008; Halilbasic, Claudel and Trauner, 2013; Pizarro et al., 2004). Ainsi, l’élimination des
conjugués du paracétamol par la bile et les urines peut être altérée lors de la NASH. En effet,
Lickteig en 2007 a démontré qu’une NASH chez le rat était associée à une augmentation de
l’expression de MRP3, MRP4 et BCRP (ARNm et protéines) et à une diminution de l’excrétion
biliaire du paracétamol-glucuronide, du paracétamol-sulfate et du paracétamol-GSH
(Lickteig et al., 2007). Plus récemment chez l’Homme, Canet et coll. (2015) ont également
montré chez des patients souffrant de NASH sévère une induction hépatique de MRP3 et
une altération de la localisation intra-hépatocytaire de MRP2. De façon intéressante,
l’augmentation de l’expression de MRP3 pourrait expliquer, au moins en partie, pourquoi les
concentrations plasmatiques de paracétamol-glucuronide sont augmentées dans le contexte
d’une NAFLD (Barshop et al., 2011; Canet et al., 2015). Une autre explication pourrait être
également une augmentation de l’expression hépatique des UDP-glucuronosyltransférases,
comme indiqué précédemment (Osabe et al., 2008).
66
C. Toxicité hépatique du paracétamol
67
1. La phase d’initiation
• Le NAPQI
Les adduits NAPQI-protéines sont mesurables par des techniques telles que l’HPLC-
ECD (High-Performance Liquid Chromatography with Electrochemical Detection). Leur
concentration intra-hépatique est maximale environ 2 à 3 heures après l’intoxication au
paracétamol (Muldrew et al., 2002). De façon intéressante, il semblerait que ce ne soit pas la
déplétion en glutathion en elle-même qui soit responsable de la toxicité du paracétamol,
68
mais bien les liaisons covalentes du NAPQI aux protéines cellulaires. En effet, un traitement
au diéthymaléate (DEM) entraîne rapidement une déplétion du glutathion intra-hépatique
chez la souris semblable à celle obtenue avec le paracétamol, mais sans induire de nécrose
hépatocytaire (Mitchell et al., 1973). En revanche, l’administration de DEM 30 minutes avant
une forte dose de paracétamol (375 mg/kg) potentialise la formation d’adduits aux protéines
et la nécrose hépatocytaire. Enfin, la quantité d’adduits mesurées 2 heures après une
intoxication au paracétamol est corrélée chez la souris avec la sévérité de la nécrose
observée (Jollow et al., 1973).
Plusieurs protéines cibles du NAPQI ont été identifiées par des techniques
immunochimiques (Cohen et al., 1997), ou grâce au développement de la protéomique
(Hinson et al., 1996; Qiu et al. , 1998; Stamper bet al., 2011). Le NAPQI se fixe notamment
sur des protéines mitochondriales telles que la glutamate déshydrogénase (Halmes et al.,
1996), l’aldéhyde déshydrogénase, la carbamyl-phosphate synthétase-I et la sous-unité
alpha de l’ATP synthétase (Cohen et al., 1997; Myers et al., 1995; Nelson et al., 1991; Qiu et
al., 2001; Tirmenstein and Nelson, 1989). L’inactivation de certaines de ces enzymes par le
NAPQI est probablement à l’origine de l’inhibition de l’activité de la chaine respiratoire
mitochondriale (Burcham and Harman, 1991; Donnelly et al., 1994).
• La péroxidation lipidique
69
régime déficient en vitamine E et riche en acides gras polyinsaturés, ce qui les a
probablement rendus particulièrement susceptibles à la péroxydation lipidique. De plus, des
souris nourries avec un régime standard ne développent que très peu de péroxydation
lipidique après un traitement au paracétamol (Jaeschke at al., 2003), et la vitamine E ne
protège pas in vitro les cellules hépatiques vis-à-vis de sa cytotoxicité (Knight et al., 2003).
Ainsi, dans les conditions classiques d’investigations expérimentales, le rôle de la
péroxydation lipidique reste incertain dans la toxicité hépatique du paracétamol.
70
2. La phase d’amplification et de propagation des lésions
Les ERO ont une action directe sur la mitochondrie. Par exemple, l’anion superoxyde
(O2˙-) réagit rapidement avec l’oxyde d’azote (NO) pour former l’anion peroxynitrite
71
(ONOO˙-) (Cover et al., 2005; Hinson et al., 1998), qui est capable d’inhiber la chaîne
respiratoire (Schöpfer et al., 2000). Il est important de noter que l’inhibition de la chaîne
respiratoire, qu’elle soit directe via le NAPQI ou indirecte par les ERO, est capable
d’entrainer elle-même une production plus importante d’ERO par certains constituants de
cette chaîne, notamment par les complexes I et III (Begriche et al., 2011). L’anion
peroxynitrite peut également endommager d’autres composants mitochondriaux tels que
les membranes, des protéines anti-oxydantes comme la superoxyde dismutase à manganèse
(MnSOD) (Agarwal et al., 2011) et l’ADN mitochondrial (ADNmt) (Cover et al., 2005; J A
Hinson et al., 1998) (Fig. 12).
72
Figure 12: Lésions mitochondriales et stress oxydant induits par le NAPQI. La déplétion
cytosolique et mitochondriale en glutathion (GSH) ainsi que l’inhibition de la chaine
respiratoire par la formation d’adduits NAPQI-protéines entraine à l’accumulation d’ERO
responsable d’un stress oxydant mitochondrial.
Le stress oxydant généré dans la mitochondrie par la production d’ERO est capable
d’activer des voies de signalisation de stress cellulaire. C’est notamment le cas de la voie JNK
(c-Jun-N-terminal), avec un pic d’activation qui se situe environ deux heures après
l’intoxication au paracétamol (Gunawan et al., 2006; Hanawa et al., 2008; Xie et al., 2014a).
Cette activation de JNK pourrait se faire par l’intermédiaire de la kinase ASK-1 (Apoptosis
Signal-regulating Kinase 1). De plus, les ERO produites par les mitochondries semblent
activer plus précocement la GSK3β (Glycogen Synthase Kinase 3β), une kinase capable
d’initier également l’activation de JNK. Ainsi, les ERO mitochondriales pourraient activer JNK
via deux voies de signalisation : ASK-1 et GSK3β (Fig. 13) (Shinohara et al., 2010).
73
JNK est un membre de la superfamille des MAP kinases (Mitogen Activated Protein
kinase). La forme phosphorylée active de JNK peut participer à de nombreux évènements
cellulaires via la phosphorylation de facteurs de transcription tels que c-jun, p53 et ATF-2 et
celle de protéines de la famille Bcl-2 (Cheng et al., 2003; Hayakawa et al., 2004; Hibi et al.,
1993; Johnson and Nakamura, 2007; Latchoumycandane et al., 2007). JNK possède trois
isoformes : JNK1 et JNK2 exprimés de manière ubiquitaire, et JNK3 principalement exprimée
dans les neurones du système nerveux central (Sabapathy et al., 2004).
Certains travaux semblent indiquer que JNK1 et JNK2 jouent un rôle important dans
la toxicité du paracétamol. En effet, l’inhibition ou l’absence de ces deux kinases protège in
vivo de cette toxicité, sans interférer avec la bioactivation du médicament et la déplétion en
GSH (Gunawan et al., 2006; Hanawa et al., 2008; Henderson et al., 2007; Latchoumycandane
et al., 2007; Saito et al., 2010a). Cependant, l’inhibition sélective d’une seule de ces
enzymes, JNK1 ou JNK2, n’entraîne pas de protection (Bourdi et al., 2008; Saito et al.,
2010a). Au contraire, Bourdi et son équipe montrent que des souris déficientes pour JNK2
sont plus sensibles à la toxicité tardive du paracétamol (Bourdi et al., 2008). En effet, après
une dose de 300 mg/kg de paracétamol, 90% des souris KO pour le gène de JNK2 meurent
dans les 48 heures, contre 20% pour leurs homologues sauvages. Ces résultats suggèrent le
rôle bénéfique de JNK2 dans la réparation tissulaire après intoxication.
Malgré ces données, certaines investigations ne semblent pas être en faveur d’un
rôle majeur de l’activation de JNK dans certains modèles expérimentaux. Par exemple, une
étude récente chez des souris obèses ou wild-type montre que l’activation de JNK1/2 n’est
pas corrélée à la sévérité de la cytolyse hépatique (Aubert et al., 2012). En effet, 8 heures
après l’intoxication au paracétamol (500 mg/kg) l’expression de phospho-JNK1/2 était très
supérieure chez les souris ob/ob par rapport aux souris db/db et wild-type alors que la
cytolyse était significativement supérieure chez les souris db/db par rapport aux autres
groupes de souris (Aubert et al., 2012).
74
Etape 3 : Perméabilité mitochondriale et mort de l’hépatocyte
Mise à part Bax, d’autres protéines peuvent subir un transfert du cytosol vers les
mitochondries, favorisant ainsi la mort cellulaire. Par exemple, la relocalisation
mitochondriale de GSK3β favoriserait le dégradation de Mcl-1 (induced Myeloid Leukemia
cell differentiation protein), une protéine anti-apoptotique de la membrane mitochondriale
(Shinohara et al., 2010). Phospho-JNK peut également se relocaliser dans la mitochondrie et
engendrer à son tour un stress oxydant par la formation d’ERO et de peroxynitrite (Hanawa
et al., 2008; Saito et al., 2010a). Le mécanisme impliqué est incertain mais il semblerait que
la liaison avec Sab, une protéine située dans la membrane externe des mitochondries, soit
nécessaire pour que phospho-JNK puisse induire la production d’ERO (Win et al., 2011).
75
Ainsi, l’intoxication au paracétamol entraîne dans la mitochondrie une dégradation ou
l’inactivation des facteurs anti-apoptotiques Mcl-2, Bcl-XL et Bcl-2, et une augmentation des
protéines pro-apoptotiques Bax (Fig. 13).
Des investigations in vivo chez la souris, et in vitro sur des mitochondries de foie de
rat, ont montré que le paracétamol induisait l’ouverture du PTPM et une libération de
calcium mitochondrial (Masubuchi et al., 2005; Moore et al., 1985; Weis et al., 1992). De
plus, des études ont montré que la toxicité du paracétamol pouvait être bloquée grâce à la
cyclosporine A, un inhibiteur de l’ouverture du PTPM. En effet, des souris prétraitées à la
76
cyclosporine A présentent une moindre augmentation des transaminases, malgré la
présence d’une déplétion en GSH, suggérant que cette molécule protectrice n’agit pas sur
l’activation métabolique du paracétamol (Beales and McLean, 1996; Haouzi et al., 2002;
Masubuchi et al., 2005). Ainsi, l’ouverture du PTPM semble être un évènement majeur
impliqué dans la physiopathologie de la toxicité hépatique induite par le paracétamol (Kon et
al., 2004a; Masubuchi et al., 2005; Reid et al., 2005). Cependant, il est important de noter
que certaines investigations in vitro montrant une ouverture du PTPM par le paracétamol
ont été réalisées en présence de calcium (Masubuchi et al., 2005), un activateur puissant du
PTPM. En revanche, en absence de calcium, ce médicament est incapable d’induire
l’ouverture du PTPM et la libération mitochondriale du cytochrome c (Porceddu et al., 2012).
Figure 13: Activation de la voie de la c-jun-N-terminal kinase (JNK) par les ERO suite à une
intoxication au paracétamol. Le stress oxydant mitochondrial favorise l’activation de JNK via
ASK-1 et GSK3β, l’ouverture du pore de transition de perméabilité, la dégradation de l’ADN
nucléaire et mitochondrial. Ces évènements conduisent à la mort de l’hépatocyte par
nécrose.
77
• La nécrose et l’apoptose dan l’hépatotoxicité du paracétamol
Il est à noter toutefois que d’autres études suggèrent le rôle significatif des caspases.
Par exemple, des investigations in vivo montrent un effet protecteur des inhibiteurs de
caspases, lorsqu’ils sont utilisés en préventif (El-Hassan et al., 2003; Hu and Colletti, 2010).
78
Cependant, ces molécules ont été dissoutes dans le DMSO, qui est lui-même un puissant
inhibiteur de l’activité enzymatique des CYPs ( Park et al., 1988), ainsi qu’un inhibiteur de la
libération de AIF dans le cytosol (Saito et al., 2010a). Même si les doses de DMSO utilisées
sont faibles, elles semblent suffisantes pour protéger entièrement de la toxicité du
paracétamol (Jaeschke et al., 2006; Jaeschke et al., 2011; Schulze-Osthoff and Bantel, 2011).
D’autres études montrent une activation de la caspase 3 après une forte dose de
paracétamol chez certaines souris non consanguines CD-1 ou Swiss Webster et non soumises
au jeûne (Antoine et al., 2009; Antoine et al., 2010; Williams et al., 2011). Malgré cette
activation, la proportion de cellules apoptotiques ne dépasse pas 0,5% des cellules
hépatiques totales alors que les auteurs observent environ 50% de cellules nécrotiques
(Williams et al., 2011). Ainsi, les cellules nécrotiques restent proportionnellement beaucoup
plus importantes suite à une intoxication au paracétamol.
Figure 14: Différences morphologiques entre la mort cellulaire par apoptose et par nécrose
observées après coloration à l’hématoxyline-éosine de coupes de foie de souris. Ces
dernières ont été traitées soit par un mélange galactosamine-endotoxine (à gauche), connu
pour entraîner une apoptose hépatocytaire, soit par 300 mg/kg de paracétamol pendant 6
heures (à droite). L’apoptose hépatocellulaire est caractérisée par la compaction de la
chromatine sous la membrane nucléaire, la condensation du cytoplasme et la fragmentation
de l’ADN. La nécrose est caractérisée par le gonflement des cellules avec rupture de la
membrane plasmique et dégradation du noyau. Objectif X400 (Jaeschke et al., 2011a).
79
3. Régénération et réparation tissulaire
• Prolifération cellulaire
Des souris KO pour IL6, p55 (récepteur de type 1 du TNFα) ou VEGFR- (récepteur de
type 1 du VEGF) présentent une réponse régénérative altérée après un surdosage au
paracétamol (Chiu et al., 2003; James et al., 2003; T. Kato et al., 2011). Cependant, un
prétraitement des animaux à l’IL-6 ne protège pas vis-à-vis de la toxicité du paracétamol
(Bajt et al., 2003). En revanche, un traitement par une faible dose de thioacétamide, qui
force l’entrée des hépatocytes dans le cycle cellulaire, atténue les lésions induites par une
forte dose de paracétamol (Chanda et al., 1995). L’activation du cycle cellulaire et de la
régénération tissulaire sont donc des évènements importants après intoxication au
paracétamol.
80
• Rôle de l’immunité innée dans la régénération tissulaire
81
pour évaluer le rôle exact des cellules de Kupffer dans l’hépatotoxicité du paracétamol, il est
possible que ce rôle soit différent en fonction de l’intensité des altérations hépatiques due à
la dose de paracétamol, et le contexte inflammatoire.
82
D. Prise en charge médicale de l’intoxication au paracétamol
1. Symptômes
83
l’hypochondre droit signifiant l’atteinte hépatique. L’atteinte hépatique se caractérise par
une nécrose hépatocytaire massive dans la région centrolobulaire, accompagnée d’une
hypoxie liée à la congestion des vaisseaux hépatiques (Walker et al., 1983). Selon la dose,
l’atteinte peut être plus ou moins importante. L’hépatite dite « fulminante » est
particulièrement redoutée car elle est marquée par une acidose métabolique, une
coagulopathie et une encéphalopathie hépatique, ce qui nécessite de considérer en urgence
la transplantation hépatique.
2. Traitements
Dans la grande majorité des cas, l’administration par voie orale ou intraveineuse de
N-acétyl-cystéine (NAC) suffit à améliorer l’état du patient. La NAC représente le traitement
de référence et de première intention de l’intoxication au paracétamol depuis plus de 35 ans
(Polson and Lee, 2005; Prescott et al., 1977). Son utilisation s’appuie sur des travaux
expérimentaux réalisés par l’équipe de Bernard Brodie, qui a mis en évidence le rôle de la
déplétion du glutathion dans la toxicité du paracétamol (Mitchell et al., 1973). La NAC agit
comme un précurseur de la resynthèse de glutathion, en fournissant aux hépatocytes la
cystéine, acide aminé limitant de la synthèse. Ainsi la NAC prévient la liaison du NAPQI aux
protéines et à d’autres constituants cellulaires (Corcoran and Wong, 1986). Elle est donc
d’autant plus efficace qu’elle est administrée précocement (dans les 10 premières heures),
avant que les transaminases n’augmentent de manière significative.
Cependant, même débuté 24 heures après intoxication, le traitement à la NAC
améliore le pronostic et diminue la progression des lésions (Keays et al., 1991), suggérant la
mise en jeu d’autres mécanismes de protection. Récemment, Saito et coll. (2010) ont
proposé en effet deux mécanismes tardifs d’action de la NAC. Elle pourrait, en favorisant la
restauration du glutathion mitochondrial, améliorer l’élimination des ERO et des
peroxynitrites, mais aussi faciliter le maintien des concentrations hépatiques d’ATP grâce à
l’oxydation mitochondriale des acides aminés du glutathion régénéré (Saito et al., 2010b).
3. Diagnostic
Ces critères sont parfois insuffisants pour le diagnostic. Le dosage des adduits (APAP-
cystéine) dans le sérum des patients a été récemment proposé. Ce dosage consiste à
mesurer les adduits formés dans les hépatocytes par la liaison du NAPQI aux protéines
cellulaires et libérés dans la circulation lors de la nécrose cellulaire (Pumford et al., 1989). Il
reflète donc la quantité de NAPQI produite par bioactivation du paracétamol par les CYPs.
Cette quantité est proportionnelle à l’intensité des lésions et selon une étude prospective, ce
dosage permet de diagnostiquer une intoxication au paracétamol pour 1/5 des hépatites
aiguës d’étiologie inconnue aux Etats-Unis. Cette technique apporte un avantage certain
dans le cas d’intoxication par ingestion répétée de dose supra-thérapeutiques, où le
nomogramme de Rumack et Matthew est inutile (Heard et al., 2011). En effet, les adduits
APAP-cystéines sont mesurables jusqu’à 12 jours après l’intoxication même lorsque le
paracétamol plasmatique est indétectable. Cependant, cette technique très spécifique n’est
86
pas encore utilisée en clinique car elle nécessite un appareillage coûteux (HPLC couplée à un
détecteur électrochimique) (Davern et al., 2006; Heard et al., 2011; Khandelwal et al., 2011;
Muldrew et al., 2002).
D’autres chercheurs ont proposé comme marqueurs des lésions hépatiques après
intoxication au paracétamol le dosage plasmatique de protéines telles que la cytokératine-
18 et l’HMGB1 (Antoine et al., 2012), la détection de microARN circulants tels que mir-122 et
mir-192 (Wang et al., 2009), ou le dosage urinaire de métabolites endogènes et/ou dérivés
du NAPQI (Clayton et al., 2006; Winnike et al., 2010). Même s’il est encore trop tôt pour dire
si ces biomarqueurs pourront être utilisés en routine, les recherches dans ce domaine
méritent d’être poursuivies. En effet, outre l’aide apporté au diagnostic, ces nouveaux
marqueurs pourraient également prédire le risque lésionnel lors d’une intoxication au
paracétamol, et ainsi identifier les sujets qui sont les plus à risque de développer une
hépatite grave, voire fulminante.
88
1. Obésité et pathologies hépatiques associées
• Données cliniques
Une large étude rétrospective a rapporté un risque accru d'atteinte hépatique aiguë
induite par un surdosage de paracétamol chez les patients présentant une maladie
hépatique stéatosique non alcoolique (NAFLD). En effet, dans cette étude, les patients
atteints d’une NAFLD préexistante et hospitalisé pour surdosage au paracétamol avaient un
risque multiplié par 7 de survenue d’atteinte hépatique aiguë par rapport à ceux ne
présentant de NAFLD (Nguyen et al., 2008). Dans une étude ultérieure, Myers et Shaheen
(2009) ont analysé une nouvelle fois la même base de données mais en tenant compte des
différences possibles existant dans les circonstances de surdosage, ce qui aurait pu
constituer un facteur confondant important (Myers and Shaheen, 2009). Cette nouvelle
analyse a confirmé le risque plus élevé d'hépatotoxicité suite à un surdosage au paracétamol
chez les patients présentant une NAFLD (Nguyen et al., 2008), même si l'ampleur de ce
risque était atténué dans cette étude (3,91 vs 7,43). Cependant, il est important de souligner
que ces deux études ont montré que le risque d’hépatotoxicité après surdosage au
89
paracétamol était similaire chez les patients présentant une NAFLD et chez ceux atteints
d’une maladie alcoolique du foie (Myers and Shaheen, 2009; Nguyen et al., 2008).
En revanche, deux études ont montré que le risque de lésions hépatiques aiguës
après surdosage au paracétamol était similaire ou inférieure, chez les patients obèses par
rapport aux sujets non obèses, mais la présence d’une NAFLD n’a pas été déterminée dans
ces travaux (Radosevich et al., 2013; Rutherford et al., 2006). Cependant, dans l'une de ces
études, l’insuffisance hépatique aiguë avait une issue plus défavorable chez les patients
obèses (Rutherford et al., 2006).
L’ensemble de ces études cliniques suggère ainsi que la NAFLD, plutôt que l'obésité
en elle-même, pourrait augmenter le risque d'atteinte hépatique aiguë après un surdosage
au paracétamol. En fait, le risque et la sévérité de l’hépatotoxicité au paracétamol
pourraient être la résultante chez chaque patient de la présence de facteurs favorisant sa
toxicité (induction du CYP2E1, diminution préalable des stocks de glutathion) et l’existence
éventuelle de facteurs plutôt protecteurs (augmentation du volume de distribution et de la
glucuronidation, diminution de l’activité du CYP3A4) (Michaut et al., 2014).
De 1987 à 2012, six études différentes ont rapporté l'effet de l'intoxication aiguë au
paracétamol dans plusieurs modèles animaux d'obésité et de NAFLD (Aubert et al., 2012;
Blouin et al., 1987; Corcoran et al., 1987; Ito et al., 2006; Kon et al., 2010; Kučera et al.,
2012). De plus, une étude a rapporté l’hépatotoxicité de fortes doses de paracétamol dans
un modèle murin de stéatohépatite induite par un régime déficient en méthionine et en
choline (régime « MCD ») (Donthamsetty et al., 2008). Cependant, il faut souligner que le
régime MCD entraîne une perte importante du poids corporel chez les animaux (Leclercq et
al., 2007; Rizki et al., 2006) et qu’il n'induit pas de résistance systémique à l'insuline (Leclercq
et al., 2007; Rinella and Green, 2004). Ainsi ce modèle de stéatohépatite n’est pas
totalement comparable aux modèles de NAFLD liés à la consommation excessive de calories.
90
Parmi ces différentes études, quatre d'entre elles ont montré que la présence d’une
NAFLD était associée à des lésions hépatiques plus sévères après une intoxication aiguë au
paracétamol (Aubert et al., 2012; Donthamsetty et al., 2008; Kon et al., 2010; Kučera et al.,
2012). Une autre étude a également montré une toxicité accrue du paracétamol chez les rats
nourris avec un régime riche en graisses (Corcoran et al., 1987), même si la présence
préalable de stéatose hépatique chez ces rats n’a pas été objectivée dans cette étude. En
revanche, les autres études ont montré des atteintes hépatiques moins graves (Ito et al.,
2006), ou similaires (Blouin et al., 1987) dans les modèles expérimentaux utilisés.
91
l’hépatotoxicité au paracétamol dans un contexte de NAFLD, comme par exemple
l'accumulation de lipides et un stress oxydant plus important.
En ce qui concerne l’accumulation lipidiques il est à noter que, dans le travail déjà
cité précédemment (Aubert et al., 2012), malgré une stéatose moins marquée chez les souris
db/db par rapport au souris ob/ob, une plus grande hépatotoxicité du paracétamol chez les
souris db/db est observée. De plus, les niveaux plasmatiques de base des transaminases
ALAT et ASAT (i.e. avant intoxication) étaient comparables entre les souris db/db et ob/ob
(Aubert et al., 2012). Ainsi, une sensibilité accrue à hépatotoxicité du paracétamol chez les
souris db/db femelles ne peut pas être attribuée à la préexistence d'une cytolyse hépatique
élevée. Cependant, cette étude ne permet pas d’exclure la possibilité que l'accumulation de
certaines espèces de lipides pourrait être impliquée. En effet, il est à noter que les
hépatocytes db/db présentent une stéatose plutôt microvésiculaire et moins
macrovacuolaire par rapport aux hépatocytes ob/ob (Aubert et al., 2012; Trak-Smayra et al.,
2011). Parce que la taille des gouttelettes est fortement influencée par la composition
lipidique (Guo et al., 2008; X. Shi et al., 2013), il est possible que l'accumulation de certaines
espèces de lipides spécifiques dans les hépatocytes des souris db/db femelles ait pu
contribuer à la plus grande susceptibilité à la toxicité du paracétamol.
92
ont été mesurées dans ces études et ainsi il serait important de déterminer si les stocks de
GSH mitochondrial sont spécifiquement diminués dans ces modèles de NAFLD. En effet,
certaines études ont suggéré un rôle clé du pool mitochondrial de GSH dans les lésions
hépatiques induites par le paracétamol (Fernandez-Checa and Kaplowitz, 2005; Zhao et al.,
2002).
En plus des investigations réalisées sur des modèles de rongeurs obèses, une étude a
rapporté l'effet de l’intoxication aiguë au paracétamol dans un modèle murin de
stéatohépatite induite par un régime « MCD » (Donthamsetty et al., 2008). Dans cette étude,
une plus grande hépatotoxicité du paracétamol était observée malgré l'absence d’induction
préexistante du CYP2E1 et la présence de concentrations normales de base du GSH
hépatique (Donthamsetty et al., 2008), suggérant ainsi l'implication d'autres mécanismes. De
93
façon intéressante, les concentrations basales d’ATP hépatique étaient réduites de 45% chez
les souris nourries par le régime « MCD » (Donthamsetty et al., 2008), suggérant une
altération importante de la chaîne respiratoire mitochondriale et de la phosphorylation
oxydative dans ce modèle expérimental (Serviddio et al., 2008, 2010). Par conséquent, un
dysfonctionnement mitochondrial préexistant pourrait avoir joué un rôle significatif dans la
plus grande hépatotoxicité du paracétamol observée chez les souris nourries avec le régime
« MCD ». Même si ces résultats sont intéressants, il faut néanmoins garder à l’esprit que ce
modèle de NAFLD présente beaucoup de différences par rapport aux modèles de NAFLD
induite par des régimes hypercaloriques, comme cela a déjà été souligné plus haut.
Bien que la présence d’une NAFLD chez les personnes obèses semble augmenter le
risque d'atteinte hépatique aiguë après intoxication au paracétamol (Nguyen et al., 2008;
Myers et al., 2009), ces études cliniques n'ont pas déterminé le mécanisme par lequel le
paracétamol pourrait être plus toxique dans cette situation pathologique. Néanmoins, il est
à noter qu’une augmentation de l'activité du CYP2E1 hépatique a été fréquemment
rapportée chez les patients présentant une NAFLD (Aubert et al., 2011; Chalasani et al.,
2003; Chtioui et al., 2007; Emery et al., 2003; Varela et al., 2008), même s'il est encore
difficile de savoir si l’induction du CYP2E1 est spécifiquement liée à cette maladie du foie, ou
à d'autres troubles métaboliques liés à l'obésité, tels que la résistance à l'insuline et le
diabète de type 2 (Aubert et al., 2011).
Dans les études expérimentales, la stéatose chez les rongeurs obèses était en général
associée à une hépatotoxicité plus élevée après un surdosage au paracétamol (Aubert et al.,
2012; Kon et al., 2010; Kučera et al., 2012). De plus, dans une de ces études, une cytolyse
hépatique aiguë plus sévère semblait corrélée avec une activité accrue préexistante du
CYP2E1 hépatique, mais pas avec le degré d'accumulation des lipides, c'est-à-dire avec la
sévérité de la stéatose hépatique (Aubert et al., 2012).
94
Contrastant avec ces études, l'obésité n’était pas associée à une plus grande
hépatotoxicité du paracétamol chez les patients chez lesquels la présence d’une NAFLD n'a
pas été recherché, comme précédemment indiqué (Rutherford et al., 2006; Radosevich et
al., 2013). De façon intéressante, une hépatotoxicité au paracétamol similaire ou inférieure a
été observée dans certains modèles de rongeurs obèses (Blouin et al., 1987; Ito et al., 2006;
Aubert et al., 2012). Différentes études cliniques et expérimentales ont montré que l'obésité
était associée à une plus grande glucuronidation hépatique du paracétamol et de sa
clairance (Abernethy et al., 1983; Aubert et al., 2012; Barshop et al., 2011; Brill et al., 2012;
Gicquel et al., 2013; Xu et al., 2012) . En revanche, l'influence de l'obésité et de la NAFLD sur
la sulfatation du paracétamol n’est pas clairement établie car les investigations chez les
rongeurs et les patients ont fourni des résultats divergents (Aubert et al., 2012; Chaudhary
et al., 1993; Corcoran et al., 1987; Hardwick et al., 2013). Il est à noter aussi que l'activité
hépatique du CYP3A4 est plus faible au cours de l'obésité et de la NAFLD chez l’Homme et
l’animal (Brill et al., 2012; Kolwankar et al., 2007; Patoine et al., 2013; Yoshinari et al., 2006),
ce qui peut réduire la production de NAPQI. Enfin, l'obésité semble être associée à une
moindre absorption gastro-intestinale du paracétamol et à un plus grand volume de
distribution, ce qui pourrait réduire les concentrations plasmatiques de cet antalgique
(Abernethy et al., 1982; Lee et al., 1981) .
Ainsi, il semble que l'apparition de lésions hépatiques aiguës chez une personne
obèse après un surdosage au paracétamol pourrait dépendre d'un équilibre délicat entre les
facteurs métaboliques qui peuvent avoir un effet protecteur (augmentation de la
glucuronidation et du volume de distribution, moindre absorption gastro-intestinale et
activité plus faible du CYP3A4) et d'autres susceptibles d’augmenter la production hépatique
de NAPQI (induction du CYP2E1) ou de réduire la détoxication de ce métabolite réactif
(baisse des stocks de GSH). L’implication possible de tous ces facteurs est présentée
schématiquement dans la Figure 17.
95
Figure 17: Facteurs pouvant moduler le risque et la sévérité de l’hépatotoxicité induite par
le paracétamol dans un contexte d’obésité et de NAFLD. Les facteurs pouvant protéger
contre les lésions hépatiques liées au paracétamol incluent la diminution de l’absorption
intestinale et de l’activité du CYP3A4, ainsi que l’augmentation du volume de distribution et
de la glucuronidation hépatique. Ces facteurs peuvent réduire le taux plasmatique de
paracétamol et diminuer la formation de NAPQI, un métabolite toxique du paracétamol. Les
facteurs pouvant aggraver les lésions hépatiques dues au paracétamol comprennent une
augmentation de l’activité du CYP2E1, qui mène à une production plus accrue de NAPQI, et
un faible stock de glutathion hépatique, ce qui diminue les capacité de détoxification du
NAPQI. D’autres investigations sont nécessaires pour déterminer si la présence d’une
stéatohépatite (NASH) et/ou des dysfonctions mitochondriales peuvent favoriser
l’hépatotoxicité du paracétamol chez les sujets obèses (Michaut et al., 2014).
96
• Questions en suspens
Bien qu'il existe des arguments expérimentaux indiquant que l’induction du CYP2E1
hépatique au cours de la NAFLD peut favoriser l'hépatotoxicité du paracétamol, il est
concevable que d'autres mécanismes puissent également jouer un rôle. Par exemple, il sera
important de déterminer si la gravité de la NAFLD peut être un facteur important.
Intuitivement, on peut s'attendre à ce que la présence d’une nécro-inflammation importante
(présence d’une NASH) puisse être associée à un risque plus élevé, par rapport à la stéatose
hépatique simple. La préexistence d'un dysfonctionnement mitochondrial liée à la NASH
(Begriche et al., 2013; Grattagliano et al., 2012) pourrait effectivement être impliqué
puisque ce dysfonctionnement joue un rôle clé dans l’apparition de la cytolyse induite par le
paracétamol (Han et al., 2010; Jaeschke et al., 2012; Knockaert et al., 2011). Il sera
également intéressant d’étudier la relation entre les concentrations intra-hépatiques de GSH
au cours de la NAFLD (et surtout de la NASH) et la sévérité des lésions hépatiques induites
par une intoxication au paracétamol.
Compte tenu du faible nombre d'études cliniques publiées sur l’hépatotoxicité du
paracétamol dans un contexte d’obésité et de NAFLD, d'autres investigations sont
clairement nécessaires pour obtenir plus d'informations sur cette question. En particulier, il
sera important de déterminer s’il existe un sous-groupe de sujets obèses présentant un
risque accru d'hépatotoxicité suite à une intoxication au paracétamol. Il est possible en effet
qu’un tel risque ne concerne pas tous les sujets obèses étant donné qu’il existe des facteurs
métaboliques liés à l’obésité qui peuvent constituer une protection vis-à-vis de
l’hépatotoxicité de cet antalgique, comme cela a été souligné précédemment. Ces
investigations cliniques devront porter non seulement sur les cas d’intoxication aiguë liés à
un surdosage, mais également sur les cas d’hépatotoxicité survenant dans le cadre d’une
administration chronique de paracétamol (Biour et al., 2004; Watelet et al., 2007). Des
investigations sont en cours dans l’équipe afin de déterminer si l’administration pendant
plusieurs semaines de doses thérapeutiques chez des souris nourries par un régime normal
ou riche en graisses est susceptible d’entraîner une cytolyse plus importante chez les souris
présentant une stéatose.
97
Des investigations seraient également nécessaires afin de déterminer si les troubles
métaboliques autres que la NAFLD pourraient favoriser l’hépatotoxicité du paracétamol, tels
que la résistance à l'insuline et le diabète de type 2. De façon intéressante, le diabète a été
associé à un risque plus élevé de lésions hépatiques graves induites par les médicaments
(Chalasani et al., 2008), bien que les cas d’hépatotoxicité au paracétamol n’aient pas été
inclus dans cette étude. Il sera également important de déterminer le(s) mécanisme(s) précis
de l’induction du CYP2E1 chez les patients obèses présentant une NAFLD. Les quelques
pistes existant actuellement ont été présentées dans le chapitre consacré à la
physiopathologie de la NAFLD.
100
pourrait également être liée à la plus grande production des corps cétoniques, et en
particulier de l’acétone (Forkert et al., 1994; Kraner et al., 1993).
• Hépatites virales
• Interactions médicamenteuses
• L’âge
• Le sexe
• Polymorphismes génétiques
103
La susceptibilité au paracétamol pourrait être également influencée par l’expression
de gènes impliqués dans la réponse immunitaire. En effet, des investigations réalisées chez
des adultes sains traités par des doses maximales recommandées de paracétamol ont
montré qu’un polymorphisme sur le gène CD44 (qui code pour une molécule d’adhésion
cellulaire exprimée sur les lymphocytes) était associé à une augmentation des transaminases
sériques et donc à une plus grande sensibilité à cet antalgique (Harrill et al., 2009).
Cependant, une étude plus récente n’a pas montré de lien statistiquement significatif entre
la présence de ce polymorphisme et une hépatotoxicité au paracétamol secondaire à un
surdosage (Court et al., 2014).
104
F. Réglementation concernant la délivrance
105
Alors que la vente exclusive du paracétamol en pharmacie semble limiter les cas
d’intoxication, notamment en France (Polson and Lee, 2007), le rapport ATTALI en 2008 avait
troublé les professionnels de santé en proposant la levée du monopole officinal dans la
vente des médicaments ne nécessitant pas de prescription médicale. Ce débat a d’ailleurs
ressurgit récemment en France avec un rapport de l'Inspection Générale des Finances (IGF)
qui s'en prend, entre autre, au monopole des pharmaciens. De fait, vu le nombre de cas
d’intoxications médicamenteuses et les coûts de santé engendrés par les hospitalisations
dans les pays où la vente est moins restrictive, les autorités de santé devront bien réfléchir
quant aux conséquences sanitaires potentiellement délétères d'ouvrir à la concurrence la
vente de médicaments dont la prescription est facultative (ou de médicaments non
remboursables), en particulier pour ceux contenant du paracétamol.
106
ARTICLE 1
REVIEW ARTICLE
Keywords Abstract
acetaminophen – hepatotoxicity – obesity – Although acetaminophen (APAP) is usually considered as a safe drug, this
fatty liver – steatosis – cytochrome P450 2E1 painkiller can lead to acute liver failure after overdoses. Moreover, there is
evidence that the maximum recommended dosage can induce hepatic cytoly-
sis in some individuals. Several predisposing factors appear to enhance the
Correspondence
risk and severity of APAP-induced liver injury including chronic alcoholic
Dr Bernard Fromenty, INSERM UMR991,
liver disease and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), which refers to a
Facult
e de Pharmacie. 2, avenue du
Professeur L
eon Bernard, 35043 Rennes
large spectrum of hepatic lesions linked to obesity. In contrast, obesity by
Cedex, France
itself does not seem to be associated with a higher risk of APAP-induced liver
Tel: +33 2 23 23 30 44 injury. Since 1987, seven studies dealt with APAP-induced hepatotoxicity in
Fax: +33 2 23 23 53 85 rodent models of NAFLD and five of them found that this liver disease was
e-mail: bernard.fromenty@inserm.fr associated with higher APAP toxicity. Unfortunately, these studies did not
unequivocally established the mechanism(s) whereby NAFLD could favour
Received 9 January 2014 APAP hepatotoxicity, although some investigations suggested that pre-exis-
Revised 10 February 2014 tent induction of hepatic cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) could play a sig-
Accepted 23 February 2014 nificant role by increasing the generation of N-acetyl-p-benzoquinone imine
(NAPQI), the toxic metabolite of APAP. Moreover, pre-existent mitochon-
DOI:10.1111/liv.12514 drial dysfunction associated with NAFLD could also be involved. In contrast,
Liver Int. 2014: 34: e171–e179 some investigations suggested that factors that could reduce the risk and
severity of APAP hepatotoxicity in obesity and NAFLD include higher hepa-
tic APAP glucuronidation, reduced CYP3A4 activity and increased volume of
body distribution. Thus, the occurrence and the outcome of APAP-induced
liver injury in an obese individual with NAFLD might depend on a delicate
balance between metabolic factors that can be protective and others that
favour large hepatic levels of NAPQI.
Acetaminophen (APAP), also known as paracetamol, is APAP-induced hepatotoxicity. These factors include
one of the most widely prescribed drugs for the manage- malnutrition and fasting, chronic alcohol abuse and
ment of pain and hyperthermia, even though its mode alcoholic liver disease, and hepatitis C virus infection
of action is still under investigation (1). The current (9–11). Another factor could be comedication with
maximum recommended dosage of APAP is 4 g/day in drugs inducing cytochromes P450 (CYPs), such as iso-
adults and 60–75 mg/kg/day in children. Although niazid, rifampicin and phenobarbital (12, 13), or with
APAP is usually considered as a safe drug, APAP intoxi- drugs which may modulate liver injury and/or repair
cation after overdosage can lead to massive hepatocellu- (14). The risk of APAP-induced liver injury could also
lar necrosis and acute liver failure (2, 3). At the be enhanced by some gene polymorphisms, in particular
moment, N-acetylcysteine is the only approved drug to in genes encoding APAP metabolizing enzymes (15, 16).
treat APAP-induced liver injury in patients after volun- Lastly, a large retrospective study also reported that
tary, or unintentional, APAP overdose (4). Importantly, obesity-related nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD)
there is accumulating evidence that the maximum rec- could be a risk factor for APAP-induced acute liver
ommended dose can induce mild-to-moderate hepatic injury after APAP overdose (9).
cytolysis, even in healthy individuals (5, 6). It is also Nonalcoholic fatty liver disease refers to the large
noteworthy that long-term APAP ingestion can induce spectrum of liver lesions in obese individuals ranging
chronic liver injury in some patients, such as granulom- from fatty liver to nonalcoholic steatohepatitis (NASH)
atous hepatitis and cirrhosis (7, 8). and cirrhosis. In some countries such as the United
Different predisposing factors are known, or sus- States, it is estimated that the prevalence of NAFLD in
pected, to significantly enhance the risk and severity of the general population could be about 20% in adults
and 10% in children and adolescents (17, 18). Actually, hepatic activity of CYP2E1 and higher APAP glucuroni-
a majority of overweight and obese people develop fatty dation have consistently been reported in obesity and
liver, which is characterized by the presence of large vac- NAFLD (22, 34–36), although the exact mechanisms of
uoles of lipids (mainly triacylglycerol) within the he- these alterations are still poorly understood. In contrast,
patocytes. During obesity, a major mechanism leading hepatic activity of CYP3A4 is reduced in obesity and
to hepatic accretion of lipids is insulin resistance, which NAFLD (36, 37).
favours the redistribution of fat from adipose tissue to After its formation, NAPQI is rapidly detoxified by
the liver and higher de novo lipogenesis in hepatocytes hepatic reduced glutathione (GSH) when APAP is taken
(19, 20). Importantly, fatty liver can progress in the long at the recommended dosage. However, after APAP over-
term to NASH in 10–20% of patients. NASH is charac- dose, high levels of NAPQI can induce several detrimen-
terized not only by steatosis but also by necroinflamma- tal effects within the liver. Indeed, hepatocellular GSH
tion (with ballooning degeneration of hepatocytes), stocks are quickly depleted and once GSH is no longer
some fibrosis and the presence of apoptotic hepatocytes. available for NAPQI detoxication, this reactive metabo-
Key factors involved in the pathogenesis of NASH lite binds to different macromolecules, including cyto-
include oxidative stress, lipid peroxidation, mitochon- solic and mitochondrial proteins (38, 39). These early
drial dysfunction and overproduction of proinflamma- cellular events are then followed by c-jun N-terminal
tory and profibrotic cytokines (20, 21). Impaired kinase (JNK) activation, profound mitochondrial dys-
activity of the mitochondrial respiratory chain and function and ATP depletion, overproduction of ROS
induction of CYP2E1 are two major factors leading to and peroxynitrite and massive hepatocellular necrosis
reactive oxygen species (ROS) overproduction during (23, 26, 40). Finally, this initial liver injury is followed
NASH (20, 22). by other key events such as inflammation, repair and
As previously mentioned, clinical investigations regeneration that play a major role in the outcome of
reported that NAFLD could favour APAP-induced acute APAP-induced hepatotoxicity (23, 25, 41).
liver failure after an overdose. Moreover, studies were
performed in different animal models of obesity and
Data from clinical investigations
NAFLD to find out whether these metabolic diseases
could favour APAP-induced liver injury. To find out the As already mentioned in the introduction, a large retro-
clinical and experimental studies dealing with the topic spective study reported an increased risk of APAP-
of this review, we performed a PubMed search of litera- induced acute liver injury after APAP overdose in
ture published in the English language using the combi- patients with NAFLD (9). In this study, patients with
nation of at least two of the following queries: pre-existent NAFLD and hospitalized for APAP over-
acetaminophen, obesity (or obese), liver, ‘fatty liver’, dose had more than a seven-fold higher prevalence of
NASH, injury and ‘risk factors’. In the present article, acute liver injury as compared to those without NAFLD
the main findings of these clinical and experimental (9). In a subsequent report, Myers and Shaheen reanaly-
investigations will be presented and subsequently dis- sed the same database by taking into account potential
cussed. Prior to these sections, some major features of differences in overdose circumstance, which could be a
APAP metabolism and liver toxicity will be recalled. significant confounding factor (42). This reanalysis sup-
ported the previous findings of a higher risk of APAP-
induced hepatotoxicity in patients with NAFLD (9),
Main features of APAP metabolism and hepatotoxicity
even though the magnitude of this risk was attenuated
This section will only summarize the current knowledge (i.e. 3.91 vs. 7.43). Importantly, both studies showed
about APAP metabolism and mechanisms of hepatotox- that the risk of severe acute liver injury after APAP over-
icity as several comprehensive reviews were recently dose was increased about similarly with NAFLD and
published on these topics (23–26). Briefly, APAP is alcoholic liver disease (9, 42). In contrast, two studies
mainly metabolized in the liver by phase II conjugating reported that the susceptibility to APAP-induced acute
enzymes into the nontoxic glucuronide and sulphate liver injury was similar, or lower, in obese patients com-
conjugates, which respectively represent about 55% and pared to nonobese individuals, but NAFLD was unfor-
30–40% of the initial APAP dose (24, 27). In addition, a tunately not taken into consideration in these
small amount of APAP is oxidized to the highly reactive investigations (43, 44). Interestingly, in one of these
metabolite N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) by studies, obese patients had significantly poorer out-
several CYPs, especially by CYP2E1 and CYP3A4 (28, comes after acute liver failure (43). Altogether, these
29). There is strong evidence that CYP2E1 is the main clinical investigations suggest that NAFLD, rather than
enzyme generating NAPQI in mice (29, 30), but several obesity by itself, could increase the risk of APAP-
investigations suggested that CYP3A4 could also be an induced acute liver injury after APAP overdose. This
important enzyme catalysing NAPQI generation in important point will be discussed later on. However, it
human (31–33). Importantly, obesity and related meta- is noteworthy that the discordant results between the
bolic disorders are associated with significant alterations aforementioned studies on the association between NA-
of APAP pharmacokinetics. In particular, increased FLD/obesity and APAP-induced acute liver injury could
be caused by differences in the criteria adopted to define C57BL/6J-ob/ob (ob/ob) are characterized by a muta-
these conditions in patients. tion in the leptin gene. Indeed, lack of the adipokine
As previously mentioned, there is evidence that pre- leptin leads to increased food consumption and lower
scription of APAP at the recommended dosage can energy expenditure, thus resulting in massive obesity,
induce mild-to-moderate hepatic cytolysis, even in insulin resistance, dyslipidaemia and severe fatty liver
healthy individuals (5, 6). However, it is still unclear (51, 52). C57BL/KsJ-db/db mice and Zucker fa/fa rats
whether NAFLD could enhance the risk, or the severity, present a mutation in the gene encoding leptin receptor,
of liver injury after therapeutic dose of APAP, although which disrupts leptin signalling and induces obesity,
this has been reported in some obese patients (45). insulin resistance and fatty liver (46, 52). The KK-Ay
mice, which present a defect in the signalling of the mel-
anocortin receptors, spontaneously develop obesity,
Data from experimental studies
fatty liver, type 2 diabetes, arterial hypertension and dia-
Different rodent models of obesity and NAFLD can be betic nephropathy (46, 52, 53). These genetic rodent
used experimentally, in particular in investigations deal- models of obesity are associated with metabolic disor-
ing with the hepatotoxic effects of chemicals such as ders that are more severe compared to the nutritional
APAP (Table 1). Classically, obesity and related meta- models, but usually with less variability between the ani-
bolic disorders can be induced by different types of mals.
high-calorie diets (including high-fat and high-sucrose/ From 1987 to 2012, six different studies reported the
fructose diets), by genetic defects altering different key effect of acute APAP intoxication in several animal
physiological functions such as food intake and energy models of obesity and NAFLD (54–59). The main data
expenditure, or by the combination of nutritional and from these investigations are presented in Table 1. In
genetic approaches (46–50). Among the more com- addition, one study reported APAP hepatotoxicity in a
monly used murine models of genetic obesity, the murine model of methionine and choline deficient
Table 1. Studies reporting APAP-induced acute liver injury in different animal models of NAFLD
References Animal models of NAFLD Presence of NAFLD Dose of APAP Response to APAP toxicity CYP2E1 activity
Corcoran and Male Sprague-Dawley Not reported in 710 mg/kg Higher toxicity after 48 h, Not reported in this
Wong (54) rats fed with a high-fat this study* (i.p.) compared to rats fed a study*
diet for 24 weeks standard diet
Blouin Obese male Zucker Not reported in 1300 mg Similar toxicity after 48 h, Not reported in this
et al. (55) fa/fa rats this study† (p.o.) compared to lean rats study†
Ito et al. (56) Male C57Bl/6 mice Yes 300 mg/kg Lower toxicity after 6 h, Not reported in this
fed a ‘Western-style’ (p.o.) compared to mice fed study*
diet for 16 weeks a standard diet
Male ob/ob mice Not reported in 300 mg/kg Lower toxicity after 6 h, Not reported in this
this study‡ (p.o.) compared to wild-type study‡
mice
Kon et al. (57) Male KK-Ay mice Yes 300 or Higher toxicity after 6 h, Not reported in this
600 mg/kg compared to wild-type study§
(p.o.) mice
Kucera Male Sprague-Dawley Yes 1 g/kg Higher toxicity after Not reported in this
et al. (58) rats fed a high-fat (p.o) 24 and 48 h, compared study*
diet for 6 weeks to rats fed a standard diet
Aubert Female db/db mice Yes 500 mg/kg Higher toxicity after 8 h, Increased
et al. (59) (p.o.) compared to wild-type
mice
Female ob/ob mice Yes 500 mg/kg Similar toxicity after 8 h, Unchanged
(p.o.) compared to wild-type
mice
Donthamsetty Male Swiss Webster mice Yes 360 mg/kg Higher toxicity from 6 to Unchanged
et al. (60) fed a MCD diet for (i.p.) 48 h after overdose, compared
1 month to mice fed a standard diet
*Different investigations in rats showed that long-term feeding with high-fat diets induce NAFLD (reviewed in 46 and 49) and increase the expression
and/or activity of CYP2E1 (reviewed in 22).
†Other studies showed that male obese and insulin resistant Zucker fa/fa rats present moderate fatty liver (106, 107), but reduced CYP2E1 activity
(106, 108).
‡Other studies showed that male obese and diabetic ob/ob mice present major fatty liver (50, 104, 109), with unchanged (59) or reduced (67)
CYP2E1 activity.
§One study showed that male KK-Ay mice present unchanged hepatic mRNA expression of CYP2E1 (110).
(MCD) diet-induced steatohepatitis (Table 1) (60). injury might be explained by lipid accumulation and
However, it must be pointed out that the MCD diet oxidative stress associated with NAFLD. Regarding lipid
consistently leads to a dramatic loss of body weight (61– accretion, it is noteworthy that higher APAP hepatotox-
63) and does not induce systemic insulin resistance (63, icity in female db/db mice compared to female ob/ob
64). It is also noteworthy that the doses of APAP greatly mice was observed despite lower lipid accumulation in
varied in these seven studies, with the highest doses used db/db liver (59). Importantly, the basal plasma levels of
in the rat models (Table 1). This is because rats are ALT and AST (i.e. before APAP intoxication) were com-
much more resistant to APAP-induced liver injury com- parable between female db/db and female ob/ob mice
pared to mice (65, 66). (59). Thus, increased susceptibility to APAP hepatotox-
Among these different studies (Table 1), four of them icity in female db/db mice cannot be attributed to the
showed that NAFLD was associated with higher liver pre-existence of higher hepatic cytolysis. However, fur-
injury after a single APAP overdose (57–60). Another ther studies will be required to find out whether the
study also showed higher APAP toxicity in rats fed a accumulation of some lipid species could be involved.
high-fat diet (54), although the presence of NAFLD can Indeed, it is noteworthy that db/db hepatocytes present
only be suspected in this study (Table 1). In contrast, more microvesicular steatosis and less macrovacuolar
the remaining investigations showed similar (55) or steatosis compared to ob/ob hepatocytes (50, 59).
lower liver injury (56). Unfortunately, there is no defi- Because the size of the droplets is greatly dependent on
nite explanation for these discrepancies, although some their lipid composition (69, 70), it is possible that the
hypotheses can be put forward. For instance, investiga- accumulation of some specific lipid species in female
tions in male and female ob/ob and db/db mice showed db/db hepatocytes could have played a role in the higher
that the hepatic CYP2E1 status could play a significant susceptibility to APAP toxicity.
role (59). Indeed, higher APAP hepatotoxicity was Nonalcoholic fatty liver disease is associated with oxi-
observed in female db/db mice but not in female ob/ob dative stress, which can alter different cellular compo-
mice and this was associated with a specific induction of nents such as nucleic acids and unsaturated fatty acids
CYP2E1 activity in the first group of animals. Interest- (20, 71, 72). Moreover, hepatic GSH reserves could be
ingly, hepatic CYP2E1 activity was unchanged (59) or lowered in NAFLD, thus reducing the antioxidant
reduced (67) in male ob/ob mice and this could explain capacity of the fatty hepatocytes (20, 73). Hence, the
why Ito and collaborators reported lower acute APAP higher susceptibility to APAP hepatotoxicity observed
hepatotoxicity in this model (56). It is also noteworthy in some rodent models of obesity might be related to
that plasma levels of APAP-glucuronide and APAP-sul- basal oxidative stress and lower GSH levels. Yet, basal
phate were almost similar between female db/db mice hepatic GSH levels were not significantly reduced in two
and female ob/ob mice after 500 mg/kg of APAP (59). rodent models of obesity showing higher vulnerability
Hence, the observed difference of APAP-induced hepa- to APAP toxicity (58, 59). It is however noteworthy that
totoxicity between these murine models cannot be total GSH levels were assessed in these studies and thus
attributed to APAP glucuronidation and sulphation. it will be important to determine whether mitochon-
At the moment, it is still unclear why hepatic CYP2E1 drial GSH was specifically depleted. Indeed, some inves-
is specifically induced in female but not in male db/db tigations suggested a key role of the mitochondrial pool
mice (59). Although there was an overall positive corre- of GSH in APAP-induced liver injury (74, 75).
lation between hepatic CYP2E1-mediated aniline As previously mentioned, JNK activation plays a
hydroxylase activity and plasma glucose in all groups of major role in APAP-induced hepatotoxicity (23, 26, 40).
untreated mice (i.e. wild-type, ob/ob and db/db of both Interestingly, JNK activation could also play a signifi-
sexes), plasma glucose levels were not different between cant role in NAFLD pathogenesis (76, 77). Only two
male and female db/db mice (59). Thus, hepatic studies examined the hepatic JNK status in obese ani-
CYP2E1 induction in female db/db mice may not be mals intoxicated by APAP (57, 59). In the first study,
explained by the severity of insulin resistance and type 2 JNK activation (as assessed by phospho-JNK) after
diabetes in these animals, contrary to what has been APAP intoxication was significantly stronger in obese
suggested by some investigations (22). In addition, there and diabetic KK-Ay mice compared to wild-type mice,
was no difference in plasma b-hydroxybutyrate levels and this was associated to higher APAP hepatotoxicity
between female and male db/db mice (59). This suggests in the obese animals (57). In the second study, increased
that ketone bodies may not be responsible for CYP2E1 APAP hepatotoxicity in db/db mice was not associated
induction in female db/db mice, although previous to higher JNK phosphorylation (59). Unexpectedly,
investigations found a significant correlation between hepatic JNK was specifically activated in ob/ob mice
plasma b-hydroxybutyrate levels and hepatic CYP2E1 although these animals did not present higher APAP
activity (34, 68). Thus, further investigations will be liver injury (59). Thus, JNK activation might not be a
needed to determine the exact mechanism of higher key mechanism of APAP hepatotoxicity in some murine
hepatic CYP2E1 activity in female db/db mice. models of NAFLD. Further investigations will be needed
Besides differences in APAP biotransformation to to assess phospho-JNK not only in whole liver but also
NAPQI, higher susceptibility to APAP-induced liver in isolated mitochondria (78).
In addition to the investigations performed in rodent obesity and NAFLD (36, 37, 90, 91), and this may
models of obesity, one study reported the effect of acute reduce the generation of NAPQI. In addition, obesity
APAP intoxication in a murine model of MCD diet- could lead to reduced APAP gastrointestinal absorption
induced steatohepatitis (Table 1) (60). In this study, rate and higher APAP volume of distribution, thus
higher APAP hepatotoxicity was observed despite the favouring lower APAP plasma concentrations (92, 93).
lack of pre-existent CYP2E1 induction and the presence Thus, it appears that the occurrence of APAP-induced
of normal basal hepatic GSH levels (60), suggesting the liver injury in an obese individual will depend on a deli-
involvement of other mechanism(s). Interestingly, the cate balance between metabolic factors that can be pro-
basal hepatic ATP levels were already reduced by 45% in tective (higher APAP glucuronidation and volume of
mice fed the MCD diet (60), which is consistent with a distribution, lower absorption rate and CYP3A4 activ-
significant impairment of the mitochondrial respiratory ity) and others that can augment the hepatic production
chain and oxidative phosphorylation in this experimen- of NAPQI (CYP2E1 induction), or reduce the detoxica-
tal model (79, 80). Hence, severe pre-existent mitochon- tion of this highly reactive metabolite (lower GSH
drial dysfunction might have played a role in the higher stores) (Fig. 1).
APAP hepatotoxicity observed in mice fed the MCD
diet.
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Dans ce travail, nous avons dans un premier temps mis au point un modèle cellulaire
de NAFLD, en essayant de reproduire certaines caractéristiques importantes de ces
pathologies hépatiques associées à l’obésité. Nous nous sommes en particulier intéressés à
l’activité des cytochromes P450 2E1 (CYP2E1) et 3A4 (CYP3A4), ainsi qu’aux modifications de
l’expression de certains gènes liés au métabolisme glucido-lipidique. Pour cela, nous avons
incubé pendant une semaine des cellules HepaRG avec de l’acide stéarique (C18:0), ou de
l’acide oléique (C18:1), en présence de 3 concentrations différentes d’insuline (0, 0,01 et 5
µg/ml). Dans un deuxième temps nous avons traitées les cellules HepaRG stéatosiques ou
non avec différentes concentrations de paracétamol. Les principaux résultats obtenus au
cours de mon travail de thèse sont les suivants:
2) L’incubation des cellules HepaRG avec l'acide stéarique est associée à une
augmentation de l'activité du CYP2E1 et à une diminution de l'activité du CYP3A4,
reproduisant ainsi différents données cliniques et expérimentales obtenues dans un
contexte d’obésité et de NAFLD. En revanche, l'acide oléique n'a pas d’effet sur l'activité de
ces CYPs. Les effets des deux acides gras sur ces CYPs sont donc différents alors que
l’intensité de la stéatose est comparable.
119
dépendante. Malgré cela, l'insuline est responsable d’une augmentation de l’expression du
CYP2E1, un effet qui est également dépendant de la concentration de cette hormone. Des
expériences réalisées sur des cultures d’hépatocytes primaires humains montrent que
l'insuline réduit également l'activité de CYP2E1 avec une augmentation concomitante des
taux d'ARNm de ce CYP.
120
A cellular model to study drug-induced liver injury in nonalcoholic
fatty liver disease: application to acetaminophen
Anaïs Michaut1, Dounia Le Guillou1, Caroline Moreau1,2, Mitchell R. McGill3, Simon Bucher1,
Sophie Martinais1, Thomas Gicquel1,2, Isabelle Morel1,2, Marie-Anne Robin1, Hartmut
Jaeschke3, Bernard Fromenty1*
1
INSERM, U991, Université de Rennes 1, Rennes, France ; 2Laboratoire de Biochimie et
Toxicologie, CHU Pontchaillou, Rennes, France ; 3Department of Pharmacology, Toxicology
and Therapeutics, University of Kansas Medical Center, Kansas City, KS, USA
*To whom correspondence should be addressed. Phone: 33-2-23-23-30-44; Fax: 33- 2-23-23-
53-85; E. mail : bernard.fromenty@inserm.fr
121
Abstract
Obesity and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) have been reported to increase the
susceptibility of hepatotoxicity induced by some xenobiotics including drugs, but the involved
mechanisms are still poorly understood. For toxic compounds such as ethanol and
acetaminophen (APAP), a role of hepatic cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) is suspected since the
activity of this enzyme is consistently enhanced during obesity and NAFLD. The first aim of our
study was to set up a cellular model of NAFLD characterized not only by triglyceride
accumulation but also by higher CYP2E1 activity. To this end, differentiated human HepaRG
cells were incubated during one week with stearic acid, or oleic acid, in the presence of
different concentrations of insulin. Cellular triglycerides and the expression of lipid-responsive
genes were similar with both fatty acids. However, CYP2E1 activity was significantly increased
only by stearate and this was associated with lower CYP3A4 activity, another metabolic feature
reported in NAFLD. CYP2E1 activity in HepaRG cells was reduced by insulin in a concentration-
dependent manner and this effect was reproduced in cultured primary human hepatocytes.
Hence, the highest CYP2E1 activity was observed in HepaRG cells with stearate and without
insulin. Next, the second aim of our study was to assess APAP cytotoxicity in HepaRG cells
presenting or not lipid accretion and CYP2E1 induction. Experiments with a large range of APAP
concentrations (1 to 20 mM) showed that the cellular loss of ATP and glutathione (GSH) was
almost always stronger in the presence of stearic acid. In cells pretreated with the CYP2E1
inhibitor chlormethiazole (CMZ), recovery of cellular ATP was significantly higher in the
presence of stearic acid with both low (2.5 mM) and high (20 mM) concentrations of APAP.
However, in the absence of insulin, CMZ-induced ATP recovery was significantly greater only for
20 mM of APAP. Surprisingly, there was no recovery of cellular GSH and no reduction of APAP-
protein adducts following CMZ pretreatment. Finally, levels of APAP-glucuronide were
significantly enhanced in the presence of insulin. Conclusions: When studied in specific
conditions of culture, the HepaRG cell line can be a valuable model of human NAFLD, especially
regarding CYP2E1 and CYP3A4 activity. Our data also suggest that higher CYP2E1 activity in
NAFLD could be secondary to the hepatic accumulation of some fatty acids and to the presence
of low insulin signaling. Hence, this cellular model can be used to unveil some important
metabolic and hormonal factors which can favor APAP hepatotoxicity in obese individuals.
122
Introduction
Liver injury can be induced by numerous drugs of our modern pharmacopoeia, herbals
and industrial toxicants (Biour et al., 2004; Seeff et al., 2015; Wahlang et al., 2013). In the most
severe cases, xenobiotic-induced liver injury can require a hospitalization and eventually lead to
the death of the patient (Björnsson, 2009). Among the different predisposing factors increasing
the risk of liver injury, there are growing evidence that nonalcoholic liver disease (NAFLD) could
play a significant role (Robin et al., 2005a; Fromenty, 2013; Tarantino et al., 2007). NAFLD is
often associated with obesity and type 2 diabetes and encompasses a large spectrum of liver
lesions such as fatty liver, nonalcoholic steatohepatitis (NASH) and cirrhosis (Michelotti et al.,
2013).
Greater hepatotoxicity in the context of obesity and NAFLD has been documented in
rodents and humans with some drugs including acetaminophen (APAP), halothane and
methotrexate as well as other xenobiotics such as ethanol and carbon tetrachloride (Robin et
al., 2005a; Donthamsetty et al., 2007; Tarantino et al., 2007; Michaut et al., 2014; Fromenty,
2013). However, the mechanisms involved in this higher susceptibility are poorly understood
although different hypotheses have been put forward (Fromenty, 2013). Furthermore, these
mechanisms could be complex and different from one compound to another (Robin et al.,
2005a; Fromenty, 2013; Carmiel-Haggai et al., 2003). Importantly, obesity and NAFLD in rodents
and humans are associated with different alterations in the expression and activity of hepatic
enzymes involved in drug metabolism including cytochromes P450 (CYPs) and UDP-
glucuronosyltransferases. More specifically, these dysmetabolic disorders are associated with
higher CYP2E1 activity, lower CYP3A4 activity and increased capacity of glucuronide conjugation
for different drugs such as APAP and lorazepam (Aubert et al., 2011; Brill et al., 2012; Chalasani
et al., 2003; Emery et al., 2003; Kolwankar et al., 2007; Michaut et al., 2014).
Deciphering the mechanisms whereby some drugs and environmental toxins are more
hepatotoxic in the context of obesity and NAFLD requires appropriate experimental models.
Although obese mice and rats can be useful (Robin et al., 2005a; Carmiel-Haggai et al., 2003;
Aubert et al., 2011; Massart et al., 2012), there are numerous differences between rodents and
humans regarding hepatic drug metabolism (Chu et al., 2013; Martignoni et al., 2006). In
123
addition, investigations in animals are cumbersome and ethically problematic. Thus, a relevant
human cellular model could be helpful in order to study hepatotoxicity in NAFLD.
In the past few years, the metabolically competent human hepatoma HepaRG cells have
been shown to be a valuable model to study the mechanism of hepatotoxicity induced by drugs
and toxicants (Anthérieu et al., 2011; McGill et al., 2011; Savary et al., 2014; Sharanek et al.,
2014; Tobwala et al., 2015). In addition, HepaRG cells have been successfully used to study the
effects of nutrients, hormones and drugs on the expression of various enzymes involved in
carbohydrate and lipid metabolism (Anthérieu et al., 2011; Madec et al., 2011; Nagasawa et al.,
2007; Samanez et al., 2012).
By using the human HepaRG cell line, the aim of the present study was two-fold. First,
we thought to set up a cellular model of NAFLD, in particular regarding the alterations of
CYP2E1 and CYP3A4 activity that are observed in this hepatic disease. To this end,
differentiated HepaRG cells were treated for one week with stearic acid (C18:0) or oleic acid
(C18:1) in the presence of different concentrations of insulin. Second, we used this cellular
model of NAFLD in order to determine the cytotoxic effects of the painkiller APAP. Indeed,
several studies in rodents and humans reported that NALFD is associated with more severe
APAP-induced hepatotoxicity, especially after an overdose (Aubert et al., 2012; Kon et al., 2010;
Michaut et al., 2014; Myers and Shaheen, 2008; NGuyen et al., 2008). Notably, some of the
studies performed in rodents suggested that higher APAP hepatotoxicity in NAFLD could be
attributed to greater CYP2E1 activity (Aubert et al., 2012; Michaut et al., 2014), the primary
enzyme responsible for the biotransformation of APAP to the highly reactive and toxic
metabolite N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) (Hinson et al., 2010; McGill and Jaeschke,
2013). Overall, the results of the present study indicated that under selected culture conditions,
steatotic HepaRG cells can be used as a valuable model to study the impact of NAFLD on the
hepatotoxicity induced by APAP and other xenobiotics.
124
Materials and Methods
Cell cultures and treatments. Native HepaRG cells were cultured as previously described
(Aninat et al., 2006). Briefly, HepaRG cells were seeded at a density of 2.6 104 cells/cm2 and
were first incubated in a William’s medium supplemented with 10% FBS, 100 units/ml
penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 mM glutamine, 5 µg/ml insulin and 50 µM
hydrocortisone hemisuccinate. After 2 weeks, cell differentiation was induced by the same
culture medium supplemented with 2% DMSO (differentiation medium) for 2 additional
weeks. Cells were subsequently treated for 7 days with different concentrations of insulin (0,
0.01 or 5µg/ml), stearic acid (0 or 100 µM), or oleic acid (0 or 100 µM). In some experiments,
lower or higher concentrations of fatty acids were used. For the APAP experiments, cells
were incubated with different concentrations of this drug (0 to 20 mM) during the last 6, 24
or 48h of the 7-day treatment. Stearic acid, oleic acid and APAP were dissolved in DMSO. For
the investigations performed with the prototypical CYP2E1 inhibitor CMZ, cells were
incubated 7 days with 150 µM of CMZ. Whatever the treatments, the culture medium was
renewed every 2 or 3 days during the 7-day experiments. For the experiments carried out
with the AMP-activated protein kinase (AMPK) activators AICAR and metformin, cells were
first preincubated for 6h with or without 500 µM of each activator. Cells were then treated
for 24h with 20 mM of APAP, with or without each AMPK activator (500 µM). HepaRG cells
were used at passages 11 to 15.
125
Primary human hepatocytes (PHH) from adult donors were prepared at Biopredic
International (Saint-Grégoire, France) by perfusion of liver fragments provided by the Centre
de Ressources Biologiques (CRB) Santé de Rennes. Hepatocytes were then immediately
seeded at a density of 11 104 cells/cm2 in a William’s E medium supplemented with 10% FBS,
100 units/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 mM glutamine, 5 µg/ml insulin and 5 µM
hydrocortisone hemisuccinate. The medium was discarded 12 h after seeding and cells were
then maintained in the same differentiation medium used for HepaRG cells, which was
renewed every other day. Two days after seeding, PHH were then treated or not with oleic
acid, stearic acid and insulin for one week.
Oil red O staining and triglycerides. For staining of neutral lipids, cells were washed with
phosphate-buffered saline, incubated for 45 min at room temperature with an oil red O-
saturated solution, washed in water, and observed under a phase-contrast microscope.
Triglyceride quantification was measured with a colorimetric kit purchased from Biovision
(Milpitas, CA), using the manufacturer’s recommendations.
Determination of CYP2E1 and CYP3A4 activities. In order to measure CYP2E1 and CYP3A4
activities, HepaRG cells or PHH were incubated for 6 and 2 hours in phenol red-free and
DMSO-free William’s E medium containing 300 µM chlorzoxazone or 200 µM testosterone,
respectively. At the end of the incubation, aliquots of culture media were collected and
stored at -80°C until analysis. 6-Hydroxychlorzoxazone was then quantified by high-
performance liquid chromatography (HPLC)-tandem mass spectrometry (Xenoblis, Rennes,
France), whereas 6β-hydroxytestosterone was measured by HPLC analysis, as previously
described (Aninat et al., 2006).
Cellular ATP and GSH. Cellular ATP was measured with the CellTiter-Glo® assay purchased
from Promega (Charbonnieres, France), using the manufacturer’s recommendations. Briefly,
HepaRG cells were incubated with the reagent 10 min at 37°C and the luminescent signal
was quantified using a POLARstar Omega microplate reader (BMG Labtech, Ortenberg,
Germany). Results were expressed in comparison to untreated cells. Total glutathione (GSH)
126
was quantified with the Glutathione assay kit purchased from Cayman Chemical (Ann Arbor,
USA), using the manufacturer’s recommendations.
Isolation of RNA and real-time quantitative PCR analysis. Total RNA was extracted from ca.
106 HepaRG cells with the SV total RNA isolation system purchased from Promega
(Charbonnières-les-Bains, France) and from ca. 600.000 PHH with RNeasy Micro kit
purchased from Qiagen (Courtaboeuf, France). Each kit included a DNase treatment step.
RNAs were reverse-transcribed into cDNA using the High-Capacity cDNA Archive kit
purchased from Life technologies (Saint-Aubin, France). Real-time quantitative PCR (RT-
qPCR) was then performed using the SYBR Green PCR Master Mix on an Applied Biosystems
7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem, Woolston, UK). Expression of the
human TATA box binding protein (TBP) was used as reference, and the 2–ΔΔCt method was
used to express the relative expression of each selected gene. The sequences of the primers
used in this study are presented in the supplementary Table 1.
Western blot analysis. To assess the protein expression of CYP2E1 and CYP3A4 in HepaRG
cells, proteins underwent SDS-polyacrylamide electrophoresis. Briefly, cells were lysed in a
RIPA buffer (25 mM Tris-HCL pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP40, 1% sodium deoxycholate and
0.1% sodium dodecyl sulfate) supplemented with protease and phosphatase inhibitors.
127
Fifteen µg of protein were then separated by electrophoresis on 4-12% gradient Bis-Tris gels
(Invitrogen, Cergy-Pontoise, France), transferred to 0.2 µM nitrocellulose membranes (Bio-
Rad, Hercules, CA), which were saturated in 2% BSA/TBS-T (0.2% tween in TBS) for 2 h at
room temperature. Proteins were then immunoblotted with antibodies against CYP2E1
(Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, MI), CYP3A4 (Oxford Biomedical Research), or
heat-shock cognate 70 (HSC70) (Tebu-bio, Le Perray-en-Yvelines, France). Finally, blots were
incubated with appropriate secondary antibodies, and protein bands were revealed by
enhanced chemiluminescence in a Chemi-smart imager (Fisher Scientific, Illkirch, France).
HSC70 was used to normalize protein loadings, and quantification was performed with the
BIO-1D software.
Statistical analysis. All results are expressed as mean ± SEM (standard error of mean).
Comparison between multiple groups were performed with two-way analysis of variance
(ANOVA). When ANOVA provided significant differences, individual means were compared
with the post-hoc Bonferroni test. The Mann and Whitney test were used for the
experiments carried out in cultured PHH.
128
Results
Effects of stearic acid, oleic acid and insulin on lipid content, CYP2E1 and CYP3A4 activity
and gene expression in HepaRG cells. HepaRG cells were incubated without or with stearic
acid, oleic acid and insulin for 7 days, as described in the Methods section. Because insulin
was studied at three different concentrations (0, 0.01 and 5 µg/ml), nine different
experimental conditions were initially studied. As expected, incubation of these cells with
each fatty acid (100 µM) was associated with significantly higher cellular triglycerides (Fig.
1A) and total neutral lipids (Fig. 1B). In addition, insulin significantly decreased triglycerides
in cells overloaded with each fatty acid (Fig. 1A). The latter result is in keeping with previous
data in rat and human indicating that chronic insulin favours hepatic triglycerides secretion
(Bartlett and Gibbons, 1988; Reaven et al., 1967; Zammit et al., 2001).
Next, the activity and expression of CYP2E1 and CYP3A4 were studied in all the
experimental conditions. Regarding CYP2E1, its activity was increased by stearic acid but not
by oleic acid (Fig. 1C). Moreover, insulin reduced CYP2E1 activity in a concentration-
dependent manner in HepaRG cells overloaded with stearic acid (Fig. 1C). Surprisingly,
insulin increased the mRNA expression of CYP2E1 in a concentration-dependent manner
(Fig. 1D). Similarly, insulin augmented the protein expression of CYP2E1 (Supplementary Fig.
1). In contrast, CYP3A4 activity was significantly reduced by stearic acid, but not oleic acid,
without significant effect of insulin (Fig. 1C). The mRNA expression of CYP3A4 was decreased
by stearic acid, especially in the absence of insulin (Fig. 1D). The protein expression of
CYP3A4 was also reduced by stearic acid (data not shown). Importantly, the activity of both
CYP2E1 and CYP3A4 was not significantly changed after 7 days of incubation with 50 µM of
each fatty acid, or after 48 h of incubation with 100 µM of these fatty acids (Supplementary
Fig. 2).
Effects of stearic acid, oleic acid and insulin on CYP2E1 and CYP3A4 activity and gene
expression in cultured PHH. In another series of experiments, the effects of stearic acid,
oleic acid and insulin were studied in PHH cultured for 7 days. In the absence of fatty acids,
insulin (5 µg/ml) significantly decreased CYP2E1 activity with a concomitant increase in
CYP2E1 mRNA levels (Fig. 3). Insulin also enhanced the protein expression of CYP2E1 in a
concentration-dependent manner in cultured PHH of 3 different donors (data not shown). In
contrast, insulin did not change CYP3A4 mRNA expression and activity (Fig. 3). Importantly,
insulin increased the mRNA expression of SREBF1, ACACA, FASN, SCD1 and PNPLA3 and
reduced that of PDK4 (Fig. 3). Thus, when incubated without fatty acid, the effects induced
by insulin were similar between cultured PHH and HepaRG cells. However, treatment with
100 µM of stearic acid did not increase CYP2E1 activity (data not shown). Notably, our PHH
often presented steatosis to a variable degree (from 10 to 40%) (Supplemental Fig. 3), and
thus CYP2E1 activity might have already been augmented in these hepatocytes. Although we
did not have the anthropomorphic data for all the different liver donors, it was noteworthy
that several of them presented overweight or obesity, sometimes associated with type 2
diabetes. Moreover, most of the donors were over age 60. This could also have contributed
to the presence of steatosis since NAFLD is common in the elderly (Bertolotti et al., 2014;
Gan et al., 2011).
APAP-induced cytotoxicity and GSH depletion in normal and steatotic HepaRG cells. In
order to determine APAP cytotoxicity in normal and steatotic HepaRG cells, a large range of
APAP concentrations was selected and cellular ATP was measured after 6, 24 and 48 h of
treatment. Whereas no significant cytotoxicity was observed for 1 mM APAP, reduced ATP
levels was already observed with 2.5 mM although the effects greatly depended of the
130
culture conditions (Supplementary Fig. 4). Indeed, APAP-induced loss of cellular ATP was
consistently more important in the presence of stearic acid (Fig. 4). Moreover, incubation
without insulin was associated with a significantly stronger ATP depletion after 6 and 12 h
for 2.5 mM APAP and after 6 h for 5 mM of this drug (Fig. 4). It was noteworthy that cellular
ATP levels in the basal state (i.e. without APAP treatment) were significantly lower with
stearic acid (Fig. 4). However, when the basal ATP levels were equally set for the three
different conditions of fatty acid incubation, APAP cytotoxicity remained most of the time
stronger in the presence of stearic acid, excepted in the presence of 5 µg/ml of insulin after
6 h of APAP treatment (Supplementary Fig. 4). Thus, these results indicated that the higher
ATP depletion induced by APAP in the presence of stearic acid was not a mere consequence
of the basal cytotoxicity induced by this fatty acid.
In the next series of investigations, cellular GSH levels were measured after a
treatment with low (2.5 mM) and high (20 mM) APAP concentrations. These investigations
were carried out with the three conditions of fatty acid incubation but with only two
concentrations of insulin (i.e. 0 and 5 µg/ml). After APAP treatment, GSH depletion was
generally stronger in the presence of stearic acid (Fig. 5). A significant effect of insulin was
also observed in some conditions. Indeed, GSH depletion after 12 h of 2.5 mM APAP was
stronger in the presence of insulin, whereas GSH depletion after 24 h of 20 mM APAP was
stronger in the absence of insulin (Fig. 5). Importantly, basal GSH levels were not significantly
different between the 6 different conditions, although there was a trend towards lower GSH
in the presence of stearic acid (P=0.11) (Fig. 5).
APAP-induced expression of oxidative stress genes in normal and steatotic HepaRG cells.
Oxidative stress, including induced by APAP, can secondarily increase the expression of
different genes such as heme oxygenase 1, γ-glutamylcysteine synthase, different
glutathione S-transferases, heat shock protein 70 and tribbles pseudokinase 3 (Aubert et al.,
2012; Chan et al., 2001). Importantly, nuclear factor, erythroid 2-like 2 (NRF2, or NFE2L2) is a
transcription factor playing a major role in the regulation of most of these genes (Chan et al.,
2001; Ma and He, 2012). Hence, the mRNA expression of some of these genes was assessed
in HepaRG cells treated with 2.5 or 20 mM APAP (Fig. 6). Notably, the expression of NRF2,
131
HMOX1, TRIB3 and HSP70 was increased by APAP, sometimes in a dose-dependent manner.
However, it was noteworthy that the expression of some oxidative stress genes was already
induced in the basal state (i.e. in cells not treated with APAP), in particular when HepaRG
cells were incubated with stearic acid. This was observed for instance with HMOX1, TRIB3
and HSP70. Moreover, we also found that in the basal state insulin significantly increased the
expression of GSTA1/2 and GSTA3. Previous studies in primary cultured rat hepatocytes also
showed that insulin enhanced the expression of GSTA1/2 and GSTA3//5 (Kim et al., 2006).
Finally, the expression of these genes was significantly decreased after APAP treatment in
cells incubated with stearic acid.
Because our experiments were carried out simultaneously with and without CMZ, the
recovery of ATP in the presence of CMZ could be calculated for these experiments. ATP
recovery was almost always observed in the different tested conditions (Fig. 7). With 2.5 mM
of APAP, ATP recovery with CMZ was significantly higher in the presence of stearic acid after
6 and 24 h of APAP treatment, but no significant effect was observed regarding insulin (Fig.
7). With 20 mM of APAP, ATP recovery was also higher in the presence of stearic acid but
only after 6 h of APAP treatment (Fig. 7). A significant effect of insulin was also observed at
this time point. Indeed, ATP recovery was significantly lower in the presence of insulin,
especially in cells incubated with oleic acid (Fig. 7). Notably, ATP recovery in the basal state
was significantly changed in the presence of fatty acids. In particular, ATP recovery was
higher with stearic acid and lower with oleic acid (Fig. 7). Taken together, these results
indicated that in HepaRG cells CYP2E1 was involved in the loss of ATP levels after APAP
132
treatment, but also in the basal state at a lesser degree. Moreover, ATP loss related to
CYP2E1 activity was usually higher in the presence of stearic acid.
The effect of CMZ pretreatment on total GSH levels and APAP-protein adducts was
also assessed in different conditions of fatty acids, insulin and APAP treatment (2.5 and 20
mM). Surprisingly, CMZ did not prevent the loss of total GSH after 24 h (Supplementary Fig.
5), thus indicating that CYP2E1 was not primarily involved in GSH depletion after APAP
treatment in HepaRG cells. Moreover, CMZ did not prevent the generation of APAP-protein
adducts 6 h after 2.5 or 20 mM of APAP (data not shown).
133
recovery with both AMPK activators, excepted in HepaRG cells incubated without fatty acid
and without insulin (Supplementary Fig. 6).
134
Discussion
There are growing evidence that NAFLD can increase the risk and the severity of
hepatotoxicity induced by some drugs and toxins (Robin et al., 2005a; Fromenty, 2013;
Tarantino et al., 2007). However, little is known regarding the involved mechanisms,
although some hypotheses have been proposed (Fromenty, 2013). Thus, relevant
experimental models are needed to determine which compounds can pose a specific risk in
NAFLD and to understand why they are more hepatotoxic in this dysmetabolic context. Since
the HepaRG cell line has been shown to be a valuable model to study hepatotoxicity induced
by drugs and toxins (Anthérieu et al., 2011; McGill et al., 2011; Savary et al., 2014; Sharanek
et al., 2014; Tobwala et al., 2015), a first goal of our study was to determine whether this cell
line could also be used as a pertinent model of human NALFD. To this end, HepaRG cells
incubated for one week in different conditions of incubation with stearic acid, oleic acid and
insulin.
Several investigations in rodents and humans reported that NALFD is associated with
more severe APAP-induced hepatotoxicity, especially after an overdose (Aubert et al., 2012;
Kon et al., 2010; Michaut et al., 2014; Myers and Shaheen, 2008; NGuyen et al., 2008).
Although the mechanism is still poorly understood, there is evidence for a significant role of
CYP2E1 whose activity is consistently increased in NAFLD (Aubert et al., 2011; Aubert et al.,
2012; Michaut et al., 2014). Thus, the second objective of our study was to assess APAP-
induced toxicity in non-steatotic and steatotic HepaRG cells.
The most relevant data from this study can be summarized as followed:
1) The incubation of HepaRG cells for one week with stearic acid was associated to higher
CYP2E1 activity and lower CYP3A4 activity, thus reproducing data collected in patients with
obesity and NAFLD (Aubert et al., 2011; Brill et al., 2012; Chalasani et al., 2003; Emery et al.,
2003; Kolwankar et al., 2007). In contrast, oleic acid had no effect on CYP2E1 and CYP3A4
activity.
135
2) Our data with different concentrations of insulin showed that CYP2E1 activity in HepaRG
cells was negatively regulated by insulin in a concentration-dependent manner. Surprisingly,
insulin was responsible for an increased CYP2E1 expression in a concentration-dependent way.
Notably, experiments in cultured PHH indicated that insulin also reduced CYP2E1 activity with a
concomitant increase in CYP2E1 mRNA levels.
3) Steatosis in HepaRG cells induced by stearic or oleic acid was associated with higher
expression of different genes known to be regulated by lipids such as APOA4 and PLIN1.
Moreover, insulin enhanced the expression of different genes involved in lipid synthesis such as
SREBF1, FASN and SCD1 (Begriche et al., 2013; Postic and Girard, 2008). Insulin also increased
the expression of PNPLA3, in keeping with recent studies (Dubuquoy et al., 2011; Huang et al.,
2010).
4) Experiments with a large range of APAP concentrations (2.5 to 20 mM) showed that APAP-
induced loss of cellular ATP was almost always stronger in the presence of stearic acid. In
contrast, APAP cytotoxicity was about similar between non-steatotic cells and HepaRG cells
incubated with oleic acid.
5) Investigations with the prototypical CYP2E1 inhibitor CMZ indicated that the stronger
cytotoxicity observed with 2.5 and 20 mM APAP in the presence of stearic acid could be
attributed, at least in part, to higher CYP2E1 activity. However, the involvement of CYP2E1 in
the higher APAP cytotoxicity observed without insulin was significant only with 20 mM APAP.
Our experiments also provided evidence that in HepaRG cells not treated with APAP, the
slight to moderate loss of cellular ATP observed in some conditions was secondary to basal
CYP2E1 activity.
Our results regarding the effects of stearic acid, oleic acid and insulin on the activity
of CYP2E1 and CYP3A4 in HepaRG cells deserves further discussion.
136
such as the degree of steatosis, hyperketonemia (especially high β-hydroxybutyrate),
hyperlipidemia, insulin resistance, type 2 diabetes and even nocturnal hypoxemia (Chalasani
et al., 2003; Chtioui et al., 2007; Emery et al., 2003; Lucas et al., 1998; Wang et al., 2003).
Importantly, our study showed that despite the similar amount of cellular triglycerides,
CYP2E1 activity was selectively enhanced when steatosis was induced by stearic acid, but not
by oleic acid. Altogether, these data suggest that higher CYP2E1 activity in human NAFLD
could depend not only on the degree of steatosis but also by the composition of the
deposited lipids. Moreover, our data suggested a post-translational regulation of CYP2E1 by
stearic acid in HepaRG cells since this saturated fatty acid increased CYP2E1 activity but not
its mRNA and protein expression. Notably, previous investigations in rats showed that
CYP2E1 could be post-translationally regulated via phosphorylation (Oesch-Bartlomovicz and
Oesch, 2005; Oesch-Bartlomovicz et al., 1998). Moreover, an inverse relationship between
hepatic CYP2E1 protein expression and activity was reported during ageing in rat (Wauthier
et al., 2006).
An important observation in this study was that insulin significantly reduced CYP2E1
activity in HepaRG cells and PHH in a concentration-dependent manner. Hence, low insulin
was associated with higher CYP2E1 activity. This could be in keeping with some data in
human NAFLD reporting an association between higher CYP2E1 activity and insulin
resistance, as already mentioned (Chalasani et al., 2003). Moreover, insulin deficiency in
rodents treated with streptozotocin was associated to higher hepatic CYP2E1 activity and
this induction was corrected by insulin therapy (Ioannides et al., 1998; Raza et al., 2004). In
addition to the accumulation of some lipid species, higher CYP2E1 activity in human NAFLD
could thus be linked to insulin resistance, which is frequently associated to this liver disease
(Begriche et al., 2013; Tilg and Moschen 2014).
In HepaRG cells and PHH, insulin reduced CYP2E1 activity but increased the mRNA
and protein expression of this CYP. This suggest that CYP2E1 activity could be regulated post-
translationally by this hormone in human hepatocytes. It is also noteworthy that the positive
effect of insulin on CYP2E1 mRNA expression in human hepatocytes is in sharp contrast with
previous investigations carried out in rat hepatocytes (Moncion et al., 2002; Woodcroft and
137
Novak, 1999). However, CYP2E1 activity was not reported in these studies. Thus, CYP2E1
expression could be differentially regulated by insulin between rat and human. Further
investigations will be needed in order to determine the transcriptional, translational and
post-translational regulation of CYP2E1 in human hepatocytes. HepaRG cells could be helpful
for this purpose.
In contrast to CYP2E1, CYP3A4 activity in HepaRG cells was reduced by stearic acid
but not by oleic acid. Moreover, reduced CYP3A4 activity was associated with lower mRNA
levels. Interestingly, a previous study performed in PHH showed that a mixture of palmitic
acid (C16:0) and oleic acid reduced CYP3A4 activity (Donato et al., 2006). Thus, CYP3A4
activity could be specifically reduced by long-chain saturated fatty acids. It will be interesting
to determine whether oxidative stress is involved in this effect, as suggested by previous
studies (Anthérieu et al., 2013; Gallagher et al., 1995).
In our experiments performed with APAP, pretreatment of HepaRG cells with CMZ
was associated with significant cellular ATP recovery although this CYP2E1 inhibitor did not
afford a significant protection regarding total GSH and APAP-protein adducts. Notably,
APAP-induced cytotoxicity could be the consequence of the covalent binding of NAPQI to
specific cellular proteins, in particular within the mitochondrial compartment (McGill and
Jaeschke, 2013; Tirmenstein and Nelson, 1989). In addition, several studies reported the
presence of significant amount of CYP2E1 in liver mitochondria, in particular in humans
(Bansal et al., 2013; Knockaert et al., 2011). Thus, it is conceivable that inhibition of CYP2E1
by CMZ could have prevented APAP-induced ATP depletion by inhibiting the covalent
binding of this drug to a small number of key mitochondrial proteins and without modifying
the total GSH levels since the mitochondrial pool of this antioxidant is rather low. Indeed,
mitochondrial GSH represents 10 to 15% of the whole cellular GSH reserve (Fernandez-
Checa and Kaplowitz, 2005; Robin et al., 2005b). Finally, CMZ pretreatment of HepaRG cells
could have not be able to prevent the generation of most APAP-protein adducts and the
depletion of total GSH because NAPQI is also generated by CYP3A4, a microsomal enzyme
that has not been reported to be also located in the mitochondrial compartment.
138
In conclusion, we set up a cellular model of human NAFLD which can be a valuable
tool to gain insight regarding the mechanisms whereby this frequent hepatic disease appears
to favour APAP-induced acute liver failure, in particular after an overdose (Michaut et al.,
2014; Myers and Shaheen, 2009; NGuyen et al., 2008). This model can also be used to test
the effect of other drugs or toxins that are suspected to be more hepatotoxic in the context
of obesity and NAFLD, in particular as a consequence of CYP2E1 induction (Fromenty, 2013).
Because AMPK can be activated in HepaRG cells, it will be also interesting to determine
whether AMPK activators such as metformin and AICAR could afford also a protection
against the cytotoxicity of these drugs.
Acknowledgement
139
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144
Legends to the figures
Figure 1. Effects of 1 week of treatment with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1) and
insulin on cellular triglycerides, neutral lipid deposition and mRNA expression and activity of
CYP2E1 and CYP3A4 in HepaRG cells. (A) Cellular triglycerides. Results are means ± SEM for 5
independent cultures, with data in duplicates for each culture. (B) Cellular lipids stained with
oil red O. The pictures 1 to 6 are representative of the following conditions: 1) HepaRG cells
incubated without insulin and fatty acids; 2) HepaRG cells incubated without insulin and
with stearic acid; 3) HepaRG cells incubated without insulin and with oleic acid; 4) HepaRG
cells incubated with insulin and without fatty acids; 5) HepaRG cells incubated with insulin
and with stearic acid; 6) HepaRG cells incubated with insulin and with oleic acid . (C) CYP2E1
and CYP3A4 activity. Results are means ± SEM for 5 independent cultures, with data in
duplicates for each culture. (D) mRNA levels of CYP2E1 and CYP3A4. Results are means ± SEM
for 5 independent cultures, with data in duplicates for each culture. In panels showing bar
graphs, letters F and I indicate a significant effect (P<0.05) of fatty acids and insulin,
respectively. *Significantly different from HepaRG cells incubated without fatty acids and
with the same condition of insulin treatment (P<0.05). #Significantly different from HepaRG
cells incubated without insulin and with the same condition of fatty acid treatment (P<0.05).
Figure 2. Effects of 1 week of treatment with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1) and
insulin on the expression of genes responsive to lipids and insulin in HepaRG cells. Results are
means ± SEM for 5 independent cultures, with data in duplicates for each culture. Letters F
and I indicate a significant effect (P<0.05) of fatty acids and insulin, respectively. FxI indicates
a significant interaction between the effects of fatty acids and insulin. *Significantly different
from HepaRG cells incubated without fatty acids and with the same condition of insulin
treatment (P<0.05). #Significantly different from HepaRG cells incubated without insulin and
with the same condition of fatty acid treatment (P<0.05).
145
Figure 3. Effects of 1 week of treatment with insulin in cultured PHH. (A) CYP2E1 and CYP3A4
activity. Results are means ± SEM for 5 and 4 independent cultures, respectively for the
activity of CYP2E1 and CYP3A4. #Significantly different from HepaRG cells incubated without
insulin (P<0.05). (B) mRNA levels of CYP2E1 and CYP3A4. Results are means ± SEM for 4
independent cultures. #Significantly different from HepaRG cells incubated without insulin
(P<0.05). (C) mRNA expression of genes responsive to insulin. Results are means ± SEM for 4
independent cultures. #Significantly different from HepaRG cells incubated without insulin
(P<0.05).
Figure 4. Levels of ATP in HepaRG cells treated or not with APAP. HepaRG cells were
incubated for 1 week with different conditions of incubation with stearic acid (C18:0), oleic
acid (C18:1) and insulin and subsequently treated or not with 2.5, 5, 10 or 20 mM of APAP.
ATP levels were measured 6, 12 or 24 hours after APAP treatment. Cellular ATP levels were
set at 100% in HepaRG cells incubated for 1 week without fatty acids and with 5 µg/ml of
insulin and not treated with APAP. Results are means ± SEM for 3 to 6 independent cultures,
with data in duplicates for each culture. Letters F and I indicate a significant effect (P<0.05)
of fatty acids and insulin, respectively. *Significantly different from HepaRG cells incubated
without fatty acids and with the same condition of insulin treatment (P<0.05). #Significantly
different from HepaRG cells incubated without insulin and with the same condition of fatty
acid treatment (P<0.05).
Figure 5. Levels of total GSH in HepaRG cells treated or not with APAP. HepaRG cells were
incubated for 1 week with different conditions of incubation with stearic acid (C18:0), oleic
acid (C18:1) and insulin and subsequently treated or not with 2.5 or 20 mM of APAP. Total
GSH levels were measured 6, 12 or 24 hours after APAP treatment. Results are means ± SEM
for 5 independent cultures. Letters F and I indicate a significant effect (P<0.05) of fatty acids
and insulin, respectively and ns, not significant with a two-way ANOVA analysis. *Significantly
different from HepaRG cells incubated without fatty acids and with the same condition of
insulin treatment (P<0.05).
146
Figure 6. Expression of different genes involved in oxidative stress in HepaRG cells treated or
not with APAP. HepaRG cells were incubated for 1 week with different conditions of
incubation with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1) and insulin and subsequently treated
with 2.5 and 20 mM of APAP. Gene expression was measured 6 hours after APAP treatment.
Results are means ± SEM for 3-4 independent cultures, with data in duplicates for each
culture. Letters F and I indicate a significant effect (P<0.05) of fatty acids and insulin,
respectively and ns, not significant with a two-way ANOVA analysis. *Significantly different
from HepaRG cells incubated without fatty acids and with the same condition of insulin
treatment (P<0.05).
Figure 7. Recovery of ATP in HepaRG cells pretreated with the CYP2E1 inhibitor CMZ and
subsequently treated with APAP. HepaRG cells were incubated for 1 week with different
conditions of incubation with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1), insulin and CMZ and
subsequently treated or not with 2.5 or 20 mM of APAP. ATP levels were measured 6, 24 or
48 hours after APAP treatment. ATP recovery was determined by calculating the difference
of ATP levels measured with and without CMZ. Results are means ± SEM for 3 independent
cultures, with data in triplicates for each culture. Letters F and I indicate a significant effect
(P<0.05) of fatty acids and insulin, respectively and ns, not significant with a two-way ANOVA
analysis. *Significantly different from HepaRG cells incubated without fatty acids and with
the same condition of insulin treatment (P<0.05). #Significantly different from HepaRG cells
incubated without insulin and with the same condition of fatty acid treatment (P<0.05).
(nmol / mg of proteins)
Triglycerides
60
#
40
20
0
Insulin
01
01
01
0
5
(µg/ml)
0.
0.
0.
B no FA C18:0 C18:1
1 2 3
4 5 6
CYP2E1 activity CYP3A4 activity
C 200
*
40
(nmol 6OH-testosterone / h / mg of proteins)
F, I F
(pmol OH-CZX / h / mg of proteins)
150 30
CYP3A4 activity
CYP2E1 activity
*
100 20 *
#
50 10
0 0
Insulin Insulin
01
01
01
0
5
01
01
01
0
0.
0.
0.
0.
0.
0.
(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
relative expression
relative expression
# 0.8
4 0.6
*
0.4
2
0.2
0 0.0
Insulin Insulin
01
01
01
0
5
0
01
01
01
0.
0.
0.
0.
0.
0.
(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
Figure 2 SREBF1 ACACA
3 2.0
#
I # # I
#
#
SREBPF1 mRNA
1.5
ACACA mRNA
relative expression
relative expression
2
1.0
1
0.5
0 0.0
Insulin Insulin
01
01
01
5
01
01
01
0
0.
0.
0.
0.
0.
0.
(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
FASN SCD1
2.0 # 4
I I # #
#
#
1.5 3
relative expression
relative expression
FASN mRNA
SCD1 mRNA
#
1.0 2
0.5 1
0.0 0
Insulin Insulin
01
01
01
5
0
01
01
01
0.
0.
0.
0.
0.
0.
(µg/ml) (µg/ml)
PNPLA3 PDK4
2.0 2.0
I F, I
# # *
1.5 # 1.5
PNPL A3 mRNA
relative expression
relative expression
PDK4 mRNA
1.0 1.0 #
# #
#
0.5 0.5
0.0 0.0
Insulin Insulin
01
01
01
0
01
0
01
01
5
0.
0.
0.
0.
0.
0.
(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
FABP4 APOA4
2.5 8
F, I F, I, FXI
2.0 * *
# 6
FABP4 mRNA
relative expression
APO A4 mRNA
relative expression
1.5
4
1.0 #
2
0.5
0.0 0
Insulin Insulin
0
01
01
01
01
01
01
0
5
0.
0.
0.
0.
0.
0.
(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
PLIN1 PLIN2
3 2
F * * F
relative expression
relative expression
PLIN2 mRNA
PLIN1 mRNA
0 0
Insulin Insulin
0
0
01
01
01
5
0
0.
0.
0.
0.
0.
0.
(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
Figure 3
100
CYP3A4 activity
CYP2E1 activity
100 # 80
60
50 40
20
0 0
0 0.01 5 0 0.01 5
1.0
3
CYP2E1 mRNA
relative expression
CYP3A4 mRNA
relative expression
# 0.8
2
0.6
0.4
1
0.2
0
0 0.01 5 0.0
0 0.01 5
Insulin (µg/ml)
Insulin (µg/ml)
4 8
SREBF1 mRNA
ACACA mRNA
relative expression
relative expression
relative expression
FASN mRNA
2
3 6
2 4
1
1 2
0 0 0
0 0.01 5 0 0.01 5 0 0.01 5
Insulin (µg/ml) Insulin (µg/ml) Insulin (µg/ml)
# 1.0
4
15
PNPL A3 mRNA
relative expression
relative expression
relative expression
SCD1 mRNA
PDK4 mRNA
0.8
3
10 0.6
# #
2
0.4
5
1
0.2
0 0 0.0
0 0.01 5 0 0.01 5 0 0.01 5
Insulin (µg/ml) Insulin (µg/ml) Insulin (µg/ml)
120 F, I 0 mM APAP
Figure 4 100 #
60
#
40
0µg/ml insulin
20 0.01µg/ml insulin
5µg/ml insulin
0
no FA C18:0 C18:1
2.5 mM APAP
120 F, I F, I F
100
Cellular ATP (%)
80
* *
60
40
*
20
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 12h 24h
5 mM APAP
120 F, I F F
100
*
Cellular ATP (%)
80
60
40
20
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 12h 24h
10 mM APAP
120 F F F
100
Cellular ATP (%)
80
60
40
20
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 12h 24h
20 mM APAP
120 F F F
100
Cellular ATP (%)
80
60
40
20
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 12h 24h
Figure 5
50
ns 0 mM APAP
[GSH] nmol / mg protein
40
30
20
10
without insulin
with 5µg/ml insulin
0
no FA C18:0 C18:1
2.5 mM APAP
40
F F, I F
[GSH] nmol / mg protein
30
20
10 * *
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 12h 24h
20 mM APAP
40
ns F F, I
[GSH] nmol / mg protein
30
20
10
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 12h 24h
Figure 6
NRF2 HMOX1
relative expression
relative expression
3 3 3
HMOX1 mRNA
3 3 3
NRF2
2 2 2 *
2 2 2
1 1 1
1 1 1
0 0 0 0 0 0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
GCLC GSTA1/2
2 2 2 4 4 4
GSTA1/2
1 1 1 2 2 2
*
0 0 0 0 0 0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
GSTA3 GSTM1
relative expression
TRIB3 HSP70
relative expression
15 15 15
HSP70 mRNA
TRIB3 mRNA
8 * 8 8 **
6 6 6 10 10 * 10
* *
4 4 4
5 5 5
2 2 2
0 0 0 0 0 0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
Figure 7
25 F 0 mM APAP
ATP recovery with CMZ (%)
20
15
10
5 without insulin
* with 5µg/ml insulin
0
no FA C18:0 C18:1
2.5 mM APAP
60 F F ns
ATP recovery with CMZ (%)
50
40
* *
30
20
10
0 *
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 24h 48h
20 mM APAP
60 F, I ns ns
ATP recovery with CMZ (%)
50
40
*
30
20
10
#
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 24h 48h
Figure 8
25 I I 250 ns I
APAP-glucuronide (µM)
APAP-glucuronide (µM)
20 200 #
15 150
10 100
5 50
0 0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
2.5 mM APAP 20 mM APAP 2.5 mM APAP 20 mM APAP
without insulin
with 5 µg/ml insulin
APAP-Sulfate after 1h APAP-Sulfate after 6h
6 ns ns 50
ns ns
APAP-sulfate (µM)
APAP-sulfate (µM)
40
4
30
20
2
10
0 0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
156
Legends to the supplementary figures
Supplementary Figure 1. Effects of 1 week of treatment with stearic acid (C18:0), oleic acid
(C18:1) and insulin on CYP2E1 protein expression in HepaRG cells. (A) Representative
western blot. (B) CYP2E1 levels were assessed in 5 independent cultures, and values were
normalized with HSC70. The letter I indicate a significant effect (P<0.05) of insulin with a two-
way ANOVA analysis.
Supplementary Figure 3. PHH from 4 different donors 2 days after seeding and before the
one-week treatment with different concentrations of insulin and with or without 100 µM of
stearic acid, or oleic acid. Note the presence of numerous cytoplasmic fat droplets in the
PHH of these donors.
Supplementary Figure 4. Levels of ATP in HepaRG cells treated or not with various
concentrations of APAP. HepaRG cells were incubated for 1 week with different conditions of
incubation with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1) and insulin and subsequently treated
with concentrations of APAP ranging from 1 to 20 mM. ATP levels were measured 6, 24 or 48
hours after APAP treatment. Results are means ± SEM for 3 to 6 independent cultures, with
data in duplicates for each culture. †Significantly different from HepaRG cells incubated
without APAP (P<0.05).
157
Supplementary Figure 5. Total GSH levels in HepaRG cells pretreated or not with the CYP2E1
inhibitor CMZ and subsequently treated with APAP. HepaRG cells were incubated for 1 week
with different conditions of incubation with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1), insulin
and CMZ and subsequently treated or not with 2.5 and 20 mM APAP. GSH levels were
measured 24 hours after APAP treatment. Results are means ± SEM for 5 independent
cultures. Letters F and I indicate a significant effect (P<0.05) of fatty acids and insulin,
respectively and ns, not significant with a two-way ANOVA analysis.
158
Supplementary figure 1
no FA C18:0 C18:1
A Insulin
0 0.01 5 0 0.01 5 0 0.01 5
(µg/ml)
CYP2E1
HSC70
3.0
B I
2.5
CYP2E1 protein
relative expression
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Insulin
0
01
0
01
0
01
(µg/ml)
0.
0.
0.
no FA C18:0 C18:1
Supplementary figure 2
A CYP2E1 activity after 7 days with 50µM FA CYP3A4 activity after 7 days with 50µM FA
60 40
ns
30
CYP2E1 activity
CYP3A4 activity
40
20
20
10
0 0
Insulin Insulin
01
01
01
0
5
0
01
01
01
0.
0.
0.
0.
0.
0.
(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
B CYP2E1 activity after 48h with 100µM FA CYP3A4 activity after 48h with 100µM FA
80 25
ns ns
(nmol 6OH-testosterone / h / mg of proteins)
(pmol OH-CZX / h / mg of proteins)
20
60
CYP2E1 activity
CYP3A4 activity
15
40
10
20
5
0 0
Insulin Insulin
01
01
01
0
5
0
01
01
01
(µg/ml) (µg/ml)
0.
0.
0.
0.
0.
0.
Donor 1 Donor 2
Donor 3 Donor 4
Supplementary figure 4
120 A, F A, F A, F
100 100
†
100
†
†
80
†
†
† 60 †
60
60 †
†
†
†
40 40
40
20 20 20
0 0 0
0 1 2.5 5 10 20 0 1 2.5 5 10 20 0 1 2.5 5 10 20
APAP concentration (mM) APAP concentration (mM) APAP concentration (mM)
120
without insulin 120
0.01 µg/ml insulin 120
5 µg/ml insulin
A, F A, F A
100 100 100
†
†
Cellular ATP (%)
Cellular ATP (%)
80 † 80 † 80 †
24h APAP
†
† †
†
† 60 †
60 60
†
† †
†
†
40 40 40
† †
† † †
†
20 20 20
0 0 0
0 1 2.5 5 10 20 0 1 2.5 5 10 20 0 1 2.5 5 10 20
APAP concentration (mM) APAP concentration (mM) APAP concentration (mM)
†
Cellular ATP (%)
Cellular ATP (%)
80
Cell viability (%)
48h APAP
80 † 80 † †
†
†
60 † 60 † 60 †
† †
† † †
40 † 40 † 40
†
†
20 † 20 † 20
†
† †
†
0 0 0
0 1 2.5 5 10 20 0 1 2.5 5 10 20 0 1 2.5 5 10 20
APAP concentration (mM) APAP concentration (mM) APAP concentration (mM)
Supplementary figure 5
without insulin
with 5µg/ml insulin
0 mM APAP
50 ns ns
[GSH] nmol / mg protein
40
30
20
10
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
without CMZ with CMZ
2.5 mM APAP
40 ns ns
[GSH] nmol / mg protein
30
20
10
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
without CMZ with CMZ
20 mM APAP
40 F, I ns
[GSH] nmol / mg protein
30
20
10
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
without CMZ with CMZ
Supplementary figure 6
30 30
20 20
10 10
0 0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
40
20
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
without AMPK activators with Metformin with AICAR
20 mM APAP
30 ns ns ns
[GSH] nmol / mg protein
20
10
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
without AMPK activators with Metformin with AICAR
DISCUSSION, CLONCLUSION ET PERSPECTIVES
165
médicaments et de toxiques auxquels l’Homme est exposé, il y a encore de nombreuses
investigations à réaliser pour déterminer les molécules les plus problématiques.
Concernant les modèles in vitro, de nombreux travaux ont proposé des modèles de
stéatose hépatique en utilisant différents types de cellules, qu’elles soient d’origine humaine
ou animale, incubées avec des acides gras ou plus rarement des émulsions de triglycérides
(Anthérieu et al., 2011; Damelin et al., 2007; De Gottardi et al., 2007; Donato et al., 2007;
Garcia et al., 2011; Janorkar et al., 2009; Liu et al., 2010; Luo et al., 2012; Nativ et al., 2013;
Tirosh et al., 2009). Cependant, ces travaux présentent dans leur ensemble des limitations
importantes qu’il faut souligner :
166
1) Les acides gras (en général, acide palmitique, acide oléique ou des mélanges de ces
deux acides gras) sont parfois utilisés à des concentrations de l’ordre du millimolaire (Donato
et al., 2007; Garcia et al., 2011; Liu et al., 2010), qui sont très supérieures aux concentrations
retrouvées dans la circulation sanguine. En effet, les concentrations plasmatiques des
principaux acides gras saturés (palmitate et stéarate) et monoinsaturés (palmitoléate et
oléate) sont en général inférieures à 200 µM (Fraser et al., 1999; Hagenfeldt et al., 1972;
Kangani et al., 2008; Kotani et al., 2000; Mitropoulos et al., 1994).
2) Plusieurs de ces études utilisent la lignée cellulaire HepG2 (Damelin et al., 2007;
Liu et al., 2010; Luo et al., 2012)qui possède des capacités de métabolisation des
xénobiotiques très limitées, en particulier en ce qui concerne les CYPs (Aninat et al., 2006;
Gerets et al., 2012).
3) Le temps d’exposition des cellules aux acides gras est en général relativement
court, au maximum 48 heures (Damelin et al., 2007; Donato et al., 2007; Garcia et al., 2011;
Liu et al., 2010; Luo et al., 2012; Tirosh et al., 2009). Ainsi, ces modèles cellulaires ne peuvent
pas être utilisés pour étudier les effets cytotoxiques à long-terme de certains xénobiotiques.
4) Dans la plupart des cas, ces travaux n’ont pas évalué l’impact de l’accumulation
lipidique sur les activités du CYP2E1 et du CYP3A4, qui sont significativement modifiées au
cours de l’obésité et des NAFLD. En effet, plusieurs travaux expérimentaux et cliniques ont
montré que l’activité du CYP2E1 est augmentée au cours de ces pathologies, tandis que celle
du CYP3A4 est réduite (Aubert et al, 2011; Brill et al, 2012; Chalasani et al, 2003; Emery et
al., 2003; Kolwankar et al, 2007; Michaut et al, 2014). Une étude réalisée sur des
hépatocytes humains en culture primaire a étudié les effets d’un mélange oléate/palmitate
sur ces activités après 14 heures d’incubation. Cette étude montre cependant une
diminution significative des deux activités (Donato et al., 2007).
167
• NAFLD et hépatotoxicité du paracétamol
Le cas du paracétamol est très intéressant, en particulier pour les raisons suivantes :
1) C’est un antalgique qui est consommé par des millions de personnes, sans
nécessité de prescription médicale.
Dans un article de synthèse récent, nous avons répertorié les différents facteurs qui,
dans un contexte d’obésité et de NAFLD, pourraient favoriser l’hépatotoxicité du
paracétamol, ou à l’inverse protéger les individus vis-à-vis de cette toxicité (Michaut et al.,
2014). Les facteurs qui favoriseraient l’hépatotoxicité au paracétamol sont l’augmentation
de l’activité du CYP2E1 hépatique, la diminution des stocks hépatocellulaires de GSH et la
présence d’une dysfonction mitochondriale significative, s’il existe des lésions de NASH. Les
facteurs qui protégeraient sont l’augmentation du volume de distribution du paracétamol et
des capacités hépatiques de glucuronidation plus importante, ainsi qu’une réduction de
l’activité du CYP3A4.
Ainsi, nous proposons que l’hépatotoxicité accrue de cet antalgique chez les sujets
présentant une NAFLD, rapportée principalement dans un contexte d’intoxication (Myers et
Shaheen, 2008; Nguyen et al, 2008), dépend de la balance entre ces différents facteurs
(Michaut et al., 2014). Ceci pourrait expliquer notamment pourquoi tous les sujets obèses ne
semblent pas susceptibles à l’hépatotoxicité du paracétamol et aussi pourquoi cette
hépatotoxicité accrue s’observerait principalement dans un contexte d’intoxication. Cette
situation contraste avec les sujets alcooliques chez lesquels l’hépatotoxicité du paracétamol
est fréquemment observée, que ce soit après une intoxication ou dans un contexte de prise
169
de doses thérapeutiques (Larson et al., 2005; Lesser et al., 1986; Manchanda et al., 2013;
McClain et al., 1980; Zimmerman and Maddrey, 1995). En effet, dans le cadre de
l’intoxication alcoolique, les facteurs qui pourraient protéger de la toxicité du paracétamol
sont peu nombreux, voire inexistants.
1) Grâce à la lignée d'hépatome humain HepaRG, nous avons voulu mettre au point
un modèle cellulaire reproduisant un certain nombre de caractéristiques métaboliques de la
NAFLD, notamment en ce qui concerne les activités des CYP2E1 et CYP3A4, et l’expression
de gènes du métabolisme glucido-lipidique. Pour celà, des cellules HepaRG différenciées ont
été traitées pendant une semaine avec de l'acide stéarique (C18:0) ou de l'acide oléique
(C18:1), en présence de différentes concentrations d'insuline (0, 0.01 or 5µg/ml). Nous avons
étudié les effets de l’insuline car cette hormone joue un rôle central dans l’accumulation des
lipides au niveau hépatocytaire (Ferré and Foufelle, 2010; Xu et al., 2013). De plus,
différentes investigations réalisées sur des cellules hépatiques de rat ont montré que
l’insuline pouvait moduler l’expression du CYP2E1 (Moncion et al., 2002; Shukla et al., 2013;
Woodcroft and Novak, 1999a; Woodcroft et al., 2002).
Les principaux résultats obtenus au cours de mon travail de thèse peuvent être
résumés de la façon suivante :
1) Le traitement des cellules HepaRG pendant une semaine avec de l'acide stéarique
est associé à une augmentation de l'activité du CYP2E1 et à une diminution de l'activité du
CYP3A4, reproduisant ainsi différents données cliniques et expérimentales obtenues dans un
contexte d’obésité et de NAFLD (Aubert et al, 2011; Brill et al, 2012; Chalasani et al., 2003;
Emery et al, 2003; Kolwankar et al, 2007). En revanche, l'acide oléique n'a aucun effet sur
l'activité du CYP2E1 et du CYP3A4.
171
3) La stéatose induite dans les cellules HepaRG par l'acide stéarique ou oléique est
associée à une plus forte expression de différents gènes connus pour être régulés par les
lipides, comme APOA4, PLIN1 et PLIN2. En outre, comme attendu, l'insuline augmente
l'expression de différents gènes impliqués dans la synthèse des lipides tels que SREBF1, FASN
et SCD1 (Begriche et al, 2013; Postic and Girard, 2008). L'insuline induit également une
augmentation de l'expression de PNPLA3, en accord avec des études récentes (Dubuquoy et
al., 2011; Huang et al., 2010).
6) Alors que le CMZ protège les cellules HepaRG vis-à-vis de la perte d’ATP, cet
inhibiteur du CYP2E1 n’offre pas de protection concernant la diminution du GSH et la
génération des adduits du paracétamol avec les protéines cellulaires (adduits «APAP-
protéines»).
Dans la suite de la discussion, certains des résultats mentionnés ci-dessus seront plus
particulièrement développés.
172
• Effets des acides gras sur l’activité du CYP2E1 et du CYP3A4 dans les cellules
HepaRG
Dans notre travail, nous avons obtenu des résultats significatifs avec l’acide stéarique
sur les activités du CYP2E1 et CYP3A4 tandis que l’acide oléique n’avait aucun effet, alors
que le degré de stéatose hépatocytaire était similaire pour les deux acides gras. Ceci suggère
que la nature des acides gras accumulés est très importante, plutôt que la simple quantité
de lipides. Ce résultat important est en accord avec une étude réalisée récemment au
laboratoire sur des souris femelles wild-type, ob/ob et db/db (Aubert et al., 2012). En effet,
cette étude a montré que l’activité du CYP2E1 hépatique était significativement augmentée
chez les souris db/db par rapport au souris non obèses mais pas chez les souris ob/ob, alors
que la quantité de lipides et de triglycérides intra-hépatiques était bien moindre chez les
souris db/db par rapport au souris ob/ob (Aubert et al., 2012). Malheureusement, l’activité
du CYP3A4 n’a pas été évaluée dans cette étude. Il est à noter enfin que deux études
cliniques ont rapporté une corrélation positive et significative entre l’activité du CYP2E1 et le
degré de stéatose mais ces études n’ont pas évalué la nature des lipides intra-hépatiques
(Chtioui et al., 2007 ; Emery et al., 2003). Il serait intéressant à l’avenir de déterminer sur les
cellules HepaRG les effets d’autres acides gras sur les activités du CYP2E1 et CYP3A4 afin de
savoir notamment si les effets de l’acide stéarique peuvent être reproduits avec d’autres
acides gras saturés à longue chaîne. En outre, des investigations seraient nécessaires afin de
déterminer les mécanismes par lesquels l’acide stéarique augmente l’activité du CYP2E1 et
réduit celle du CYP3A4.
Contrairement au CYP2E1, l'activité du CYP3A4 dans les cellules HepaRG est réduite
par l'acide stéarique, mais pas par l'acide oléique. La diminution de l’activité du CYP3A4 est
associée à une expression plus faible de cette enzyme. De façon intéressante, une étude
réalisée sur des hépatocytes humains a montré qu'un mélange d'acide palmitique (C16:0) et
d'acide oléique réduisait l'activité du CYP3A4 (Donato et al, 2006). Cependant, ces effets
apparaissent assez rapidement (14 h) après l’ajout d’acides gras, et l’étude n’a pas
déterminé les taux d’ARNm (Donato et al, 2006). Ainsi, l'activité du CYP3A4 et peut-être son
expression pourrait être plus spécifiquement réduite par les acides gras saturés à longue
chaîne, mais des investigations avec différents acides gras seraient nécessaires afin de
répondre à cette question.
174
intéressant de noter qu’une étude réalisée sur des hépatocytes humains a montré que
l’activation de la PKA était responsable d’une diminution de l’expression (mRNA) du CYP3A4
(Lichti-Kaiser et al., 2009). Cependant, bien que la piste de la PKA puisse être intéressante, il
serait difficile d’expliquer pourquoi l’augmentation de l’activité du CYP2E1 par l’acide
stéarique serait liée à une réduction de l’activité de PKA et la diminution de l’expression du
CYP3A4 à une activation de cette kinase.
Mis à part la nature des lipides accumulés dans le foie, d’autres facteurs pourraient
participer à l’augmentation de l’activité du CYP2E1 observée au cours de l’obésité et de la
NAFLD. En particulier, certaines investigations cliniques ont rapporté que cette induction du
CYP2E1 était associée à l'insulinorésistance et au diabète de type 2 (Chalasani et al., 2003;
Emery et al., 2003; Wang et al, 2003). Ainsi, des facteurs comme l’insuline et le glucose
pourraient jouer un rôle significatif. Dans notre travail, nous avons étudié les effets de
l’insuline pour des raisons déjà évoquées ci-dessus mais pas les effets du glucose car nous
avions déjà beaucoup de conditions de culture cellulaire à tester.
Une observation importante dans notre étude est que l'insuline réduit de façon
concentration-dépendante l'activité de CYP2E1 dans les cellules HepaRG et les hépatocytes
humains en culture primaire. Ainsi, plus les quantités d’insuline sont faibles, plus l’activité du
CYP2E1 est élevée dans les hépatocytes. Etant donné que l’obésité et la NAFLD sont souvent
associées à une insulinorésistance, en particulier au niveau hépatique (Asrih and Jornayvaz,
2015; Begriche et al., 2013), nos résultats suggèrent qu’une moindre signalisation insulinique
dans les hépatocytes pourrait, au moins en partie, expliquer l’induction du CYP2E1
hépatique au cours de ces pathologies dysmétaboliques. Il est à noter aussi que nos résultats
sont en accord avec certaines études réalisées chez l’animal. Des études ont montré que
l’insulinopénie induite chez les rongeurs traités par la streptozotocine était associée à une
augmentation du CYP2E1 hépatique, et que cette induction était corrigée par un traitement
à l'insuline (Ioannides et al., 1988; Raza et al., 2004).
175
De façon surprenante, alors que l'insuline réduit l'activité du CYP2E1 dans les HepaRG
et les hépatocytes humains en culture primaire, cette hormone est responsable d’une
augmentation des taux d’ARNm du CYP2E1. De plus, l'insuline augmente l'expression
protéique du CYP2E1 dans les 2 types cellulaires. Ceci suggère que l'activité du CYP2E1
pourrait être régulée de façon post-traductionnelle par l'insuline dans les hépatocytes
humains. Il est également intéressant de relever que les effet positifs de l'insuline sur les
taux d’ARNm du CYP2E1 observés contrastent avec les résultats d’études menées sur des
hépatocytes de rats dans lesquelles des effets inverses étaient observés (Moncion et al.,
2002; Woodcroft and Novak, 1999). Cependant, l'activité du CYP2E1 n'a malheureusement
pas été rapportée dans ces études. Ainsi, l'expression du CYP2E1 pourrait être régulée
différemment par l'insuline chez le rat et l'Homme. D'autres travaux de recherche seront
nécessaires pour déterminer les effets de l’insuline sur la transcription, la traduction et la
régulation post-traductionnelle du CYP2E1 dans les hépatocytes humains. Pour cela, les
cellules HepaRG pourraient être utiles comme modèle expérimental.
Dans notre travail, nous avons étudié une large gamme de concentrations de
paracétamol, allant de 1 à 20 mM, même si la plus faible de ces concentrations n’était pas
cytotoxique dans la plupart des conditions expérimentales testées. Ainsi, nous avons utilisé
une gamme de concentrations qui reproduit le facteur 20 retrouvé dans différentes
situations cliniques. Il est également important de souligner que les concentrations de
paracétamol que nous avons utilisées sont équivalentes à celles classiquement étudiées sur
des hépatocytes humains ou de rongeurs (Jemnitz et al., 2008; Saberi et al., 2014; Xie et al.,
176
2014a). Le travail de Jemnitz et coll. (2008) montre d’ailleurs que les hépatocytes humains
sont beaucoup moins sensibles à la toxicité du paracétamol comparés aux hépatocytes de
rongeurs. En effet, si l’on compare la cytotoxicité de ce médicament sur des hépatocytes de
souris, de rat et d’Homme, les EC50 sont respectivement de 3,8 mM, 7,6 mM et de 28,2 mM
(Jemnitz et al., 2008). Malheureusement dans cette étude, les auteurs n’ont pas retrouvé de
corrélation entre la sensibilité des hépatocytes au paracétamol et l’activité du CYP2E1 pour
les trois espèces étudiées.
Dans nos expériences réalisées sur les cellules HepaRG traitées avec le paracétamol,
l’inhibition du CYP2E1 par le prétraitement au CMZ est associée à une protection
significative vis-à-vis de la chute de l'ATP cellulaire. Celà confirme que le CYP2E1 est
important dans le mécanisme de cytotoxicité de ce médicament. Il est important de noter
que cette « récupération » (recovery) d’ATP à des temps précoces après le traitement au
paracétamol (6 heures) était significativement plus importante en présence d’acide
stéarique comparée aux autres conditions, que cela soit avec de faibles (2,5 mM) ou de
fortes (20 mM) concentrations de paracétamol. Ce résultat est intéressant car il suggère que
la NAFLD pourrait favoriser la cytotoxicité du paracétamol dans un contexte
«thérapeutique» en plus du contexte de surdosage. En absence d’insuline, la
« récupération » d’ATP induite par le CMZ n’est significative que pour les fortes
concentrations de paracétamol (20 mM), ce qui suggère que les sujets ayant le plus grand
risque d’hépatotoxicité sévère après une intoxication au paracétamol seraient ceux qui
présenteraient une signalisation insulinique altérée au niveau hépatique.
De façon surprenante, alors que le CMZ protége les cellules HepaRG de la chute
d’ATP induite par le paracétamol, cet inhibiteur du CYP2E1 n’offre pas de protection vis-à-vis
de la déplétion du GSH ou de l’apparition des adduits « APAP-protéines ». Nous n’avons pas
à l’heure actuelle d’explication définitive à ces résultats apparemment contradictoires.
Cependant, une hypothèse possible serait que l’inhibition du CYP2E1 dans les cellules
HepaRG diminue la formation de NAPQI dans le compartiment mitochondrial sans
177
retentissement significatif sur les concentrations cellulaires totales de GSH et les quantités
d’adduits « APAP-protéines ».
178
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Résumé
L'obésité et les maladies du foie associées (NAFLD) augmentent le risque et la sévérité de l’hépatotoxicité induite par
certains xénobiotiques, mais les mécanismes impliqués sont encore mal compris. Pour l'éthanol et le paracétamol (APAP),
le rôle du cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) hépatique est suspecté car l'activité de cette enzyme est augmentée au cours
er
de ces pathologies dysmétaboliques. Le 1 objectif de notre travail expérimental a été de mettre au point un modèle
cellulaire de NAFLD caractérisé non seulement par l'accumulation de triglycérides mais aussi par l’augmentation de
l'activité du CYP2E1. Pour cela, des cellules humaines HepaRG différenciées ont été incubées pendant une semaine avec
de l'acide stéarique ou de l'acide oléique, en présence de 3 concentrations différentes d'insuline. Les triglycérides
cellulaires et l'expression de gènes induits au cours de la stéatose étaient similaires avec les deux acides gras. Cependant,
l'activité du CYP2E1 était significativement augmentée uniquement par le stéarate et ceci était associé à une diminution
de l'activité du CYP3A4, une autre caractéristique des NAFLD. L’activité du CYP2E1 dans les cellules HepaRG était réduite
par l'insuline d'une manière concentration-dépendante et cet effet était reproduit sur des hépatocytes humains en
culture primaire. Ainsi, l'activité du CYP2E1 était la plus élevée dans les cellules HepaRG cultivées avec du stéarate et sans
ème
insuline. Le 2 but de notre étude était ensuite d'évaluer la cytotoxicité de l’APAP sur des cellules HepaRG présentant
ou non une stéatose et une induction du CYP2E1. Des expériences avec une large gamme de concentrations d’APAP (de 1
à 20 mM) indiquaient que la perte cellulaire d'ATP et du glutathion (GSH) était presque toujours plus forte en présence de
stéarate. Dans les cellules prétraitées avec le chlorméthiazole (CMZ, un inhibiteur du CYP2E1), la moindre diminution
d’ATP était plus importante en présence de stéarate, avec de faibles (2,5 mM) ou de fortes (20 mM) concentrations
d’APAP. Cependant, en l'absence d'insuline, la moindre chute d’ATP induite par le CMZ était significativement plus forte
uniquement pour 20 mM d’APAP. Étonnamment, suite au prétraitement par le CMZ, il n'y avait pas de protection vis-à-vis
de la diminution du GSH et de la formation des adduits APAP-protéines. Enfin, les concentrations du métabolite APAP-
glucuronide étaient significativement augmentées en présence d'insuline. Ainsi, lorsqu’elle est étudiée dans des
conditions spécifiques de culture, la lignée cellulaire HepaRG semble être un modèle intéressant de NAFLD, notamment
en ce qui concerne les activités du CYP2E1 et du CYP3A4. Nos données suggèrent aussi que l’induction du CYP2E1
observée au cours des NAFLD pourrait être secondaire à l'accumulation de certains acides gras et à la présence d’une
faible signalisation insulinique dans le foie. Ainsi, ce modèle cellulaire peut être utilisé pour mettre en évidence les
principaux facteurs métaboliques et hormonaux favorisant hépatotoxicité de l’APAP chez les personnes obèses. Cette
thèse inclut également une revue de la littérature sur l’hépatotoxicité de l’APAP dans le contexte de l’obésité et des
NAFLD (Michaut et al., Liver Int 2014).
Abstract
Obesity and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) are able to increase the risk and the severity of hepatotoxicity
induced by some xenobiotics including drugs, but the involved mechanisms are still poorly understood. For toxic
compounds such as ethanol and acetaminophen (APAP), a role of hepatic cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) is suspected
since the activity of this enzyme is consistently enhanced during obesity and NAFLD. The first aim of our experimental
study was to set up a cellular model of NAFLD characterized not only by triglyceride accumulation but also by higher
CYP2E1 activity. To this end, differentiated human HepaRG cells were incubated during one week with stearic acid, or
oleic acid, in the presence of 3 different concentrations of insulin. Cellular triglycerides and the expression of lipid-
responsive genes were similar with both fatty acids. However, CYP2E1 activity was significantly increased only by stearate
and this was associated with lower CYP3A4 activity, another metabolic feature reported in NAFLD. CYP2E1 activity in
HepaRG cells was reduced by insulin in a concentration-dependent manner and this effect was reproduced in cultured
primary human hepatocytes. Hence, the highest CYP2E1 activity was observed in HepaRG cells with stearate and without
insulin. Next, the second aim of our study was to assess APAP cytotoxicity in HepaRG cells presenting or not lipid
accretion and CYP2E1 induction. Experiments with a large range of APAP concentrations (1 to 20 mM) showed that the
cellular loss of ATP and glutathione (GSH) was almost always stronger in the presence of stearic acid. In cells pretreated
with the CYP2E1 inhibitor chlormethiazole (CMZ), recovery of cellular ATP was significantly higher in the presence of
stearic acid with both low (2.5 mM) and high (20 mM) concentrations of APAP. However, in the absence of insulin, CMZ-
induced ATP recovery was significantly greater only for 20 mM of APAP. Surprisingly, there was no recovery of cellular
GSH and no reduction of APAP-protein adducts following CMZ pretreatment. Finally, levels of APAP-glucuronide were
significantly enhanced in the presence of insulin. Hence, when studied in specific conditions of culture, the HepaRG cell
line can be a valuable model of human NAFLD, especially regarding CYP2E1 and CYP3A4 activity. Our data also suggest
that higher CYP2E1 activity in NAFLD could be secondary to the hepatic accumulation of some fatty acids and to the
presence of low insulin signaling. This cellular model can be thus used to unveil the main metabolic and hormonal factors
favoring APAP hepatotoxicity in obese individuals. This thesis also includes a review on APAP hepatotoxicity in the context
of obesity and NAFLD (Michaut et al., Liver Int 2014).