Tecnicas

PROCESAMIENTO TISULAR
TECNICAS ESPECIALES (HISTOQUIMICA)
Dr. Mauricio Valbuena

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO
HISTOQUÍMICA
Las Técnicas histoquímicas a aquellas que supongan una reacción química
en la que intervienen moléculas pertenecientes al propio tejido.
El objetivo de la histoquímica → poner de manifiesto una molécula o familia de

moléculas presentes en una sección histológica y estudiar su distribución tisular "in
situ".
Estas moléculas son difícilmente discernibles con técnicas generales y por tanto es
necesario realizar pasos previos para poner de manifiesto la molécula que queremos
detectar.
Vamos a dividir las técnicas histoquímicas en dos grupos:

- REACCIONES QUIMICAS
- HISTOQUIMICA ENZIMATICA
HISTOQUÍMICA
(GLÚCIDOS → Glykos). “HIDRATOS DE CARBONO”
Biomoléculas → Formados principalmente por ( C - H2 -O) → “Hidratos de carbono”
+ OH (Hidroxilo)
*Los hidratos de carbono o glúcidos son polialcoholes oxidados

(polihidroxicetonas o polialdehídos).
HISTOQUÍMICA
.
HISTOQUÍMICA
Tipos de Glúcidos.
-Monosacáridos ( 1 sola molécula) → GLUCOSA
-Oligosacáridos ( 2-10 moléculas) → SACAROSA
-Polisacáridos (>10 moléculas) → SIMPLES : GLUCOGENO , ALMIDÓN

→ COMPLEJOS: MCPS , MCProt, MCLip.
HERETEROSIDOS → Glucolípidos , glucoproteínas

( Glúcidos + otra molécula) Nucleótidos ( ARN, ADN)
HISTOQUÍMICA
.
HISTOQUÍMICA
HISTOQUÍMICA
DISACARIDOS
HISTOQUÍMICA
-POLISACARIDOS (GLUCOGENO)
HISTOQUÍMICA
DETECCIÓN DE GLÚCIDOS (HIDRATOS DE CARBONO)
El fundamento de las coloraciones de los hidratos de carbono se basa en:
- Oxidación producida sobre los Polisacáridos, que provocan aparición de

funciones aldehídicas que van a recolorear la leucofucsina o el reactivo
de Shiff.
- Dependiendo de la calidad de la oxidación :

- Reacción del PAS ( Ácido Peryodico-Schiff)
- Reacción de Casella ( Permanganato-Schiff)
- Reacción de Bauer ( Ácido crómico-Schiff)
HISTOQUÍMICA
DETECCIÓN DE GLÚCIDOS ( HIDRATOS DE CARBONO)
- Dependiendo de la calidad de la OXIDACIÓN:
- Reacción del PAS ( Ácido Peryodico-Schiff) :

- PAS + → Color púrpura
( glucógeno, moco , coloide tiroideo, células basófilas de adenohipófisis, luz glandular)
- Reacción de Bauer ( Ácido crómico-Schiff)

- Bauer + → Rojo púrpura
- Reacción de Casella ( Permanganato-Schiff)

HISTOQUÍMICA
TÉCNICA DEL PAS (Ácido Periódico Schiff)
Consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido periódico (HIO4) para incrementar el
número de grupos carbonilo (aldehído o cetona) presentes en ellos, de forma que
puedan ser demostrados posteriormente mediante reactivo de Schiff.
Fijación: Formalina al 4 % o Líquido de Carnoy o Bouin

Solución de Ácido Periódico……………0.5 % p/v.
Reactivo de Schiff:
Fucsina básica (CI: 42510)………… 1g.
Agua destilada……………………... 200 ml.
Contratinción: Hematoxilina Harris modificada
Expresión: Fucsia brillante→ Magenta
*Agua sulfurosa→ Bisulfito sodico10% en solución HCl 10%
HISTOQUÍMICA
DETECCIÓN DE GLÚCIDOS
El fundamento de las coloraciones de los
hidratos de carbono se basa en:
- Oxidación producida sobre los

Polisacáridos, que provocan aparición
de funciones aldehídicas que van a
recolorear la leucofucsina o el reactivo
de Shiff.
HISTOQUÍMICA
TÉCNICA DEL PAS (Ácido Periódico Schiff)
Compuestos PAS +
• Polisacáridos simples: como el Glucógeno y la Celulosa.
• Mucopolisacáridos Neutros
• Mucoproteínas como son algunas mucinas del tubo digestivo y del árbol respiratorio
o bronquial, también la tiroglobulina que está en el tiroides y la hormona estimulante.
• Glucoproteínas del suero
• Glucolípidos: como los gangliósidos y cerebrosidos.
HISTOQUÍMICA
Controles de la técnica del PAS.
Es imprescindible realizar preparaciones testigo o de control que
confirmen los resultados obtenidos, para ello suelen ser muy útiles las
técnicas de bloqueo.
1. Técnica de bloqueo para aldehídos en general

Se realiza tratando los grupos aldehído presentes en el tejido, tras la
oxidación con ácido peryódico con una solución de ácido acético saturado
con Dimedona (1-16 h. a 60 º C). Posteriormente se lava con agua destilada
y se continúa con PAS normal.
Únicamente se teñirá el material PAS +→ grupos aldehídos situados en
posición 1,2 glicol (proceden de los glúcidos)
HISTOQUÍMICA
Controles de la técnica del PAS.
2. Técnica de bloqueo mediante acetilación para grupos 1,2 glicol.

Se basa en la negatividad de la reacción del PAS después de la acetilación de los
grupos 1,2 glicol presentes en los hidratos de carbono. Este proceso es total o
parcialmente reversible por saponificación posterior mediante tratamiento con
hidróxido potásico.
El 2º problema en la técnica del PAS : tratar de diferenciar si los grupos aldehídos

aparecidos tras la oxidación lo han hecho sobre grupos alcohólicos situados en
posición 1,2 glicol o si los oxidados han sido grupos hidroxiaminos 1º o 2º (no
presentes habitualmente en los hidratos de carbono que son PAS +.)
Esta distinción pude realizarse mediante acetilación reversible y saponificación.

HISTOQUÍMICA
…Controles de la técnica del PAS.
2. Técnica de bloqueo mediante acetilación para grupos 1,2 glicol.
Acetilación: consiste en introducir un grupo acetilo en un compuesto orgánico (El
anhídrido acético) con este reactivo se bloquean todos los grupos alcohólicos en general
existentes en el tejido. → Enlace tipo ester
Saponificación: Romper un enlace tipo ester de forma que en condiciones idóneas
reaparece el grupo químico que existía antes de la acetilación.
La acetilación es totalmente reversible tras saponificación para los grupos alcohólicos

en posición 1,2 glicol → (Realmente proceden de los glúcidos)
Totalmente irreversible para los grupos hidroxiamino Secundarios

Moderadamente reversible para los grupo hidroxiamino Primarios.
HISTOQUÍMICA
POLISACARIDOS COMPLEJOS: (1. MUCOPOLISACARIDOS)
- MPS NEUTROS: ( Galactosa + Acetil-glucosamina)+ Proteína → PAS +

- Glucoproteínas y Mucoproteínas -
- MPS ÁCIDOS: Predomina el ácido urónico y pueden contener restos de

sulfatos . Los mucopolisacáridos ácidos no pueden ser oxidados por el
ácido periódico (ya que no aparecen los grupos carbonilos) → PAS –
- Acido hialurónico (N-acetilglucosamina y ácido D-glucorónico) -
HISTOQUÍMICA
MPS ÁCIDOS: Los mucopolisacáridos ácidos no tienen grupos alcohólicos
en posición 1,2 glicol sino grupos ácidos carboxilos o sulfatados. Se
clasifican en:
1. Mucopolisacáridos ácidos no sulfatados (Carboximucopolisacáridos)

• Carboximucopolisacáridos Epiteliales o Sialomucinas
• Carboximucopolisacáridos Conjuntivos
2. Mucopolisacáridos ácidos sulfatados (Sulfomucopolisacáridos

• Mucopolisacáridos ácidos Sulfatados epiteliales
• Mucopolisacáridos ácidos Conjuntivos
HISTOQUÍMICA
TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS.
Son unos polisacáridos que no tienen grupos alcohólicos en posición 1,2 glicol sino
grupos ácidos carboxilos o sulfatados.
Las técnicas para determinar mucopolisacáridos ácidos

a) Técnica del Azul Alcián:
• pH en torno a 2,4 -2,6 se colorean los mucopolisacáridos ácidos
sulfatados y los carboxílicos.
• pH muy bajo cerca de 1, sólo se colorea los mucopolisacáridos
sulfatados, los carboxílicos no se tiñen.
• pH hasta 0,5 se incrementa la selectividad de la tinción y en este caso
sólo se tiñen los mucopolisacáridos fuertemente sulfatados.
HISTOQUÍMICA
Procedimiento Técnico: Fijación: formalina al 4%.
Soluciones:
Azul alcián a pH 2,5:
Azul alcián (C.I. 74240)…………… 1 g.
Ácido Acético 3%………………….. 100 ml.
Azul alcián a pH 1:
Azul alcián…………………………. 1 g.
HCl 0,1 N …………………………… 100 ml.
Azul alcián a pH 0,5 :

Azul alcián …………………………. 1 g.
HCl 0,5 N ………………………….. 100 ml.
HISTOQUÍMICA
Modo de operar:
• Desparafinar e hidratar.
• Tratar con la solución deseada de azul alcián durante 30 min.
• Si se usó la solución a pH 2,5, lavar con agua (d)
• Si se usó cualquiera de los otros dos, secar sólo con papel de filtro.
• Contrastar si se desea con rojo nuclear.
• Deshidratar, aclarar y montar.

HISTOQUÍMICA
Resultados:
• Azul alcián a pH 2,5: mucopolisacáridos ácidos
• Azul alcián a pH 1 sólo se tiñen de azul los mucopolisacáridos ácidos

sulfatados.
• Azul alcián a pH 0,5 sólo se tiñen de azul los mucopolisacáridos ácidos

fuertemente sulfatados.
HISTOQUÍMICA
Resultados:
HISTOQUÍMICA
b) Reacción Metacromática:
Cambio de color cuando un colorante químicamente puro tiñe selectivamente
una estructura tisular de color “diferente” al de la solución diluida de colorante.
Sustancias cromotropas:
• Mucopolisacáridos ácidos
• Ácidos nucleicos
• Lípidos de carácter ácido
• Partículas de sílice.
.
HISTOQUÍMICA
b) Reacción Metacromática: La reacción metacromática presenta grandes
variaciones ante las más pequeñas modificaciones del medio donde reproduce, por lo
tanto la reacción metacromática es de difícil interpretación e incluso puede proporcionar
resultados contradictorios
Factores de la Técnica Histológica que influyen sobre la metacromasia:

1. Fijación:
• Tejido congelado o liofilizado (menores problemas de interpretación)
• MCPS ácidos fijar con : Alcohol, Bouin , Formalina → Evitar Agentes oxidantes
2. Colorantes: Mas utilizados
• Azul de Toluidina y Azur A
HISTOQUÍMICA
b) Reacción Metacromática:
Factores de la Técnica Histológica que influyen sobre la metacromasia:
3. Disolventes y pH de disolución:
• Disolvente: Agua destilada o Alcohol Etílico 30%
• pH de la disolución: 0,5 – 7.0 ( Caracterización de los MCPS)
4. Montaje de Preparaciones
• Las características de los colorantes metacromáticos varían en función del
disolvente utilizado.
• La DHT alcohólica modificara los resultados de la reacción( Inhibe metacromasia)
HISTOQUÍMICA
b) Reacción Metacromática: Controles de Especificidad en la Reacción
metacromática→ Se utilizan esencialmente para distinguir Sulfomucopolisacáridos Vs
Carboximucopolisacáridos
1. Vacunación de pH: Realizar la coloración a pH de 3.5 ( valor al que la mayoría de los

Carboximucopolisacáridos pierden su metacromasia y Sulfomucopolisacáridos la
preservan).
• Se hacen 2 lotes ( 1º se tiñe a pH 4.5→ C-MCPS se pierden y 2º pH 3.5→ S-MCPS)
2. Metilación Reversible:
• 1º se Trata 1 grupo de cortes con OH Metílico y HCL → Bloqueo x metilación de grupos ácidos
• Metilación + Saponificación en otro lote → Reaparece metacromasia solo en C-MCPS
HISTOQUÍMICA
b) AZUL DE TOLUIDINA → Técnica de metacromasia que mas se hace
Fijación: Alcohol, Bouin alcohólico, formalina-> evitarse los fijados con agentes oxidantes.
Resultados: Elementos de carácter metacromático se van a ver de rojo a púrpura y el resto se va
a ver azul. Los baños en alcohol etílico inhiben la metacromasia→ realizar preparaciones
testigo.
• 1ª preparación se observa tras su paso por el agua acética antes de fijar con molibdato. Esto
tiene por objeto evaluar el efecto metacromático inmediato en fase inestable.
• 2ª preparación no se deshidrata y se monta en un medio acuoso para evitar el paso por
alcohol etílico.
• 3ª preparación se confecciona normalmente, es decir, deshidratando y montando por el
método habitual.
Comparando las 3 preparaciones se puede seguir la evolución del efecto metacromático y la
influencia del procesamiento histológico realizado sobre ellas.
HISTOQUÍMICA
TÉCNICA PARA DIFERENCIAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS, NEUTROS Y GLICOPROTEÍNAS.
TÉCNICA DEL AZUL ALCIAN - PAS.
Es la Técnica de diferenciación de carbohidratos mas empleada el practica habitual.
Procedimiento Técnico:
• Fijación: formol al 4 %.
• Soluciones:
• Solución azul alcián a pH 2,5.
• Solución ácido periódico el 0,5 %.
• Reactivo de Schiff.
• Solución de ácido sulfuroso.
• Resultados:
• Mucopolisacáridos ácidos → Azul
• Mucopolisacáridos neutros y glucoproteínas → Rojo intenso
HISTOQUÍMICA
TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS
HISTOQUÍMICA
MÉTODOS HISTOQUÍMICOS PARA COLORACION DE PROTEÍNAS
Las proteínas→ (griego: πρωτεῖος [proteios], ‘prominente, de primera calidad’)

son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos.
• Forman parte de la estructura básica de los tejidos

• Desempeñan funciones metabólicas y reguladoras
• Son la base de la estructura del código genético (ADN)
• Base de los sistemas de reconocimiento de organismos extraños en el sistema
inmunitario.
HISTOQUÍMICA
Las proteínas→ (griego: πρωτεῖος [proteios], ‘prominente, de primera calidad’)
son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos.
Un aminoácido una molécula orgánica con un grupo amino (-NH2) y un grupo

carboxilo (-COOH).
HISTOQUÍMICA
Las proteínas→ (griego: πρωτεῖος [proteios], ‘prominente, de primera

calidad’) son macromoléculas formadas por cadenas lineales
de aminoácidos.
2 aminoácidos se combinan en una reacción de condensación entre el

grupo amino de uno y el carboxilo del otro, liberándose una molécula
de agua y formando un que se denomina enlace peptídico ( Formación de
enlace covalente CO-NH)
HISTOQUÍMICA
HISTOQUÍMICA
SE PUEDEN CLASIFICAR EN 3 GRUPOS
- REACCIONES GENERALES → COLOREAR GLOBALMENTE LAS PROTEÍNAS PRESENTES
EN UN TEJIDO, DETERMINANDOLAS COMO TAL.
- REACCIONES DE GRUPO → NO CARACTERIZAN LA MOLÉCULA PROTEÍCA COMPLETA
SINO UN CORTO NUMERO DE REACTIVOS PRESENTES EN DICHAS PROTEÍNAS
- TETRAZORREACCIÓN
- REACCIONES ESPECÍFICAS → GRUPOS QUÍMICOS PARTICULARES, PROPIOS DE
DETERMINADOS AMINOÁCIDOS (PRESENTE / AUSENTE ) EN UNA DETERMINADA
PROTEÍNA. (COMPOSICION EXACTA)
- SULFHIDRILO
- FENOL
- INDOL
- GUANIDIL
HISTOQUÍMICA
- REACCIONES DE GRUPO → NO CARACTERIZAN LA MOLÉCULA PROTEÍCA COMPLETA SINO UN

CORTO NÚMERO DE REACTIVOS PRESENTES EN DICHAS PROTEÍNAS
- REACCION NIHIDRINA-SCHIFF :
- DESAMINACION OXIDATIVA DE CADENAS POLIPETÍDICAS POR LA NIHIDRINA
- LOS GRUPOS AMINO SON SUSTITUIDOS POR GRUPOS CARBONILO
- SE REALIZA LA DETERMINACION DE GRUPOS CARBONILO POR EL REACTIVO SE SCHIFF
- RESULTADOS → COLORACION ROJO PURPURA
- MÉTODO DE LA TETRAZORREACCION:
- DETECCION DE PROTEINAS USANDO LA BENCIDINA TETRAZOADA
- A Ph 9.2 → UNIÓN SELECTIVA A PROTEINAS X MEDIO DE A.A DE CARÁCTER CÍCLICO ( PROLINA,
TIROSINA…)
HISTOQUÍMICA
MÉTODOS PARA LA DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS
Los Ácidos nucleicos son grandes polímeros formados por la
repetición de monómeros denominados nucleótidos unidos
mediante enlaces fosfodiéster. Existen dos tipos básicos de
ácidos nucleicos.: ADN y el ARN.
HISTOQUÍMICA
Cada nucleótido es un ensamblado de tres

componentes:
1. BASES NITROGENADAS
• PURÍNICAS: Adenina (A) y la guanina(G).
• PIRIMIDÍNICAS: Timina (T), la Citosina (C)

y Uracilo (U)
HISTOQUÍMICA
2. Pentosa (azúcar de cinco átomos de carbono)
- Puede ser RIBOSA (RNA) o DESOXIRIBOSA (DNA).
- La diferencia es que el ARN sí posee un grupo OH en el segundo carbono.

HISTOQUÍMICA
Cada nucleótido es un ensamblado de tres componentes:
3. Ácido fosfórico: de fórmula H3PO4.

• Cada nucleótido puede contener 1 o varios
• (nucleótidos-monofosfato, como el AMP)
• (nucleótidos-difosfato, como el ADP)
• **(nucleótidos-trifosfato, como el ATP) → Principal fuente de energía
El trifosfato de adenosina (adenosine triphosphate, ATP) es un nucleótido fundamental en la obtención de
energía celular. Está formado por una base nitrogenada (adenina) unida al carbono 1 de la ribosa, que en su
carbono 5 tiene enlazados tres grupos fosfato.
HISTOQUÍMICA
ARN → Qué función tiene?

Las funciones del ARN pueden comprenderse mejor a través de la descripción de los
diferentes tipos que existen. Entre los más conocidos están:
• ARNm o ARN mensajero: Transmite la información codificante del ADN sirviendo de

pauta a la síntesis de proteínas.
• ARNt o ARN de Transferencia: Transporta aminoácidos para la síntesis de proteínas.
• ARNr o ARN Ribosómico: localizado en los ribosomas y ayuda a leer los ARNm y
catalizan la síntesis de proteínas.
HISTOQUÍMICA
ARN → Es una Cadena simple formado por Ribosa + fosfato + bases
nitrogenadas (adenina, guanina, citosina y uracilo).
• El ARN celular es lineal y monocatenario (de una sola cadena).
Las bases púricas (adenina y guanina) pueden formar puentes de hidrógeno con
las pirimidínicas (uracilo y citosina) según el esquema C=G y A=U
HISTOQUÍMICA
ADN → ¿Qué función tiene el ADN?
Función más evidente→ Proveer la información genética que nos determina, el ADN
tiene otras funciones, por ejemplo:
• Replicación: La capacidad de hacer copias de sí mismo permite que la información

genética se transfiera de una célula a las células hijas y de generación en generación.
• Codificación: La codificación de las proteínas adecuadas para cada célula se realiza
gracias a la información que provee el ADN.
• Metabolismo celular: Intervienen en el control del metabolismo celular mediante la
ayuda del ARN y mediante la síntesis de proteínas y hormonas.
• Mutación: Nuestra evolución como especie está determinada por la función de
mutación del ADN. También la diversidad biológica responde a esta capacidad.
HISTOQUÍMICA
ADN → DOBLE CADENA ENLAZADA POR PUENTES DE HIDRÓGENO

Formación de un enlace de hidrógeno:
Una de las bases debe presentar un "donador" de hidrógenos con un átomo de
hidrógeno con carga parcial positiva (-NH2 o -NH)
la otra base debe presentar un grupo "aceptor" de hidrógenos con un átomo

cargado electronegativamente (C=O o N).
complementariedad de las bases: Cada tipo de base en una hebra forma un enlace
únicamente con un tipo de base en la otra hebra → A -T, y C - G.
HISTOQUÍMICA
ADN → DOBLE CADENA ENLAZADA POR PUENTES DE HIDRÓGENO
los dos tipos de pares de bases forman un número diferente de enlaces de hidrógeno:
A=T (dos puentes de hidrógeno) y C≡G (tres puentes de hidrógeno) → Estabilidad a la
doble hélice.
HISTOQUÍMICA
ADN →
DOBLE CADENA
ENLAZADA POR
PUENTES HIDRÓGENO
HISTOQUÍMICA
• En condiciones normales la molécula ADN se autorreplica y contiene la carga

hereditaria del individuo.
• ARN es responsable de la transmisión de la información nuclear al citoplasma.
• Los ácidos nucleicos + Proteínas básicas → nucleoproteínas
La hidrolisis ácida → Separa el componente proteico y permite demostrar los ácidos

nucleicos.
HISTOQUÍMICA
PROCEDIMIENTOS PARA EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS

EXTRACCIÓN DE ADN
- Hidrolisis ácida
- Ácido perclórico 5% a 70⁰C x 20min + neutralización con carbonato sódico 1% x
5min y lavado en agua corriente x 5min.
- Ácido tricloroacético 5% a 90⁰C x 15min y lavado en agua corriente x 5min.
EXTRACCIÓN DE ARN
- Hidrolisis en ácido perclórico 5% a 4⁰C durante 4 – 18 horas ( extracción selectiva)
- Ribonucleasa al 0.01% a 37⁰C durante 1 hora
HISTOQUÍMICA
TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS QUE PERMITEN SEPARAR ADN DE OTRAS ESTRUCTURAS
SE UTILIZAN PARA VISUALIZAR EL NÚCLEO → REACCION DE FEULGEN
SE REALIZA EN 2 FASES CONSECUTIVAS :

1. HIDROLISIS ÁCIDA DEL ADN ( HCL) → Romper la estructura del ADN por el sitio de
unión de la pentosa a la base nitrogenada, para que reaparezca el grupo Carbonilo
( distancia 1 a 1.1nm)
2. DEMOSTRACION DE GRUPOS CARBONILO→ Reactivo de Schiff
Resultados: ADN → Rojo purpura

HISTOQUÍMICA
1. HIDROLISIS ÁCIDA DEL ADN ( HCL)
2. DEMOSTRACION DE GRUPOS CARBONILO→

Reactivo de Schiff
HISTOQUÍMICA

REACCION DE FEULGEN
Problemas Generales
1. Hidrólisis excesiva → HCl es muy fuerte si el tejido expuesto por tiempo
prolongado se disgrega el ADN e impide su detección. ( Tiempo varia según fijador)
Carnoy→ 8 min Formalina → 8min Zenker → 5min Fleming→ 16min
2. Envejecimiento del Reactivo de Schiff → En condiciones normales es incoloro , la

aparición de una tonalidad rosada (liberación de fucsina) → envejecimiento
HISTOQUÍMICA

REACCION DE FEULGEN
Controles
1. Hidrolisis prolongada puede producir falsos - negativos
2. Falsos Positivos → No se someten a Hidrólisis las preparaciones control
Importancia
Carácter estequiométrico → (Cada molécula fijada de reactivo Schiff se corresponde
con una porción constante y equivalente de molécula de ADN)
Permite conocer la cantidad de ADN:
Célula Fase 0 → Rojo débil Célula Fase de Replicación → Rojo intenso
HISTOQUÍMICA
REACCION DE FEULGEN
Resultados: ADN → Rojo purpura

HISTOQUÍMICA
MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS

PIGMENTO: Sustancias coloreadas que existen de forma natural , es decir tienen color
por si mismo.
• Se pueden realizar técnicas específicas para identificación de un determinado
pigmento en un preparado histológico.
TIPOS DE PIGMENTOS
• ARTEFACTUAL
• EXOGENOS
• ENDOGENOS
• Hemoglobinógenos
• No Hemoglobinógenos
HISTOQUÍMICA
TIPOS DE PIGMENTOS
• ARTEFACTUAL: Aparecen como consecuencia de la aplicación generalmente
incorrecta de determinadas técnicas histológicas y/o como efecto indeseable de las
mismas. (Sobrefijación).
• Pigmento formólico
• Depósitos de sales de mercurio
• Depósitos de Cromo
• Precipitados de plata
HISTOQUÍMICA
TIPOS DE PIGMENTOS
• EXOGENOS: Procedentes del medio ambiental , penetran al organismo y generan
una coloración particular de los tejidos, que puede acompañar o no a una patología
en los mismos.
• Pigmentación por humo de tabaco , polvo de carbon ( Pigmento Antracótico(
• Pigmentación por metales , sílice
• Pigmentación por ingesta de carotenos ( Coloración amarillenta de la piel)
• Agentes terapéuticos ( Sales de oro )
• Tatuajes
HISTOQUÍMICA
TIPOS DE PIGMENTOS
• PIGMENTOS ENDÓGENOS: Sustancias coloreadas presentes en los tejidos y
elaboradas por el propio organismo a partir del catabolismo, degradación o síntesis
de diferentes elementos.
HEMOGLOGINÓGENOS: Degradación y
NO HEMOGLOGINÓGENOS:
destrucción fisiológica o patológica de la
molécula de hemoglobina:
- Melanina
- Lipofucsina
- Hemoglobina
- Ceroide
- Hemosiderina
- Cobre
- Hemofucsina
- Hematoidina
- Bilirrubina
• Problema es que la mayoría tiñen de igual color (pardo) → excepto la hemoglobina

HISTOQUÍMICA
TIPOS DE PIGMENTOS
• PIGMENTOS HEMOGLOBINÓGENOS
HEMOGLOBINA : Es el que aparece con mayor frecuencia en tejidos normales
• Principalmente en el interior de los hematíes
• Soluble en Agua y se diluye fácilmente en Alcohol etílico
• Patológico →Depósitos amarillo-dorados ( cilindros tubulares del riñon)
HISTOQUÍMICA
1. Técnica histoquímica para determinación de hemoglobina ( Técnica de la bencidina)

- Conocida también como Reacción de pseudo-peroxidasa
- La Hb es capaz de liberar O2 a partir de agua oxigenada
- Primero oxida a la bencidina incolora → venzo-purina de color verde
- Sustituida por el método de la diaminobencidina
- Resultados → Núcleos : Azules Hemoglobina y Eritrocitos: Verde
HISTOQUÍMICA
2. Métodos HQ para la demostración del hierro y pigmentos que lo contienen.

- Deposito Tisular de Hierro:
a. Forma iónica o formando sales ferrosas / férricas
• Azul de Perls → Hierro férrico
• Azul de Turnbull → Hierro ferroso
• Tirman-Schmeltzer → ambos
b. Hierro ligado a proteínas (enmascarado):
- No se puede visualizar directamente → proceso de Desenmascaramiento → Fe iónico
- Ferritina / Transferrina
HISTOQUÍMICA
2. Métodos HQ para la demostración del hierro y pigmentos que lo contienen.

-HEMOSIDERINA:
• Pigmento proteico color amarillo dorado o pardusco
• Contiene hidróxido férrico (Fe***)→ Acúmulos o granulaciones en interior de
Macrófagos.
• Soluble en Ácidos incluso tras su fijación
• Insoluble en álcalis , alcohol y agua
• Puede colorearse x Azul de Perls
HISTOQUÍMICA
• TÉCNICA PARA DETECTAR IÓNES FÉRRICOS

Técnica del Azul de Perls (Prusia) → Técnica de mayor importancia para detectar hierro
Fundamento: Se basa en la propiedad del ferrocianuro potásico o prusiato amarillo para
transformarse en presencia de hierro férrico en ferrocianuro férrico o azul de Prusia por
acción del HCl.
1. Solución de Ferrocianuro potásico 10%

2. Acido Clorhídrico 2%
3. Solución Ferrocianuro potásico + HCl
Fe Férrico incluido hemosiderina→Azul

HISTOQUÍMICA
• TÉCNICA PARA DETECTAR HIERRO FERROSO
- Método del Azul de Turnbull → Escasa utilidad práctica

Fundamento: Reacción que ocurre al poner en contacto el *Ferricianuro potásico
K3[Fe+++(CN)6] y el Ácido Clorhídrico en presencia de Cloruro Ferroso existente en el
tejido formándose ferricianuro ferroso (azul de turnbull)
*Ferricianuro potásico, también conocido como Rojo de Prusia
- Método Tirmann-Smeltzer :
Convertir (Fe+++) por acción del sulfato de amonio en (Fe++) , Luego realizar la técnica de
Turnbull y colorear ambos iones.
Expresión → Azul oscuro
HISTOQUÍMICA
• Métodos para detectar hierro ligado a proteínas.
• Desenmascara hierro mediante el tratamiento de tejidos con ácido sulfúrico 4% en
etanol de 96% (30min a 2 horas).
• Hierro ligado a proteínas ( Ferritina y transferrina) pasa a Fe2+ o Fe3+ y luego se realiza
procedimiento normal para hierro.
HISTOQUÍMICA
TÉCNICA PARA DETECCION DE HEMATOIDINA Y BILIRRUBINA

• Hematoidina y bilirrubina son pigmentos difíciles de diferenciar pero fáciles de separar
de los demás pigmentos.
Hematoidina: Pigmento derivado de la descomposición de la Hb ( NO CONTIENE HIERRO)
Color amarillo parduzco
Bilirrubina: Producto de la desintegración de la hematoidina y Resultado final de la

degradación de la Hb.
Determinación Conjunta → Método de Gmelin

Determinación específica de Bilirrubina → Método de Hall
HISTOQUÍMICA
Determinación Conjunta → Método de Gmelin

• Hacer reaccionar Hematoidina o la bilirrubina con ácido nítrico para producir
otros pigmentos diferentes.
• Continúan secuencia normal degradativa de pigmentos Hb → Bilicianina y
biliverdina ( Color verde azulado característico) → Resultado final Rojo purpura
HISTOQUÍMICA
Determinación específica de Bilirrubina → Método de Hall

• Solución reactivo de Fouchet ( Ac. Tricloroacético 25%+Cloruro férrico 10%)
• Picrofucsina de Van Gieson
• Resultados:
Bilirrubina → Verde
Colágena → rojo
Músculo, células epiteliales y eritrocitos → Amarillo
HISTOQUÍMICA
TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS NO HEMOGLOBINOGENOS
Métodos para determinar Melanina
• Argentafinidad de Masson-Fontana:
• Técnica de decoloración de la melanina: ( “blanqueamiento de melanina)
• Agentes oxidantes fuertes que decoloran la melanina
• Permanganato potásico, ácido perfórmico y agua oxigenada
• Resultados la decoloración del pigmento melánico
• Métodos histoenzimáticos que determinan DOPA-oxidasa: Determinación de
melanosomas o granulaciones citoplasmáticas de células que producen melanina.
• Métodos que emplean Fluorescencia: Células con granulaciones citoplasmáticas que
contienen aminoácidos ( Fenilalanina, Triptófano) → autofluorescencia tras su
tratamiento previo con paraformaldehído.
• Células argentafines, melanocitos, cromafines → Fluorescencia amarilla
HISTOQUÍMICA
Técnicas para determinar lipofucsina y pigmento ceroide
Lipofucsina → Pigmento que sirve como marcador de desgaste (pardo-amarillo)
que aparece en Células envejecidas del SNP, músculo , hígado, testículo y
glándulas suprarrenales.
3 métodos de coloración carácter no específico
1. Técnica de lípidos ( sudan negro y azul de Nilo)

2. Técnica del PAS ( lipofucsina es PAS+ por contener restos de hidratos carbono)
3. Técnica de Schmorl→ Lipofucsina, melanina, pigmento biliar, argentafines y
cromafines.
HISTOQUÍMICA

Técnicas para determinar lipofucsina y pigmento ceroide
Pigmento Ceroide → Es una Lipofucsina en fase inicial
- PAS , Sudan negro y azul de Nilo negativos
- Autofluorescencia amarilla espontanea que se tiñe con Ziehl-Neelsen

Tecnicas

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PROCESAMIENTO TISULAR

TECNICAS ESPECIALES (HISTOQUIMICA)

Dr. Mauricio Valbuena

El objetivo de la histoquímica → poner de manifiesto una molécula o familia de

Vamos a dividir las técnicas histoquímicas en dos grupos:

*Los hidratos de carbono o glúcidos son polialcoholes oxidados

-Oligosacáridos ( 2-10 moléculas) → SACAROSA

-Polisacáridos (>10 moléculas) → SIMPLES : GLUCOGENO , ALMIDÓN

HERETEROSIDOS → Glucolípidos , glucoproteínas

- Oxidación producida sobre los Polisacáridos, que provocan aparición de

- Dependiendo de la calidad de la oxidación :

- Dependiendo de la calidad de la OXIDACIÓN:

- Reacción del PAS ( Ácido Peryodico-Schiff) :

- Reacción de Bauer ( Ácido crómico-Schiff)

- Reacción de Casella ( Permanganato-Schiff)

Fijación: Formalina al 4 % o Líquido de Carnoy o Bouin

- Oxidación producida sobre los

1. Técnica de bloqueo para aldehídos en general

2. Técnica de bloqueo mediante acetilación para grupos 1,2 glicol.

El 2º problema en la técnica del PAS : tratar de diferenciar si los grupos aldehídos

Esta distinción pude realizarse mediante acetilación reversible y saponificación.

La acetilación es totalmente reversible tras saponificación para los grupos alcohólicos

Totalmente irreversible para los grupos hidroxiamino Secundarios

- MPS NEUTROS: ( Galactosa + Acetil-glucosamina)+ Proteína → PAS +

- MPS ÁCIDOS: Predomina el ácido urónico y pueden contener restos de

1. Mucopolisacáridos ácidos no sulfatados (Carboximucopolisacáridos)

2. Mucopolisacáridos ácidos sulfatados (Sulfomucopolisacáridos

Las técnicas para determinar mucopolisacáridos ácidos

Azul alcián a pH 0,5 :

• Tratar con la solución deseada de azul alcián durante 30 min.

• Si se usó la solución a pH 2,5, lavar con agua (d)

• Contrastar si se desea con rojo nuclear.

• Deshidratar, aclarar y montar.

• Azul alcián a pH 2,5: mucopolisacáridos ácidos

• Azul alcián a pH 1 sólo se tiñen de azul los mucopolisacáridos ácidos

• Azul alcián a pH 0,5 sólo se tiñen de azul los mucopolisacáridos ácidos

Factores de la Técnica Histológica que influyen sobre la metacromasia:

1. Vacunación de pH: Realizar la coloración a pH de 3.5 ( valor al que la mayoría de los

Las proteínas→ (griego: πρωτεῖος [proteios], ‘prominente, de primera calidad’)​​

• Forman parte de la estructura básica de los tejidos

Un aminoácido una molécula orgánica con un grupo amino (-NH2) y un grupo

Las proteínas→ (griego: πρωτεῖος [proteios], ‘prominente, de primera

2 aminoácidos se combinan en una reacción de condensación entre el

- REACCIONES DE GRUPO → NO CARACTERIZAN LA MOLÉCULA PROTEÍCA COMPLETA SINO UN

Cada nucleótido es un ensamblado de tres

• PIRIMIDÍNICAS: Timina (T), la Citosina (C)

2. Pentosa (azúcar de cinco átomos de carbono)

- Puede ser RIBOSA (RNA) o DESOXIRIBOSA (DNA).

- La diferencia es que el ARN sí posee un grupo OH en el segundo carbono.

Cada nucleótido es un ensamblado de tres componentes:

3. Ácido fosfórico: de fórmula H3PO4.

ARN → Qué función tiene?

• ARNm o ARN mensajero: Transmite la información codificante del ADN sirviendo de

• Replicación: La capacidad de hacer copias de sí mismo permite que la información

ADN → DOBLE CADENA ENLAZADA POR PUENTES DE HIDRÓGENO

la otra base debe presentar un grupo "aceptor" de hidrógenos con un átomo

MÉTODOS PARA LA DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS

• En condiciones normales la molécula ADN se autorreplica y contiene la carga

• ARN es responsable de la transmisión de la información nuclear al citoplasma.

• Los ácidos nucleicos + Proteínas básicas → nucleoproteínas

La hidrolisis ácida → Separa el componente proteico y permite demostrar los ácidos

PROCEDIMIENTOS PARA EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS

TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS QUE PERMITEN SEPARAR ADN DE OTRAS ESTRUCTURAS

SE UTILIZAN PARA VISUALIZAR EL NÚCLEO → REACCION DE FEULGEN

Las proteínas→ (griego: πρωτεῖος [proteios], ‘prominente, de primera calidad’)