Cromatografía
Giudice, Agustina Daniela
agustina.d.giudice@gmail.com
Laboratorio de Química Instrumental - Módulo Analitico, DQIAQF - INQUIMAE, Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires
Resumen
Las técnicas separativas lo que nos ofrecen son un paso de selectividad. Lo que nos ofrece, es la separación de entidades
químicas, generalmente moléculas, pero tambien pueden ser iones o macromoléculas. Las técnicas separativas son varias
como por ejemplo la destilación. La técnica que mas se utiliza en analítica son las cromatografías.
1. Cromatografía
La primer cromatografía se hacia sobre una columna de
tiza molida y se utilizo para separar los distintos componen-
tes de la clorofila. Después hubieron cromatografías sobre
columnas de cualquier cosa. Hoy en día la que mas se utili-
zan son las de silicas y un poco mas abajo las de aluminas,
celulosa, sobre papel en algunos casos y la cromatografía
gas-liquido.
1.1 Bases de la cromatografía
La cromatografía se basa en una fase estacionaria y una
fase móvil. La fase estacionaria es generalmente un solido,
pero no siempre, puede ser un liquido depositado en la
superficie de un solido. La fase móvil puede ser un liquido
o un gas, debe ser una fase fluida que pase de alguna
forma suavemente por la fase estacionaria. Lo que sucede
constantemente se forman equilibrios de la sustancia que
quiero analizar de mi analito entre la fase móvil y mi analito.
Lo que sucede, como mi fase móvil se mueve, poco a poco,
la fase móvil se lleva parte de lo que esta en equilibrio, en
función de la afinidad de la fase móvil con el analito y en
función a esa afinidad de la fase estacionaria con el analito,
van a ser los tiempo de retención. Los analitos que tengan
gran afinidad con la fase móvil y nunca vayan a pasar en
la fase estacionaria van a pasar muy rápido, a la misma
velocidad que pasa la fase móvil. Los analitos que estén
todo el tiempo, porque el equilibrio esta desplazado hacia la
unión con la fase estacionaria se van a quedar pegadas y no
van a salir nunca. En el medio hay un montón de compuestos
que van a salir en distintos tiempos de retención.
Vamos a definir algunos conceptos de cromatografía:
Tiempo de retención: Es el tiempo que tarda un analito
en atravesar la columna. Conviene tomarlo en relación
al tiempo de la fase móvil.
Tiempo de retención prima: esta restado el tiempo
muerto (Tr0 = Tr − Tm ). Una sustancia que se queda
pegado a la fase estacionaria tiene un tiempo de reten-
ción infinito, nunca se va de la columna y la arruine.
Algunos dicen que se puede seguir utilizando porque
total el compuesto no va a salir nunca, sin embargo,
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no es tan así porque ese compuesto puede reaccionar
con los analitos que le pase a través de ella, arruinando
las corridas cromatografías posteriores. Por ejemplo:
Complejos metálicos, se suelen separar por columna
y como son cargados, se suelen quedar pegados en la
sílica. Esos complejos metálicos probablemente hagan
redox con las cosas que le pasan cerca, porque los me-
tales tienen muchos estados de oxidación accesibles y
te van arruinando las cosas que te pasan por dentro
de la columna.
Variable κ: es el tiempo de retención dividido el tiempo
muerto. Si κ es mucho menor que uno lo que voy a
tener que no va a haber separación. Si κ es mayor que
20 puede ser que tenga una separación razonable, pero
voy a tener que todas mis cromatografías van a ser
larguísimas en tiempo y en costo de fase móvil, que
suelen ser solventes caros, porque suelen ser bastante
puros, sin partículas en suspensión, no estar húmedo,
... En la práctica se busca valores de κ entre 1-5, donde
se considera que hay buena separación.
Tiempo muerto: Tiempo que tarda un compuesto que
no interactúa con la columna de recorrerla.
Selectividad: Es la diferencia entre dos valores de κ,
que tiene que ver directamente con la constante de
equilibrio que hay entre la fase móvil y fase estacionaria
de una sustancia. Entonces si tengo una sustancia que
tiene mucha afinidad con la fase móvil y otra que tiene
menos, la relación entre lo que va a quedar dentro de
la columna de esas sustancias lo da este valor α que
es la selectividad. Si una tiene una constante 10 veces
más grande que la otra, sin duda se trata de una mala
cromatografía porque si una tuviera una selectividad
de 1 (límite inferior) y otra 10, lo cual se va de 5.
Entonces la relación de α no se va a ir de 5. Esto
no significa que no voy a poder separar bien, porque
selectividad no tiene nada que ver con si voy a poder
separar o no. Esta idea la da la resolución.
Resolución: Da idea de si dos compuestos se separan. Se
relaciona con la selectividad pero se relaciona con otro
parámetro: el ancho de los picos. Si yo tengo dos picos
muy filosos en una cromatografía, bien bien marcados y
su selectividad es pequeña, los separa muy bien, porque
 Análisis Instrumental - Módulo Analítico
los picos son finos. La conjunción de picos finitos con
la distancia de los picos es lo que me da la resolución.
Depende de muchos parámetros físico-químicos. Se
calcula haciendo una extrapolación de las gaussianas,
mido el ancho de la base, w, y con los tiempos de
2(t −tr,b )
retención (R = wr,a b +wa
). También se puede sacar el
sigma, o sea ayustar toda una gaussiana, y las anchuras
esas valen 4 sigmas en la base. Es una construcción
geométrica. Si la resolución es alta, me va a dar bien.
Resoluciones bajas dan mal. Una resolución de 1 es
lo mínimo, pero en la base los picos no van a estar
separado. Ojo! Saber que una sustancia está presente
en una muestra, no es lo mismo que cuantificar. Si
quiero cuantificar tengo que tener un pico que haya ido
completamente antes que me salga otro. Por supuesto
esto es el mejor de los casos, cuando los picos son
gaussianas y del mismo tamaño.Si uno de los picos no
es gaussianos, por ejemplo, si tiene una cola, se puede
llegar a comer el próximo pico, entonces uno tiene
que ver muy bien la forma del pico, porque si hago la
resolución de un pico que tiene una cola y la cola sale de
abajo, voy a tener un resultado erróneo. Los picos con
cola aparecen cuando la columna está vieja o no la elegí
bien y hay interacciones muy fuerte con compuestos en
la columna, o compuesto que quedaron en la columna
o interacciones más complicadas como cambios de pH
en la columna y compuestos que cambien su afinidad
según el pH, como aminas, ácidos carboxilicos.
Los picos de cromatografía no son finos y perfectos, son
anchos. Por qué? Primero uno no siembra todos las sustan-
cias juntas, eso ya ensancha los picos. Pero supongamos que
este no es el principal motivo. Lo que pasa es que se tratan
de equilibrios que es aleatorio y el tiempo de retención son
distintos. Uno tiende a pensar que los picos son anchos
porque las moléculas siempre están en esa fase liquida y
se mueven para los costados. Y uno de los costados que se
mueven es para arriba y abajo.Y entonces se ensancha los
picos por más que no pase nada. El equilibrio es estadísti-
co. El hecho que exista equilibrios ensancha las bandas y
eso tiene una implicación importante porque sin equilibrio
no hay separación, entonces las bandas siempre se van a
ensanchar, sino no hay separación.
2. Métodos para mejorar la croma-
tografía
Uno busca que la separación siempre sea mayor al ensan-
chamiento y todas las mejoras se basan en este hecho.
La forma más fácil de ver esto es pensando la separación
como una destilación. En una destilación yo tengo una
fase liquida y una fase vapor. Paso el liquido a fase vapor
y el vapor se va por otro costado,esto es una destilación
simples. Ahora si yo agarro este vapor y yo lo condenso y lo
destilo y repito el proceso varias veces a una temperatura
levemente superior tengo una destilación fraccionaria. En
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la practica le ponemos un tubo lleno de bolitas arriba del
balón y lo que sucede son un montón de equilibrios liquido
vapor, donde esas bolitas cada vez están más frío hacia
arriba y condenso más rápido y en algún momento separo.
Una columna es lo mismo básicamente. Por analogía por la
destilación, donde se habla de platos teóricos, de estadios
donde había un equilibrio, se habla de platos teóricos en
la columna. Entonces si tengo muchos platos teóricos en la
columna, yo voy a tener una gran resolución, porque tengo
la posibilidad de hacer muchos equilibrios que me ensancha
la base pero por otro lado me hace mucho más lento el
proceso. El ancho de un pico, cuando aumenta el numero
de platos teóricos, se incrementa como raíz de n, donde
n es el número de platos teóricos. Aumentar el numero
de platos teóricos, aumentar el numero de equilibrios es
el paso crucial. Entonces todo lo que tiene que ver con la
performance que voy a separar se va a contar en platos
teóricos. Un ejemplo: Supongamos que en una columna el
ancho de pico es w1 = 4T √ r1 , donde N es el numero total
N
de platos teóricos y Tr1 el tiempo de retención. Ahora si
aumentamos el largo de la columna 4 veces, tenemos que
Tr2 = 4Tr1 y 4N, por lo tanto w2 = 4X4T √ r1 . Entonces vemos
2 N
que w2 = 2w1 .
Entonces vamos a hablar de la altura equivalente del
plato teórico. la altura equivalente del plato teórico es el
numero de platos teóricos que sacamos directamente de
resolución o de los valores de Tr y W. Esta es la forma de
obtener la mejor estimación de la cantidad de platos teóricos
que voy a tener. (AEPT=L/N, donde L es la longitud de
la columna y N el numero de platos teóricos; N=t2r /σ 2 =
5,55t2r /w1/2
2
= 16t2r /2 ).
3. HPLC (High performance li-
quid chromatography)
3.1 Columna
Fase reversa: Utilizo partículas recubiertas de una capa
no polar (la silica se utiliza solamente como soporte).
Si al recubrimiento no polar se la rasca a la silica por
algún motivo mecánico (presión que hace mover a las
partículas dentro de la columna) o químico (se le puso
un tratamiento que fue muy agresivo a la columna), la
columna se arruino dejando de comportarse como fase
reversa). No hay partículas de fase reversa que sean
solo fase reversa, o sea no polar que sea como la silica
que es un pedacito de materia adentro y que si la silica
se rompe un poco deja de servir.
La fase reversa es mas delicada que la fase directa
porque la fase móvil no es la partícula de silica, solo
una capa finita en la superficie. La naturaleza de lo
que uno generalmente analiza en HPLC (compuestos
solubles en agua y por lo tanto compuestos polares),
la columna C-18 de fase reversa donde las partículas
de silica están recubiertas de un alcano de 18C son
las mas usadas de todas (mucho mas usadas que la
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fase directa y que otras de fase reversa). Hay columnas

que poseen elementos quirales que permiten separar
compuestos como el D-Glutamato y el L-Glutamato.
En la columna de fase reversa, la cadena de alcano fija
es bastante debil y si se utiliza un pH alto revienta.
Por lo que esta prohibido usar columna de fase reversa
con soluciones de pH alcalino.
Cuantos mas C tenga el recubrimientos mejor poder
separador tendrá debido a que disminuye la probabili-
dad de que el analito se encuentre con la silica y vea
solamente la cadena de C no polar siendo retenido
durante mas tiempo. El solvente no mojar a la silica,
si la empieza a mojar se arruina. Se pueden utilizar el
solvente polar puro o mezcla de estos, cuanto menos
polar sea el solvente mas fuerza de solvente tendra por-
que es reverso. La fuerza eluotropica es una magnitud
arbitraria de cuanto se van a llevar de los compuestos
que uno quiere analizar en la cromatografia de fase
reversa
Si se tiene mas de 1 bomba en HPLC se puede hacer
un gradiente de solvente, donde cada bomba tira un
solvente puro pero se van a ir mezclando en distinta
proporcion permitiendo ir separando algunos compo-
nentes primeros (los mas polares) y luego los menos
polares despues.

4. Referencias
[1] Química Física I, Laboratorio B, Primer Cuatrimestre
2019, FCEyN, UBA. Guía de trabajos prácticos.