Dissertação - Versão Entregue A Banca

1
Universidade de São Paulo

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto 2016
EFEITO DO CAMPO ELÉTRICO PULSADO E DO LASER DE

BAIXA INTENSIDADE NA VIABILIDADE DO RETALHO
MIOCUTÂNEO TRANSVERSO DO MÚSCULO RETO DO
ABDOME EM RATOS DIABÉTICOS
Gabriella de Paula
Marcondes Ferreira Leite
Dissertação
2
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
GABRIELLA DE PAULA MARCONDES FERREIRA LEITE
EFEITO DO CAMPO ELÉTRICO PULSADO E DO LASER DE BAIXA

INTENSIDADE NA VIABILIDADE DO RETALHO MIOCUTÂNEO
TRANSVERSO DO MÚSCULO RETO DO ABDOME EM RATOS
DIABÉTICOS
Ribeirão Preto
2016
3
GABRIELLA DE PAULA MARCONDES FERREIRA LEITE
Efeito do campo elétrico pulsado e do laser de baixa

intensidade na viabilidade do retalho miocutâneo
transverso do músculo reto do abdome em ratos diabéticos
Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Reabilitação e
Desempenho Funcional – FMRP/USP,
pelo Departamento de Biomecânica,
Medicina e Reabilitação do Aparelho
Locomotor para obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
Área de concentração: Fisioterapia
Orientadora: Profa. Dra. Elaine C. O.

Guirro
4
Ribeirão Preto
2016
5
MESTRADO
FMRP – USP
Efeito do campo elétrico pulsado e do laser de baixa
LEITE, intensidade na viabilidade do retalho miocutâneo
2016
G.P.M.F. transverso do músculo reto do abdome em ratos diabéticos
6
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL

DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU
ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A
FONTE.
Catalogação da Publicação
Serviço de Documentação da Faculdade de Medicina
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
Leite, Gabriella de Paula Marcondes Ferreira

Efeito do campo elétrico pulsado e do laser de baixa intensidade na
viabilidade do retalho miocutâneos transverso do músculo reto do abdome em
ratos diabéticos. Ribeirão Preto 2016.
82p.: il, 30 cm.
Orientadora: Guirro, Elaine Caldeira de Oliveira.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em

Reabilitação e Desempenho Funcional. Universidade de São Paulo,
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP.
1. Câncer de mama. 2 Equilíbrio. 3. Marcha.

7
Nome: Gabriella de Paula Marcondes Ferreira Leite
Título: Efeito do campo elétrico pulsado e do laser de baixa intensidade na viabilidade

do retalho miocutâneos transverso do músculo reto do abdome em ratos diabéticos
Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Reabilitação e
Desempenho Funcional – FMRP/USP para
obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Fisioterapia
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. ___________________________ Instituição: __________________________
Julgamento: ________________________ Assinatura: __________________________

8
9
Dedicatória
10
Dedico meu mestrado à minha mãe Maria Magali de Paula e a minha avó Ana Cândida
de Paula, duas mulheres fortes nas quais me espelho.

11
Agradecim
entos
Agradeço primeiramente à minha orientadora, que já admirava antes de
conhecer, e fez com que minha admiração aumentasse a cada dia., sem ela nada seria
possível. Ela me ensinou, me aconselhou e me fez crescer. Agradeço de coração,
muito obrigada professora Dra. Elaine Caldeira de Oliveira Guirro.
A minha mãe Maria Magali de Paula que sempre me estimulou a buscar novas
possibilidades e aos meus avós Ana Cândida e Sebastião de Paula Marcondes que
sempre se dedicaram a mim.
Ao meu namorado Ricardo Dias Vidigal, que esteve ao meu lado me apoiando
em todos os momentos. Agradeço toda dedicação e atenção durante esta jornada,
cuidando de mim com paciência e muito amor.
A minha amiga Laís Mara Siqueira, a quem tenho grande admiração e

carinho. Agradeço por sempre me ensinar tudo que eu precisava para conduzir este
estudo, por sempre me ouvir e ajudar, me salvando até mesmo à distância! Agradeço
as minhas companheiras Ana Karina de Souza e Thamires Rodrigues de Souza por
toda ajuda no biotério, por toda paciência e acima de tudo, pela amizade.
Agradeço minhas queridas amigas Iara Fernandes Elias, Cintia Fonseca de

Souza e Amanda Alves Silva, que me acompanham desde Alfenas deixando minha
vida mais leve.
12
Às amigas Estela de Paula e Cristiane de Moura Lacerda pela imensa

contribuição pessoal, pela paciência, por toda dedicação, carinho e apoio em todos os
momentos.
Às amigas Suely e Silvana Cau, por estarem comigo durante toda a jornada,
sempre apoiando e me deixando mais forte para prosseguir.
Agradeço aos companheiros de laboratório (Vânia, Fernanda, Carla, Monique,

Adriana, Camila e Emilson) por tornar o LAIDEF leve e divertido. Também ao
professor Dr. Rinaldo Roberto de Jesus Guirro e aos pesquisadores do LARF por todo
conhecimento transmitido.
À Nathália Cristina de Souza Borges por toda parceria e amizade, e junto das
queridas Larissa Perossi, Ana Cláudia Ferreira e Monique Silva Rezende, me fazer
sentir menos saudade de Alfenas, alegrando o corredor da Pós-Graduação.
À técnica Rosangela Lopes por toda paciência e por me ajudar

confeccionando as lâminas, ao técnico Tenisson por me ensinar no manuseio de
programas e equipamentos, e também ao Rubens Salomão por cuidar do biotério.
Ao professor Dr. Carlos Alberto Silva, grande colaborador. Agradeço por todo
conhecimento transmitido, por toda paciência e por confiar no meu trabalho. Sem sua
ajuda, este trabalho não teria tanta qualidade. Ao colaborador professor Dr. Sérgio
Britto Garcia por toda parceria na realização e análise imunohistoquímica.
Aos funcionários da Universidade de São Paulo, especialmente ao Samuel

Filipini por me orientar com a parte burocrática do mestrado.
A equipe do REMA (Reabilitação de mastectomizadas) por me receber tão bem

e por todo conhecimento transmitido. Agradeço também a todas as pacientes que tive o
prazer em atender, possibilitando um grande aprendizado profissional e pessoal.
13
O futuro pertence àqueles que acreditam na beleza de seus sonhos.
(Eleanor Roosevelt)
I
RESUMO
Leite, GPMF. Efeito do laser de baixa intensidade e do campo elétrico pulsado na

viabilidade do retalho miocutâneo transverso do músculo reto do abdome em ratos
diabéticos. [Dissertação]. Ribeirão Preto: Universidade de São Paulo, Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, 2016. 82f.
Na cirurgia reconstrutora, uma importante preocupação é a conservação do

retalho miocutâneo transverso do músculo reto do abdome (TRAM). A necrose é a
principal complicação que pode levar ao insucesso do tratamento. Em indivíduos
diabéticos o metabolismo corporal e o processo de cicatrização tecidual estão
comprometidos, o que gera grande preocupação com as complicações pós-operatórias.
O objetivo deste estudo foi investigar o efeito do campo elétrico pulsado (CEP) e do
laser de baixa intensidade (LBI) na viabilidade do retalho TRAM em ratos diabéticos.
Para tanto, foram utilizados 50 ratos da linhagem Wistar, distribuídos aleatoriamente em
5 grupos homogêneos: Grupo 1 – controle; Grupo 2 – diabéticos sem tratamento; Grupo
3 – diabéticos estimulados com CEP; Grupo 4 – diabéticos irradiados com laser 660 nm,
fluência de 10 J/cm2; Grupo 5 - diabéticos irradiados com laser 660 nm, fluência de 140
J/cm2. A porcentagem de área de necrose foi avaliada por meio do software Image J ®. A
circulação periférica do retalho foi avaliada por meio de termografia infravermelha
FLIR T450 (FLIR® Systems – Oregon USA). Foram avaliadas também, a espessura da
epiderme (Hematoxilina-eosina), contagem de mastócitos (Azul de toluidina) e
leucócitos, além de imunohistoquímica para fator de crescimento do endotélio vascular
(anti-VEGF), de fibroblastos (anti-FGF) e vasos neoformados (anti-CD34). Para a
análise estatística foi aplicado os testes de Kruskal-Wallis seguido de Dunn, ANOVA
seguido de Tukey e correlação de Pearson. O processamento dos dados foi efetuado pelo
software SPSS (Chicago, IL, USA), versão 13.0, sendo fixado o nível crítico de 5%
(p<0,05). O CEP apresentou resultados significantes ao reduzir a área de necrose,
diminuir números de leucócitos, aumentar número de mastócitos, aumentar a espessura
da epiderme e aumentar vasos sanguíneos neoformados, quando foi comparado ao
grupo de animais diabéticos não tratados. O LBI com comprimento de onda 660 nm e
fluência 140 J/cm² apresentou melhores resultados que LBI 10 J/cm² relacionado a
redução da área de necrose e número de leucócitos, aumento do número de mastócitos,
aumento da espessura da epiderme, aumento do número de fator de crescimento do
endotélio vascular, aumento do número de fator de crescimento de fibroblastos e
aumento de vasos sanguíneos neoformados em animais diabéticos.
Palavras-chave: Terapia com laser de baixa intensidade; Fisioterapia; Diabetes Mellitus.

II
ABSTRACT
LEITE, GPMF. Low-intensity electric field and laser pulsed effect on the viability of the
flap transverse myocutaneous rectus abdominis in diabetic rats. [Dissertation]. Ribeirao
Preto: University of São Paulo, School of Medicine of Ribeirão Preto, 2016. 82f.
In reconstructive surgery, a major concern is the preservation of the flap

transverse myocutaneous rectus abdominis (TRAM). Necrosis is a major complication
that can lead to failure of the treatment. In diabetic patients the body metabolism and
tissue healing process is compromised, which causes great concern for postoperative
complications. The aim of this study was to investigate the effect of pulsed electric field
(CEP) and low intensity laser therapy (LLLT) on the viability of the TRAM flap in
diabetic rats. Therefore, we used 50 Wistar rats were randomly divided into 5
homogeneous groups: Group 1 - control; Group 2 - untreated diabetics; Group 3 -
Diabetics stimulated with CEP; Group 4 - diabetic irradiated with 660 nm laser, fluence
10 J / cm2; Group 5 - diabetic irradiated with 660 nm fluence of 140 J / cm2. The
percentage of necrosis area was evaluated using the software Image J ®. The retail
peripheral circulation was evaluated by means of infrared thermography FLIR T450
(FLIR® Systems - Oregon USA). They also evaluated the thickness of the epidermis
(hematoxylin-eosin), mast cell count (Toluidine Blue) and leukocytes, and
immunohistochemistry growth factor vascular endothelial (anti-VEGF), fibroblast (anti-
FGF) and vases newly formed (anti-CD34) The statistical analysis was applied to the
test: Kruskal-Wallis followed by Dunn, ANOVA followed by Tukey and Pearson
correlation. Data processing was performed using SPSS software (Chicago, IL, USA),
version 13.0, and set the critical level of 5% (p <0.05). The CEP significant results
submitted to reduce the area of necrosis, decrease leukocyte numbers, increased number
of mast cells, increase epidermal thickness and increase of newly formed blood vessels,
when it was compared to the untreated diabetic group of animals. The LBI with a
wavelength of 660 nm and creep 140 J / cm² showed better results than LBI 10 J / cm²
related to reduction of necrosis area and the number of leukocytes, increased number of
mast cells, increased epidermal thickness, increasing the number growth factor of
vascular endothelium, increased number of fibroblast growth factor and increase of
newly formed blood vessels in diabetic animals.
Keywords: Low-level laser therapy; Physiotherapy; Diabetes Mellitus.

III
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fluxograma demonstrando o delineamento do estudo.............................25
Figura 2: Imagem demonstrando a indução ao diabetes experimental por via endovenosa

na veia peniana. Fonte: Arquivo Pessoal.........................................................................26
Figura 3: Procedimento Cirúrgico: A – Demarcação do Retalho; B – Incisão da pele em

todo o perímetro do retalho; C – Dissecção do lado esquerdo até a linha alba; D –
Dissecção do lado direito até a margem lateral do músculo reto do abdome direito.
Arquivo Pessoal...............................................................................................................27
Figura 4: Procedimento Cirúrgico: A – Incisão na Linha Alba; B – Incisão na margem

lateral do músculo reto do abdome direito; C – Liberação completa do retalho; D –
Sutura contínua na parede abdominal. Fonte: Arquivo Pessoal......................................28
Figura 5: A – Reposicionamento do retalho no leito, com sutura simples nos quatro

vértices; B – Fechamento da Pele. Fonte: Arquivo Pessoal............................................29
Figura 6: Retalho TRAM dividido em quatro zonas. Fonte: Arquivo Pessoal................30
Figura 7: Aplicação de laser de baixa intensidade (LBI) em local delimitado de forma

padronizada por molde de plástico. Fonte: Arquivo Pessoal...........................................31
Figura 8: Aplicação do campo elétrico pulsado. Fonte: Arquivo pessoal.......................32
Figura 9: Desenho do retalho demarcado no software Image J ®. Fonte: Arquivo Pessoal.

.........................................................................................................................................33
Figura 10: Equipamento usado para padronizar a distância das imagens por termografia.
Fonte: Arquivo Pessoal....................................................................................................34
Figura 11: Marcadores de isopor nos quatro vértices do retalho. Fonte: Arquivo Pessoal.
.........................................................................................................................................34
Figura 12: Retalho demarcado no software Research IR FLIR ®. Fonte: Arquivo

Pessoal.............................................................................................................................35
Figura 13: – Imagem microscópica de um dos quadrantes da câmara de Neubauer, onde

os leucócitos foram contados. Fonte: Arquivo Pessoal...................................................36
Figura 14: Imagem ilustrativa da medida da espessura da epiderme em µm dos retalhos

com a coloração Hematoxilina e Eosina (HE). (Fonte: Arquivo pessoal).......................37
IV
Figura 15: Imagem ilustrativa da contagem de mastócitos nos retalhos por meio da
coloração Azul de Toluidina. (Fonte: Arquivo pessoal)..................................................38
Figura 16: Fotomicrografias da imunomarcação de anticorpo primário para Anti-

VEGFA. Representação dos grupos: A – Grupo 1; B – Grupo 2; C – Grupo 3; D –
Grupo 4; E – Grupo 5. (Fonte: arquivo pessoal).............................................................40
Figura 17: Fotomicrografias da imunomarcação de anticorpo primário para Anti-FGF

basic. Representação dos grupos: A – Grupo 1; B – Grupo 2; C – Grupo 3; D – Grupo 4;
E – Grupo 5. (Fonte: arquivo pessoal).............................................................................41
Figura 18: Fotomicrografias da imunomarcação de anticorpo primário para Anti-CD34.

Representação dos grupos: A – Grupo 1; B – Grupo 2; C – Grupo 3; D – Grupo 4; E –
Grupo 5. (Fonte: arquivo pessoal)...................................................................................42
Figura 19: Gráfico em linha ilustrando o valor médio (pontos) de acordo com os dias
avaliados. Grupo 1 – Controle; Grupo 2 – Diabetes; Grupo 3 – Diabetes + CEP; Grupo
4 – Diabetes + LBI 10 J/cm2; Grupo 5 – Diabetes + LBI 10 J/cm2. Não foi observado
diferença significativa entre os grupos............................................................................47
V
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores das porcentagens média e desvios-padrão da área de necrose dos

retalhos, nos grupos estudados (%)................................................................................. 46
Tabela 2 - Valores das temperaturas médias e desvios-padrão dos retalhos nos grupos
estudados (ºC) de acordo com os dias avaliados............................................................. 47
Tabela 3 - Valores das porcentagens média e desvios-padrão da leucometria nos grupos

estudados (%).................................................................................................................. 49
Tabela 4 - Valores médios e desvios-padrão da quantidade de mastócitos dos retalhos,

nos grupos estudados.......................................................................................................49
Tabela 5 - Valores médios e desvios-padrão da espessura da epiderme dos retalhos, nos

grupos estudados (µm).................................................................................................... 50
Tabela 6 - Valores médios e desvios-padrão da quantidade de fator de crescimento do

endotélio vascular (VEGF) dos retalhos, nos grupos estudados..................................... 51
Tabela 7 - Valores médios e desvios-padrão da quantidade de fator de crescimento de

fibroblastos (FGF) dos retalhos, nos grupos estudados...................................................51
Tabela 8 - Valores médios e desvios-padrão da quantidade de CD-34 dos retalhos, nos

grupos estudados............................................................................................................. 52
Tabela 9 - Correlação entre porcentagem de área de necrose e temperatura, espessura da

epiderme, mastócitos, fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator de
crescimento de fibroblastos (FGF), anticorpo anti-CD34 e leucócitos........................... 53
VI
LISTA DE ABREVIAÇÕES
β Beta
º Grau
ºC Grau Celsius
% Por cento
µm Micrômetro
ANOVA Análise de Variância
CEP Campo elétrico pulsado
CETEA Comissão de Ética em Experimentação Animal
CD34 Cluster de diferenciação 34
cm Centímetros
DP Desvio Padrão
E Energia
FGF Fator de crescimento de fibroblastos
FMRP Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
HE Hematoxilina e Eosina
J Joules
J/cm² Joules por centímetro quadrado
LARF Laboratório de Recursos Fisioterapêuticos
LBI Laser de baixa intensidade
Leucócitos/mm³ Leucócitos por milímetro cúbico
M Mol
mg/dL Miligramas por decilitro
mg/kg Miligrama por quilo
MHz Mega Hertz
mL/100g Mililitros por cem gramas
mm³ Milímetro cúbico
mW Miliwatt
NIH National Institutes of Health
VII
nm
pH Nanômetro
Q Potencial hidrogeniônico
r Quadrante
S Coeficiente de Pearson
TRAM Segundo
Miocutâneo transverso do músculo reto do
Abdome
USA
United States of America
VEGF
Fator de crescimento endotelial vascular
W
Watts
W/cm²
Watts por centímetro quadrado
SUMÁRIO
RESUMO...........................................................................................................................I
ABSTRACT......................................................................................................................II
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................III
LISTA DE TABELAS......................................................................................................V
LISTA DE ABREVIAÇÕES...........................................................................................VI
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................19
2. OBJETIVOS............................................................................................................22
2.1 Primário.................................................................................................................22
2.2 Secundários.......................................................................................................22
3. MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................24
3.1 Amostra.............................................................................................................24
3.2 Delineamento Experimental.............................................................................24
3.3 Indução do Diabetes Experimental...................................................................25
3.4 Técnica Operatória............................................................................................27
3.5 Procedimento Terapêutico com laser de baixa intensidade..............................29
3.6 Procedimento Terapêutico com campo elétrico pulsado..................................31
3.7 Avaliação da Porcentagem da Área de Necrose (Image J®).............................32
3.8 Termografia Infravermelha...............................................................................33
3.9 Leucometria...........................................................................................................35
3.9 Técnica Histológica..........................................................................................36
3.10 Imunohistoquímica........................................................................................38
3.11 Método Estatístico.........................................................................................43
4. RESULTADOS........................................................................................................45
4.1 Valores percentuais da área de necrose.................................................................45
4.2 Valores da temperatura dos retalhos......................................................................45
4.3 Valores da leucometria...........................................................................................47
4.4 Valores da quantidade de mastócitos.....................................................................48
4.5 Valores da espessura da epiderme dos retalhos.....................................................49
4.6 Valores da quantidade de fator de crescimento do endotélio vascular..................50
4.7 Valores da quantidade de fator de crescimento de fibroblastos.............................50
4.8 Valores da quantidade de vasos sanguíneos neoformados.....................................51
4.9 Correlação de Pearson...........................................................................................52
5. DISCUSSÃO...........................................................................................................55
6. CONCLUSÃO.........................................................................................................66
REFERÊNCIAS..............................................................................................................68
Introdução
19
1. INTRODUÇÃO
O retalho miocutâneo transverso do músculo reto do abdome (TRAM) é

comumente utilizado em cirurgias de reconstrução mamária. Dentre as complicações do
procedimento, a mais frequente é a necrose tecidual, que pode levar ao insucesso da
cirurgia (Ferreira, 2003; Sahin et al., 2014; Krishnan et al., 2015, Chen et al., 2015).
O diabetes mellitus é um problema de saúde pública mundial e o número de
indivíduos acometidos é crescente. Evidencias apontam que esta disfunção metabólica
gera uma redução ou atraso da capacidade de cicatrização do tecido (Peters et al., 2001;
Ullah et al., 2015). Em indivíduos diabéticos, o metabolismo corporal e o processo de
reparação tecidual estão prejudicados, aumentando a preocupação com as frequentes
complicações pós-operatórias (Moraes et al., 2000).
Em indivíduos diabéticos a síntese proteica é reduzida, enquanto o catabolismo é
aumentado, com mudanças nos tecidos em crescente processo de regeneração e
reparação. Este processo faz com que aumente a taxa de complicações no pós-
operatório, e a incidência de necrose na cirurgia de obtenção do retalho TRAM
(Carvalho et al. 2005; Chen et al., 2007; Nelson et al., 2010; Momoh et al., 2012;
Baldea et al., 2015).
Diversos recursos são avaliados com a intenção de incrementar a viabilidade de
retalhos isquêmicos, como a acupuntura e eletroacupuntura (Niina et al., 1997),
correntes polarizadas (Im, Lee, Hoopes, 1990) e não polarizadas (Kjartansson;
Lundeberg, 1990; Niina et al., 1997; Liebano; Ferreira; Sabino Neto, 2002), laser de
baixa intensidade (Pinfildi et al., 2005; Prado et al., 2006; Pinfildi et al., 2009; Prado et
al., 2009, Costa et al. 2010), e campo eletromagnético pulsado (Rohde et al., 2015).
O laser de baixa intensidade (LBI) tem sido utilizado em retalhos
musculocutâneos (TRAM), com o objetivo incrementar a perfusão sanguínea,
angiogênese e liberação de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), com
consequente redução da área de necrose aumento da viabilidade do retalho (Baldan et
al., 2012; Pinfildi et al., 2013). Porém o efeito do LBI na viabilidade de retalhos
miocutâneos é controverso. As respostas divergentes estão relacionadas a diferentes
parâmetros físicos como comprimentos de onda e fluência. Não foi encontrado estudo
20
que compara os efeitos de diferentes fluências em animais com disfunção metabólica

como o diabetes, de grande incidência na população.
Terapias de estimulação elétrica têm sido usadas na cicatrização por interferir
nas propriedades elétricas dos tecidos, alteradas em tecidos lesados e em feridas
crônicas, influenciando o processo de cicatrização (Herberger et al. 2012; Marie et al.,
2012). Estas propriedades também podem ser modificadas em terapia com o campo
elétrico, que interfere na bioeletricidade endógena dos tecidos, bem como no potencial
de membrana, produzindo migração celular facilitando cicatrização de feridas (Dube et
al., 2005 e Zhao, 2009), porém a utilização deste recurso na viabilidade de retalhos
ainda não está fundamentada.
Diante do exposto, justifica-se a necessidade de investigar recursos terapêuticos
com intuito de minimizar os efeitos deletérios do diabetes na viabilidade de retalhos
miocutâneos transverso do músculo reto do abdome.
21
Objetivos
22
2. OBJETIVOS
2.1 Primário
Avaliar o laser de baixa intensidade (660 nm) com diferentes fluências e o campo
elétrico pulsado na viabilidade do retalho miocutâneo transverso do músculo reto do
abdome em ratos diabéticos.
2.2 Secundários
 Analisar a porcentagem de área de necrose dos retalhos;
 Analisar a temperatura dos retalhos no período pré-operatório, imediatamente

após a cirurgia, e no quarto dia após a cirurgia;
 Analisar o número de leucócitos;
 Analisar o número de mastócitos;
 Analisar a espessura da epiderme;
 Analisar o fator de crescimento de vasos sanguíneos, fibroblastos e vasos

sanguíneos neoformados por meio de imunohistoquímica.
23
24
Material e
Métodos
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostra
Foram utilizados 50 ratos machos (Rattus norvegicus: var. albinus, Rodentia,

Mammalia), adultos, com cerca de 3 meses de idade, pesando entre 280 gramas a
310 gramas, da linhagem Wistar, fornecidos pelo Biotério Central da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, São Paulo (FMRP-USP). Os procedimentos
experimentais realizaram-se no biotério do Programa de Pós-Graduação em
Reabilitação e Desempenho Funcional. Os animais foram mantidos em biotério,
com ciclo claro-escuro de 12 horas, alojados em gaiolas individuais, recebendo
ração comercial e água ad libitum.
O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal
(CETEA) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP/USP), sob protocolo
número 172/2014 (Anexo 1).
3.2 Delineamento Experimental
Os retalhos miocutâneos foram delineados com dimensões de 5 cm de

comprimento por 3 cm de largura (Ely et al. 2009).
Os ratos foram pesados e distribuídos, aleatoriamente, em 5 grupos de 10
animais:
 Grupo 1 – (controle) - submetido ao procedimento cirúrgico para confecção do
retalho TRAM.
 Grupo 2 – submetido a indução do diabetes por administração de aloxana, e ao
procedimento cirúrgico para a confecção do retalho TRAM.
25
 Grupo 3 – submetido a indução do diabetes por administração de aloxana, e

submetidos ao procedimento cirúrgico para a confecção do retalho TRAM, e à
estimulação com campo elétrico pulsado.
 Grupo 4 – submetido a indução do diabetes por administração de aloxana, ao
procedimento cirúrgico para a confecção do retalho TRAM, e à irradiação com
laser de baixa intensidade (660 nm), fluência de 10 J/cm 2, tempo de aplicação de
0,56 s, e energia total E = 0,16 J.
 Grupo 5 – submetido a indução do diabetes por administração de aloxana, ao
procedimento cirúrgico para a confecção do retalho TRAM, e submetido à
irradiação do laser de baixa intensidade (660 nm), fluência de 140 J/cm2, tempo
de aplicação de 13,44 s, e energia total E = 4,03 J.
O grupo 1 aponta a evolução natural do retalho TRAM, possibilitando

quantificar os efeitos deletérios do diabetes mellitus na cicatrização deste retalho.
Os grupos 3, 4 e 5 mostram como os recursos terapêuticos podem interferir na
cicatrização de animais diabéticos.
A aplicação do campo elétrico pulsado e do laser de baixa intensidade foi
efetuada imediatamente após o procedimento cirúrgico e nos dois dias subsequentes,
segundo critérios estabelecidos por Pinfildi et al. (2009).
26
Figura 1 - Fluxograma demonstrando o delineamento do estudo.

CEP: Campo elétrico pulsado.
LBI: Laser de baixa intensidade.
50 Ratos Wistar
Grupo 4 Grupo 5
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Diabetes + Diabetes +
Controle Diabetes Diabetes + CEP LBI 10 J/cm² LBI 140 J/cm²
3.3 Indução do Diabetes Experimental

27
O diabetes experimental foi induzido por meio da administração de solução

aquosa de aloxana a 2% (5,6-Dioxyuracil Monohydrate, Aloxan-Sigma ®, St. Louis.
USA), diluída em tampão citrato 0,01 M (Sodium Citrate, Dihydrate, Molecular
Biology Grade - Calbiochem®), pH 4,5. A solução foi injetada por via endovenosa, na
dose única de 42 mg/kg de peso corporal, utilizando a veia peniana (Figura 2).
Figura 2 - Imagem demonstrando a indução ao

diabetes experimental por via endovenosa na veia
peniana. Fonte: Arquivo Pessoal.
Antes do procedimento de indução do diabetes, os animais foram submetidos a

um jejum alimentar de 12 horas e água ad libitum, e então anestesiados com injeção
intraperitoneal de Cloridrato de Cetamina –Agener União® (0,1 mL/100g) e Cloridrato
de Xilazina Dopaser® (0,07 mL/100g). Decorridos 30 minutos da indução, os animais
foram alimentados normalmente.
A caracterização do diabetes induzido foi efetuada por meio de incisão com
bisturi na cauda do rato, sendo coletada uma amostra do sangue venoso do animal em
uma tira reagente 24 horas após o procedimento de indução de diabetes para a
determinação do nível de glicose. A glicemia foi avaliada por meio de glicosímetro
Accu-check active® (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Foram considerados
diabéticos os ratos que tiveram glicemia igual ou superior que 200 mg/dL (Lerco et al.,
2003; Carvalho et al., 2005).
28
3.4 Técnica Operatória
Para a realização do retalho miocutâneo transverso monopediculado unilateral

caudalmente do músculo reto do abdome (TRAM), os animais foram anestesiados com
injeção intraperitoneal de Cloridrato de Cetamina – Agener União® (0,1 mL/100g) e
Cloridrato de Xilazina Dopaser® (0,07 mL/100g).
Os animais foram imobilizados em prancha cirúrgica para realização da
depilação por tração manual dos pelos, sendo a antissepsia efetuada com álcool 70%, e a
área cirúrgica delimitada por campo esterilizado. O retalho foi demarcado nas medidas
padrão de 5 cm no sentido látero-lateral e 3 cm no sentido crânio-caudal, posicionado a
1 cm (no sentido caudal) do apêndice xifoide (Pinfildi, 2009).
A incisão da pele e tecido celular subcutâneo foi efetuada em todo o perímetro
do retalho. Em seguida, o retalho foi dissecado no lado contralateral (esquerdo) ao
pedículo, em sentido látero-medial até a linha mediana (linha Alba). O lado ipsilateral
(direito) ao pedículo do retalho foi dissecado até a margem lateral do músculo reto do
abdome direito (Figura 3).
Figura 3 - Procedimento Cirúrgico: A – Demarcação

do Retalho; B – Incisão da pele em todo o perímetro
29
do retalho; C – Dissecção do lado esquerdo até a linha

alba; D – Dissecção do lado direito até a margem
lateral do músculo reto do abdome direito. Arquivo
Pessoal.
O retalho foi liberado mediante incisão na linha alba e na margem lateral do

músculo reto do abdome direito, no sentido crânio-caudal e se completou com a incisão
da porção cranial (1 cm do processo xifoide).
Na incisão para a dissecção do músculo do seu leito, foi feito sutura contínua de
náilon 4-0. O retalho permaneceu pediculado somente no músculo reto do abdome
direito, com base na artéria epigástrica caudal direita, sendo em seguida efetuado o
reposicionamento do retalho junto ao leito do doador (Figura 4).
Figura 4 - Procedimento Cirúrgico: A – Incisão na Linha

Alba; B – Incisão na margem lateral do músculo reto do
abdome direito; C – Liberação completa do retalho; D –
Sutura contínua na parede abdominal. Fonte: Arquivo
Pessoal
Para reposicionar o retalho, foi efetuada sutura simples com náilon 4-0 nos
quatro vértices do retalho, seguida de sutura contínua em todo o perímetro do retalho,
até o total fechamento da pele (Figura 5).
30
Figura 5 - A – Reposicionamento do retalho no

leito, com sutura simples nos quatro vértices; B –
Fechamento da Pele. Fonte: Arquivo Pessoal.
Após a cirurgia para confecção do retalho TRAM, os animais receberam

dipirona (Biovet®) como analgésico, 1 gota/150 mL (Silveira, 2012).
3.5 Procedimento Terapêutico com laser de baixa intensidade
A irradiação com laser de baixa intensidade (LBI) foi efetuada com equipamento
Thera laser® (DMC Equipamentos Ltda., São Carlos, Brasil), sendo aplicado
comprimento de onda 660 nm, densidade de energia de 10 J/cm 2 e 140 J/cm2, densidade
de potência de 3,5 W/cm2, modo de emissão contínuo, potência de 30 mW, área de
secção transversal do feixe de 0,028 cm2.
Para avaliação da potência da irradiação do LBI foi utilizado um dosímetro
Laser Check (Coherent®, Santa Clara, CA, USA) modelo Field Max II TO com sensor
PM3 - 0.5 mW to 2 W broad band sensor (RoHS), pertencente ao Laboratório de
Recursos Fisioterapêuticos (LARF), da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP.
Após o período de um minuto do procedimento cirúrgico TRAM, os animais
permaneceram anestesiados e foram submetidos à irradiação com LBI de forma
randomizada por sorteio com um envelope lacrado.
O retalho TRAM foi dividido em quatro zonas, classificadas de acordo com sua
irrigação, onde a zona um é a referente à região sobre o músculo reto do abdome, a
31
segunda zona ipsilateral adjacente ao músculo reto do abdome, a zona três se localiza na
sobre o músculo reto do abdome contralateral.A quarta zona corresponde a porção do
retalho mais distante na região contralateral, conforme demonstrado na Figura 6.
Figura 6 - Retalho TRAM dividido em

quatro zonas. Fonte: Arquivo Pessoal.
Os grupos experimentais foram submetidos à técnica pontual com contato com o

LBI, onde a sonda aplicadora permaneceu em contato com a pele do animal durante o
tempo de aplicação, mantida a 90º perpendicular ao retalho, com apenas um ponto de
aplicação na Zona I do retalho (Kubota, 2002; Pinfildi et al., 2009).
Foi utilizado um molde plástico sobre o retalho com a demarcação do ponto a 1
cm de distância da margem caudal, 2 cm da margem cranial, 1,8 cm da lateral direita e
3,2 cm da lateral esquerda do retalho onde foi efetuada a radiação, para padronizar o
local de aplicação (Figura 7). Os animais foram submetidos à LBI imediatamente após a
cirurgia TRAM e nos dois próximos dias seguintes, totalizando três sessões.
32
Figura 7 - Aplicação de laser de baixa intensidade (LBI) em

local delimitado de forma padronizada por molde de plástico.
Fonte: Arquivo Pessoal.
3.6 Procedimento Terapêutico com campo elétrico pulsado
O equipamento de estimulação por CEP utilizado no presente estudo foi

desenvolvido e aferido pelo Departamento de Bioengenharia da Universidade de São
Paulo, São Carlos, SP, Brasil, com emissão de estimulação elétrica pulsada de baixa
intensidade com potência de saída 30 mW, tensão 40 V pico-a-pico, frequência 1.5 MHz
e ciclo de trabalho de 1:4. Os eletrodos consistem de duas placas metálicas (20X20 cm),
que foram posicionadas nas laterais da caixa, onde os ratos foram estimulados
individualmente, sem a necessidade de anestésicos (Figura 8).
33
Figura 8 - Aplicação do campo elétrico pulsado. Fonte:

Arquivo pessoal.
A estimulação com o CEP ocorreu imediatamente após a cirurgia, e nos dois dias
subsequentes, por um período de 60 minutos cada sessão.
3.7 Avaliação da Porcentagem da Área de Necrose (Image J®)
A porcentagem de área de necrose dos retalhos foi verificada no 4º dia após a

operação por meio do método computadorizado por meio do software Image J ®
(National Institutes of Health - NIH), Washington, USA, versão 1.48. As fotos usadas
nesta análise foram tiradas no quarto dia pós-operatório, antes da eutanásia dos animais.
O limite entre o tecido viável (pele macia, rósea, quente e com pelos) e o necrosado
(pele rígida, escurecida, fria e sem pelos) foi demarcado no software (Figura 9).
Para calcular a porcentagem de área de necrose do retalho foi utilizada a fórmula
abaixo:
% = Área total do retalho x 100
Área de necrose
34
Figura 9 - Desenho do retalho demarcado no software Image

J®. Fonte: Arquivo Pessoal.
3.8 Termografia Infravermelha
A avaliação da circulação sanguínea periférica por meio da temperatura dos

retalhos TRAM dos grupos experimentais, foi efetuada pelo equipamento marca FLIR ®
T450 (FLIR Systems, Wilsonville, OR, EUA).
®
As análises das imagens infravermelhas foram efetuadas em ambiente com

temperatura controlada a 23ºC, e aclimatação de 15 minutos.
As imagens infravermelhas foram efetuadas no período pré-operatório,
imediatamente após a cirurgia, e no quarto dia após a cirurgia. O equipamento foi fixado
a uma distância de 80 centímetros do animal, por meio de instrumento confeccionado
para padronização das imagens (Figura 10).
35
Figura 10 - Equipamento usado para padronizar a

distância das imagens por termografia. Fonte:
Arquivo Pessoal.
As imagens infravermelhas foram analisadas pelo software Research IR FLIR ®

(FLIR® Systems, Wilsonville, OR, EUA). Marcadores de isopor foram posicionados nos
quatro vértices do retalho para facilitar a identificação no software (Figura 11), visto
que o isopor possui baixa absorção de energia, e sendo assim, aparece em destaque na
imagem infravermelha, delimitando a área a ser analisada. Os retalhos foram
demarcados no software, que informava a temperatura média do retalho (Figura 12).
Figura 11 - Demarcação com isopor nos quatro

vértices do retalho. Fonte: Arquivo Pessoal.
36
Figura 12 - Retalho demarcado no software Research IR

FLIR®. Fonte: Arquivo Pessoal.
3.9 Leucometria
Para a contagem de leucócitos, foi retirada uma amostra de sangue da veia caudal do
animal, em seguida pipetou-se o sangue e foi usado como diluente o líquido de Turk
(solução de ácido acético 2%) na diluição de 1:20. A pipeta foi agitada suavemente por
dois minutos e em seguida a solução foi transferida para a câmara de Neubauer, onde
repousou por dois minutos para que houvesse a sedimentação dos glóbulos. Após dois
minutos, foi efetuada a contagem de leucócitos, usando aparelho de microscopia com o
aumento de 100x (Figura 13).
Para determinação da contagem global dos leucócitos, foi utilizada a fórmula,
segundo critérios estabelecidos por Silva e Hashimoto (2003): leucócitos/mm³ = [(Q1
+Q2 + Q3 + Q4)/4 x 10 x 20], onde: Qn = número de células no quadrante da câmara;
10 = fator de conversão para 1 mm³ (profundidade da lâmina); 20 = fator de conversão
da diluição.
37
Figura 13 - Imagem microscópica de um dos

quadrantes da câmara de Neubauer, onde os leucócitos
foram contados. Fonte: Arquivo Pessoal.
3.9 Técnica Histológica
No quarto dia pós-operatório os animais foram eutanasiados por dose excessiva

de anestésico (Cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina), e em seguida, amostras
da zona 1 (referente à região onde está o músculo reto do abdome) foram coletadas para
análise histológica. As amostras foram imersas em meio fixador de formol 10%. Em
seguida as amostras passaram pelos procedimentos de fixação em solução tamponada de
formol a 10% (por 48 horas), desidratação por meio da passagem da peça em álcool
etílico, diafanização por xilol a fim de retirar o álcool etílico, embebição em parafina
liquida à temperatura de 56 ºC e a emblocagem. Em seguida as peças foram cortadas em
um micrótomo com a espessura variando entre 5 e 6 µm e corados por Hematoxilina-
Eosina para quantificar a espessura da epiderme (Figura 14) e Azul de Toluidina para
quantificar mastócitos (Figura 15).
38
Figura 14 - Imagem ilustrativa da medida da espessura da epiderme em µm

dos retalhos com a coloração Hematoxilina e Eosina (HE). (Fonte: Arquivo
pessoal).
39
Figura 15: Imagem ilustrativa da contagem de mastócitos nos retalhos por

meio da coloração Azul de Toluidina. (Fonte: Arquivo pessoal).
3.10 Imunohistoquímica
Para as reações de imunohistoquímica foram efetuados cortes histológicos do

material parafinado, onde houve a reação antígeno-anticorpo e em seguida o material
passou por reação com marcador visível ao microscópio. As lâminas desparafinadas e
hidratadas passaram por um processo de recuperação antigênica através da incubação
em panela a vapor em meio tamponado por 40 minutos. Após resfriamento do material,
as peroxidases teciduais endógenas foram removidas pela adição de peróxido de
hidrogênio, e ligações inespecíficas do anticorpo primário foram evitadas por adição de
soro de cavalo. As lâminas foram então incubadas com anticorpo primário para Anti-
VEGFA (ABCAM®) figura 16, Anti-FGF basic (ABCAM ®) figura 17, e Anti-CD34
(ABCAM®) na figura 18 e incubados por 12 horas (over night) em câmara úmida. Em
seguida, as lâminas foram incubadas com anticorpo secundário por 30 minutos,
seguindo para o polímero conjugado também por 30 minutos, e corou-se com DAB por
1 minuto; todos do Kit PicTureTM MAX Polymer (ZYMED® Laboratories). As lâminas
40
foram contra-coradas com Hematoxilina de Harris por 1 minuto e montadas com

Entelan para posteriores análises em microscopia de luz.
41
Figura 16 - Fotomicrografias da imunomarcação de anticorpo primário para Anti-

VEGFA. Representação dos grupos: A – Grupo 1; B – Grupo 2; C – Grupo 3; D –
Grupo 4; E – Grupo 5. (Fonte: arquivo pessoal).
42
Figura 17 - Fotomicrografias da imunomarcação de anticorpo primário para Anti-FGF

basic. Representação dos grupos: A – Grupo 1; B – Grupo 2; C – Grupo 3; D – Grupo 4;
E – Grupo 5. (Fonte: arquivo pessoal).
43
Figura 18 - Fotomicrografias da imunomarcação de anticorpo primário para Anti-

CD34. Representação dos grupos: A – Grupo 1; B – Grupo 2; C – Grupo 3; D – Grupo
4; E – Grupo 5. (Fonte: arquivo pessoal).
44
3.11Método Estatístico
Os dados foram avaliados inicialmente pelo teste de normalidade de Shapiro-

Wilk, onde apenas os valores de mastócitos não apresentaram distribuição normal. Para
análise da porcentagem de área de necrose, número de leucócitos, espessura da
epiderme, fator de crescimento do endotélio vascular, fibroblastos, e vasos sanguíneos
neoformados, foi utilizado o teste ANOVA one-way e post-hoc de Tukey (p<0.05).
Para a análise da temperatura cutânea por meio da termografia infravermelha, foi
aplicado o teste two-way de medidas repetidas seguido do teste de Bonferroni (p<0.05).
O número de mastócitos foi avaliado por meio do teste de Kruskal-Wallis e post-
hoc de Dunn (p<0.05), utilizando o software BioEstat 5.0.
Os dados foram processados pelo software SPSS (versão 13.0), todas as análises
foram realizadas por dois avaliadores, não encontrando diferença significativa entre as
avaliações.
A correlação entre as variáveis foi verificada pela Correlação de Pearson. Os
dados foram processados pelo software SPSS (versão 13.0).
45
Resultados
46
4. RESULTADOS
4.1 Valores percentuais da área de necrose
A porcentagem de área de necrose foi obtida por meio do software Image J ®. A

porcentagem entre os grupos foi avaliada pelo teste ANOVA one-way e post-hoc de
Tukey, com valor de F4,45=3,494 e p˂0,05 entre o grupo 2, quando comparado com os
grupos 3 e 5, que apresentou maior porcentagem de área de necrose.
Tabela 1 - Valores das porcentagens média e desvios-padrão da área de necrose dos

retalhos, nos grupos estudados (%).
Média±DP
Grupo 1 – Controle 41,42±16,34
Grupo 2 – Diabetes 57,08±22,94*
Grupo 3 – Diabetes + CEP 28,70±15,33
Grupo 4 – Diabetes + LBI 10 J/cm2 43,29±23,21
DP – Desvio-padrão ⃰ p≤0,05 vs Grupos 3 e 5.

CEP – Campo elétrico pulsado
LBI – Laser de baixa intensidade
4.2 Valores da temperatura dos retalhos
A temperatura cutânea foi obtida por meio da termografia, avaliada em três

momentos, pré-cirúrgico, pós-cirúrgico e no quarto dia, antes da eutanásia dos animais.
Os resultados obtidos da temperatura cutânea média dos retalhos avaliados pela
termografia estão demonstrados na Tabela 2, de acordo com os grupos estudados.
47
Tabela 2 - Valores das temperaturas médias e desvios-padrão dos

retalhos nos grupos estudados (ºC) de acordo com os dias avaliados.
Pré cirurgia Pós cirurgia 4º dia

Grupo 1- Controle
35,25±0,45* 31,33±1,50# 34,67±1,21
Grupo 2 – Diabetes
35,36±0,94* 31,07±0,60# 33,47±1,14µ
Grupo 3 – Diabetes +
CEP 35,99±1,18* 32,24±1,19# 33,75±0,96µ
LBI 10J 35,81±0,34* 31,85±1,12# 34,36±0,97µ
LBI 140J 35,74±0,96* 31,94±1,44# 33,76±0,90µ
# µ
*p≤0.05 vs Pós cirurgia p≤0.05 vs 4º dia p≤0.05 vs Pré cirurgia.
DP – Desvio-padrão
CEP – Campo Elétrico Pulsado
LBI – Laser de Baixa Intensidade
A figura 19 demonstra um gráfico em linha de acordo com os grupos estudados

para melhor exemplificar a variação da temperatura no decorrer dos dias avaliados.
48
Figura 19 - Gráfico em linha ilustrando o valor médio (pontos) de

acordo com os dias avaliados. Grupo 1 – Controle; Grupo 2 – Diabetes;
Grupo 3 – Diabetes + CEP; Grupo 4 – Diabetes + LBI 10 J/cm 2; Grupo 5
– Diabetes + LBI 10 J/cm2. Não foi observado diferença significativa
entre os grupos.
A avaliação da temperatura cutânea foi avaliada pelo teste ANOVA two-way de

medidas repetidas e post-hoc de Bonferroni, com valor de F4,145= 2,37 e p<0,05.
Os dados avaliados referentes ao Grupo 1 (Tabela 2 e Figura 11), apresentaram
diferença significativa no período pré-cirurgia, quando comparado com o período pós
cirurgia, que apresentou menor temperatura. O período pós-cirurgia apresentou
diferença significativa quando comparado ao 4º dia, que teve um aumento da
temperatura. Não houve diferença significativa entre os períodos pré-cirurgia e 4º dia,
mostrando que a temperatura cutânea dos animais do Grupo controle foi normalizada.
Os dados avaliados referentes aos Grupos 2, 3, 4 e 5 apontam que houve
diferença significativa (p≤0,05) no período pré-cirurgia, quando comparado com o
período pós-cirurgia e 4º dia. Também houve diferença significativa (p≤0,05) entre o
período pós-cirurgia quando comparado ao período pré-cirurgia e 4º dia pós-cirurgia.
4.3 Valores da leucometria
O número de leucócitos encontrado entre os grupos foi avaliado pelo teste ANOVA
one-way e post-hoc de Tukey, com valor de F4,45=2,825, sendo observada diferença
49
significativa (p≤0,05) entre o grupo 2, quando comparado com o grupo 3, que

apresentou menor número de leucócitos.
Tabela 3 - Valores das porcentagens média e desvios-padrão da leucometria nos grupos

estudados (%).
Média±DP
Grupo 1 – Controle 1846,1±3279,41
Grupo 2 – Diabetes 23330,7±3980,02*
Grupo 3 – Diabetes + CEP 17899±5353,27
Grupo 5 – Diabetes + LBI 140 J/cm2 21010±4386,26
DP – Desvio-padrão ⃰ p≤0,05 vs Grupo 3.

4.4 Valores da quantidade de mastócitos.
Os mastócitos foram quantificados através da coloração Azul de toluidina. O número

de mastócitos encontrado entre os grupos foi avaliado pelo teste Kruskal-Wallis e post-
hoc de Dunn, sendo observada diferença significativa (p≤0,05) entre o grupo 2 quando
comparado aos grupos 3, 4 que apresentaram maior número de mastócitos, e entre o
grupo 5 quando comparado aos grupos 1, 2 e 3 que apresentaram menor número de
mastócitos.
Tabela 4 - Valores médios e desvios-padrão da quantidade de mastócitos dos retalhos,

nos grupos estudados.
Média±DP
Grupo 4 – Diabetes + LBI 10 J/cm² 5,80±0,74

50
Grupo 5 – Diabetes + LBI 140 J/cm² 11.60±1,11 α

α
DP – Desvio-padrão * p≤0.05 vs Grupo 3 e 4 p≤0.05 vs Grupo 1, 2 e 3.
4.5 Valores da espessura da epiderme dos retalhos
A avaliação da espessura da epiderme entre os grupos foi efetuada pelo teste ANOVA
one-way e post-hoc de Tukey, com valor de F4,45= 6,127, sendo observada diferença
significativa (p≤0.05) entre o grupo 2 quando comparado ao grupo 1, 3, 4 e 5, que
apresentaram uma maior espessura da epiderme.
Tabela 5 - Valores médios e desvios-padrão da espessura da epiderme dos retalhos, nos

grupos estudados (µm).
Média±DP
DP – Desvio-padrão ⃰ p≤0.05 vs Grupos 1, 3, 4 e 5.

4.6 Valores da quantidade de fator de crescimento do endotélio vascular.
O fator de crescimento do endotélio vascular (Vascular Endothelial Grow Factor -

VEGF) entre os grupos foi avaliado pelo teste ANOVA one-way e post-hoc de Tukey,
com valor de F4,45=16,15 e p˂0,05, sendo observada diferença significativa (p≤0,05)
entre o grupo 1 quando comparados ao grupo 2 que apresentou menor número de
51
VEGF, e entre o grupo 5 quando comparados aos grupos 2, 3 e 4, que apresentaram

menor número de VEGF.
Tabela 6 - Valores médios e desvios-padrão da quantidade de fator de crescimento do

endotélio vascular (VEGF) dos retalhos, nos grupos estudados.
Média±DP
Grupo 1 – Controle 2,82±0,78*
Grupo 2 – Diabetes 0,73±0,39
Grupo 5 – Diabetes + LBI 140 J/cm² 4,16±1,99#

#
DP – Desvio-padrão ⃰ p≤0.05 vs Grupos 2; p≤0.05 vs Grupos 2, 3 e 4.
4.7 Valores da quantidade de fator de crescimento de fibroblastos.
O fator de crescimento de fibroblastos (Fibroblasts Grow Factor - FGF) entre os

grupos foi avaliado pelo teste ANOVA one-way e post-hoc de Tukey, com valor de
F4,45=5,44 sendo observada diferença significativa (p≤0,05) entre o grupo 2 quando
comparado ao grupo 1 e 5 que apresentaram valores maiores, e entre o grupo 4 quando
comparado ao grupo 5, que apresentou maior número de FGF.
Tabela 7 - Valores médios e desvios-padrão da quantidade de fator de crescimento de fibroblastos

(FGF) dos retalhos, nos grupos estudados.
Média±DP
Grupo 4 – Diabetes + LBI 10 J/cm² 3,09±1,71#

52
DP – Desvio-padrão ⃰ p≤0.05 vs Grupos 1 e 5; # p≤0.05 vs Grupo 5.

4.8 Valores da quantidade de vasos sanguíneos neoformados
Os vasos neoformados (avaliados através do anticorpo anti-CD34) foram

avaliados pelo teste ANOVA one-way e post-hoc de Tukey, com valor de F4,45=6,77,
sendo observada diferença significativa (p≤0,05) entre o grupo 2 quando comparado ao
grupo 1, 3 e 5 que apresentavam maiores números de CD34.
Tabela 8 - Valores médios e desvios-padrão da quantidade de CD-34 dos retalhos, nos

grupos estudados.
Média±DP
DP – Desvio-padrão ⃰ p≤0.05 vs Grupos 1, 3 e 5.

4.9 Correlação de Pearson
A análise da correlação entre a variável porcentagem de área de necrose e

temperatura média (4º dia), espessura da epiderme, mastócitos, fator de crescimento do
53
endotélio vascular (VEGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), vasos

sanguíneos neoformados pelo anti-CD34 e leucócitos está demonstrada na tabela 9.
No grupo 1 foi observado correlação indireta entre FGF e mastócitos e a

porcentagem da área de necrose, sendo que quanto menor o número de FGF e
mastócitos, maior a porcentagem de necrose. O grupo 2 não apresentou correlação entre
as variáveis estudadas. A porcentagem da área de necrose foi correlacionada
indiretamente com o VEGF e CD34 no grupo 4, sendo que quanto maior o número de
VEGF e CD34, menor a porcentagem de necrose. Quando correlacionada com o número
de mastócitos, a porcentagem de área de necrose apresentou correlação indireta no
grupo 5, onde quanto maior o número de mastócitos, menos a porcentagem da área de
necrose.
Tabela 9 - Correlação entre porcentagem de área de necrose e temperatura, espessura da

epiderme, mastócitos, fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator de
crescimento de fibroblastos (FGF), anticorpo anti-CD34 e leucócitos.
ÁREA DE NECROSE
G1 G2 G3 G4 G5
Temperatura -0,95 -0,18. -0,55 -0,17 0,18 r
0,79 0,64 0,24 0,87 0,60 p
Espessura 0,21 0,45 -0,40 0,28 -0,11 r
epiderme 0,95 0,21 0,24 0.41 0,75 p
Mastócitos -0,76 0,27 -0,19 0,28 -0,70 r
0,01* 0,47 0,59 0,41 0,02* p
VEGF -0,31 -0,19 -0,69 -0,24 -0,23 r
0,48 0,64 0,02* 0,49 0,51 p
FGF -0,70 -0,22 0,02 -0,16 -0,55 r
0.05* 0,63 0,4 0.65 0,09 p
CD34 -0,36 -0,20 -0,73 0,25 -0,36 r
0,36 0,63 0,01* 0,65 0,33 p
Leucócitos 0,29 0,41 -0,07 -0,68 0,06 r
0,41 0,91 0,84 0,02* 0,86 p
G1 – Controle; G2 – Diabetes; G3 – Diabetes + CEP; G4 – Diabetes + LBI 10
J/cm²; G5 – Diabetes + LBI 10 J/cm². r – Coeficiente de Pearson; p–
Valor de p
54
55
Discussão
56
5. DISCUSSÃO
Na cirurgia reconstrutora, uma importante preocupação é a conservação do

retalho, pois a necrose é a principal complicação que pode levar ao insucesso do
tratamento. A necrose do tecido faz com que o tempo e custo de internação aumentem, e
implica em repetidas operações (Ferreira, 2003; Sahin et al., 2014).
O diabetes mellitus está associado a recorrente comorbidade relacionada ao
aumento da necrose no retalho miocutâneo transverso do músculo reto do abdome
(Paredes et al., 2012; Cosac et al., 2013). Dentre os agentes diabetogênicos, a aloxana é
comumente utilizada para a indução do diabetes experimental por desenvolver
glicosúria, polifagia, polidipsia, encontrados também em indivíduos diabéticos
(Carvalho, 2002). Antes da indução ao diabetes os animais permaneceram 12 horas sem
se alimentar, sendo que o jejum promove maior sensibilidade à ação diabetogênica da
droga, e tem importância significativa na resposta dos animais à aloxana (Lenzen and
Panten, 1988). A citotoxidade da aloxana é especifica para as células β pancreáticas,
pois estas células possuem grande capacidade em acumular a droga (Fedeiruk et al.,
2004).
Após a administração da aloxana, o processo de diabetogênese segue em duas
fases, onde se observa uma hiperglicemia inicial causada por uma resposta adrenérgica e
em seguida, apresenta uma hipoglicemia atribuída à liberação de insulina pelas células β
degeneradas (Lerco et al., 2003; Zanoello et al., 2002; Black et al., 1980). Nesta
segunda fase que acontece cerca de 6 horas após a administração é necessário a
administração de glicose aos animais (Federiuk et al., 2004). Diante disto, foi
administrado glicose a 10% por via intraperitoneal.
O acompanhamento dos animais após a indução ao diabetes é importante. A
glicose sanguínea e deve ser monitorada diariamente para diminuir a incidência de óbito
entre os animais. Além do acompanhamento da glicemia, é importante prevenir a
desidratação, hipoglicemia e desnutrição. Este cuidado deve ser tomado principalmente
na primeira semana de indução (Silva, Nogueira, 2015). Durante todo o período de
experimentação os animais foram monitorados diariamente.
A exposição à luz foi controlada em um ciclo claro/escuro de 12 horas, para não
afetar o ciclo circadiano dos animais. Está comprovada a correlação entre a interrupção
do ciclo circadiano com o diabetes tipo II e uma insuficiência das ilhotas pancreáticas.
57
Estudo mostra que alterações no ciclo claro/escuro afeta a fase de transcrição de

insulina nas ilhotas de Langerhans (Quian et al., 2013).
O aumento na microcirculação e na perfusão vascular faz com que a viabilidade
do tecido possa ser aumentada e, estudada em modelos de retalhos em animais. Devido
ao comprometimento da cicatrização gerado pelo diabetes mellitus, se torna importante
a investigação de recursos que possam aumentar a viabilidade do retalho TRAM em
ratos. No presente estudo foi utilizado o laser de baixa intensidade e o campo elétrico
pulsado durante três dias consecutivos após a cirurgia, para que fossem observados os
efeitos à curto prazo, visto que o comprometimento cicatricial pode ser observado no
segundo dia após a cirurgia, e a necrose tecidual apresenta-se instalada no quarto dia
pós-operatório (Pinfildi et al., 2013; Costa et al., 2015).
O modelo experimental do retalho miocutâneos do músculo transverso do
abdome foi proposto por Dunn et al., (1993). Em tal modelo a necrose pode ser
observada no quarto dia pós-operatório, apresentando geralmente a porcentagem de
37,49% (Pinfildi et al. 2009; Pinfildi et al. 2013), neste estudo, o Grupo controle
apresentou porcentagem de necrose 41,42%.
Para avaliar a área de necrose apresentada pelo retalho miocutâneos, foi
utilizado o software Image J®, de fácil aplicabilidade e rapidez no modo de avaliação.
Foi demonstrado que o Grupo 2 apresentou maior área de necrose como no estudo de
Carvalho et al. (2005), que avaliou a viabilidade do retalho cutâneo em ratos diabéticos.
A porcentagem da área de necrose dos Grupos 3 e 5 apresentaram diferenças
significativas comparadas ao Grupo 2, salientando a importância dos recursos na
cicatrização e na viabilidade do retalho TRAM. É importante observar que o laser de
baixa intensidade (LBI) com fluência de 10 J/cm² promoveu redução da área de necrose,
porém não houve diferença significativa quando comparado com o Grupo 2.
Até o momento, não foi encontrado estudo com a utilização do campo elétrico
pulsado em retalhos cutâneos e miocutâneos, sendo pioneiro nesta área. Há estudos que
utilizaram deste recurso na cicatrização de feridas, obtendo resultados satisfatórios
(Houghton et al., 2003; Cinar et al., 2009; Liani et al., 2014). A terapia de campo
eletromagnético já foi estudada em pós-operatório de cirurgia TRAM, reduzindo
significativamente a dor e a inflamação (Rohde et al., 2015).
O campo elétrico pulsado ao ser usado na lesão isquêmica do pé diabético
demonstrou resultados satisfatórios alterando o metabolismo e acelerando a cicatrização
da ferida (Liani et al., 2014). O incremento circulatório foi apontado como responsável
58
pelos efeitos apontados o que poderia explicar os efeitos produzidos no presente estudo,
onde o Grupo 3 (estimulado com o campo elétrico pulsado) teve a melhor viabilidade
quando comparado ao Grupo 2 (controle diabético). Estudos mostram que o campo
elétrico pulsado aumenta o fluxo sanguíneo (Hargrave and Li, 2015; Cinar et al., 2009),
o que poderia explicar a redução da área de necrose do retalho nos animais estimulados
com o campo.
O efeito do LBI na viabilidade de retalhos miocutâneos é controverso, e está
relacionado a redução de área necrótica por incremento da circulação. As respostas
divergentes estão relacionadas a diferentes parâmetros físicos como comprimentos de
onda e dose. Estudo que avalia a viabilidade do retalho TRAM mediada pelo LBI com
dose baixa (30 J/cm²) não encontrou redução significativa na área de necrose quando
comparado ao Grupo 1 (Cury et al., 2009). Em contrapartida, foi observado que a dose
de 36 J/cm² trouxe resultados satisfatórios sobre a viabilidade do retalho (Prado et al.,
2012). Tal resposta corrobora com este estudo, onde o Grupo 4 não apresentou
resultados satisfatórios enquanto que o grupo estimulado com 140 J/cm² (Grupo 5)
apresentou diferença significativa quando comparado ao Grupo 2.
Resultados positivos foram encontrados com a aplicação de LBI em doses altas
72 J/cm² (Pinfildi et al., 2009), 89 J/cm² (Nishioka et al., 2012), 144 J/cm² (Pinfildi et
al., 2009) e 260,71 J/cm² (Esteves et al., 2012). Porém não foi encontrado estudo que
compara os efeitos de diferentes doses em animais com disfunção metabólica como o
diabetes, de grande incidência na população (Ullah et al., 2015; Peters et al., 2001).
A eficácia do laser de baixa intensidade com 660 nm, com comprimento de onda
alto na viabilidade de retalhos, foi estudada e apresentou resultados que corroboram
com este estudo (Prado et al., 2010; Costa et al., 2010). O efeito atribuído ao LBI em
retalhos é atribuído a ação angiogênica, incremento da microcirculação e da perfusão
vascular, contribuindo com a cicatrização e diminuindo área de necrose tecidual
(Pinfildi et al., 2009; das Neves et al., 2011; Pinfildi et al., 2013).
A termografia infravermelha têm sido amplamente utilizada como método de
avaliação, acompanhamento e monitorização de feridas (Jiménez et al., 2013; Prindeze
et al., 2015; Batinjan et al., 2014), e sua eficácia como método de avaliação da
vitalidade retalho de pele está confirmada (Shejbal et al., 2012). Também associada a
efetiva determinação de profundidade de queimaduras e detecção de lesões em tecidos
profundos (Higashino et al., 2014; Miccio et al., 2016). É considerado como um método
59
de avaliação simples, preciso e não invasivo, com variedade de aplicações clínicas e

diagnósticas (Gurjarpadhye et al., 2015).
O equipamento de termografia FLIR modelo T450 também foi usado como
método de avaliação do efeito circulatório da estimulação elétrica de alta voltagem na
viabilidade do retalho musculocutâneo em ratos (Neves et al., 2015), porém o método
de análise dos dados foi diferente deste estudo, dividindo o retalho em quatro zonas
(sendo a zona 1 é a zona de maior perfusão e a zona quatro, a de menor perfusão), e não
avaliando a temperatura média total do retalho. Os dados expostos corroboram com este
estudo onde foi observado aumento da temperatura média dos animais no quarto dia, ao
ser comparado com o período pós-cirúrgico.
Em retalhos cutâneos efetuados em animais, a termografia se mostrou como um
método eficiente para avaliação da temperatura cutânea e circulação periférica do
retalho, apresentando diminuição da temperatura cutânea após a cirurgia em todos os
grupos. Não foi observada diferença significativa na temperatura cutânea no período
pré-cirúrgico quando comparado ao 4º dia no Grupo 1, mostrando que a temperatura
cutânea se normalizou nos animais sem distúrbio circulatório.
Foi observada diferença significativa na temperatura entre os períodos pós-
operatórios e quarto dia após a cirurgia no Grupo 3, o que já era esperado visto que o
CEP pode incrementar a circulação sanguínea periférica (Cinar et al., 2009; Hargrave
and Li, 2015). Os animais estimulados com LBI também tiveram aumento na
temperatura quando comparado o período pós-operatório e quarto dia. Estudos
demonstram que o laser de baixa intensidade promove leve aumento na temperatura,
corroborando com os dados apresentados neste estudo (Hegedus et al., 2009; Batinjan et
al., 2014).
As células leucocitárias são atraídas para o local da ferida no momento da injúria
do tecido, e permanece por um período que varia de três a cinco dias. Essas células
inflamatórias têm como função fagocitar bactérias, corpos estranhos e fragmentos de
células além de produzir fatores de crescimento, que preparam a lesão para a fase
proliferativa (Lingen, 2001).
A hiperglicemia, comum no diabetes mellitus não tratado, pode levar a uma
alteração quimiotáxica, o que pode resultar em aumento do recrutamento de leucócitos
na fase inflamatória em locais onde há processo de reparação na pele (Minelli et al.,
2003; Shakya et al., 2015), isto foi evidenciado neste trabalho, onde o Grupo 2
apresentou maior número de leucócitos quando comparado ao Grupo 1.
60
Não foi encontrado estudo que analisa leucometria após estimulação por campo
elétrico pulsado, porém é observado que o campo eletromagnético pulsado interage com
as células monocelulares do sangue periférico por meio de canais de cálcio, fazendo
com que cascatas sejam ativadas, alterando a proliferação de células da região (Cañedo-
Dorantes et al., 2002; Cañedo-Dorantes et al., 2015).
Ao estudar o efeito do laser de baixa intensidade no período pós-operatório em
ratos diabéticos, foi observado aumento na cicatrização de feridas e diminuição de
leucócitos quando comparado ao Grupo 2 (Santana et al., 2015), tais dados são
semelhantes aos encontrados no presente estudo, onde os animais diabéticos
estimulados com o LBI (Grupo 4 e Grupo 5) apresentaram menores valores na
contagem de leucócitos quando comparados com o Grupo 2, porém sem apresentar
diferença significativa.
Os grupos estimulados (Grupo 3, 4 e 5) comparados ao Grupo 2 sugerem que
pelo fato dos recursos serem pro inflamatórios, atuaram reduzindo a fase inflamatória, e
consequentemente, reduzindo o número de leucócitos no quarto dia pós cirúrgico.
Resultado semelhante foi encontrado em um estudo (Demir et al., 2004) que analisou o
efeito do laser de baixa intensidade e corrente elétrica na cicatrização de ferida. Foi
observado uma diminuição significativa no número de leucócitos no quarto dia após a
incisão da ferida nos animais que foram tratados durante três dias consecutivos,
mostrando que a duração da fase inflamatória foi menor nestes animais.
Os mastócitos são células importantes que são encontradas abundantemente na
pele. Estão intimamente ligadas à fase inflamatória da cicatrização, principalmente pela
liberação de histamina que promove vasodilatação e fator de ativação plaquetária, que
por sua vez, promove a adesão leucocitária (McNeil, 1996).
Na cicatrização de feridas, os mastócitos são capazes de melhorar a
reepitelização e estimular a angiogênese, porém têm sido associadas a cicatrização
anormal. Com a persistência da fase inflamatória, grandes números de mastócitos foram
encontrados em feridas crônicas, cicatrizes hipertróficas e quelóides (Wulff BC, Wilgus
TA. 2013; Nishikori et al., 2014; Douaiher et al., 2014).
É observada uma maior degranulação de mastócitos em animais diabéticos
quando comparado a animais não diabéticos, e esta diferença é apresentada no terceiro
dia após a lesão (Tellechea et al., 2016). A administração de aloxana faz com que haja
um aumento em glicocorticoides, o que induz a depleção de mastócitos na pele,
pulmões e intestinos (Goldsmith et al, 1990). Resultados semelhantes foram
61
encontrados em um estudo que utilizou streptozotocina para a indução do diabetes,

números menores de mastócitos foram apresentados no grupo de animais diabéticos
quando comparados a animais não diabéticos, os valores permaneceram diferentes até o
48° dia após uma lesão (Nishikori et al., 2014). Apesar de não apresentar diferença
significativa, o Grupo 2 apresentou menores números de mastócitos quando comparados
ao Grupo 1.
Não foi encontrado estudo que avaliasse mastócitos após estimulação do campo
elétrico, porém foi avaliado o efeito de estimulação elétrica em pata de ratos, onde foi
observado um pequeno aumento do número de mastócitos em animais estimulados (Li
et al., 2012). Apesar de ter sido encontrado um aumento no número de mastócitos no
Grupo 3 comparando ao Grupo 2, este não foi significativo.
A fototerapia com o laser de baixa intensidade modula o processo inflamatório,
melhorando a cicatrização de feridas (Sousa et al., 2009). Estudo (Pinfildi et al., 2009)
avaliou mastócitos em retalho TRAM, mostrou que em grupos irradiados com laser
670nm e fluências de 6 e 144 J/cm 2 houve um aumento da quantidade de mastócitos. O
mesmo foi demonstrado neste estudo, onde os grupos de animais diabéticos 4 e 5
apresentaram diferença significativa quando comparados com o grupo 2, que representa
a evolução natural da cicatrização em animais diabéticos. É possível observar que o
grupo 5 se sobressaiu ao apresentar maior número de mastócitos.
Estudos (Chao et al., 2011; Boric et al., 2013; Kadic et al., 2014) têm
demonstrado alterações cutâneas como a diminuição da espessura da epiderme em ratos
induzidos ao diabetes, o que pode predispor o desenvolvimento do pé diabético. A
mesma alteração foi encontrada neste estudo, onde houve diferença significativa entre o
Grupo 1 quando comparado ao Grupo 2 que apresentou uma menor espessura da
epiderme, salientando que o diabetes gera alterações cutâneas.
O campo elétrico se mostrou eficiente em enxerto de pele em ratos na reparação
da pele. Amostras da pele foram analisadas por meio da histologia demonstraram
aumento da espessura da derme e epiderme dos animais estimulados, quando
comparados aos animais do grupo controle. Os resultados demonstraram que a
estimulação elétrica afeta diretamente a sobrevivência e a reparação do enxerto de pele
(Politis et al., 1989). Ao avaliar o efeito da estimulação de corrente direta sobre a taxa
de proliferação da epiderme, foi observado espessamento da epiderme e tempo de cura
da ferida acelerado nos animais que foram estimulados (Jiang H, 1992). Ao comparar a
espessura da epiderme em animais diabéticos não tratados e animais diabéticos tratados
62
com o campo elétrico pulsado, foi possível notar que houve diferença significativa entre
os grupos, mostrando que a estimulação foi capaz de aumentar a espessura da epiderme,
tornando-a mais espessa, sem diferença significativa quando comparado a animais não
diabéticos.
O aumento significativo da espessura da epiderme e da derme também foi
observado em um estudo que analisou o efeito do laser de baixa intensidade em
camundongos (Zheng et al., 2014). Em outro estudo (Gál et al., 2006), amostras da pele
foram retiradas no quarto dia após uma cirurgia de incisão de 3 cm no dorso do animal,
mostrou que com estimulação diária de LBI 30 J/cm², houve um espessamento epitelial
sobre a incisão, terminando a queratinização da superfície da epiderme. A camada de
queratina nas feridas que foram estimuladas se mostrou semelhante a camada de
queratina da pele intacta, mostrando que o laser regenerou completamente a epiderme.
Neste estudo observamos que o laser aumentou a espessura da epiderme em ratos
diabéticos sem mostrar diferença significativa comparada a ratos não diabéticos. Não foi
encontrado diferença significativa entre o Grupo 4 e 5, mostrando que ambas fluências
são eficazes para tornar a epiderme mais espessa.
Na cicatrização de feridas a angiogênese tem grande importância, e é mediada
principalmente pela liberação vascular de fator de crescimento endotelial (VEGF) a
partir de células endoteliais (Liebano, Machado, 2013). Em indivíduos diabéticos, as
complicações vasculares são as principais causas associadas com a mortalidade e
incapacidade. A angiogênese é indispensável para a cicatrização de úlceras e feridas
(Cheng 2015) restaurando níveis de oxigênio e nutrientes para o tecido recém formando,
favorecendo a proliferação e migração celular (Schaffer and Nanney, 1996). Em um
estudo experimental (Oba et al., 2014), foi observado que o crescimento pró-
angiogênico visto pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foi reduzida em
ratos diabéticos quatro semanas após a indução ao diabetes. Resultados semelhantes
foram encontrados neste estudo, onde em apenas 7 dias após a indução, valores
significantemente menores de VEGF foram encontrados em animais induzidos quando
comparados a animais não diabéticos
A estimulação elétrica tem a capacidade de aumentar a expressão de VEGF em
feridas (Zhao et al., 2004; Baia et al., 2011; Mohajeri-Tehrani et al., 2014; Ud-Din et al.,
2014). Um estudo in vitro mostrou que a expressão de VEGF foi significativamente
aumentada em células expostas ao campo elétrico de alta frequência, quando
comparadas ao grupo não estimulado. Resultados semelhantes foram encontrados in
63
vivo onde foi avaliado o campo elétrico em feridas em ratos. O tratamento de feridas
com campo elétrico de alta frequência resultou em níveis significativamente
aumentados de VEGF no local da ferida quando comparado com animais não tratados
(Sheikh et al., 2012). Neste estudo, o campo elétrico se mostrou capaz de aumentar
valores de VEGF em animais diabéticos, porém não foi observada diferença
significativa.
Estudos (Colombo et al., 2013; Cury et al., 2013; Rhee et al., 2016) demonstram
que a terapia com laser de baixa intensidade contribui aumentando angiogênese.
Avaliação da ação do laser de baixa intensidade em retalhos cutâneos apontou a
capacidade deste recurso em melhorar a viabilidade por meio da angiogênese (Cury et
al., 2013). Neste estudo, apenas a irradiação com LBI 140 J/cm 2 se mostrou eficaz ao
aumentar significantemente o número de VEGF quando comparado ao grupo de animais
diabéticos não tratados, e também quando comparado as outras terapias (CEP e LBI 10
J/cm2). O efeito do LBI no aumento de VEGF é dose dependente, porém valores
aumentados de VEGF foram encontrados em animais não diabéticos irradiados com 40
J/cm2 quando comparados a animais não tratados (Curry et al., 2013).
O fator de crescimento de fibroblastos (FGF) é secretado por células epiteliais, e

desempenha um papel importante no desenvolvimento de órgãos e a cicatrização de
feridas (Zheng et al., 2014). A diminuição da expressão de fator de crescimento de
fibroblastos, contribui para o retardamento da cura de feridas em ratos (Komi–
Kuramochi et al., 2005). O diabetes afeta negativamente a fase proliferativa da
cicatrização diminuindo VEGF, fator de crescimento epidérmico e fator de crescimento
de fibroblastos (FGF) (Peplow et al., 2012). Diversos estudos mostram que após lesão
cutânea, valores de FGF estão diminuídos em animais diabéticos, quando comparados a
animais não diabéticos (Moulin et al., 1998; Werner et al., 1994;; Cianfarani et al.,
2006).
Alguns recursos são estudados com o intuito de aumentar FGF, sendo que o
campo elétrico com de 60 kHz, 20 mV/cm, 50% de ciclo de trabalho, durante 2 horas
por dia, por 7 dias foi capaz de aumentar significativamente a expressão de FGF, sendo
eficaz na regeneração de fraturas ósseas (Clark et al., 2014). Na cicatrização do retalho
TRAM, o campo elétrico aumentou os níveis de FGF quando comparado a ratos
diabéticos não tratados, porém não houve diferença significativa.
64
Os efeitos benéficos da terapia com laser de baixa intensidade foram

comprovados em estudo (Ihsan M, 2005) que tinha por objetivo analisar a circulação
colateral e microcirculação em coelhos que tiveram um vaso sanguíneo ocluso. Foi
observado que houve um aumento significativo de FGF, atingindo um pico entre 12 e 16
horas após a irradiação com o laser de 904 nm e 10 J/cm 2. No presente estudo foi
possível observar que os efeitos deletérios do diabetes foram suprimidos pela irradiação
com o laser, e resultados satisfatórios foi encontrado com a irradiação do LBI 660 nm e
140 J/cm2, onde o recurso foi capaz de aumentar o número de FGF quando comparado
com animais diabéticos não tratados e animais não diabéticos. No grupo estimulado
com 10 J/cm2 houve um aumento não significativo de FGF comparando ao grupo 2.
As células progenitoras endoteliais, incluindo as células CD34 positivas, são
responsáveis pela neovascularização e manutenção da função endotelial vascular
(Gallangher et al., 2007; Makino et al., 2015), sua migração para o local de uma lesão é
de grande importância para a cicatrização de feridas (Zhao et al., 2012). Autores relatam
que em indivíduos diabéticos, os números de CD34 circulantes estão diminuídos (Fadini
et al., 2005; Sega et al., 2006; Gallangher et al., 2007). O início clínico do diabetes tipo
2 é marcado pela redução de células progenitoras, especialmente CD34+ (Fadini et al.,
2010). O mesmo foi encontrado neste estudo, onde o grupo de animais diabéticos
mostrou redução significativa de CD34 quando comparado ao Grupo 1.
Terapias neuromusculares aumentam significantemente os índices de CD34,
atuando positivamente na regeneração endotelial (Stefanou et al., 2016). Estudo que
analisou o campo elétrico induzindo a migração de células progenitoras endoteliais para
o local de uma lesão, mostrou que a estimulação elétrica é eficaz em orientar e estimular
esta migração (Zhao et al., 2012). O campo elétrico se mostrou eficaz em aumentar os
valores de CD34. Foi observado diferença significativa entre o Grupo 3 quando
comparados ao Grupo 2, que apresentou menores valores de CD34. É possível observar
que apesar de não apresentar diferença significativa, apresentou maiores valores que o
grupo controle, que mostra a evolução natural da cicatrização do retalho em animais não
diabéticos.
O LBI se mostrou eficiente ao aumentar CD34 em um estudo que avaliou a taxa
de angiogênese foi por meio do antígeno CD34 na cicatrização de feridas após extração
dental. Em indivíduos estimulados com laser 820 nm e 6 J/cm² por cinco dias, a taxa de
angiogênese foi significantemente maior que no grupo controle (Halon et al., 2015). O
65
mesmo foi encontrado neste estudo, onde o LBI foi capaz de aumentar
significantemente CD34 após 3 dias de irradiação.
Durante o curso deste estudo houve perda amostral devido à grande toxicidade
da aloxana nos animais. Para reduzir esta perda, os ratos foram monitorados
diariamente, sendo checada a glicemia duas vezes ao dia (Federiuk, 2004).
Os resultados do presente estudo são limitados aos efeitos agudos do diabetes.
Neste contexto, sugere-se estudos complementares que avaliem efeitos de recursos em
sequelas produzidas pelo diabetes crônico.
66
67
Conclusão
6. CONCLUSÃO
Diante dos resultados apresentados, pode-se concluir que o laser de baixa

intensidade e o campo elétrico pulsado são capazes de aumentar a viabilidade do retalho
miocutâneo transverso do músculo reto do abdome, diminuindo o efeito deletério do
diabetes em ratos.
A porcentagem de área de necrose foi significante menor no grupo estimulado
com o campo elétrico pulsado e laser de baixa intensidade com comprimento de onda
660 nm e fluência 140 J/cm².
A temperatura cutânea apresentou mesmo comportamento em todos os grupos
estudados, diminuindo após o procedimento operatório e aumentando no quarto dia.
Houve uma redução significativa da leucometria no grupo estimulado com o
CEP quando comparado ao grupo de animais diabéticos não estimulados.
O número de mastócitos nos grupos de animais diabéticos que receberam
tratamento foi significantemente maior que o grupo de animais diabéticos não tratados,
sendo que o que apresentou maior diferença foi o grupo estimulado com LBI 140 J/cm².
A espessura da epiderme se mostrou significantemente maior em animais
diabéticos tratados quando comparados a animais diabéticos não tratados.
Em animais diabéticos não tratados houve uma redução significativa de fator de
crescimento do endotélio vascular quando comparado a animais não diabéticos. O
número de VEGF no grupo de animais diabéticos irradiados com o LBI 140 J/cm² foi
significantemente maior que nos demais grupos de animais diabéticos.
Foi encontrado menores valores de fator de crescimento de fibroblastos em
animais diabéticos. Os animais que receberam tratamento com os recursos tiveram os
números de FGF aumentados, sendo que os animais estimulados com o LBI 140 J/cm²
apresentaram valores significantemente maiores que os estimulados com LBI 10 J/cm².
A quantidade de vasos sanguíneos neoformados em animais diabéticos foi
significantemente menor que em ratos não diabéticos, porém em ratos estimulados com
68
o CEP e o LBI 140 J/cm², esses valores aumentaram significantemente, excluindo o

efeito deletério do diabetes mellitus.
69
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1

Universidade de São Paulo

EFEITO DO CAMPO ELÉTRICO PULSADO E DO LASER DE

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

GABRIELLA DE PAULA MARCONDES FERREIRA LEITE

EFEITO DO CAMPO ELÉTRICO PULSADO E DO LASER DE BAIXA

GABRIELLA DE PAULA MARCONDES FERREIRA LEITE

Efeito do campo elétrico pulsado e do laser de baixa

Dissertação apresentada ao Programa de

Orientadora: Profa. Dra. Elaine C. O.

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL

Serviço de Documentação da Faculdade de Medicina

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

Leite, Gabriella de Paula Marcondes Ferreira

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em

1. Câncer de mama. 2 Equilíbrio. 3. Marcha.

Nome: Gabriella de Paula Marcondes Ferreira Leite

Título: Efeito do campo elétrico pulsado e do laser de baixa intensidade na viabilidade

Dissertação apresentada ao Programa de

Prof. Dr. ___________________________ Instituição: __________________________

Julgamento: ________________________ Assinatura: __________________________

Prof. Dr. ___________________________ Instituição: __________________________

Julgamento: ________________________ Assinatura: __________________________

Prof. Dr. ___________________________ Instituição: __________________________

Julgamento: ________________________ Assinatura: __________________________

de Paula, duas mulheres fortes nas quais me espelho.

A minha amiga Laís Mara Siqueira, a quem tenho grande admiração e

Agradeço minhas queridas amigas Iara Fernandes Elias, Cintia Fonseca de

Às amigas Estela de Paula e Cristiane de Moura Lacerda pela imensa

Agradeço aos companheiros de laboratório (Vânia, Fernanda, Carla, Monique,

À técnica Rosangela Lopes por toda paciência e por me ajudar

Aos funcionários da Universidade de São Paulo, especialmente ao Samuel

A equipe do REMA (Reabilitação de mastectomizadas) por me receber tão bem

O futuro pertence àqueles que acreditam na beleza de seus sonhos.

Leite, GPMF. Efeito do laser de baixa intensidade e do campo elétrico pulsado na

Na cirurgia reconstrutora, uma importante preocupação é a conservação do

Palavras-chave: Terapia com laser de baixa intensidade; Fisioterapia; Diabetes Mellitus.

In reconstructive surgery, a major concern is the preservation of the flap

Keywords: Low-level laser therapy; Physiotherapy; Diabetes Mellitus.

Figura 1: Fluxograma demonstrando o delineamento do estudo.............................25

Figura 2: Imagem demonstrando a indução ao diabetes experimental por via endovenosa

Figura 3: Procedimento Cirúrgico: A – Demarcação do Retalho; B – Incisão da pele em

Figura 4: Procedimento Cirúrgico: A – Incisão na Linha Alba; B – Incisão na margem

Figura 5: A – Reposicionamento do retalho no leito, com sutura simples nos quatro

Figura 6: Retalho TRAM dividido em quatro zonas. Fonte: Arquivo Pessoal................30

Figura 7: Aplicação de laser de baixa intensidade (LBI) em local delimitado de forma

Figura 8: Aplicação do campo elétrico pulsado. Fonte: Arquivo pessoal.......................32

Figura 9: Desenho do retalho demarcado no software Image J ®. Fonte: Arquivo Pessoal.

Figura 12: Retalho demarcado no software Research IR FLIR ®. Fonte: Arquivo

Figura 13: – Imagem microscópica de um dos quadrantes da câmara de Neubauer, onde

Figura 14: Imagem ilustrativa da medida da espessura da epiderme em µm dos retalhos

Figura 16: Fotomicrografias da imunomarcação de anticorpo primário para Anti-

Figura 17: Fotomicrografias da imunomarcação de anticorpo primário para Anti-FGF

Figura 18: Fotomicrografias da imunomarcação de anticorpo primário para Anti-CD34.

Tabela 1 - Valores das porcentagens média e desvios-padrão da área de necrose dos

Tabela 3 - Valores das porcentagens média e desvios-padrão da leucometria nos grupos

Tabela 4 - Valores médios e desvios-padrão da quantidade de mastócitos dos retalhos,

Tabela 5 - Valores médios e desvios-padrão da espessura da epiderme dos retalhos, nos

Tabela 6 - Valores médios e desvios-padrão da quantidade de fator de crescimento do

Tabela 7 - Valores médios e desvios-padrão da quantidade de fator de crescimento de

Tabela 8 - Valores médios e desvios-padrão da quantidade de CD-34 dos retalhos, nos

Tabela 9 - Correlação entre porcentagem de área de necrose e temperatura, espessura da

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