16/05/2019

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

(HPLC)

Yuris Diksy., M.Si

Definisi dan Sejarah

Kromatografi : Teknik analitik

Kromatograf : Instrumen
Kromatogram : Gambar/hasil
Kromatografer : Orang

1
 16/05/2019

Definisi dan Sejarah

Kromatografi cair: Dapat menganalisis berbagai senyawa yang dapat larut

dalam fase gerak, analit nonvolatil hingga yang mudah
terdekomposisi

•Tipe mekanisme pemisahan

–Partisi : kromatografi cair-cair

–Adsorpsi : kromatografi cair-padat
–Penukar ion
–Size exclusion
–Afinitas
–kiral

HPLC
HPLC stands for “High-performance liquid chromatography”
(sometimes referred to as High pressure liquid chromatography).

•High performance liquid chromatography is a powerful tool in

analysis, it yields high performance and high speed compared to
traditional columns chromatography

HPLC is a chromatographic technique that can

separate a mixture of compounds

•It is used in biochemistry and analytical chemistry to identify, quantify and purify
the individual components of a mixture.

2
 16/05/2019

HPLC
•Chromatography : physical method in which separation of components takes place
between two phases-a stationary phase and a mobile phase

•Stationary phase : The substance on which adsorption of the analyte (the substance
to be separated during chromatography) takes place . It can be a solid, a gel, or a solid
liquid combination

•Mobile phase : solvent which carries the analyte (a liquid or a gas)

HPLC is a type of liquid chromatography where the sample is forced through a

column that is packed with a stationary phase composed of irregularly or spherically
shaped particles, a porous monolithic layer , or a porous membrane by a liquid
(mobile phase) at high pressure.

HPLC

3
 16/05/2019

HPLC

PRINCILPE
Liquid chromatography is a separation technique that involves:
•the placement (injection) of a small volume of liquid sample
•into a tube packed with porous particles (stationary phase)
•where individual components of the sample are transported along the
packed tube (column) by a liquid moved by gravity.

The main principle of separation is adsorption .

HPLC

•HPLC is a separation technique that involves:

•the injection of a small volume of liquid sample into a tube packed with
tiny particles (3 to 5 micron (μm) in diameter called the stationary phase)

•where individual components of the sample are moved down the packed
tube (column) with a liquid (mobile phase) forced through the column by
high pressure delivered by a pump.

4
 16/05/2019

HPLC

•These components are separated from one another by the column packing
that involves various chemical and/or physical interactions between their
molecules and the packing particles.

•These separated components are detected at the exit of this tube (column)
by a flow-through device (detector) that measures their amount.The output
from the detector is called a liquid chromatogram In principle, LC and
HPLC work the same way except the speed , efficiency, sensitivity and
ease of operation of HPLC is vastly superior .

Jenis-Jenis HPLC
I. Berdasarkan mode pemisahan
1. Kromatografi Fase Normal : Fase diam polar (hidrofilik)
Fase gerak non-polar (hidrofobik)

2. Kromatografi Fase Terbalik : Fase diam non-polar (hidrofobik)

Fase gerak polar (hidrofilik)

Fase Normal Fase Terbalik

Fase Diam Polar (silica gel) Non-polar (C18)

Non-polar Polar
Fase Gerak (pelarut organik) (air / organik)
Pergerakan sampel Non-polar tercepat Polar tercepat
Pemisahan berdasarkan Perbedaan polaritas Perbedaan kandungan
(gugus fungsi) hidrokarbon

5
 16/05/2019

Jenis-Jenis HPLC
II. Berdasarkan prinsip pemisahan

1. Kromatografi adsorpsi :
• Pada kromatografi adsorpsi, molekul solute terikat
langsung pada permukaan dari fase diam.

• Komponen yang memiliki afinitas lebih besar terhadap

fase gerak terelusi lebih dahulu dan komponen yang
memiliki afinitas kurang terhadap fase diam terlelusi lebih
lama.

• Tidak ada dua komponen yang memiliki afinitas yang

sama terhadap fase diam dan fase gerak

Jenis-Jenis HPLC
II. Berdasarkan prinsip pemisahan

2. Kromatografi pertukaran ion :

• Kromatografi pertukaran ion adalah suatu proses yang menyebabkan terjadinya pemisahan dari
ion-ion dan molekul polar berdasarkan muatannya.

• Dapat digunakan untuk hampir semua jenis molekul bermuatan termasuk protein ukuran besar,
nukleotida, dan asam amino.

• Retensinya berdasarkan pada atraksi antara ion-ion terlarut dan muatan pada fase diam.

• Penggunaan resin (fase diam padat) digunakan dengan menambahkan anion atau kation
secara kovalen terhadapnya.

• Ion terlarut dari muatan yang berlawanan dalam fase gerak cair tertarik ke resin oleh gaya
elektrostatik.

6
 16/05/2019

Jenis-Jenis HPLC
II. Berdasarkan prinsip pemisahan

3. Kromatografi pasangan ion :

• Bentuk kromatografi di mana ion dalam larutan dapat "dipasangkan“ atau dinetralkan dan
dipisahkan sebagai pasangan ion pada kolom fase terbalik.

• Agen pasangan ion biasanya adalah senyawa ionik yang mengandung rantai hidrokarbon yang
menanamkan hidrofobisitas tertentu sehingga pasangan ion dapat dipertahankan pada kolom
fase terbalik.

7
 16/05/2019

Jenis-Jenis HPLC
II. Berdasarkan prinsip pemisahan

4. Kromatografi permeasi gel / size exclusion :

• Jenis kromatografi ini kurang memiliki interaksi yang

menarik antara fase diam dan zat terlarut.

• Fase cair atau gas melewati gel berpori yang

memisahkan molekul sesuai dengan ukurannya.

Jenis-Jenis HPLC
II. Berdasarkan prinsip pemisahan

5. Kromatografi affinitas:
• Jenis kromatografi paling selektif yang
digunakan. Memanfaatkan interaksi spesifik
antara satu jenis molekul terlarut dan molekul
kedua yang diimobilisasi pada fase diam.

• Sebagai contoh, molekul yang diimobilisasi

mungkin merupakan antibodi bagi sebagian
protein spesifik. Ketika zat terlarut yang
mengandung campuran protein dilewatkan pada
molekul ini, hanya protein spesifik yang bereaksi
terhadap antibodi ini, mengikatnya pada fase
diam. Protein ini kemudian diekstraksi dengan
mengubah kekuatan ion atau pH.

8
 16/05/2019

Jenis-Jenis HPLC
II. Berdasarkan prinsip pemisahan

6. Kromatografi kiral:

• Melibatkan pemisahan stereoisomer.

• Dalam kasus enansiomer, ini tidak memiliki perbedaan secara kimia

atau fisik selain menjadi gambar cermin tiga dimensi.

• Kromatografi konvensional atau proses pemisahan lainnya tidak

mampu memisahkannya.

• Untuk memungkinkan pemisahan kiral terjadi, baik fase gerak atau

fase diam sendiri harus dibuat kiral, sehingga memberikan perbedaan
afinitas antara analit.

Jenis-Jenis HPLC
III. Berdasarkan teknik elusi

1. Elusi isokratik:

• Pemisahan dengan komposisi fase gerak tetap konstan sepanjang

prosedur pengujian disebut elusi isokratik

• Dalam elusi isokratik, lebar puncak dan waktu retensi meningkat

sejalan dengan jumlah pelat teoritis. Hal ini menyebabkan kerugian
bahwa puncak yang terlambat dielusi menjadi sangat datar dan
melebar.

• Cocok untuk pemisahan sederhana

• Biasa digunakan untuk kepentingan quality control

9
 16/05/2019

Jenis-Jenis HPLC
III. Berdasarkan teknik elusi

2. Elusi gradien:
• Pemisahan dengan komposisi fase gerak diubah selama proses
pemisahan digambarkan sebagai elusi gradien

• Elusi gradien mengurangi retensi komponen yang lama terelusi

sehingga lebih cepat mengelusi, menghasilkan puncak yang lebih
sempit.

• Hal Ini juga meningkatkan bentuk puncak yang lebih tajam dan
ketinggian puncak

• Cocok untuk analisis sampel yang kompleks

• Biasa digunakan dalam pengembangan metode untuk sampel yang

tidak diketahui “unknown mixture”. Linear gradient adalah yang paling
banyak digunakan

Jenis-Jenis HPLC
IV. Berdasarkan skala operasi

1. HPLC analitik:

• Tidak ada perolehan kembali dari komponen individu

2. HPLC preparatif:

• Komponen individu dari campuran dapat diperoleh kembali

10
 16/05/2019

Jenis-Jenis HPLC
V. Berdasarkan tipe analisis

1. Analisis kualitatif:
• Analisis suatu zat untuk memastikan ada tidaknya suatu zat
berdasarkan sifat konstituen kimianya

• Dapat memisahkan masing-masing komponen tetapi tidak dapat

menghitung secara kuantitas dalam analisis ini

2. Analisi kuantitatif:

• Menentukan jumlah dan proporsi konstituen kimianya

• Kuantitas pengotor dan komponen individu dapat ditentukan nilainya

11