Cromatografia - A Gás e A Líquido (SCHULER, A.) PDF

Alexandre Schuler
CROMATOGRAFIA
AG
A GÁÁSS EE AA L
LÍÍQ
QUUIID
DOO
(detectores, aquisição de dados, validação e avaliação estatística)
Décima Primeira Edição
2009
Alexandre Schuler
Professor Adjunto 4
Departamento de Engenharia Química
Universidade Federal de Pernambuco
CROMATOGRAFIA
AG
A GÁÁSS EE AA L
LÍÍQ
QUUIID
DOO
(detectores, aquisição de dados, validação e avaliação estatística)
Décima Primeira Edição
2009
Alexandre Schuler - Cromatografia i
SUMÁRIO
1 - Introdução, 1
1.1. Histórico, 1
1.2. Classificação, 1
2 - Tipos de Processos Cromatográficos, 3
2.1. Cromatografia de adsorção, 3

2.2. Cromatografia de partição, 3
2.3. Distribuição em contracorrente, 6
2.4. Cromatografia em fase líquida, 7
2.5. Fatores que influem na separação, 8
2.6. Cromatografia em fase gasosa, 12
3 - Tratamento teórico da Cromatografia, 15
3.1. A equação de Van Deemter, 15

3.2. Fase estacionária, 15
3.3. Suporte, 16
3.4. Coluna, 17
3.5. Fase móvel, 17
4 - O Cromatógrafo, 19
4.1. O Cromatógrafo a Gás, 19

4.2. O Cromatógrafo a Líquido, 22
4.3. Detectores, 24
5 - Análise Qualitativa, 31
6 - Análise Quantitativa, 32
6.1. Introdução, 32
6.2. Medição de área, 32
6.3. Métodos de cálculo, 34
6.4. Seleção do melhor método de cálculo, 39
7. Otimização do processo analítico, 40

7.1. Parâmetros analíticos, 40
Alexandre Schuler - Cromatografia ii
7.2. Projetando um método analítico, 42

7.3. Validação de um método analítico, 44
8. Técnicas adicionais de identificação, 50
8.1 Tempo de retenção e retenção relativa, 50

8.2. Índice de retenção, 50
8.3. Equivalência entre fases estacionárias, 51
Bibliografia, 53
Apêndice 1 (Túnel do Tempo), 54
Apêndice 2 (Características Básicas dos Detectores), 59
A2.1. Sensibilidade, 59
A2.2. Nível de ruído, 59
A2.3. Limite de Detecção, 59
A2.4. Faixa de Linearidade Dinâmica, 60
Apêndice 3 (Técnicas de introdução da amostra), 61
Apêndice 4 (Sistemas de aquisição de dados), 65
Apêndice 5 (O desenvolvimento cromatográfico), 66
Apêndice 6 (Outros detectores utilizados em Cromatografia), 68
Apêndice 7 (Estatística), 72
Apêndice 8 (Outros parâmetros cromatográficos), 76

Alexandre Schuler - Cromatografia
1 - INTRODUÇÃO
1.1. Histórico1
Cromatografia é um termo genérico, aplicado a um processo de separação físico-

químico, o qual é baseado principalmente nos fenômenos de adsorção e partição. Este termo foi
escolhido porque as primeiras separações foram realizadas com substâncias coloridas. Entretanto, o
processo cromatográfico não é restrito a essa classe de substâncias, constituindo-se na atualidade no
método mais eficiente de separação, com aplicações na Química Analítica Qualitativa e Quantitativa, para
compostos orgânicos e inorgânicos, independentemente de seu estado físico.
1.2. Classificação
Um processo cromatográfico envolve uma fase móvel e uma fase estacionária.

A fase estacionária é um sólido ou um líquido (Figura 1.1). No segundo caso, este fica
impregnado em um sólido (suporte) e o fenômeno mais atuante é a partição. No primeiro caso,
tem predominância a adsorção. Assim, pode-se classificar a Cromatografia em dois tipos gerais:
Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição.
Figura 1.1 - O Processo Cromatográfico.

A Fase Móvel transporta a amostra através da Fase Estacionária. A velocidade média das partículas da amostra
depende da sua natureza. Desse modo, cada componente atingirá o final da coluna em um instante diferente.
A fase móvel pode ser um líquido ou um gás. No primeiro caso, denomina-se o

processo de Cromatografia em Fase Líquida e no segundo caso de Cromatografia em Fase
Gasosa, ou simplesmente Cromatografia a Líquido e Cromatografia a Gás. A Cromatografia
pode ainda ser classificada em função da técnica empregada:
Cromatografia em Papel
Cromatografia em Camada Delgada
Cromatografia em Coluna Clássica
Cromatografia em Fase Gasosa
1
É sugerida a leitura do Apêndice 1 (Túnel do Tempo), para um breve histórico do desenvolvimento da Cromatografia.
Alexandre Schuler - Cromatografia 2
Cromatografia em Fase Líquida de Alto Desempenho
Esta última é mais conhecida pelas iniciais de seu nome em inglês (High
Performance Liquid Chromatography - HPLC) e constituem-se variantes suas as seguintes
técnicas:
• Cromatografia de Permeação∗ em Gel (GPC)

• Cromatografia de Troca Iônica (IEC)
GPC (do inglês Gel Permeation Chromatography) é empregada na análise de

polímeros, enquanto a IEC (do inglês Ion Exchange Chromatography) é empregada na análise
de íons (cátions e ânions).
∗
Na realidade, este termo é empregado quando a fase móvel é um solvente orgânico. Quando a fase móvel é água ou
solução aquosa, emprega-se o termo Cromatografia de Filtração em Gel. O termo Cromatografia por Exclusão de
Tamanho (em inglês Size Exclusion Chromatography) é mais genérico e abrange as duas técnicas.
2 - TIPOS DE PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS
2.1. Cromatografia de Adsorção
Adsorção é um fenômeno físico-químico através do qual um sólido

(adsorvente) fixa em sua superfície um líquido ou um gás, por meio de interações como as
“forças de Van Der Waals”. Chama-se coeficiente de adsorção à relação
Na
ka =
Nn
onde Na e Nn são respectivamente o número de moles adsorvidos e não adsorvidos de uma
determinada substância. Compostos diferentes possuem diferentes valores de ka, estes variando
com a temperatura e com a natureza do adsorvente. Se uma mistura de vários componentes é
forçada a passar através de um tubo contendo um adsorvente (coluna cromatográfica), cada
componente necessitará de um intervalo de tempo diferente para transpor a coluna. Esse
intervalo de tempo é denominado tempo de retenção (Tr). A Figura 2.1a ilustra um processo de
Cromatografia por Adsorção. A substância mais fortemente adsorvida é mais dificilmente
arrastada pela Fase Móvel.
a) Cromatografia de Adsorção b) Cromatografia de Partição
Figura 2.1 - Diferença entre Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição.
2.2. Cromatografia de Partição
Se uma substância é adicionada a um recipiente contendo dois líquidos não

miscíveis, ela se dissolverá parcialmente em cada solvente, de modo a ser constante a relação C1
/ C2, onde C1 e C2 são as concentrações da substância em cada um dos dois líquidos. Denomina-
se coeficiente de partição à relação
C1
kp =
C2
Se m0 é a massa total da substância e m1 é a massa dissolvida no solvente 1, é
possível escrever
m1
V1 m1 V 2
kp = = ⋅
(m0 − m1) V 1 m0 − m1
V2
logo:
kpV 1
m1 = m0. (eq. 1)
V 2 + kpV 1
Se a substância estava inicialmente dissolvida no solvente 1, m1 é a massa que

permanece neste solvente após adição do solvente 2, o qual extraiu a massa (m0 - m1). Se as duas
fases forem separadas (com auxílio de um funil de separação, por exemplo), a adição de outra
quantidade do solvente 2 vai extrair a massa (m1 - m2), onde
kpV 1
m 2 = m1. (eq. 2)
V 2 + kpV 1
Substituindo na eq. 2 o valor de m1 (eq. 1), fica
m2 = mo [kpV1/(V2 + kpV1)] 2 (eq. 3)
É possível generalizar a eq. 3 para
mn = mo [kpV1/(V2 + kpV1)] n (eq. 4)
que dá a massa mn que permanece no solvente 1 após n extrações com o solvente 2. Dá-se ao
processo aqui descrito o nome de extração. Por outro lado, tratando-se de uma mistura de, por
exemplo, 2 componentes (A e B), com kpA ≠ kpB , um dos componentes ficará preferencialmente no
solvente 1 e o outro no solvente 2. Assim sendo, à medida que n cresce, cada fase ficará mais rica (mais
pura) em um dos componentes. No caso anterior (extração), a porção de líquido 1 era sempre a mesma,
renovando-se apenas o líquido 2. Agora, ambos são renovados. O Esquema 2.1, onde o líquido 1 é o
superior, ilustra o processo, que pode ser visualizado a nível “molecular” na Figura 2.1.b. No exemplo,
kA é maior que kB. Isto significa que o líquido 1 vai se enriquecendo de A e o líquido 2, relativamente, vai
se enriquecendo de B, a cada etapa do processo. Os números da esquerda, em cada quadrícula 1,

indicam a fração de A e os da direita indicam a fração de B. Do mesmo modo, os números
superiores indicam a fração de A e de B no líquido 1 e os inferiores indicam a fração de A e de B no
líquido 2. No exemplo, foi utilizada uma mistura com quantidades iguais de A e de B, cujos
coeficientes de partição valem, respectivamente, 3/1 e 1/3. A partir dos valores de mAn e mBn,
pode-se calcular a composição da mistura (ou o grau de pureza de cada componente) em cada
solvente, após n etapas (n partições) 2.
ETAPA 1 ETAPA 2 ETAPA 3

27/64 1/64
9/64 3/64
9/16 1/16
3/16 3/16
A B
1 3/4 1/4 9/32 3/32

etc
2 1/4 3/4 3/32 9/32
3/16 3/16
1/16 9/16
3/64 9/64
1/64 27/64
Esquema 2.1 - Distribuição (partição) de duas substâncias (A e B), em dois líquidos (1 e 2)

imiscíveis. Algumas frações se juntam por terem mesma composição.
1
Cada quadrícula corresponde a um frasco de extração (ex.: funil de separação).
2
No exemplo apresentado no esquema 2.1, as massas correspondentes a A e B, respectivamente, no solvente 1 do frasco
superior da ETAPA 3, são 0,422 g e 0,016 g, que correspondem a 96,35% de A e 3,65% de B.
A partição, como entendida neste segundo exemplo, descreve o processo

cromatográfico. O número de “equilíbrios” (etapas) que ocorrem dentro de uma coluna (n) é conhecido
como o “número de pratos teóricos”, prato teórico sendo um ponto de equilíbrio (entre uma fase e
outra). A distância entre dois pontos de equilíbrio consecutivos chama-se “altura equivalente a um
prato teórico” (H). Os parâmetros n e H serão novamente discutidos mais adiante. Observe-se,
neste exemplo, que partindo de uma mistura contendo 50% de A e 50% de B, obtém-se,
respectivamente, nas etapas 1, 2 e 3, os seguintes percentuais (em massa) de A, nas frações superiores
(solvente 1): 75%, 90% e 96,4%. Como o coeficiente de partição de B é o inverso do coeficiente
de partição de A, os correspondentes percentuais de B (nas frações inferiores, solvente 2) serão
exatamente os mesmos. É possível inclusive calcular quantas etapas serão necessárias para obter-
se, por exemplo, uma pureza igual ou maior a 99%, bastando aplicar a eq. 4. No caso, encontra-
se n = 5.
IMPORTANTE! Se kB também for maior que a unidade, a perda de B será muito grande e
também a purificação de A será muito demorada (exigirá maior número de etapas).
2.3. Distribuição em contracorrente
O procedimento descrito a seguir é um exemplo típico de extração líquido-

líquido. Na seção anterior foi demonstrado que uma substância inicialmente dissolvida em um
líquido 1 pode ser extraída por um líquido 2, desde que os dois líquidos sejam imiscíveis. Trata-
se de uma operação que é feita manualmente, com auxílio de um funil de separação, e que pode
ser repetida até a exaustão (literalmente!). O instrumento de Craig (ver Apêndice 1) é constituído
de um conjunto de um grande número de tubos de distribuição de Craig, cada um contendo
uma porção constante do líquido mais denso (em azul escuro na Figura 2.2), a um nível tal que
não passe para a câmara D através de C. Os diversos tubos são fixados, na mesma posição, a um
eixo (perpendicular ao papel, na figura). Adiciona-se então a amostra (contendo, por exemplo,
duas substâncias, como exemplificado na seção anterior) e o líquido menos denso (em azul
claro) ao primeiro tubo da seqüência (identificado com o no 1), estando os tubos na posição
mostrada em (a). Por rotação desse eixo (cerca de 45o), num movimento de vai-e-vem, promove-
se agitação da mistura (como se faria com um funil de separação) e em seguida deixa-se em
repouso por alguns instantes, para separarem-se de novo as duas fases. Finalmente, gira-se 90o,
de modo a colocar os tubos na posição (b). Nessa posição, o líquido menos denso flui através de
C para a câmara D. Após alguns instantes, retorna-se à posição (a), quando então o líquido
menos denso, através de E, passa para B do tubo seguinte, atingindo a câmara A. Então, começa
outro ciclo. A fração Fm,n do soluto contido no m-ésimo tubo depois de n transferências é dada
pela seguinte expansão binomial, onde kp é o coeficiente de distribuição, V1 é o volume do
líquido menos denso e V2 é o volume do líquido mais denso:
n! kp m V2
Fm, n = ⋅ n
⋅
m!(n - m)! (kp + 1) V1
. 2.4. Cromatografia em Fase Líquida
O exemplo mais simples de cromatografia a líquido é a separação em uma camada

delgada de sílica-gel depositada sobre uma placa de vidro (Cromatografia em Camada Delgada).
A Figura 2.3 ilustra o processo.
Figura 2.2 – Esquema do Aparelho de Craig para distribuição em contracorrente.
O líquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os componentes

de uma mistura binária (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicação). Quando o solvente se
aproxima da outra extremidade da placa (2), esta é removida da cuba que contém o solvente e na
qual estava parcialmente mergulhada, na posição vertical e a um nível abaixo do ponto de
aplicação. As razões de frente, RfA = d1 / d3 e RfB = d2 / d3 são características de cada substância,
dependendo da natureza da fase móvel e da fase estacionária. A Cromatografia em Camada
Delgada é a mais empregada em Análise Qualitativa ou semi-Quantitativa. Em virtude da
pequena quantidade de amostra utilizada, é menos indicada para fins preparativos, quando então
se emprega a Cromatografia em Coluna Clássica. Neste segundo tipo de processo, a fase
estacionária é colocada em um tubo de vidro (coluna cromatográfica) colocado na posição
vertical. A coluna é dotada de uma torneira na extremidade inferior (Fig. 2.4), que é utilizada
para controlar a vazão da fase móvel, que desce por gravidade.
Fig. 2.3 - Cromatografia em Camada Delgada.
Neste exemplo, a amostra contém dois componentes, A e

B, que são identificados pelos respectivos valores de Rf, por
comparação com padrões puros. A figura da capa é uma
reprodução fotográfica de uma CCD revelada1 com luz UV.
A necessidade de se controlar a vazão da fase móvel e a temperatura da coluna, além da

impossibilidade (naquela época - anos 50) de se bombear um líquido com fluxo constante e
contínuo, levaram os projetistas a abandonar essa técnica, passando a utilizar um gás como fase
móvel (1952).
O ponto A’ indica o nível da fase estacionária e o ponto A indica o

nível da fase móvel. A diferença (A’ – A) deve ser mínima, para evitar a
diluição do material a ser cromatografado, o que resultaria em zonas (na
Fig. 2.4, as faixas 1, 2 e 3) mais largas. Ao se fazer a eluição (passagem
da fase móvel), os componentes afastam-se do ponto de aplicação (topo
da coluna) a uma distância d tal que d/l = Rf (l é o comprimento da
coluna), obtendo-se assim uma coluna desenvolvida. A partir daí,
continuando-se a eluição, cada componente pode ser coletado
isoladamente, quando atingir o final da coluna. Denomina-se Volume de
Retenção (Vr) o volume de fase móvel necessário para a eluição
completa de um componente. Desse modo, tem-se Vr = V1 / Rf, onde V1
é o volume ocupado pela fase móvel dentro da coluna. Finalmente, pode
ser calculado o volume total de solvente necessário para a eluição
Figura 2.4 completa de todos os componentes da amostra, que é essencialmente
Cromatografia em Coluna igual ao Vr do componente que sai por último (menor Rf). No Apêndice
4, são discutidos mais detalhes sobre o desenvolvimento da coluna.
2.5. Fatores que influem na separação
Independentemente do processo envolvido na separação cromatográfica

(adsorção ou partição), esta é função de uma série de fatores, a saber:
Natureza da fase estacionária Vazão da fase móvel

Concentração da fase estacionária Temperatura
Natureza da fase móvel Granulometria e geometria do suporte
A polaridade da fase estacionária é um fator importante a se considerar. Em

princípio, quando se tem uma fase estacionária não polar, os diversos componentes da amostra
1
Ver Seção 4.1.d.
eluem1 na ordem crescente de seus pontos de ebulição (Figura 2.5) e o processo assemelha-se
bastante a uma destilação. Quando a fase estacionária apresenta alguma polaridade, essa ordem
de eluição em função do ponto de ebulição fica alterada (Figura 2.6) e só é obedecida quando os
componentes apresentam polaridade de mesma ordem de grandeza (componentes A-C e D-G da
Figura 2.7). Em alguns casos, a diferença de polaridade pode ser equilibrada com a diferença de
ponto de ebulição, fazendo com que dois componentes distintos eluam juntos (Figura 2.8).
Nesses casos, outros fatores podem auxiliar na separação, como a ponte de hidrogênio entre os
componentes D-G e a FE (Figura 2.7).
A concentração da fase estacionária líquida também influi na separação, como

pode ser observado na Figura 2.9. Aliás, com o uso, é normal diminuir a concentração, por
arraste pela fase móvel, mesmo à temperatura ambiente, de modo que colunas com fase
estacionária líquida possuem um tempo de vida útil finito. Este tempo de vida pode ser bastante
curto, na medida em que a temperatura da análise se aproxima da temperatura limite, que por
definição situa-se a 150oC abaixo da temperatura de ebulição da fase estacionária. Essa perda de
fase estacionária também acontece em HPLC, apesar de quase nunca se aquecer a coluna, porque
a imiscibilidade entre fase estacionária e fase móvel (agora um líquido) não é infinita.
Atualmente, têm sido desenvolvidas fases quimicamente ligadas (ver Seção 3.2 - Fase
Estacionária; p. 15).
FE: Esqualano (hidrocarboneto de baixíssima FE: TCEP (tris cianoetoxipropano)

polaridade)
B ⇒ ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0oC)

A ⇒ Benzeno (ponto de ebulição = 80,2oC)
Figura 2.5 – Separação em função da Figura 2.6 - Efeito da polaridade sobre a

diferença no ponto de ebulição separação cromatográfica
Figura 2.7 – Efeito da ponte de hidrogênio sobre a separação cromatográfica (Dados da coluna:
Fase estacionária diglicerol, 6 metros).
1
Eluição é o de transporte do analito promovido pela fase móvel ao longo de todo o sistema cromatográfico (placa ou coluna).
Outro fator importante, principalmente em HPLC, é a polaridade da fase

móvel. Aliás, esse é o principal recurso para implementar uma separação (ver Gradiente de
Polaridade, na Seção 4.2; p. 22). Também a vazão da fase móvel é muito importante na
separação. A Figura 2.10 ilustra a situação, que foi alvo de um estudo semi-teórico realizado por
van Deemter (Capítulo 3). A temperatura (a que está submetida a coluna) é outro fator
determinante na separação, particularmente em CFG, conforme resume o quadro anexo à Figura
2.11. Finalmente, a granulometria da fase estacionária sólida (ou do suporte sólido da fase
estacionária líquida), conforme mostrado na Tabela 2.1, também influi na separação.
FE: Apiezon (um hidrocarboneto)
A ⇒ Benzeno (ponto de ebulição = 80,2oC)

B ⇒ ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0oC)
Figura 2.8 - Uma separação mal-sucedida
Tabela 2.1 - Efeito da granulometria do suporte ou da FE sólida sobre a separação cromatográfica
malha/polegada nmáx Hmín Fo (mL/min)

60-80 4300 0,93 20
80-100 4600 0,87 20
100-120 5700 0,70 24
Dimensões da coluna: Diâmetro externo = 1/8”; comprimento = 4 m.
Figura 2.9 – Efeito da concentração da fase estacionária sobre a separação cromatográfica.
onde: V1 < V2 < V3 < V4

Figura 2.10, a – Efeito da vazão da fase móvel sobre a separação cromatográfica.
Figura 2.10, b – Efeito da polaridade da fase móvel sobre a separação cromatográfica (em
cromatografia a líquido).
Figura 2.11 - Efeito da temperatura sobre a separação cromatográfica.
O quadro apresentado a seguir sumariza a relação entre o efeito da temperatura

sobre o tempo de retenção e o tipo de processo. No primeiro caso (adsorção; cromatografia gás-
sólido), um aumento na temperatura da análise diminui o poder de adsorção (diminui a afinidade
com a fase estacionária) e aumenta a solubilidade na fase móvel. Logo, diminui o tempo de
retenção. No segundo caso, pelas mesmas razões, também ocorre diminuição do tempo de
retenção. No terceiro caso (partição; cromatografia gás-líquido), a afinidade com ambas as fases
aumenta, mas a solubilidade na fase gasosa (móvel) aumenta mais rapidamente que na fase
líquida (estacionária). Conseqüentemente, em termos relativos, a afinidade com a fase móvel
aumenta, acarretando também uma diminuição no tempo de retenção. No último caso, entretanto,
o aumento na solubilidade em ambas as fases é de mesma ordem de grandeza, de modo que
eventuais variações no tempo de retenção são, via de regra, imperceptíveis.
TIPO FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA EFEITO SOBRE TR

G S DIMINUI
ADSORÇÃO
L S DIMINUI
G L DIMINUI
PARTIÇÃO
L L NÃO ALTERA
2.6. Cromatografia em Fase Gasosa (CFG)
Na Cromatografia a Gás empregam-se colunas bem mais longas que aquelas

usadas em Cromatografia a Líquido. O princípio é o mesmo, mas a força motora é a pressão do
gás e não a força da gravidade, de modo que as colunas normalmente são dobradas em espiral, a
fim de ocupar menos espaço dentro do cromatógrafo. A Fig. 2.12 esquematiza um cromatógrafo
a gás e a Fig. 2.13 apresenta a fotografia de um cromatógrafo a gás moderno.
A amostra (gás, líquido ou sólido em solução) é injetada (ver Apêndice 2), com
auxílio de uma microseringa ou válvula apropriada, no Injetor, que também é o Vaporizador (V)
e os seus vapores são arrastados para o interior da coluna pela fase móvel (gás de arraste). Na
saída da coluna, a amostra passa pelo Detector (D), que envia um sinal para o Registrador (R).
Como será visto adiante (Detectores, p. 24), este sinal é proporcional à quantidade de cada
componente, o que permitirá uma análise quantitativa. Vale acrescentar que a Cromatografia a
Gás é talvez o método de análise mais preciso. O sinal eletrônico captado pelo registrador é
transformado num movimento da pena do mesmo. Como o papel de registro está em movimento,
obtém-se um gráfico (Fig. 2.14) denominado cromatograma.
Fig. 2.12 – Esquema de um cromatógrafo a gás Figura 2.13 – Cromatógrafo a gás.
Fig. 2.14 - Cromatograma de uma amostra com dois componentes.
As áreas A1 e A2 sob as duas curvas do cromatograma da Fig. 2.14 são

proporcionais às quantidades dos dois componentes na mistura. Distância de Retenção (Dr) é a
distância, no papel, entre o ponto registrado no momento da injeção (Início) e o ponto
correspondente ao máximo de cada curva (pico). Dr varia com a velocidade do papel (z), mas o
tempo de retenção (tr = Dr/z) é uma característica da substância que varia com a vazão da fase
móvel, a natureza e a concentração da fase estacionária e com a temperatura. Por isso, o
cromatógrafo possui controladores de vazão da fase móvel e da temperatura do forno da coluna.

A coluna (e conseqüentemente a fase estacionária) pode ser substituída, até encontrar-se a coluna
ideal para uma dada amostra. Além disso, existe uma vazão ideal para cada coluna,
independentemente da natureza da amostra (ver Fig. 2.15). Assim sendo, a temperatura da coluna
é o principal recurso disponível para obter-se um máximo de separação entre os diversos
componentes da amostra.
Outro parâmetro usado em CFG é a Retenção Relativa (RR), que é também

usado na identificação:
tr2 Vr2 Dr2

RR = = =
tr1 Vr1 Dr1
Essas relações são equivalentes, desde que Vr2 = F.tr e F e z são constantes (F = vazão da fase
móvel).
Fig. 2.15 - Relação entre F e n ou H. Fi é a Vazão Ideal (os parâmetros A, B e C são descritos na
Seção 3.1, eq. 5).
Obs.: Experimentalmente determina-se H por medição da distância de retenção e aplicação das

equações abaixo, onde l é o comprimento da coluna e L é a largura do pico na base. A Figura
2.16 ilustra o procedimento. O parâmetro n mede a eficiência de uma coluna cromatográfica
(ver Capítulo 3).
n = (4Dr/L)2 e H = l/n,
Figura 2.16 - Procedimento para determinação do

número de pratos teóricos. As duas
grandezas devem ser medidas em
milímetros (ou em minutos ou
segundos).
n = (4Dr/L)2
O Apêndice 8 discute outros parâmetros importantes relacionados com a

separação.
3 - TRATAMENTO TEÓRICO DA CFG
3.1. a equação de Van Deemter
Van Deemter estabeleceu uma equação empírica (eq. 6) que relaciona as diversas
variáveis da Cromatografia a Gás com H (altura equivalente a um prato teórico). Como H é igual a l/n e
n mede a eficiência do processo, buscam-se condições em que o valor de H é mínimo:
(eq. 5)
λ= Parâmetro adimensional que mede as irregularidades no empacotamento da coluna.

dp = Diâmetro médio das partículas do suporte.
Dg = Coeficiente de difusão da amostra na fase móvel.
γ= Fator de correção para a tortuosidade dos canais entre partículas.
K’ = k.Nl /Ng ; k = coeficiente de partição.
N= Fração de fase estacionária (l) ou da fase móvel (g) dentro da coluna.
df = Espessura efetiva do filme líquido (película de fase estacionária na superfície do suporte).
Dl = Coeficiente de difusão da amostra na fase estacionária.
v= Velocidade linear da fase móvel.
A equação de Van Deemter pode ser escrita sob a forma geral da equação 7,
que é a equação de uma hipérbole (Fig. 2.15).
H = A + B/v + C.v (eq. 7)
Como pode ser visto na eq. 6, o modo de empacotamento, o dimensionamento do

suporte e o coeficiente de difusão da amostra em cada fase são fatores que devem ser seriamente
considerados, quando é projetada uma coluna. Temperatura é talvez o fator mais importante, embora não
apareça explicitamente na eq. 6. É que K’ e D são altamente dependentes da temperatura. Realmente,
observa-se na prática que esta é a variável que mais influi na resolução, em Cromatografia a Gás,
variando drasticamente a retenção relativa. De um modo geral, o tempo de retenção depende da natureza
da fase estacionária, da temperatura de operação e da vazão da fase móvel.
3.2. Fase estacionária
A fase estacionária é um sólido (Cromatografia de Adsorção) altamente poroso (mais

de 150 m2/g), ou, mais comumente, um líquido (Cromatografia de Partição). No segundo caso, o líquido é
depositado sobre um sólido (suporte), que será discutido mais adiante.
Interações entre dipolos, polaridade e pontes de hidrogênio são os principais
fatores, na fase estacionária, que determinam a separação cromatográfica. Esses fatores são
dependentes da temperatura, daí também a necessidade de um controle dessa variável. Os

Cromatogramas 3.1.a e 3.1.b ilustram a influência da polaridade e da ponte de hidrogênio sobre
a separação. Em ambos, como são usadas fases estacionárias polares, os picos aparecem na
ordem crescente de polaridade dos componentes. Mas, no Cromatograma 3.1.b, como a fase
estacionária (diglicerol) interage com o etanol (ponte de hidrogênio), o tempo de retenção deste
é bastante aumentado (ver também Seção 2.5; p. 8).
Alto ponto de ebulição e inércia química e catalítica (em relação à amostra, à

fase móvel e ao material de que é constituído o tubo da coluna) são os principais requisitos para
uma fase estacionária. Em relação a ponto de ebulição (PE) deve ser lembrado que a temperatura
limite para operação com uma dada coluna é 1500C abaixo do PE da fase estacionária. Acima
dessa temperatura, a perda por volatilização é excessiva. Em anos recentes tem sido utilizada a
FQL (Fase Quimicamente Ligada), onde a FE une-se ao suporte mediante uma reação química.
As fases estacionárias mais freqüentemente utilizadas, com um amplo espectro de aplicações, são
polímeros derivados de silício, as polisiloxanas (ou siliconas), como a SE-30, por exemplo.
Outra fase também bastante utilizada é o polietilenoglicol (ex.: Carbowax 20M).
3.3. Suporte
O suporte tem a função de fixar dentro da coluna a fase estacionária. É

necessário que o suporte seja quimicamente e também cataliticamente inerte. O material a ser
empregado também não pode exibir área superficial maior que 50 m2/g, alta porosidade, nem
grande poder de adsorção. Centros ativos (ácidos ou básicos) podem provocar modificações
estruturais na amostra, devendo ser removidos. Terras diatomáceas, graças à sua baixa
capacidade de adsorção e à sua baixa porosidade, são ainda bastante empregadas como suporte.
Um excelente suporte à base de diatomácea é comercializado com um nome constituído da
palavra Chromosorb seguida de uma ou mais letras (ex.: Chr WHP). Atualmente, têm sido
desenvolvidos materiais sintéticos, copolímeros do etilvinilbenzeno com divinilbenzeno. Outros
monômeros, como cianovinilbenzeno, também são empregados, para modificar a polaridade da
FE. A depender do processo de fabricação, esses polímeros também podem ser empregados
como fase estacionária (Ex.: Porapak Q, Chromosorb 101, etc). Permitem um bom
empacotamento, graças à uniformidade na granulometria e na própria geometria das partículas.
Também a porosidade pode ser controlada na fabricação.
Figura 3.1 - Ausência (a) e presença (b) de ponte de hidrogênio entre FE e etanol
3.4. Coluna
O material de que é constituída a coluna (tubo) pode ser aço inox 316,
alumínio, níquel, vidro ou teflon. Quando não se conhece o material a ser analisado, dá-se
preferência às colunas de vidro (trata-se de um vidro especialmente tratado, para remover centros
ácidos de sua superfície) ou de teflon, sendo que esta última tem emprego mais restrito, devido à
sensibilidade ao calor e à pressão. As colunas são classificadas quanto ao diâmetro externo:
- Coluna microanalítica (capilar) ......... 0,05 a 0,53 mm

- Coluna analítica .................................. 1/8”, 3/16” e 1/4”
- Coluna semipreparativa ..................... 3/8”, 1/2” e 5/8”
- Coluna preparativa .............................. 5, 7 e 10 cm
As colunas analíticas mais comumente empregadas possuem 2–3 m de

comprimento, com 1.000–10.000 pratos teóricos. Colunas capilares são bem mais longas. As
primeiras capilares fabricadas possuíam mais de 100 m. Com o avanço da tecnologia, o
comprimento atual situa-se entre 20–60 m, embora com cerca de 100.000 pratos teóricos. Tem-
se notícia de uma coluna capilar com cerca de 1600 m de comprimento e 1 milhão de pratos
teóricos. Geralmente as colunas capilares são construídas com sílica fundida, recoberta
externamente por uma película de poliimida. O suporte é a própria parede interna da coluna,
onde a fase estacionária líquida é depositada com uma espessura uniforme. A espessura do filme
líquido varia entre 0,1 µm e 5 µm. As colunas capilares recebem denominações diferentes, em
função do diâmetro interno:
Microbore: 0,05 mm e 0,10 mm
Minibore: 0,18 mm
Midibore: 0,25 mm e 0,32 mm
Megabore: 0,45 mm e 0,53 mm
As colunas capilares “megabore” são mais simples de instalar, reúnem as
qualidades das colunas analíticas (injeção de volumes maiores) e das capilares (resolução mais
alta). As colunas usadas em CLAD (seção 4.2, 24) são bem mais curtas (10–40 cm) e os
diâmetros encontrados mais comumente no comércio especializado variam entre 3–7 mm.
3.5. Fase móvel
Em CFG, a fase móvel é um gás inerte, devendo apresentar-se bastante puro1,

principalmente quando se tratar da análise de traços. Os gases mais empregados são H2, N2, He,
Ar e Ne, podendo também ser utilizados outros, em casos especiais.
Na escolha da fase móvel (ou gás de arraste), devem ser considerados os
seguintes fatores:
1
A pureza dos gases empregados em cromatografia é dada de uma forma codificada. Por exemplo, a pureza do hidrogênio
empregado em detectores de ionização de chama é 4.5, que corresponde a 99,995 (o número 4 indica a quantidade de noves).
- Disponibilidade/custo. - Segurança.
- Eficiência na separação. - Efeito sobre o sistema de detecção.
- Efeito sobre o tempo de análise.
OBSERVAÇÃO:
1 - A equação de Van Deemter simplificada (eq. 7), aplicada aos gases N2 e H2, apresenta os seguintes
coeficientes (amostra: Propano), com uma dada coluna:
Ha = 0,1 + 0,07/v + 0,05v (N2)

Hb = 0,1 + 0,28/v + 0,05v (H2)
Esses dados comprovam a influência da natureza do gás de arraste sobre a eficiência.
2 - A velocidade relativa de eluição aumenta na ordem H2 < N2 < He < Ar, fato que demonstra a influência
da natureza do gás de arraste sobre o tempo de análise.
A Tabela 3.1 resume a aplicação dos critérios acima mencionados, para seleção
da fase móvel em função do detector empregado.
Tabela 3.1 - Gases mais recomendados para CFG, por tipo de detector.
GASES MAIS USADOS
TIPO DE DETECTOR
(Ordem de prioridade)
Condutividade Térmica H2 > He >> N2
Ionização por Chama N2 > Ne > He
Captura Eletrônica N2 > He
Em Cromatografia a Líquido empregam-se como Fase Móvel principalmente

água deionizada, metanol, acetonitrila, etc. A seleção depende do detector a ser empregado e a
fase móvel deve ser imiscível com a fase estacionária liquida. Em vez de água deionizada, é
aconselhável empregar uma água de maior pureza, como a produzida em um equipamento da
Millipore (Milli-Q). Um outro detalhe muito importante é que a fase móvel, além de ser de alta
pureza, deve ser filtrada em filtros especiais com diâmetro de poros de no máximo 0,45 µm.
Além disso, a fase móvel também deve ser desgaseificada (ver página 23), para evitar que
ocorram problemas como picos falsos, alto ruído, cavitação na bomba e até quebra do pistão.
4 - O CROMATÓGRAFO
4.1. O Cromatógrafo a Gás
A Fig. 2.12 (p. 13) representa esquematicamente um Cromatógrafo a Gás. É

possível agora descrever mais detalhadamente o instrumento.
a) Controles de Temperatura
O cromatógrafo dispõe de termostatos para controle independente do

aquecimento dos três principais setores: câmara de vaporização (é o próprio injetor), forno da
coluna e bloco do detector. O aquecimento da coluna, promovido por uma resistência elétrica
localizada na base do forno, é homogeneizado por um ventilador, que pode permanecer ligado
após o final do aquecimento, de modo a acelerar o resfriamento. Nesse caso, o compartimento do
forno deve permanecer aberto, exceto nos equipamentos que possuam dispositivo de
resfriamento automático.
Figura 4.1 - Fluxímetro de bolha Figura 4.2 - Divisor de fluxo para coletor
b) Controles Pneumáticos
Os cromatógrafos a gás normalmente possuem uma válvula controladora de

pressão e outra para ajuste da vazão da fase móvel. Idênticos sistemas existem para o controle
da vazão dos gases auxiliares (ver seção 4.3.2.b; p. 26). A vazão é medida com o auxílio de
um fluxímetro de bolha, ou bolhômetro (Fig. 4.1). A “pêra” (parte inferior) contém uma
solução de sabão líquido. Comprimindo-se a “pêra”, o nível do líquido sobe e o gás forma
uma bolha que ascende pelo tubo. Para se determinar a vazão, é suficiente marcar com um
cronômetro o tempo gasto para a bolha percorrer os 20 mL do tubo. Na atualidade, existem no
mercado alguns equipamentos totalmente microprocessados, tornando obsoletos esses
acessórios.
c) Coletor de Frações
O coletor de frações é um acessório utilizado em Cromatografia preparativa. O

material efluente da coluna pode passar por um divisor de fluxo (Fig. 4.2), de modo que uma
parte é desviada para o coletor, onde cada componente, isoladamente, é condensado. Colunas de
maiores dimensões permitem a injeção de uma maior quantidade de amostra, permitindo assim a
produção de pequenas quantidades de um material com alta pureza (maior que 99,9999%), que
pode ser empregado como padrão, por exemplo.
d) Detectores
Nos primórdios da Cromatografia, a visualização dos diversos componentes da

amostra era possível porque os mesmos eram coloridos (daí o nome da técnica). Os primeiros
pesquisadores que trabalharam com substâncias incolores desenvolveram vários procedimentos
para torná-las coloridas. Surgiram então os reveladores. Reagentes, como o iodo, o ácido
sulfúrico, a 2,4-dinitrofenil-hidrazina, entre vários outros, que borrifados sobre a placa
desenvolvida, geram manchas coloridas (spots), permitindo assim a visualização do
cromatograma. Tanto na placa quanto na coluna, iluminação com luz ultravioleta (UV) também
permite a visualização das zonas ocupadas pelos componentes (evidentemente, apenas aqueles
que absorvem luz UV). Para a quantificação, Tswett e seus seguidores empregavam técnicas de
degradação química, que consiste em transformar o analito desconhecido em alguma substância
já conhecida e em seguida desenhar a reação (ou as reações) realizada(s), do fim para o começo,
para chegar à estrutura do desconhecido. A idéia de colocar um feixe de luz UV na saída da
coluna e aproveitar a relação matemática associada à absorção da luz pelo analito (lei de Beer) é
um exemplo do desenvolvimento de detectores (dispositivos que em contato com o analito geram
um sinal que é registrado e quantificado). O momento da detecção também é registrado (tempo
de retenção), de modo que os detectores modernos fazem simultaneamente a identificação e a
quantificação da amostra. Por ser necessário um estudo mais detalhado, esses detectores serão
discutidos mais adiante (Seção 4.3).
e) Eletrômetro
O eletrômetro é um amplificador de sinal. Este módulo pode ser controlado a

qualquer instante, de modo que um sinal fraco (componente menor) pode ser ampliado
independentemente dos outros, enquanto que um sinal muito forte (componente maior) pode ser
atenuado o suficiente para que seu pico fique contido no papel do registrador. Os cromatogramas
as Figuras 4.3 e 4.4 ilustram, respectivamente, a relação real de áreas e outro registro da mesma
amostra, com ampliação do primeiro sinal e atenuação do terceiro, ou mais exatamente,
atenuação menor para o primeiro e atenuação maior para o terceiro, em relação à atenuação do
segundo. Logicamente, as áreas medidas no segundo cromatograma, multiplicadas pelos
respectivos fatores de atenuação, fornecem os valores reais das áreas relativas.
Figura 4.3 – Mesma atenuação Figura 4.4 - Atenuações diferentes
f) Registrador
O registrador é um instrumento acessório, que transforma o sinal emitido pelo

detector e amplificado pelo eletrômetro, em um sinal mecânico. Na extremidade do sistema
mecânico existe uma caneta (pena) e a magnitude de seu deslocamento, acima da linha de base, é
proporcional à quantidade do componente na amostra. Como o papel está em movimento, obtém-
se uma curva (cromatograma), onde a distância do início da análise (ponto de injeção) ao
máximo de cada pico é a distância de retenção (Dr). Dividindo Dr por z (velocidade do papel),
obtém-se o tempo de retenção, Tr. Idealmente, com separação completa e condições ótimas
(incluindo seleção perfeita da fase estacionária), obtém-se uma curva simétrica. Este
equipamento está em desuso. No Apêndice 3 são discutidas outras técnicas de aquisição de
dados.
g) Programador Linear de Temperatura
Às vezes numa mesma amostra existem alguns componentes que eluem

rapidamente e já bastante próximos entre si nas condições de análise (componentes 1, 2 e 3 da
Figura 4.5), enquanto que outros apresentam um tempo de retenção excessivamente alto com
uma separação desnecessariamente alta (componentes 4 e 5 da Figura 4.5). Para reduzir o tempo
de análise e obter um pico mais agudo para os últimos componentes (o que inclusive diminuiria o
erro na determinação de Dr e melhoraria o Limite de Detecção1), a opção de empregar uma
temperatura mais alta acarretaria uma diminuição na já pequena retenção relativa dos primeiros
componentes. Em situações como essa, pode-se aplicar um gradiente de temperatura, com o
auxílio de um Programador Linear de Temperatura (PLT). A velocidade de aquecimento pode
ser controlada, sendo possível também promover um aquecimento isotérmico em algumas
regiões. Em operações desse tipo deve-se indicar no cromatograma a temperatura inicial (Ti), a
temperatura final (Tf), que não deve diferir da temperatura de ebulição da fase estacionária em
menos de 1500C, e a velocidade de aquecimento, para que o cromatograma possa ser
reproduzido posteriormente (Figura 4.6).
1
Ver Apêndice 2.
Figura 4.5 - Análise Isotérmica. Figura 4.6 - Análise com PLT.

1 (1,25 min), 2 (1,43 min), 3 (1,54 min), 4 (3,2 min) 1 (1,25 min), 2 (1,43 min), 3 (1,54 min), 4 (2,9 min)
e 5 (4,1 min). e 5 (3,3 min).
4.2. O Cromatógrafo a Líquido
O cromatógrafo a líquido, mais comumente conhecido pela sigla inglesa da

técnica, HPLC (High Performance Liquid Chromatography; em português: Cromatografia
Líquida de Alto Desempenho), é um instrumento mais simples que o cromatógrafo a gás nos
seguintes aspectos (ver Figura 4.3a):
a) só possui um canal analítico, enquanto CG’s podem ter até quatro canais;
b) é modulado, isto é, o sistema de bombeamento e o detector são independentes, o
que facilita a substituição de detectores;
c) opera geralmente à temperatura ambiente;
A Figura 4.7b é um diagrama em blocos de um CL típico. Cada bloco é

descrito a seguir:
Figura 4.7a – Cromatógrafo a Líquido (HPLC). Figura 4.7b - Diagrama em blocos de um HPLC.
a) Reservatório de Fase Móvel
A Fase Móvel (um líquido puro ou uma mistura de composição definida) deve ser
filtrada em membranas com 0,46 µm de diâmetro de poros e desgaseificada (ver próximo item).
b) Sistema de desgaseificação
A Fase Móvel deve ser desgaseificada, para evitar a formação de bolhas, as

quais podem provocar cavitação (com conseqüente dano à bomba) ou gerar picos falsos, ao
passarem pela célula do detector. São conhecidas várias técnicas de desgaseificação:
- aquecimento com agitação; - ultra-som;

- borbulhamento de gás hélio; - vácuo.
c) Bomba
O bombeamento da Fase Móvel é realizado por uma bomba controlada por um

microprocessador, o qual pode alterar a velocidade de sucção (para evitar vaporização de fase
móvel mais volátil) e a vazão (importante quando a análise é realizada com Gradiente de
Polaridade, em cujo caso há necessidade de uma segunda bomba; ver mais adiante).
d) Válvula de injeção
A amostra é sempre introduzida com auxílio de uma válvula, porquanto a

pressão de trabalho raramente é menor que 20 atmosferas (Apêndice 2).
e) Coluna
As colunas empregadas em CL são retas, uma vez que seu comprimento

raramente ultrapassa 30 cm, ocupando, portanto, muito pouco espaço no equipamento.
f) Detector
Os detectores utilizados em CL serão descritos na próxima seção.
g) Sistema de aquisição de dados.
Os sistemas de aquisição de dados empregados em CL são os mesmos

empregados em CG, ou seja, registradores, integradores ou microcomputadores (Apêndice 3).
Gradiente de Polaridade
Quando o CL dispõe de apenas uma bomba, é evidente que a fase móvel tem
uma composição constante, do início ao fim da análise. Nessa situação, a polaridade da mesma
também é constante. Diz-se então que o processo é isocrático. Quando se dispõe de duas
bombas (ou mais), é possível variar a composição da fase móvel, colocando-se em cada
reservatório um líquido de polaridade diferente. O microprocessador altera a vazão de cada linha
de líquido, de modo que a partir do ponto de confluência a vazão seja constante. Nesse caso, diz-
se que o processo ocorre com gradiente de polaridade. Substituindo-se temperatura por
polaridade, podem ser utilizados os cromatogramas das Figuras 4.5 e 4.6 (página 22) como
ilustração de um processo isocrático de um processo com gradiente de polaridade,
respectivamente.
4.3. Detectores
4.3.1. Generalidades
Os detectores mais empregados são do tipo diferencial. A sua resposta (R),

dada pelas áreas relativas dos picos, é proporcional à concentração de cada componente
(detectores de condutividade térmica) ou à velocidade de fluxo de massa do componente
(detectores de ionização):
dm
R = K1.C R = K 2.
dt
Dentre os detectores dos tipos descritos acima, destacam-se, pelo maior uso, os
seguintes: detector de condutividade térmica (DCT), detector de ionização por chama (DIC) e
detector de índice de refração (DIR), embora existam outros, de mais restrita aplicação. A
escolha do detector é importante e depende do material a ser analisado. As principais
características dos detectores, que devem ser consideradas quando da seleção do detector mais
apropriado, são as seguintes (ver Apêndice 1, p 56):
- Sensibilidade - Custo/vida útil

- Nível de ruído - Universalidade
- Resposta (Sinal) - Especificidade / Seletividade
- Faixa de linearidade dinâmica - Limite de Detecção (relação sinal/ruído).
4.3.2. Detectores empregados em Cromatografia a Gás
a) Detector de Condutividade Térmica (DCT)
O sistema de detecção por diferença de condutividade térmica consiste de dois

pares filamentos (células para amostra e células de referência), os quais fazem parte de uma
ponte de Wheatstone (Figuras 4.8a e 4.8b). O filamento pode ser de platina, níquel, tungstênio
ou ligas de tungstênio, como W/Re, normalmente coberto de ouro, para aumentar a resistência à
corrosão. Faz-se passar corrente pelos filamentos e estes perdem calor para o gás de arraste. No
momento em que a amostra atingir a célula correspondente, o filamento perderá calor para a
solução (gás de arraste + amostra). Como a solução possui condutividade térmica diferente da
fase móvel pura, a temperatura do filamento é alterada, o mesmo ocorrendo com a sua resistência
elétrica. Essa variação na resistência é medida pela ponte. Note-se que quanto maior for a
concentração do material analisado, maior será a variação na corrente e portanto maior será o
sinal (R = K.C). A sensibilidade de um detector de condutividade térmica pode ser avaliada pela
equação:
2 ( λ g - λ s)
S = KI . . (T f - T b ) (eq. 8)
λg
onde:
S = sensibilidade (mV.cm3/mg) λg = condutividade térmica do gás de arraste (cal/cm.s)

K = constante da célula λs = condutividade térmica da substância (cal/cm.s)
I = intensidade de corrente (mA) Tf = temperatura do filamento (oC)
R = resistência do filamento (Ohm) Tb = temperatura do bloco (oC)
IMPORTANTE ! Se as células do detector contiverem ar atmosférico no momento em que o

circuito for energizado ocorrerá queima do filamento. Portanto, deve-se primeiro fazer circular o
gás de arraste.
Figura 4.8.a - Bloco do Detector de Condutividade Térmica.

Figura 4.8b- Diagrama Eletrônico do DCT
b) Detector de Ionização por Chama (DIC)
A Figura 4.9 representa o circuito eletrônico de um DIC. Rv é uma resistência

variável, cujo valor depende do número de partículas entre os eletrodos. O efluente da coluna, ao
passar entre os eletrodos, é ionizado. Nos DIC, a fonte de ionização é a chama resultante da
combustão de hidrogênio com ar (gases auxiliares). A corrente contínua gerada pela fonte
(fonte CC, Fig 4.9.b) é transportada do polarizador para o coletor (Fig 4.9.a) por impurezas
existentes na fase móvel ou por partículas de fase estacionária líquida arrastada pela fase móvel,
por exemplo. No amplificador existe outra fonte de corrente, sendo esta variável e de sentido
contrário, permitindo assim zerar a corrente resultante no circuito. Quando um componente da
amostra atinge o detector, caso possua átomos de carbono e átomos de hidrogênio (uma
substância orgânica, portanto), entrará em combustão, sendo ionizado. Com a ionização,
aumenta a corrente de saída do coletor, o que irá gerar uma tensão (∆V), a qual é ampliada pelo
amplificador eletrométrico e enviada ao registrador/integrador. Evidentemente, a sensibilidade
do detector dependerá da facilidade relativa de ionização de cada componente da amostra.
Fig. 4.9.a- Estrutura física de um DIC
c) Detector de Captura Eletrônica (DCE)

Embora possuindo circuito semelhante ao de um DIC, o DCE, ao contrário

daquele, mede a queda de corrente quando da passagem de amostra pelos eletrodos (Rv). Uma
fonte de 3H-1 ou de 63Ni ioniza as moléculas do gás de arraste (N2), liberando os elétrons
responsáveis pela corrente (corrente de fundo). Se uma substância capaz de absorver esses
elétrons passar pelo detector, haverá uma queda na corrente, resultando num sinal que também
será amplificado e enviado ao registrador.
Aqui, a sensibilidade do detector depende da capacidade de absorção de

elétrons por parte dos diversos componentes da amostra.
Fig. 4.9.b- Circuito eletrônico de um DIC / DCE
d) Propriedades dos detectores
A Tabela 4.1 é auto-explicativa e sumariza as principais propriedades dos

detectores, auxiliando no trabalho de seleção do detector mais apropriado para uma análise. O
Apêndice 5 descreve outros detectores de uso menos extensivo, como o DNP e o DFC.
Tabela 4.1 - Propriedades dos principais tipos de detectores empregados em CFG.
PROPRIEDADES DCT DIC DNP DCE

Limite de detecção 1 ppm 100 ppb 0,1 ppb 0,1 ppb
Faixa de linearidade 104 107 104 102
Vazão da fase móvel 1-103 mL/min 1-200 mL/min 10-100 mL/min 10-100 mL/min
Quant. típica de amostra 1 - 40 µL 0,05 – 5 µL 1 - 5 µL 1 - 5 µL
Compostos Detectados todos orgânicos nitrogenados e fosforados halogenados
Áreas de aplicação uso geral orgânicos resíduos de pesticidas resíduos de pesticidas
4.3.3. Detectores empregados em CLAD

Os detectores mais empregados em Cromatografia a Líquido de Alto

Desempenho (CLAD), embora existam outros tipos de detectores são:
a) Detectores de índice de refração
À semelhança do detector de condutividade térmica, o detector de índice de

refração é o mais antigo, menos sensível e o único universal, dentre os detectores empregados
em CLAD. Baseando-se na diferença de índice de refração entre a fase móvel e cada
componente da amostra, conhecem-se dois tipos de detectores IR:
• Os detectores tipo deflexão utilizam como elemento ativo um diodo capaz de gerar uma corrente
contínua cuja intensidade é proporcional ao ângulo de incidência da luz que atravessa a célula
(Figura 4.10). Ao passar pela célula analítica uma substância com índice de refração diferente daquele
da fase móvel, haverá uma alteração no ângulo de incidência, resultando numa variação na intensidade
de corrente, que é proporcional à concentração dessa substância na célula e conseqüentemente
também proporcional à sua concentração na amostra.
Figura 4.10 - Detector de Índice de Refração tipo deflexão.
• Os detectores tipo Fresnel baseiam-se no fato da luz incidente sobre o sistema mostrado na
Fig. 4.7 ser fracionada em dois feixes: uma parte da luz é refletida e a outra parte é refratada.
De acordo com a Lei de Fresnel, a relação entre essas duas frações é função do índice de
refração. Assim, ao passar uma substância (transportada pela fase móvel) pela célula, altera-
se o índice de refração e, portanto, o percentual de luz refratada. Utilizando-se como
fotodetector um diodo sensível à intensidade de luz, a corrente gerada por este será alterada
de um modo proporcional à concentração dessa substância na amostra.
b) Detectores de UV-VIS
Os detectores de ultravioleta-visível (UV-VIS) baseiam-se na Lei de Lambert-

Beer, que estabelece uma relação linear entre Absorbância e Concentração:
A=ε.l.c
onde l é o caminho ótico (distância percorrida pela luz dentro da solução; espessura da célula).
A constante de proporcionalidade ε denomina-se absortividade. A absorbância, por sua vez, é
proporcional à transmitância, fração de luz transmitida. Quando o conteúdo da célula (Fig. 4.11)
é transparente à radiação empregada (UV ou VIS), a transmitância é 100 % e evidentemente a
absorbância é ZERO. Entretanto, quando chega à célula uma substância que absorva essa luz, o
sistema de detecção mede a diferença em intensidade, gerando o cromatograma correspondente.
Os instrumentos mais comuns (e mais baratos) utilizam como fonte de radiação

uma lâmpada de mercúrio, cuja radiação é monocromática (discreta), com comprimento de onda
de 254 nm. Esses instrumentos, portanto, operam com um comprimento de onda fixo (e único).
A Fig. 4.12 representa um diagrama esquemático desse tipo de instrumento. Como a região útil
da radiação UV varia de 190 nm a 370 nm, é de se esperar que mesmos os compostos que
absorvem luz UV não venham a ser detectados em um detector do tipo fixo, ou que sejam
detectados com baixa sensibilidade. Para se conseguir uma varredura em toda a região UV, é
primordial, evidentemente, que a fonte de radiação possa emitir luz com todos os comprimentos
de onda da faixa de interesse (fonte não monocromática, ou contínua). Para tanto, emprega-se a
lâmpada de deutério. Nesse caso, o instrumento (UV variável) necessita de um dispositivo que
selecione um determinado comprimento de onda, de modo a irradiar a amostra com uma luz
monocromática. Esse dispositivo chama-se “monocromador”. A seleção do comprimento de
onda pode ser manual (UV ajustável). Nesse caso, comporta-se como um UV fixo, embora possa
ser selecionado qualquer comprimento de onda dentro da região UV. Existe um outro tipo de
equipamento (UV de varredura), no qual a alteração do comprimento de onda é automática, indo
de um ao outro extremo da região UV, num intervalo de tempo muito menor que o tempo de
residência da amostra na célula analítica. Com esse equipamento, substâncias que absorvam em
comprimentos de onda bem diferentes podem ser detectadas em uma única corrida. Também
existem equipamentos que operam na região visível (400-750 nm), que empregam uma lâmpada
de tungstênio, cuja radiação também é contínua. Finalmente, existem equipamentos que operam
em ambas as faixas (UV-VIS).
Figura 4.11 - Detector de Índice de Refração tipo Fresnel.
Figura 4.12 - Detector de Ultravioleta fixo

5 - ANÁLISE QUALITATIVA
O tempo de retenção (Tr) é uma característica físico-química e como tal

permite que se faça análise qualitativa, desde que se disponha de um padrão. Na falta do padrão,
é necessário coletar cada componente isoladamente e identificá-lo por outros métodos analíticos;
espectrometria, por exemplo. Atualmente, são comercializados cromatógrafos (a gás e a líquido)
cujo detector é um espectrômetro de massas.
Quando uma amostra é submetida à análise, é preciso fornecer ao analista

alguns dados a respeito da mesma:
- Origem (de síntese, natural, etc?);

- Componentes prováveis (espécie, número);
- Composição quantitativa provável;
- Solubilidade;
- Faixa de ponto de ebulição (amostra líquida);
- Outros dados relacionados com as variáveis do processo.
Quanto maior for o número de informações, mais rapidamente o analista

encontrará as condições ideais de análise. Como existe apenas uma vazão ideal para cada
coluna, resta ao analista procurar a coluna e a temperatura (ou programação de
temperatura) ideais. Existem outros modos de efetuar a identificação, os quais serão
estudados mais adiante (Capítulo 8).
6 - ANÁLISE QUANTITATIVA
6.1. Introdução
Para se determinar a composição de uma mistura (Análise Quantitativa) é

necessário medir as áreas relativas dos picos de todos os componentes. Entretanto, nem sempre o
número de picos é igual ao número de componentes, pois além da probabilidade de ocorrer
superposição, alguns componentes poderão não ser detectados, o tempo de análise poderá ser
inferior ao tempo de retenção de um componente menos volátil, etc. O uso de uma referência
(padrão) permite, contudo, determinar a percentagem de um dado componente, mesmo que não
apareçam os picos dos outros componentes.
Antes de se efetuar o cálculo da composição, entretanto, é preciso fazer as correções

das áreas, pois a relação das áreas de dois componentes quase sempre é diferente da relação entre as suas
massas (composição em massa). Isto porque a sensibilidade (Resposta) de um detector a duas diferentes
substâncias normalmente é diferente. Analisando a eq. 8 (p. 25) é verificado que além de outros fatores, a
sensibilidade dos detectores de condutividade térmica depende da diferença λg - λs. Como λs varia de
substância para substância, podemos dizer que uma mistura binária qualquer contendo 50% de cada
componente muito provavelmente terá uma relação de áreas diferente da unidade. Com os detectores de
ionização por chama (e também com os de captura de elétrons) existe esse mesmo problema, pois a
facilidade de se ionizar (ou de capturar elétrons) varia de substância para substância. Aliás, essa afirmação
vale para qualquer outro tipo de detector, inclusive aqueles empregados em Cromatografia a Líquido.
Assim sendo, vale a pena repetir, é necessário primeiro determinar os fatores de resposta para as áreas e só
depois efetuar o cálculo da composição.
6.2. Medição de Área
A área de um pico pode ser medida por vários métodos, a saber:
a) Com auxílio de um planímetro.

b) Por pesagem (recorta-se cada pico e pesa-se em balança analítica).
c) Com auxílio de um integrador:
de disco (eletromecânico)
eletrônico
d) Determinação gráfica:
i) S = h.L (triangulação)
ii) ii) S = h.L’ (meia-altura),
onde h é a altura do pico, medida desde a linha de base até o ápice do mesmo, L é a largura na
base (distância entre os pontos em que a linha de base é interceptada pelas tangentes traçadas nos
dois ramos da curva) e L’ é a largura do pico na metade de sua altura, como se vê na Figura 6.1.
A unidade de medida dessas grandezas deve ser o milímetro.
O planímetro é um dispositivo mecânico, articulado. Na medida em que se

percorre o perímetro do pico, um ponteiro percorre uma escala. A leitura ao final do perímetro é
a área do pico. O traçado do integrador de disco é mostrado abaixo do pico, na fig. 6.1. O uso de
um integrador permite determinar a área com um erro da ordem de 0,1%. Entretanto, os erros
dos outros métodos, em torno de 0,5 - 1%, é bastante aceitável para a maioria das finalidades.
Dado o alto custo dos integradores, principalmente os eletrônicos, muitos Laboratórios ainda
utilizam o método gráfico. Atualmente, encontram-se no mercado várias versões de softwares
(com a respectiva interface), que substituem com muitas vantagens (inclusive de custo) os
integradores eletrônicos.
A utilização do planímetro exige habilidade do operador, de modo que o erro

poderá ser bem maior que 1% (a precisão normalmente é baixa). O método de pesagem, por sua
vez, é pouco empregado em virtude de exigir a destruição do cromatograma. Dentre os métodos
gráficos (i e ii), o da meia altura (ii) é recomendado para os picos cuja linha de base não está
bem definida e também por causa da imprecisão no traçado das tangentes. Entretanto, a medição
de uma largura L’ (da ordem de 5 mm) muitas vezes acarreta um erro da mesma magnitude do
erro da medida de L (triangulação), de modo que os dois métodos, em geral, podem ser
considerados igualmente precisos (ou imprecisos). A experiência indicará, em cada ocasião, qual
método deverá ser empregado.
Se os picos não estão completamente separados, a ponto de não se poder medir

a largura L’, utiliza-se o método i (S = h.L), medindo-se L do seguinte modo (Fig. 6.2):
1) Traçar, como na Fig. 6.1, a tangente do pico; mas só as mostradas na fig. 6.2;
2) A partir do ponto A (Fig. 6.2), traçar uma vertical até cortar a linha de base;
3) L1 e L2 são as bases dos dois picos da Fig. 6.2 e as suas áreas são h1L1 e h2L2.
Fig. 6.1 - Método gráfico para determinação de áreas relativas em

cromatografia.
OBS.: Essa técnica pode ser empregada também nos casos em

que A fica abaixo de L’ e é denominada CORREÇÃO VERTICAL. Se o
primeiro pico for muito menor que o segundo (Fig. 6.3), o procedimento é
exatamente igual. Por outro lado, na situação inversa, a medição da área do
segundo pico é feita como mostrado na Fig. 6.4. Essa segunda técnica
chama-se CORREÇÃO TANGENCIAL. Se houver um outro pico sobre a
cauda do primeiro e o ponto A estiver acima da tangente, procede-se a uma
correção vertical entre os dois pequenos.
Figura 6.2 - Correção vertical Figura 6.3 - Correção vertical Fig. 6.4 - Correção horizontal
6.3. Métodos de Cálculo
Os métodos de cálculo descritos a seguir já incluem a correção da área.
a) Normalização de área
A seguinte relação é válida para um cromatograma dessa mistura:
Ai
Ci = . 100 (eq. 9)
ΣAi
onde Ai é a área do pico de um componente qualquer e ΣAi a soma de todas as áreas.
Evidentemente, é necessário que todos os componentes sejam detectados. Melhor seria que suas
áreas fossem de mesma ordem de grandeza, pois em caso contrário, pode haver erro de exatidão maior
que o aceitável. Além disso, é essencial que o detector seja igualmente sensível a todos os componentes
da amostra, senão haverá fatalmente um erro de exatidão proporcional à diferença de sensibilidade.

Exemplificando: numa amostra com dois componentes (50% de cada), se o detector apresentar para o
componente A o dobro da sensibilidade apresentada em relação ao componente B, o resultado, aplicando
a eq. 9, será: 33,3% de B e 66,7% de A.
Das três restrições apresentadas acima, a mais difícil de ser atendida é a

terceira. Assim, a equação 9 deve ser empregada com bastante cautela, ou apenas como uma
primeira aproximação à solução do problema. Em seu lugar, pode ser empregada a eq. 10, onde
Fi é um número que gera áreas (ditas corrigidas) que seriam obtidas caso o detector fosse
igualmente sensível a todos os componentes da amostra.
Aci
Ci = . 100 (eq. 10)
ΣAci
onde Aci é a área corrigida de um componente qualquer e é calculada com auxílio da eq. 11:
Aci = Ai.Fi (eq. 11)
e Fi é calculado experimentalmente a partir do cromatograma de uma mistura sintética (solução

padrão) contendo todos os componentes da amostra real:
Fi = Ci/Ai (eq. 12)
onde Ci é a concentração de um componente qualquer e Ai sua respectiva área.
Quando todos os componentes de uma mistura pertencem a uma mesma função

química, os fatores de correção (também denominados fatores de conversão - pois convertem
a área em concentração ou massa - ou fatores de resposta) são praticamente iguais. Assim,
admitindo-se que F1 = F2 = ... = Fn = F, pode-se fazer F = 1 e a equação 10 simplifica-se,
transformando-se na eq. 9.
O caso geral (eq. 10) é conhecido como Normalização de Área com Fator de
Resposta (Norm %) e o caso particular (eq. 9) como Normalização de Área sem Fator de
Resposta, ou simplesmente Área %.
b) Padronização Interna
Para a determinação da composição de uma amostra pelo método da

Normalização de Área, é necessário que todos os seus vários componentes sejam detectados (a
eq. 10 exige que sejam calculadas todas as áreas: ΣAci). Entretanto, não é fácil ter certeza
absoluta de que todos os componentes foram realmente detectados. Além disso, se apenas um
único componente interessa ao analista, a sua determinação a partir de uma amostra com muitos
componentes traria dois outros agravantes:
i) Todo trabalho de medição e cálculo dos picos de interesse.
ii) A probabilidade maior de um outro componente ter o mesmo tempo de

retenção do componente de interesse.
Para resolver o problema (ii) o analista poderia usar um detector que se

possível só detectasse o componente de interesse. Mas, como resolver o problema inicial? A
resposta a essas questões está na adição à amostra de uma substância nova, com as seguintes
características:
- Solúvel na amostra.
- Detectável.
- Possuir tr diferente de qualquer componente detectável.
- Não reagir com a amostra.
Essa substância é denominada padrão interno.
Seja uma solução padrão contendo todas as substâncias de interesse e o padrão

interno (Pi), cujas concentrações e áreas sejam respectivamente:
Ai e Ci - um componente qualquer de interesse.

APi e CPi - o padrão interno.
O procedimento experimental pode ser descrito do seguinte modo:
a) prepara-se uma solução padrão (como no método Norm%), mas contendo apenas os
componentes de interesse (sol. A);
b) em seguida, prepara-se uma outra solução, onde o soluto será o padrão interno (ou
uma solução de concentração conhecida) e o solvente será a sol. A (sol. B);
c) com cada amostra, segue-se o procedimento do item anterior, substituindo-se a sol.
A pela amostra (sol. C).
d) finalmente, injeta-se igual volume das soluções B e C.
Observe-se que a concentração do padrão interno é a mesma, nas soluções B e

C. Assim, nos dois cromatogramas deve ser encontrada a mesma área, para o padrão interno,
posto que a massa injetada foi a mesma (ver p. 60 – Linearidade). Caso essas áreas sejam
diferentes, conclui-se de imediato que os volumes injetados não foram exatamente iguais. Como o
operador deve estar operando na região linear (senão estaria cometendo um erro grosseiro), é
válida a relação:
Api/A’pi = V/V’ (eq. 13)
onde Api e A’pi são, respectivamente, a área do pico do padrão interno na solução padrão (sol.
B) e na amostra (sol. C); V e V’ são, também respectivamente, o volume injetado do padrão e o
volume injetado da amostra. A metodologia acima exigia que V e V’ fossem iguais. Entretanto,
pode ter havido algum erro na medição desses volumes e o que se pretende é exatamente
eliminá-lo. É claro que outras fontes de erro foram introduzidas (preparação das soluções B e C).
Entretanto, com o uso de uma boa técnica de preparação dessas soluções, o erro global pode ser
bastante diminuído.
As relações Ci /Ai = Fi e CPi /APi = FPi dão a resposta do detector para qualquer
componente, inclusive Pi. Numa mesma solução, a relação Fi / FPi é constante. Logo:
(Ci/Ai) . (Api/Cpi) = K (eq. 14)
A adição do padrão interno a uma amostra de concentração desconhecida,

resulta em uma solução para a qual são válidas as mesmas relações acima:
(C’i/A’i) . (A’pi/Cpi) = K (eq. 15)
Dividindo-se a eq. 15 pela eq. 14 e considerando a eq. 12, obtém-se:
C’i = A’i . Fi . (Api/A’pi) (eq. 16)
OBS.: A precisão desse método, bem como a do método “a”, independe do erro de injeção,
mas a precisão de ambos depende do erro na preparação dos padrões.
c) Padronização externa
Mais prático que o método anterior e não necessitando também da detecção de

todos os componentes da amostra, o método do padrão externo, entretanto, depende do volume
injetado, de modo que sua precisão é influenciada pelo erro de injeção.
Substituindo-se na equação 16 Api/A’pi por V/V’ (da eq. 13), tem-se:
C’i = A’i . Fi . (V/V’) (eq. 17)

Se o erro do operador na medição do volume injetado (mensurável) for

considerado aceitável, pode-se considerar que a relação V/V’ é igual à unidade. Nesse caso, a
equação 16 pode ser simplificada, resultando na eq. 18:
C’i = A’i . Fi (eq. 18)
OBS.:
1. Os valores de Fi, obtidos num determinado laboratório, podem ser tabelados, ou
fornecidos a um computador (integrador/processador), para agilização das
análises. Devido a alterações na sensibilidade do detector (variação na relação de
fluxo dos gases auxiliares no DIC, corrosão, decaimento natural na fonte
radioativa do DCE, etc.), os valores de Fi devem ser recalculados periodicamente.
O analista deverá determinar experimentalmente a periodicidade.
2. O método do padrão externo (regra de três simples) é uma simplificação do

método do padrão interno (regra de três composta), onde se faz Vip = Via , onde
Vip é o volume injetado de solução padrão e Via é o volume injetado da amostra.
Portanto, a precisão deste método de cálculo depende da perícia do analista na
medição do volume a ser injetado.
d) Um caso especial
Em situações especiais, em que os fatores de resposta de todos os componentes

da amostra são iguais ou podem ser considerados iguais, é possível empregar-se um “padrão
interno” cujo fator de resposta seja igual ao dos analitos. O exemplo clássico é a determinação
da pureza de um biodiesel, mistura de ésteres de ácidos graxos. A norma européia EN
14103:2001 admite que os fatores de todos os ésteres são idênticos e iguais ao do hepdecanoato
de metila (C17:0), éster que não existe na amostra (característica de um padrão interno). O seu
fator de resposta é empregado para calcular o teor absoluto de cada éster da amostra
(característica da padronização externa). Este método deve ser empregado com muita cautela,
principalmente nos casos em que o teor total é muito alto (acima de 95%), quando existe a
possibilidade, ressaltada na norma em questão, de encontrar-se um total superior a 100%. A
equação aplicável é:
C=
(∑ A ) x C EI x VEI
x 100
A EI W
Onde:
ΣA é a área total dos picos dos ésteres compreendidos entre C12:0 e C18:3, exceto o C17:0;
AEI é a área do pico correspondente ao heptadecanoato de metila;
CEI é a concentração, em mg/mL, da solução do heptadecanoato de metila;
VEI é o volume, em mililitros, da solução do heptadecanoato de metila;
W é a massa, em miligramas, da amostra (biodiesel) contida em 1 mL.
e) Técnica para fechar uma análise
Muitas vezes é necessário fazer duas injeções. Isso acontece quando uma única
coluna não consegue separar todos os componentes e/ou um único detector não detecta todas as
substâncias. Considere-se o método de Normalização de Área e uma situação em que um dos
componentes aparece isolado nos dois cromatogramas. Como nas duas injeções o volume não foi
exatamente o mesmo, haveria um erro grosseiro se as diversas áreas dos dois cromatogramas
fossem somadas diretamente.
No exemplo a seguir, a amostra possui cinco componentes, sendo que os

componentes (1), (2) e (4) são quantificados no cromatograma A. Observa-se que (2) aparece
nos dois cromatogramas. Teoricamente as suas áreas, nos dois cromatogramas (Aa2 e Ab2) seriam
iguais. Na prática, geralmente encontra-se Aa 2 ≠ Ab 2 . Qualquer uma das áreas é correta, de
modo que A ou B pode ser tomada como referência, indiferentemente. Tomando o
cromatograma A como referência, tem-se:
A a2
= K (para corrigir as áreas no cromatograma B)
A b2
A a1. F 1 + A a 2 . F 2 + A b 3. K. F 3 + A a 4 . F 4 + A b 5. F 5. K =
o
∑A ci (eq. 20)
onde Aci é qualquer termo do 1 membro da eq. 20. A concentração de qualquer componente é
calculada a partir dessa equação.
6.4. Seleção do melhor método de cálculo
Para se decidir sobre o melhor método de cálculo para uma dada amostra, basta
responder às questões apresentadas no Esquema 6.1.
Esquema 6.1 - Critérios para seleção do melhor método de cálculo.

7 - OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO ANALÍTICO
7.1. Parâmetros analíticos
Conforme foi visto ao longo dos capítulos anteriores, muitos fatores influem no
processo cromatográfico. Essa influência não é aleatória, podendo portanto ser controlada pelo
operador, com o objetivo de otimizar o processo de separação.
A Tabela 7.1 mostra a importância do correto dimensionamento de uma coluna

cromatográfica, enquanto que a Tabela 7.2 mostra a influência do volume injetado sobre L (largura do
pico na base; ver Fig. 2.16, p. 14), n e H (ver Fig. 2.15, p. 14). O gráfico da Figura 7.1 mostra a relação
entre C e nmax () e entre C e Hmin(), onde C é a concentração da fase estacionária. O gráfico da Figura
7.2 mostra como esses parâmetros (n e H) variam com o comprimento da coluna (l).
A temperatura (T) modifica o tempo de retenção (tr). A variação do tr com T

não é linear. A relação
∆tr / ∆T
depende do composto em estudo e da faixa de temperatura empregada. A Tabela 7.3, o gráfico

da Figura 7.3 e os cromatogramas das Figuras 7.4.a,b e 7.5.a,b,c evidenciam essas afirmações.
Finalmente, a Tabela 7.4 mostra que nmax, Hmin e Fo (vazão ideal) dependem inclusive da
granulometria do suporte.
Tabela 7.1 - Efeito do comprimento da coluna e da concentração da FE sobre a eficiência.
Coluna * Vazão Ideal

Fo n x 10-3 H (mm)
l (m) C (%) m (g)
(mL/min)
1 10 0,13 30+5 0,8 1,25
2 10 0,24 20+5 1,4 1,43
4 10 0,57 28+5 4,3 0,93
9 10 1,24 21+5 8,0 1,13
16 10 2,15 38+5 16,0 1,00
4 1 0,05 18+5 1,9 2,11
4 2 0,12 26+5 2,0 2,00
4 5 0,26 34+5 2,7 1,48
4 20 1,18 37+5 3,3 1,21
(*) a) Fase estacionária: Apiezon L; DE = 1/8”; DI = 2,04 mm; Suporte: Chromosorb P; 60-80 mesh
b) l = comprimento da coluna; C = conc. da FE; m = massa da FE na coluna.
Tabela 7.2 - Efeito do volume injetado sobre L, n e H.
Volume (µL) L (mm) n H (mm)

0,5 7 15.800 1,01
1,0 9 9760 1,64
1,5 11 6800 2,35
2,0 12 5270 3,03
Figura 7.1 – Efeito da concentração da FE Figura 7.2 – Efeito do comprimento da

sobre a eficiência. coluna sobre a eficiência.
Tabela 7.3 - Efeito da temperatura sobre o tempo de retenção
Composto 70oC 100oC 130oC 160oC

n-pentano 1,60 1,17 0,85 0,68
n-hexano 3,29 1,93 1,23 0,77
n-heptano 7,38 3,65 1,92 1,35
n-octano 18,88 7,08 3,25 2,00
A partir dessas informações é possível estabelecer, por exemplo, para uma

coluna com 1/8” de diâmetro externo (coluna analítica), que:
♦ Para uma mesma FE, mesmo suporte e mesma granulometria, nmax é função linear de l.
♦ O valor de nmax aumenta, quando diminui a granulometria do suporte.
♦ O valor de nmax varia com C, sendo máximo quando C = 12 %, para suporte com faixa de
granulometria de 60-80 mesh ( ≡ malhas por polegada linear; equivale a um diâmetro de
partícula de 175-230 mm).
♦ A faixa de vazão ideal não varia com a temperatura.
♦ O tempo de retenção diminui de maneira não linear com o aumento da temperatura; a relação ∆tr / ∆T
varia com a natureza do composto e o intervalo de temperatura considerado.
7.2. Projetando um método analítico
Para se projetar um novo método analítico por cromatografia, são necessárias

várias avaliações, relacionadas a seguir:
♦ Seleção do tipo de cromatógrafo (a gás ou a líquido);

♦ Seleção do detector, em função dos compostos a serem analisados e de suas concentrações;
♦ Parâmetros de funcionamento do detector;
♦ Seleção da coluna:
• natureza da Fase Estacionária (e sua granulometria, caso seja sólida);

• dimensões da coluna (comprimento e diâmetro);
• concentração da Fase Estacionária (FE), natureza e granulometria do suporte, no caso
de FE líquida;
♦ Seleção da temperatura (ou programação de temperatura) para a coluna, no caso de CFG;

♦ Seleção do Gradiente de Polaridade, se necessário, no caso de CFL (HPLC);
♦ Determinação do Limite de Detecção (LD) e da Faixa de Linearidade Dinâmica (FLD);
♦ Determinação dos Fatores de Resposta;
♦ Determinação das demais condições de análise: volume injetado, técnica de injeção,
atenuação (se não dispuser de sistema de integração), temperatura do vaporizador (em CFG)
e do detector e vazão da fase móvel (ou gradiente);
♦ Concentração dos componentes na solução padrão, natureza do solvente empregado e
técnicas de amostragem e de preparação da amostra e da solução padrão;
♦ Método de cálculo utilizado;
♦ Número mínimo de determinações em paralelo e erro máximo (reprodutibilidade);
♦ Avaliação do erro estatístico global, associado às diversas operações (preparação de
soluções, técnica de amostragem, técnica de injeção e medição de área); expressão do
resultado final;
Observações:
a) na seleção do detector, verificar se o material a ser analisado é detectável por ele e se o
seu Limite de Detecção é compatível com a faixa de concentração de interesse (ver, por
exemplo, a Tabela 4.1 na p. 27);
b) na avaliação dos erros estatísticos, considerar todas as operações envolvidas, tais como
pesagem, medição de volume, diluição, técnicas de amostragem e de injeção, etc;
c) para cálculos estatísticos, utilizar o Apêndice 6 (ver Seção 7.3);
d) em relação aos diversos métodos de cálculo, lembrar que:
Preparação Preparação Componentes
Método Injeção Altura(1)
do Padrão da Amostra não detectados
Área % Não Não Não Sim Sim
Norm % Sim Não Não Sim Sim

P. Ext. Sim Não Sim Não Não(2)
P. Int. Sim Sim Não Não Não(2)
Sim significa “é fonte de erro”; Não significa “não é fonte de erro”.
(1) como medida da “área”; (2) dentro de uma faixa mais ou menos estreita de concentração.
Figura 7.3 – Efeito da temperatura sobre o tempo de retenção.
Figura 7.4 – Efeito da temperatura sobre o tempo de retenção.
Figura 7.5 – Efeito da temperatura sobre a separação.

Tabela 7.4 – Efeito da granulometria do suporte sobre a eficiência
Malha/polegada nmáx Hmín Fo (mL/min)

60-80 4300 0,93 20
80-100 4600 0,87 20
100-120 5700 0,70 24
D.E. = 1/8”; l = 4 m; C = 10 %
7.3. Validação de um método analítico
7.3.1. Objetivo
A identificação por Cromatografia (a gás ou a líquido) é feita por

comparação dos tempos de retenção, para uma dada substância, entre uma solução padrão e a
amostra. Entretanto, é sabido que num determinado sistema cromatográfico (Fase Móvel,
Fase Estacionária e Detector), mesmo empregando-se como fluxo da Fase Móvel aquele
considerado ideal (de acordo com os experimentos de van Deemter), não é nula a
probabilidade de outro componente da amostra apresentar o mesmo tempo de retenção que o
da substância de interesse. Validar um método analítico consiste em garantir que nas
condições analíticas, a substância-problema e apenas ela apresenta aquele tempo de retenção.
Evidentemente um método validado deve ser operacionalizado através de um manual
(Norma), o qual determina condições padronizadas que garantam a sua
repetibilidade/reprodutibilidade. Deve ser enfatizado que um determinado método analítico
validado para um determinado tipo de amostra não é necessariamente válido para outro tipo
de amostra (ex.: dosagem de um princípio ativo existente em um determinado medicamento
versus a mesma determinação nas vísceras do cadáver de uma suposta vítima de
superdosagem), posto que outro tipo de amostra pode conter outras substâncias também
passíveis de ser detectadas no mesmo tempo de retenção do analito e que não tenham sido
incluídas na pesquisa de validação.
7.3.2. Conceitos
Com o objetivo de garantir uma correta compreensão deste texto, são

apresentados a seguir os termos técnicos aqui empregados, com suas respectivas definições.
Nome notaçã descrição

o
Analito Substância-problema.
Amostra Qualquer material, independentemente de sua origem, que contenha o analito.
Padrão O analito, comercializado com alta pureza.
United States Pharmacopea USP Farmacopéia Americana. Fonte de consulta.
Concentração c Concentração do analito (ou do padrão).
Solução Estoque SE Solução do padrão a alta concentração (pode ser guardada por alguns meses,
dependendo da natureza da substância).
Solução Intermediária SI Solução do padrão, necessária para se chegar à Solução de Trabalho.
Solução de Trabalho ST Solução do padrão com concentração semelhante ao que se espera da amostra.
Faixa de Linearidade FL Intervalo de concentração em que existe relação linear com a área do pico.
Curva de Calibração Curva construída com os dados da Faixa de Trabalho.
Coeficiente de Correlação r Parâmetro que mede a precisão com que a Curva de Calibração relaciona as áreas
com as respectivas concentrações. É usado para avaliar o fim da região linear na
construção da FL.
Faixa de Trabalho FT Intervalo contido na FL, compreendendo as concentrações usuais da amostra.
Limite de Detecção do LDE Concentração mínima detectável do analito no extrato injetado.
Equipamento
Limite de Detecção da LDA Concentração mínima detectável do analito na amostra.
Amostra
Limite Efetivo LE Concentração mínima do analito que corresponde a um erro máximo aceitável.
Seletividade α Capacidade de separar a substância-problema dos demais componentes da
amostra.
Resolução Rs Mede a seletividade.
Precisão Avalia a repetibilidade ou a reprodutibilidade de um método analítico, por medida
da 1a ou da 2a estimativa do desvio-padrão (Apêndice 6).
Exatidão Grau de fidelidade com que o resultado exprime o valor real da concentração do
analito. Avaliado com auxílio do teste t1 (de Student), por comparação com uma
solução padrão (Apêndice 6).
Recuperação Nos casos em que se faz uma extração, é necessário determinar o percentual de
extração e sua repetibilidade. Recomenda-se que a solução padrão seja submetida
à mesma operação.
Repetitividade Mede a dispersão dos resultados obtidos por repetição da análise, num mesmo
Laboratório, com o mesmo equipamento e mesmo analista. Ver Precisão.
Reprodutibilidade Mede a dispersão dos resultados obtidos por repetição da análise, em diferentes
Laboratórios, diferentes equipamentos ou diferentes analistas. Usa o teste F
(Apêndice 6).
Consistência Mede a influência sobre a repetibilidade, das diversas operações constantes do
método.
Robustez Mede a influência sobre a Reprodutibilidade, das diversas operações constantes do
método.
7.3.3. Procedimento
a) Seletividade / Identificação
A principal fase do trabalho é aquela em que é testada a confiabilidade da

identificação. Isso inclui a determinação do tempo de retenção de toda e qualquer substância que
possa eventualmente existir na amostra, quais sejam:
♦ Impurezas de síntese (no caso de produtos naturais, esse trabalho poderá ser bastante penoso);
♦ Impurezas de degradação (essas informações podem ser obtidas de estudos shelf-life);
♦ Excipientes, conservantes, aditivos e outros princípios ativos constantes da formulação (no
caso de associações);
Deve ser lembrado que a identificação pura e simples por cromatografia

(método não validado) não tem valor científico. Assim, o ideal, o recomendado mesmo, é
associar à técnica cromatográfica, a técnica de Espectrometria de Massas. Essa associação
pode ser manual, através da separação física, por coleta na saída da coluna, seguida da obtenção
do espectro de massas. A identificação pode ser ainda complementada com auxílio de outra
técnica analítica, como a Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear, Espectrofotometria
no Ultravioleta-Visível ou a Espectrofotometria no Infravermelho. Atualmente existem
cromatógrafos (CFG ou HPLC) acoplados a um espectrômetro de massas, o qual substitui o
detector tradicional do cromatógrafo. Embora os exemplos aqui apresentados sejam típicos da
indústria farmacêutica, os diversos procedimentos são igualmente aplicáveis a qualquer outro
tipo de amostra. De um modo geral, produtos de síntese (de uso farmacêutico ou não) podem ter
seu método analítico validado sem auxílio da espectrometria (embora seu emprego dê maior
credibilidade à validação). Por outro lado, qualquer outro material (inclusive de uso
farmacêutico) exige a associação de métodos espectrométricos.
Já se sabe que a eficiência (n) de uma coluna é diretamente proporcional ao

tempo de retenção. Portanto, quanto maior for o tempo de eluição, maior será a sua eficiência.
Assim, a seletividade (Apêndice 8) ou a retenção relativa (RR; p. 13) podem ser empregadas
como medida da eficiência. Entretanto, esse critério é algo insatisfatório, posto que colunas com
diferentes eficiências podem apresentar mesmos fatores de separação, conforme pode ser visto
na Figura 7.1.a,b. Por isso, em vez da seletividade, emprega-se a resolução (Rs), como medida
efetiva da capacidade de separação:
Rs = 2(tr2 – tr1)/(L1 + L2)
A resolução é igual à diferença entre os tempos de retenção dividida pela

média das larguras na base (Figura 2.16, p. 14). Entretanto, quanto maior o tempo de retenção,
maior será a difusão longitudinal, a qual provoca alargamento dos picos. É óbvio que a resolução
diminui com o alargamento do pico. Portanto, é desejável que a análise não seja muito
demorada. A resolução também diminui se a cauda, resultante de uma interação excessiva com a
fase estacionária, é bastante pronunciada (Figura 7.2). Essa deformação do pico deve ser
considerada quando da seleção da coluna. Chama-se fator de deformação ou fator de assimetria
(TF, do inglês tailing factor) a relação:
BC
TF =
AB
onde a distância BD é igual a 10 % da altura do pico ( DE ). Alguns especialistas1 acreditam que

o TF máximo admissível é 3.
Figura 7.1 – Resolução a) baixa; b) alta Figura 7.2 – Pico com cauda (deformação)
b) Detalhamento da Metodologia
A metodologia analítica inclui todos os parâmetros explicitados na Seção 7.2 (p. 42).
c) Avaliação estatística
Para realização dos testes estatísticos, sugere-se que qualquer operação (preparação da
solução padrão, tomada de alíquotas, etc) seja realizada em triplicata (ou mais) e que cada solução obtida
seja injetada pelo menos cinco vezes. Nesses casos, deve ser empregada a 2a estimativa do desvio-padrão
(sR; Apêndice 6). A 1a estimativa (s) só deve ser empregada em conjuntos de dados com mais de 10 itens.
d) Exemplo
1
A Farmacopéia Americana (USP) mede o segmento AC a 5% da altura do pico, calcula TF dividindo AC por duas
vezes AB e estabelece 2 como TFmax.
A seguir, é apresentado um exemplo, para ilustrar toda a operação. Para este exemplo,
foi selecionada a aspirina, que é comercializada em várias formas, sendo selecionado como amostra o
comprimido. A aspirina (ácido acetilsalicílico) é produzida industrialmente a partir do ácido salicílico:
Desse modo, é de se esperar que o precursor (AS) seja um contaminante

comum no produto (AAS). Conseqüentemente, o AS é uma das substâncias que devem ter seu
tempo de retenção medido, para verificar se coincide ou não com o do AAS.
Uma vez completada a etapa de identificação (vale repetir: confirmação de que

nada que eventualmente possa estar presente na amostra apresente o mesmo tempo de retenção
do AAS), parte-se para as avaliações estatísticas.
i. Condições analíticas:
♦ Cromatógrafo a líquido modelo CG 480E, com detector de ultravioleta CG 437B.

♦ Comprimento de onda: 254 nm.
♦ Coluna: RP-18, 250 mm X 4,6 mm, 10 µm; temperatura ambiente.
♦ Fase Móvel: H2O:Metanol:Ácido Acético (52,5:46:1,5); 1,5 mL/min (isocrático).
Preparação das soluções padrão (para AAS e AS):
A solução estoque foi de 500 mg/100 mL. As demais soluções foram de 200
mg/100 mL, 100 mg/100 mL, 20 mg/100 mL, 10 mg/100 mL e 5 mg/100 mL.
Preparação da amostra:
A partir de 5 comprimidos pulverizados em almofariz, foi tomada uma alíquota

pesando 55 mg (10% do peso médio de um comprimido). O material foi dissolvido em 10 mL da
fase móvel, com auxílio de ultra-som e em seguida filtrado (0,46 µm).
Injeção da amostra: válvula Rheodyne, com loop de 20 µL.
ii. Faixa de Linearidade e Limite de Detecção

As soluções padrão foram injetadas em triplicata, sendo que a mais diluída foi
injetada dez vezes. A partir das médias das áreas obtidas, foram construídas as respectivas Faixas
de Linearidade (Gráficos 7.4 e 7.5), onde se evidencia que as massas injetadas conforme
prescrito em Preparação da amostra permanecem dentro da região linear. O ruído (medido
com atenuação mínima necessária para uma altura não inferior a 5 mm) foi de 7 mm, o que por
comparação com a média das alturas dos picos das dez injeções da solução mais diluída resultou
em um Limite de Detecção (para AAS e AS), da ordem de 0,3 mg/100 mL.
2
8,0x10 400
2
6,0x10
300
Área do pico
Área do pico
2
4,0x10
200
r = 0,99996 r = 0,99999
2
2,0x10
100
0,0
0
0 500 1000 1500 2000 0 100 200 300 400 500
Concentração (mg/L) Concentração (mg/L)
Gráfico 7.4 – FLD do AAS. Gráfico 7.5 – FLD do AS.
iii. Precisão e expressão dos resultados
A partir dos dados (áreas) das dez injeções da solução mais diluída referida no
item ii acima, pode ser calculado o erro analítico (de repetibilidade) e a partir deste (no
exemplo, foi 1,2%), determinar a forma correta de expressão do resultado (forma esta válida para
ambos os compostos):
Re = X ± 0,01 mg/L
8 – TÉCNICAS ADICIONAIS DE IDENTIFICAÇÃO
A identificação de substâncias efluentes de uma coluna cromatográfica é

normalmente realizada por simples comparação dos seus tempos de retenção com os tempos de
retenção de padrões puros, conforme descrito no Capítulo 5. Entretanto, existem outros
procedimentos de identificação também muito úteis e até mais confiáveis que aquele. Além dos
dados cromatográficos (conforme será discutido a seguir), também pode ser realizada a
identificação com auxílio de outros procedimentos. Dentre esses se destacam: adição de padrão
(para corrigir pequenas variações no tempo de retenção que ocorre quando se usa o método
absoluto), derivação (o desconhecido é transformado em outra substância, cujo tempo de
retenção também é comparado com o tempo de retenção do padrão dessa outra) e técnicas
espectroscópicas: ultravioleta, infravermelho, massas e ressonância magnética nuclear. Na
atualidade, são conhecidas as chamadas técnicas hifenizadas. Exemplo disso é o emprego de um
espectrômetro de massas acoplado a um cromatógrafo a gás (GC-MS) ou a um cromatógrafo a
líquido (HPLC-MS). Nesses equipamentos, o espectrômetro substitui o detector usual e a
amostra é transferida da saída da coluna para o espectrômetro sem auxílio do operador. Este, ao
analisar o analito, envia uma cópia do espectro para um banco de dados, que se encarrega da
identificação, por comparação com espectros de padrões.
8.1. Tempo de retenção e retenção relativa
A identificação é feita tradicionalmente através da medição do tempo de retenção (tr).

Entretanto, a essa forma de medição está associado um erro, decorrente de uma natural variação no tempo
transcorrido entre a injeção e o acionamento do sistema de registro. Esse erro costuma ser da ordem de 2
% em relação ao tempo de retenção. É pequeno demais, na maioria das vezes. Mas há casos em que a
diferença de tr entre dois componentes é dessa mesma ordem de grandeza. Em tais casos é recomendável o
emprego da Retenção Relativa (RR). Um dos componentes é tomado como referência (RRr = 1) e as RR’s
dos demais são calculadas com auxílio da relação:
RRb = trb/tra ,
onde trr e tri são, respectivamente, os tempos de retenção da referência e de outro componente.
8.2. Índice de retenção
Outro parâmetro utilizado para identificação, o Índice de Retenção (Ir) é

determinado experimentalmente a partir do cromatograma da mistura do desconhecido (i) com
duas parafinas normais com n e m (geralmente m = n + 1) átomos de carbono, desde que:
D’rn < D’ri <D’rm ; onde D’r = distância de retenção corrigida

Em outras palavras, o(s) analito(s) deve(m) gerar pico(s) com distância de retenção
maior que o da parafina CnH2n+2 e menor que o da parafina CmH2m+2.
Sabe-se que o logaritmo da distância de retenção (D’r) varia linearmente com o ponto de
ebulição ou com o número de átomos de carbono, numa série homóloga1. Por interpolação pode
ser construída a relação:
log D 'ri − log D 'rn

I ri = 100 + 100.n
log D 'rm − log D 'rn
Nesse sistema, assume-se que o índice de retenção do hidrogênio é zero e que o índice
de retenção de qualquer parafina é igual a cem vezes o seu número de átomos de carbono:
I r (H2) = 0,00 e I rn = 100.n
Padrões para determinação do Ir:
a) Como visto acima, as parafinas normais são, por definição, padrões primários, com Ir = 100n.
b) Em qualquer série homóloga com mais de 5 átomos de carbono, o Ir cresce de 100
unidades para cada CH2 adicional e não é influenciado pela temperatura. Esses
compostos podem, portanto, ser utilizados como padrões secundários.
8.3. Equivalência entre fases estacionárias
p n p n
É conhecida a relação ∆I = Ι r − I r , onde I r e I r são, respectivamente, os
i i i i
índices de retenção de um composto i numa fase polar qualquer e numa fase estacionária não
polar tomada como referência (geralmente esqualano), medidos a uma mesma temperatura. Essa
relação permite avaliar a influência, na separação, da fase estacionária e de grupos substituintes
presentes na molécula da substância considerada.
McReynolds, baseado em trabalho inicial de Rohrschneider, tomou cinco

compostos como referência e associou o somatório dos seus valores de ∆I com a polaridade da
fase estacionária, chegando a classificar centenas de fases estacionárias. A Tabela 8.1 apresenta
alguns exemplos (observe-se que as FE’s estão colocadas em ordem crescente de polaridade). Os
valores de ∆I, denominados constantes de McReynolds, foram determinados a 120oC. Os valores
de Ir para os cinco compostos, com a fase estacionária esqualano, são: benzeno, 653; n-butanol,
590; 2-pentanona, 627; nitropropano, 652 e piridina, 699. Por comparação entre os números
1
Série homóloga é um grupo de substâncias de uma mesma função química cuja única diferença molecular é o número
de átomos de carbono da cadeia principal (ex: ácidos carboxílicos com um grupo metila no carbono alfa).
de McReynolds de duas diferentes fases estacionárias, é possível concluir se as mesmas são

equivalentes ou não. É possível também prever como melhorar uma separação, comparando-se a
natureza de duas substâncias-problema com duas das cinco substâncias tomadas como
referência.
Tabela 8.1 – Valores do Número de McReynolds (Σ∆I) para algumas fases estacionárias.
VALORES DE ∆I
FASE ESTACIONÁRIA
A B C D E Σ∆I
Σ∆
Esqualano (*) 0 0 0 0 0 0
Nujol 9 5 2 6 11 33
Apiezon L 32 22 15 32 42 143
SE-30 15 53 44 64 41 217
SE-52 32 72 65 98 67 334
Hallcomid M-18 OL 89 280 143 239 165 916
QF-1 144 233 355 463 305 1500
Carbowax 20M 322 536 368 572 510 2308
Diglicerol 371 826 560 676 854 3287
DEGS 492 733 581 833 791 3430
TCEP 593 857 752 1028 915 4145
BIBLIOGRAFIA(*)
1. Heftmann, E. Chromatography. Van Nostrand Reinhold, Holland. 1967.
2. Ciola, R. Fundamentos da Cromatografia a Gás. Ed. Edgard Blücher Ltda., São Paulo, 1985.
3. Ciola, R. Tópicos em Cromatografia a Líquido. Inst. Científicos C. G. Ltda., São Paulo, 1984.
4. Hadden, N. e Col. Basic Liquid Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1971.
5. McNair, H. e Bonelli, E. Basic Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1968.
6. Basics of Liquid Chromatography. Spectra-Physics, Cal. USA, 1977.
7. Fundamentals of Gas Analysis by Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1977.
8. Schuler, A. Caderno de Práticas de Cromatografia. Depto. Eng. Química/UFPE, 1994.
9. Randerath, K. Thin-Layer Chromatography. Verlag Chemie – Academic Press, USA, 1968.
10. Lederer, E. e Lederer, M. Chromatography. Elsevier Publishing Co., London, GB, 1953.
11. Heftmann, E. Chromatography. Van Nostrand Reinhold Co., New York, USA, 1967.
12. Treybal, R. E. Liquid Extraction. McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, USA, 1951.
13. Wilcox, Melissa J., Lab South America, Guide 1999/2000, GB, p. 19-22.
(*) A Literatura aqui apresentada serviu de base para a elaboração deste texto e é
recomendada àqueles que pretendem se aprofundar na matéria.
APÊNDICE 1
Túnel do Tempo
A intenção deste texto é apresentar uma seqüência cronológica dos fatos mais
importantes que marcaram o desenvolvimento da técnica cromatográfica, até os tempos atuais.
Mais do que apresentar uma lista exaustiva, pretende-se tão somente dar ao leitor uma
compreensão geral da história da Cromatografia.
Reza a lenda que um pesquisador, trabalhando em seu laboratório com uma solução
contendo uma mistura de corantes, acidentalmente molhou sua vestimenta. Para sua surpresa, no
lugar de uma mancha mais ou menos circular e de cor uniforme (igual à da solução), surgiram
círculos concêntricos, cada um com uma cor diferente das demais, como na figura abaixo. De
algum modo esse fato teria ficado registrado, tendo servido de sugestão para Tswett (ver adiante)
resolver seu problema analítico. Isso teria acontecido no século XIX1.
Em 19 de maio de 1872 nasceu em Asti, uma pequena cidade

localizada no Tirol italiano. Filho de Siméon Tswett (russo) e Marie
Dorroza (italiana), Mikhaïl Semenovitch Tsvet, foi registrado como de
nacionalidade russa. Mikhail Tswett (grafia mais usual na literatura)
mudou-se em 1875 com o pai (a mãe falecera pouco após o seu
nascimento) para Lausanne e depois Genebra (Suíça), onde passou toda
a sua infância e juventude, graduando-se em 1893 em botânica pela
Universidade de Genebra e doutorando-se em 1896 na mesma universidade. Nesse mesmo ano
mudou-se para a Rússia, como professor de botânica em escolas privadas na cidade de São
Petersburgo (Leningrado) e em 1901 mudou-se para Varsóvia (Polônia), sendo contratado pela
Universidade de Varsóvia, onde trabalhou até 1915. Com a invasão alemã, durante a 1a Guerra
Mundial, Tswett fugiu para a Rússia, refugiando-se em Moscou. Em 1917 tornou-se professor de
botânica e Diretor do Jardim Botânico da Universidade de Jourjeff, em Dorpat (Tartu). No início
de fevereiro os alemães ocuparam Jourjeff e fecharam a Universidade. Mais
uma vez Tswett se mudou, dessa vez para Voronej, aonde veio a falecer,
debilitado pela tuberculose, no dia 26 de junho de 1919, com 47 anos de
idade. Em 1900, Tswett descobrira a razão da cor verde das plantas, isolando
as clorofilas A e B, xantofilas e carotenóides amarelos, entre outros
pigmentos, em uma coluna de adsorção contendo carbonato de cálcio. Éter de
petróleo foi empregado como fase móvel neste trabalho. Este primeiro
trabalho (de uma série de mais de cinqüenta) foi publicado em 1903, no
volume 14 da revista científica Proc. Warsaw Soc. Nat. Sci., Biol. Sec. Sua
obra maior foi um livro, publicado (em russo) em 1906, intitulado "Os
Mikhail Tswett
1
Na verdade, o mérito de Tswett é bem maior, como pode ser visto na descrição do biógrafo Leslie S. Ettre (ver p. 58).
cromófilos no mundo animal e vegetal", no qual ele descreve com detalhes seu método de
separação de pigmentos. É de Tswett a seguinte definição: "Cromatografia é um método em que os
componentes de uma mistura são separados numa coluna de adsorvente num sistema em fluxo". Ele
deu à técnica o nome de Cromatografia, combinando as palavras gregas Khromatos (cores) e Graphos
(descrever). Ele acreditava que o processo de separação, de algum modo, tinha algo a ver com a cor da
substância. Segundo suas próprias palavras, "como raios de luz no espectro, os diferentes componentes
de uma mistura de pigmentos, obedecendo a alguma lei, se separam numa coluna de carbonato de
cálcio e podem assim ser qualitativamente e quantitativamente determinados. Eu chamo tal preparação
um cromatograma, e o método correspondente o método cromatográfico". Mais tarde, antevendo toda
a potencialidade de sua invenção, afirmou: "... é bastante evidente que o fenômeno de adsorção
descrito não se restringe aos pigmentos vegetais, mas devemos aceitar que todos os tipos de compostos
químicos, coloridos ou incolores, estão sujeitos às mesmas leis". Após sua morte, ninguém de imediato
empregou a Cromatografia em suas pesquisas. Um detalhe interessante é que o nome tswett, em russo,
significa cor. Alguém chegou a sugerir, como uma homenagem póstuma a Tswett, que o nome da
técnica fosse tswettografia.
Linha do Tempo:
1931 – Khun e Lederer repetiram o trabalho de Tswett com clorofilas, xantofilas e

carotenos, rompendo um silêncio de 12 anos1. Logo em seguida, Brockmann,
Karrer, Winterstein e Zechmeister trouxeram suas contribuições.
1938 – Reichstein realiza a primeira análise de uma substância incolor. Para visualizar as
zonas ocupadas por substâncias incolores empregam-se reativos próprios,
designados como reveladores (Figura A1.1).
Figura A1.1 – Cromatografia em Camada Delgada (diferentes formas de revelar).

1940 – Wilson, Devault, Weiss, Glückauf, Martin e Synge2 deram início aos estudos
teóricos da Cromatografia.
1
Ver texto na página 58 sob o título “O valor do experimento”.
2
Archer John Porter Martin (1910–2002) e Richard Laurence Millington Synge (1914-1994).
1941 – Martin e Synge introduziram a cromatografia de partição (com sílica gel).
1943 – Lyman C. Craig desenvolve um aparelho para extração líquido-líquido, que pode
ser considerado um precursor do cromatógrafo e cujo funcionamento, descrito
adiante, auxilia no entendimento do processo cromatográfico.
1944 – Consden, Gordon e Martin inventaram a cromatografia em papel.
1947 – Boyd, Marinsky, Spedding, Tompkins e outros realizaram pesquisas que conduziriam mais
tarde à produção industrial de terras raras por cromatografia de troca iônica.
1948 – Lederer e Linstead aplicaram a cromatografia em papel a compostos inorgânicos.
1951 – Kirchner introduziu a cromatografia em camada delgada.
1952 – Martin e Synge desenvolvem a cromatografia a gás.
1956 – Sober e Peterson prepararam as primeiras celuloses para troca iônica e Lathe e
Ruthvan trabalharam com peneiras moleculares (naturais e modificadas) para
medidas de peso molecular.
1964 – Moore desenvolveu a cromatografia por permeação em gel.
O aparelho de Craig
Lyman C. Craig (1906-1974), pesquisador da Universidade de

Rockefeller (New York, USA), desenvolveu um equipamento,
denominado Aparato de Craig, que promove a separação de misturas de
substâncias através da técnica de extração líquido-líquido, conforme
descrito na página 6. Esse equipamento (Figura A1.2) foi bastante
utilizado em separações (inclusive preparativas), antes do advento dos
modernos cromatógrafos. Craig inventou também um equipamento ainda
bastante empregado em laboratórios, o evaporador rotatório, também
conhecido como rotavapor.
Figura A1.2a – Aparato de Craig (original). Obtido em: http://www.theliquidphase.org/
Figura A1.2b – Aparato de Craig (“moderno”).

O valor do experimento
A realização de um experimento, por si só, é de extrema importância para o

desenvolvimento da ciência. É assim que teorias são testadas e aperfeiçoadas. Entretanto, sua
importância é mais bem reconhecida quando o pesquisador consegue extrair informações às
vezes não muito explícitas. A descrição a seguir, traduzida livremente de uma biografia de
Tswett escrita por Leslie S. Ettre1, não exige maiores explicações:
Dos experimentos realizados para a sua tese de doutorado na Suíça, Tswett

extraiu as seguintes informações:
• Solventes diferentes apresentam diferentes comportamentos;
• Pigmentos podem ser facilmente extraídos com álcool (etílico) ou
acetona;
• Éter de petróleo (uma fração do petróleo rica em hidrocarbonetos com
cinco e seis átomos de carbono), que dissolve facilmente a clorofila em
sua forma isolada (já extraída da planta) apenas extrai os carotenóides
das folhas, não conseguindo extrair a clorofila;
A partir de tais informações, Tswett concluiu que algum fenômeno,
provavelmente adsorção (e estava certo!) fixa seletivamente os pigmentos na folha (na
celulose) do vegetal. No caso, a adsorção sobre a clorofila seria mais intensa. Como o
etanol tem um poder solvente mais acentuado, consegue extrair tudo, o que não acontece
com o éter de petróleo, que não extrai a clorofila. Para testar essa hipótese, Tswett
substituiu a folha da planta por uma folha de papel de filtro (também constituída de
celulose). O comportamento foi idêntico: o éter de petróleo extraiu apenas os carotenos,
mas adição de apenas uma pequena quantidade de álcool ao éter de petróleo levou à
extração de todos os componentes. O próximo passo foi testar outros adsorventes. Para
tanto, Tswett colocou o adsorvente (o primeiro foi o carbonato de cálcio, em pó) em um
tubo de vidro fino através do qual fez passar uma solução contendo a amostra. Estava
inventada a Cromatografia!
Os trabalhos de Tswett não foram de pronto aceitos pelos pesquisadores de sua época.
Dois fatos contribuíram para isso: seus trabalhos foram escritos inicialmente em russo e o
químico alemão R. M. Willstätter, ganhador do Prêmio Nobel de 1915, tornou-se um inimigo
ferrenho. Considerado o “papa” da Química, afastou seus seguidores de Tswett. Um deles, o
também ganhador do Prêmio Nobel Heinrich Wieland, chegou a dizer2: "Nós aprendemos, com
muito esforço, a destilar, cristalizar e recristalizar e agora eles vêm e dizem que conseguem fazer
tudo isso apenas com um pequeno tubo!" Mas no futuro, seu trabalho seria reconhecido por
todos. Aliás, ironicamente, o primeiro pesquisador a empregar a Cromatografia em seus
trabalhos após a morte de Tswett, foi exatamente o aluno predileto de Willstätter: Richard Kuhn
(ver Túnel do Tempo, 857).
1
Fonte: http://www.chromatographyonline.com/lcgc/data/articlestandard//lcgc/202003/56954/article.pdf.
2
Fonte: http://pubs.acs.org/hotartcl/tcaw/98/sep/creat.html.
APÊNDICE 2
Características básicas dos detectores
1. Sensibilidade
A sensibilidade de um detector é medida pela sua Resposta, que é a magnitude

do sinal recebido pelo Sistema de Aquisição de Dados (Registrador potenciométrico, Integrador
ou Software), sob a forma de área do pico. Assim, quanto maior for a área do pico de uma
mesma amostra, maior será a sensibilidade do detector empregado.
2. Nível de ruído
O ruído é uma característica indesejável dos detectores, ou melhor, de qualquer

dispositivo eletrônico. No caso do cromatógrafo, o ruído é devido a um conjunto de fatores, tais
como:
- impurezas dos componentes eletrônicos - mau contato em cabos e conectores

- interferências na rede elétrica - sangramento da coluna
- defeitos em circuitos eletrônicos - contaminação na válvula de amostragem
- contaminação no septo da coluna - contaminação no detector
- vazamento de fase móvel - contaminação na coluna
Essas causas podem ser removidas, exceto a primeira, que depende não só da
qualidade do produto, mas também de suas características próprias. Assim, existe um nível
mínimo de ruído que não pode ser removido. Evidentemente, um pico com altura igual à do
ruído não poderá ser reconhecido como tal. O ruído faz com que a linha de base não seja uma
reta perfeita, mas algo parecido com o traçado mostrado na Fig. A2.1.
Fig. A2.1. Linha de base com ruído.
3. Limite de Detecção
Limite de Detecção (LD), ou Quantidade Mínima Detectável (QMD), como o

próprio nome o diz, é a massa mínima injetável que produza um pico que possa ser identificado
como tal. Por definição, LD é uma massa cujo pico tenha uma altura igual ao dobro da altura
média do ruído (hr, Fig. A2.1).
4. Faixa de Linearidade Dinâmica
Entende-se por Faixa de Linearidade Dinâmica (FLD) o intervalo

compreendido entre a Quantidade Mínima Detectável (QMD) e a massa máxima injetável cuja
Resposta ainda seja linear. A Fig. A2.2 ilustra a situação. A linha vermelha compreende a
região linear. Alguns detectores, possuem uma faixa ampla (DIC), enquanto outros apresentam
linearidade numa faixa bem mais estreita (DCE). Alguns operam com massas altas (DCT, DIR),
enquanto outros só apresentam linearidade a altas diluições (DCE, DUV). Para se determinar a
FLD de um detector, em relação a um determinado composto, é necessário preparar soluções
dentro do intervalo de interesse e montar um gráfico equivalente ao apresentado na Fig. A2.2.
Em seguida, o analista deve calcular o coeficiente de correlação (r; Apêndice 6) para todos os
pontos e depois recalcular o coeficiente de correlação após retirar, sucessivamente, os pontos n,
(n-1), (n-2), etc, até que o valor de r permaneça estável e próximo da unidade. Não tendo havido
erro grosseiro na preparação das soluções, nas injeções, nem nas medições de áreas, deve-se
encontrar um valor de r maior ou igual a 0,999.
Figura A2.2 – Faixa de Linearidade Dinâmica.

APÊNDICE 3
Técnicas de introdução da amostra
Tradicionalmente a amostra (sólido em solução, líquido ou gás) é introduzida

com auxílio de uma microseringa (Figura A3.1). Em Cromatografia a Gás (CFG), exceto com
colunas capilares (Seção 3.4), recomenda-se injetar de 3 a 5 microlitros (µL), sendo que o erro
de medição é inversamente proporcional ao volume.
Figura A3.1 – Microseringa para amostras líquidas em CFG
Em se tratando de amostras gasosas, existem duas outras técnicas: seringa

especial para gases (seringas gas-tight, que previnem contaminação ou diluição da amostra com
ar), que é utilizada quando a amostra não está pressurizada e a válvula injetora de sete vias
(Figura A3.2).
Em Cromatografia a Líquido (HPLC), a amostra (líquido ou sólido em

solução) é introduzida com auxílio de uma seringa numa válvula equivalente à válvula da Figura
A3.2, sendo do tipo rotativo e resistente à alta pressão empregada neste tipo de equipamento.
Ambas as válvulas encarregam-se de medir o volume injetado, que varia de umas poucas dezenas
de microlitros (HPLC) a 1-2 mL (CFG). No caso da válvula de injeção do HPLC, é
recomendado que o volume de amostra seja no mínimo cinco vezes maior que o volume do loop,
para evitar diluição da amostra. A seringa somente pode ser removida após a injeção
propriamente dita (Figura A3.3.b), sob pena de perda da amostra por sifonagem.
No caso de colunas capilares (exceto megabore), o volume máximo injetável

de amostra não gasosa é muito pequeno para ser medido por uma microseringa (0,01 a 1 µL).
Além disso, o diâmetro das mesmas é tão pequeno (≤ 0,32 mm) que a injeção não pode ser feita
diretamente na coluna, como acontece com as colunas de maior diâmetro (CFG). Nesses casos, é
necessário um injetor especial, onde a amostra, uma vez vaporizada, é dissolvida na fase móvel e
esta solução sofre uma divisão (divisor pneumático), de modo que 1/1001 ou uma fração ainda
menor é realmente enviada para a coluna, enquanto que o restante é descartado. As colunas
1
Esta relação chama-se “razão de divisão” (em inglês, split) e é igual à vazão na coluna dividida pela vazão total (vazão
na coluna + vazão no divisor). Ver detalhes do divisor na Figura A3.3.b.
megabore, por apresentarem um maior volume interno (0,53 mm de diâmetro interno), podem
suportar maiores volumes e até injeção sem divisão (nesse caso, apenas 1 µL é o recomendado).
Na atualidade existem amostradores automáticos, programáveis, que

comportam um número relativamente grande de amostras, injetando-as seqüencialmente, o que
torna a rotina do laboratório menos exaustiva, além de oferecer maior precisão.
Figura A3.2.a – Válvula de injeção de amostra gasosa (posição carga)
Figura A3.2.b – Válvula de injeção de amostra gasosa (posição injeção)
Independentemente da forma de introdução da amostra, esta entra na coluna

através de um dispositivo denominado injetor (Seção 2.6), exceto no caso de um cromatógrafo a
líquido (HPLC), em que a válvula de injeção direciona a amostra diretamente para a coluna.
Muitas vezes a amostra necessita ser vaporizada. Por isso, os injetores, na

cromatografia a gás, são denominados também de vaporizadores. Existem basicamente dois tipos
de injetor: o injetor para coluna empacotada e o injetor para coluna capilar. No primeiro, a
amostra é introduzida diretamente na coluna (Figura A3.3.a), conhecida como injeção on
column. No segundo, a fase móvel segue três diferentes caminhos, após entrar no injetor: a)
fluxo através da coluna, para arraste da amostra; b) fluxo pelo divisor, para diminuir a
quantidade de amostra realmente introduzida na coluna; c) fluxo sobre a parede interna do septo,
para mantê-lo limpo (purga do septo). Como a amostra não é introduzida diretamente na coluna,
existe a possibilidade de parte da mesma ficar absorvida no septo, daí a necessidade dessa purga.
Para minimizar esse problema, existem septos (os septos são de borracha de silicona) com uma
camada de teflon (menos poroso). Esta face fica voltada para o interior do injetor. Normalmente
ajusta-se a vazão da puga do septo (PS) em 20 mL/min. A vazão da coluna capilar é ajustada
indiretamente. Ajusta-se a pressão da fase móvel na entrada do injetor de modo a garantir a
vazão desejada (1 mL/min a 5 mL/min, dependendo do diâmetro da coluna). Depois ajusta-se a
vazão do divisor de modo a obter-se a razão de divisão desejada. Esta razão depende do
diâmetro da coluna (quanto menor o diâmetro, maior a razão) e da concentração da amostra
(quanto maior a concentração, maior a razão). Finalmente, ajusta-se a purga do septo.
Figura A3.3.a – Injetor para coluna Empacotada

1- Porca de fixação do septo e guia para entrada da agulha da seringa; 2- Septo de
silicona; 3- Entrada de Fase Móvel; 4- Corpo do injetor; 5- Lã de vidro silanizada; 6-
Porca de fixação da coluna; 7- Anel de vedação; 8- Coluna; 9- Fase estacionária.
Figura A3.3.b – Injetor para coluna Capilar

1- Porca de fixação do septo e guia para entrada da agulha da seringa; 2- Septo de
silicona; 3- Purga do septo; 4- Corpo do injetor; 5- Tubo de vidro recheado com lã de
vidro silanizada (insert); 6- Entrada de Fase Móvel; 7- Anel de vedação (borracha de
silicona); 8- Purga do divisor; 9- Coluna capilar.
O injetor para coluna capilar pode ser operado de quatro distintos modos:
a) Injeção a frio
Em casos especiais, pode ser necessário injetar amostras líquidas a frio.

Evidentemente, a amostra não deve ter um ponto de ebulição alto. Esse modo não pode ser
empregada com colunas capilares, apenas com empacotadas e megabore. Desligando o
aquecimento do injetor, este assume a temperatura da coluna. O resultado esperado é a formação
de picos mais agudos para o solvente, melhorando a sensibilidade.
b) Injeção a quente
Empregado com qualquer tipo de coluna, esse modo de injeção e é indicado

quando a amostra apresenta alto ponto de ebulição. A temperatura do injetor é ajustada para
algum valor acima do ponto de ebulição da amostra, o que causa uma vaporização instantânea.
c) Injeção a quente com divisão
Indicado para colunas capilares, esse modo é o mais largamente empregado.

Passado 1 minuto da injeção, a válvula do divisor pode ser fechada para economizar gás.
d) Injeção a quente sem divisão
Também indicado para colunas capilares, esse modo é empregado quando a

amostra possui um mais alto ponto de ebulição. Como o próprio nome indica, a válvula do
divisor fica fechada no momento da injeção. Passado 1 minuto da injeção, a válvula do divisor é
aberta, para facilitar a limpeza do injetor (remoção de algum material que não tenha entrado na
coluna). Passado mais 1 minuto, a válvula do divisor pode ser fechada para economizar gás.
APÊNDICE 4
Sistemas de aquisição de dados
Mesmo na atualidade ainda são empregados registradores para a aquisição

dos dados cromatográficos. Qualquer que seja o detector empregado (CFG ou HPLC), o sinal
gerado pelo mesmo é uma tensão (corrente contínua). Trabalhando-se com registrador, obtém-se
um gráfico (cromatograma), com auxílio do qual são medidos os tempos de retenção e as áreas
dos diferentes picos. O tempo gasto nesse trabalho é muito grande e o erro é às vezes bastante
expressivo (5 a 10 %).
O integrador eletromecânico realizou uma verdadeira revolução na

Cromatografia, particularmente em laboratórios de Controle de Qualidade, acelerando e
aumentando bastante a precisão do trabalho analítico (erro da ordem de 0,5 %).
Com o desenvolvimento da eletrônica, alguns registradores passaram a ser

comercializados com um integrador eletrônico cujo registro gráfico era igual ao do integrador
eletromecânico, de modo que não houve diminuição visível no erro de integração, pois a leitura
continuava sendo analógica. Mas logo em seguida surgiram os verdadeiros integradores
eletrônicos. Os primeiros limitavam-se a imprimir a área medida. Os cálculos eram ainda
realizados pelo analista, embora com uma precisão na integração (medida da área) da ordem de
0,001 %. A Segunda geração de integradores veio complementar o trabalho. Após a integração,
o equipamento, utilizando o método de cálculo previamente selecionado pelo analista, realizava
a operação final, chegando a imprimir a concentração na unidade desejada. Esses equipamentos
denominam-se integradores-processadores. Alguns, mais sofisticados, imprimem o
cromatograma, em tempo real, utilizando os recursos de correção vertical e correção
tangencial e inclusive realizando cálculos pós-análise (geralmente em BASIC), além de
automatizar o acionamento de válvulas. Na realidade esses integradores de última geração são
computadores dedicados. Seu alto custo, aliado a uma curta vida tecnológica, decretou o fim
desses equipamentos.
Na atualidade, os laboratórios de cromatografia estão substituindo os

integradores por softwares bastante completos e sofisticados, que com auxílio de um
microcomputador tipo PC e de uma interface, realizam o trabalho do integrador com a mesma
eficiência, a um preço bem menor, além de poderem monitorar até quatro cromatógrafos de um
modo totalmente independente.
APÊNDICE 5
O desenvolvimento cromatográfico
As Figuras 1.1 (p. 1) e 2.1 (p. 3) mostram, respectivamente, a distribuição das

partículas sólidas (fase estacionária sólida ou suporte, no caso da fase estacionária líquida)
dentro de uma coluna empacotada e o processo de separação a nível molecular (pictoricamente).
Na Seção 2.2 (p. 3) é dado um pequeno tratamento matemático ao processo de separação por
partição, quando então há referência a etapas ou pontos de equilíbrio. Entre as páginas 7 e 8 é
oferecida uma pequena discussão a respeito do que acontece numa coluna de cromatografia
clássica (fase estacionária sólida), quando se faz referência a uma coluna desenvolvida. No final
da Seção 2.6, ao discutir as Figuras 2.15 (p. 14) e 2.16 (p. 14), é feita referência ao número de
pratos teóricos (n), como medida da eficiência (capacidade de separação) de uma coluna
cromatográfica. Finalmente, no Capítulo 3 (p. 15), é apresentada a equação de van Deemter e
seus diversos parâmetros são discutidos.
O processo de separação cromatográfica pode ser analisado, por analogia, como uma
destilação fracionada. No projeto de uma coluna de destilação contínua, o engenheiro químico calcula em
que pontos devem ser colocadas bandejas (pratos) para a retirada de frações de diferentes pontos de
ebulição. Numa destilação em batelada não existem essas bandejas, mas evidentemente o cálculo é o
mesmo. Como não existem pontos de remoção ao longo da coluna, tudo sai pelo topo da mesma, na
ordem crescente do ponto de ebulição. O mesmo acontece com a cromatografia. A diferença é que outros
fatores também interferem no processo, tornando-o mais complexo, porém também mais completo, mais
eficiente. Assim, enquanto uma coluna de destilação contém cerca de 40-60 bandejas, uma coluna de
cromatografia possui algumas centenas ou mesmo milhares de bandejas (pratos teóricos).
Cada componente da amostra, com diferente coeficiente de partição (ou de

adsorção), movimenta-se ao longo da coluna, transportado pela fase móvel, com uma
velocidade média diferente: quanto maior for sua afinidade com a fase estacionária (ou menor
com a fase móvel), maior será o coeficiente e, portanto, maior será seu tempo de residência
(tempo de retenção) na coluna, ou seja, menor será sua velocidade média. O material eluído
comporta-se como um pistão móvel, com concentração máxima nas proximidades da parte
central e distribuição de concentração quase gaussiana. À medida que o tempo passa, a largura
do pistão aumenta (por efeito da difusão), de modo que se o tempo de eluição for muito grande,
os picos coalescem e a separação será incompleta (ver Figura 2.10, vazão V1, na página 11). Por
outro lado, se o tempo for muito curto, (vazão V4 da Figura 2.10), pode ser insuficiente para
permitir separação completa. Esse raciocínio levou à elaboração da equação abaixo, para o
cálculo da eficiência de uma coluna cromatográfica (Fig. 2.16, 15):
n = (4Dr/L)2
Pictoricamente, uma mistura de três componentes apresentaria o

comportamento mostrado na Figura A5.1 e a distribuição de concentração (ou de massa) de cada
componente é mostrada na Figura A5.2. Observe-se que a Figura A5.2 não é um cromatograma.
A substância que sai primeiro da coluna é a primeira a atingir o detector. Do mesmo modo, a
primeira porção de cada componente a atingir o detector é a da extremidade direita (na Figura).
O cromatograma, por outro lado, é traçado da esquerda para a direita (neste livro). Assim,
enquanto a Figura A5.2 mostra uma cauda frontal, o cromatograma correspondente mostraria
uma cauda no ramo negativo (descendente) do pico de cada componente.
Figura A5.1 – Desenvolvimento cromatográfico de uma mistura. Figura A5.2 – Distribuição de massa.
APÊNDICE 6
Outros detectores empregados em Cromatografia
1. Detector de Nitrogênio e Fósforo (DNP)
O DNP é um detector utilizado em cromatografia a gás e foi projetado

especificamente para a detecção de compostos nitrogenados (N) e fosforados (P) ao nível de
traços (concentrações da ordem de ppb). Também conhecido como detector termoiônico, o DNP
utiliza uma eletrônica (e o próprio hardware) equivalente ao DIC, inclusive com os mesmos
gases (Nitrogênio como fase móvel e Hidrogênio e Ar Sintético como auxiliares). O polarizador
contém uma pastilha alcalina e a razão de fluxos dos três gases (que é diferente para compostos
nitrogenados ou fosforados) é insuficiente para produzir chama, mas o potencial elétrico
estabelecido no local gera um plasma, que aumenta de 104-105 a sensibilidade do detector para
esses compostos, relativamente a outros compostos. Devido a essas características, o DNP é dito
seletivo para compostos nitrogenados e fosforados, unicamente para soluções extremamente
diluídas, sendo portanto ideal para a detecção de traços de pesticidas organo-nitrogenados e
organo-fosforados.
2. Detector Fotométrico de Chama (DFC)
O DFC é basicamente um detector de ionização por chama, no que diz respeito

ao hardware. Entretanto, a detecção baseia-se na absorção da radiação emitida pelo enxofre (e
também pelo fósforo e ainda outros elementos) na região visível do espectro eletromagnético.
Trata-se, portanto, de um espectrofotômetro, obedecendo assim à Lei de Beer. A radiação
emitida pela chama atravessa um filtro, o qual seleciona o comprimento de onda desejado (394
nm para o enxofre e 526 nm para o fósforo). Para compostos contendo um desses elementos, sua
sensibilidade é da mesma ordem de grandeza do DNP, sendo, portanto, indicado para a detecção
de traços (ppb) de pesticidas fosforados e sulfurados.
3. Detector de Íons
Até os anos 70 a Cromatografia Instrumental apenas não era empregada na

análise de íons (cátions e ânions). Posteriormente foi observado que o bombeamento em paralelo
de um reagente complexante poderia transformar o íon em um derivado (na saída da coluna),
colorido, o qual seria detectado num espectrofotômetro (ex.: detector UV-VIS).
A separação cromatográfica de íons, não discutida neste livro, ocorre numa

coluna contendo uma resina trocadora de íons apropriada, tratando-se, portanto, de uma técnica
bastante antiga, mais largamente empregada na purificação de águas (deionização). O
equipamento é, em última análise, um HPLC típico.
Para evitar o trabalho de derivação, foi desenvolvido um detector específico, o detector

de íons, que é, em última análise, um condutivímetro. Consta de um par de eletrodos contidos numa célula
termostatizada. Aplica-se um campo elétrico entre os eletrodos. O efluente da coluna passa pela célula,
variando a resistência R entre os eletrodos, de acordo com a Lei de Ohm. A condutância (L) é
inversamente proporcional à resistência e é medida em Ohm-1. Essa unidade atualmente denomina-se
Siemens (símbolo S). Quando a distância entre os eletrodos é de 1 cm, tem-se:
k = L/A
onde k é a condutância específica e A é a área do eletrodo. Por outro lado, a condutância

equivalente (Ce) é relacionada com a condutância específica como:
Ce = 1000 k/c
onde c é a concentração do íon em equivalente-grama/L.
4. Detector de Fluorescência
O Detector de Fluorescência, utilizado em HPLC, é equivalente a um Detector de

Ultravioleta. A única diferença consiste na localização (ortogonal e não linear) em relação ao caminho
ótico. Desse modo, é captada apenas a radiação proveniente do processo de fluorescência, característico
de certas classes de compostos. Assim, substâncias que não fluorescem podem existir na amostra sem
interferir na detecção. Uma importante aplicação é a análise de aminoácidos em materiais biológicos (ex.:
teste do pezinho). Neste exemplo, os aminoácidos são transformados em derivados fluorescentes com o
reagente AQC (carbamato de aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidila). Nove aminoácidos podem ser
analisados em aproximadamente dez minutos, em gradiente ternário, com limite de detecção menor que
10 mg/L.
5. Detector Eletroquímico
O Detector Eletroquímico, também utilizado em HPLC, é basicamente uma célula

eletroquímica. O analito oriundo da coluna, ao passar pela célula, é oxidado (ou reduzido) pelo potencial
aplicado, gerando uma corrente elétrica que é proporcional à sua concentração.
Existem dois tipos de detectores:

a) Detector coulométrico: a amostra passa através da célula. Desse modo, todo o
material é oxidado (ou reduzido);
b) Detector amperométrico: a amostra passa pela superfície do eletrodo. Assim,
apenas cerca de 1% a 5% do material é realmente oxidado (ou reduzido).
Desenvolvido para detectar traços (ppb a ppt) de íons, este detector exige alta
pureza de solventes e reagentes. A água, por exemplo, deve ser deionizada, purificada em
sistema Milli-Q ou equivalente e filtrada em filtros com 0,2 µm (membrana de nylon 66) e sua
resistividade deve ser ao menos 18,2 MOhm.cm. O fabricante inclusive aconselha que ao sair do
sistema Milli-Q a água passe em coluna com fase móvel C18 para extração.
6. Detector por Espalhamento da Luz com Evaporação
Surgiu recentemente no mercado um detector para HPLC que se apresenta

como o detector ideal. Este detector, denominado Evaporative Light Scattering Detector
(ELSD), emprega o fenômeno de espalhamento (ou dispersão) da luz, também conhecido como
Efeito Tyndall. Embora conhecido desde 1966, quando foi descrito por pesquisadores da Union
Carbide australiana, apenas em anos recentes começou a ser comercializado. A grande vantagem
do ELSD é sua universalidade (como o DIR) aliada a uma alta sensibilidade (como o DUV),
além de apresentar resposta proporcional à massa, não requerendo portanto a preparação de
solução padrão para calibração, ou seja, não exige calibração. Os cromatogramas da Figura
A6.1(a) e (b) ilustram bem a importância desse detector.
Figura A6.1 – Análise de ácidos graxos com: a) Detector UV (215 nm) e b) ELSD.
O detector de Índice de Refração, embora universal, apresenta baixa
sensitividade e não pode trabalhar com gradiente de polaridade. O detector de Ultravioleta,
embora apresente um Limite de Detecção muito mais baixo, somente detecta substâncias que
absorvam luz ultravioleta. Observe-se que no Cromatograma A6.1.a aparece um pico bastante
proeminente de uma impureza presente em baixíssima concentração na amostra. Devido à sua
alta absortividade molar, a área do pico é bastante grande e além disso acarreta um problema de
resolução entre si e o pico do componente 2. No cromatograma A6.1.b, obtido com um ELSD,
esse problema desaparece totalmente, além de obter-se um sinal mais alto para o componente 3,
de baixa absortividade molar. A literatura já apresenta um grande número de métodos analíticos
empregando um ELSD. Pode-se acrescentar que muitas vezes, principalmente devido à baixa
sensitividade do DIR, é necessário realizar-se uma derivação na amostra para que a mesma
torne-se detectável por um DUV ou um detector de fluorescência, como por exemplo, no caso de
aminoácidos. A derivação sempre é um transtorno, por representar um trabalho a mais e uma
fonte de erro a mais.
No ELSD (Figura A6.1.) o efluente da coluna sofre três processos, nessa

ordem: a) nebulização, por um gás inerte, b) evaporação da fase móvel em uma câmara
aquecida e c) detecção da luz espalhada pelas partículas remanescentes. Por esta descrição
torna-se óbvia a talvez única restrição do ELSD: só detecta substâncias de mais alto ponto de
ebulição que a fase móvel. A referência 13 traz um review sobre ELSD, com 26 referências
cobrindo o período de 1966 a 1998.
Figura A6.1 – Diagrama esquemático de um ELSD

APÊNDICE 7
Estatística
1. Erro estatístico
Todo trabalho experimental é dotado de erro. Trata-se aqui de dois tipos de

erro: a) erro estatístico e b) erro sistemático.
O erro estatístico possui características aleatórias. Pode ser avaliado e

minimizado, mas nunca anulado. Apresenta um comportamento gaussiano, isto é, em um
determinado número de repetições, os valores que mais se afastam da média (aritmética) ocorrem
com menor freqüência e erros positivos e negativos de mesma grandeza ocorrem com igual
freqüência. O erro sistemático, por outro lado, é um erro determinado, possui sinal (é positivo
ou negativo). Em Cromatografia, o erro sistemático é corrigido automaticamente pelo próprio
método de cálculo (Seção 6.3; p. 34).
2. Avaliação do erro estatístico
Uma das maneiras de se medir o grau de dispersão de um conjunto de

resultados analíticos (repetições) é o desvio padrão (s), o qual pode ser calculado com auxílio da
equação 22.
s = [Σ (xi - x )2/(n – 1)]1/2 (eq. 22)
onde xi é um resultado qualquer, x é a média aritmética e n o número de repetições. Esse

parâmetro é denominado primeira estimativa do desvio padrão, já que o verdadeiro desvio
padrão só pode ser calculado quando n tende para infinito. Entretanto, s só pode ser empregado
quando n é maior que 10. Como normalmente n é muito pequeno (3 a 5 determinações em
paralelo), emprega-se em seu lugar a segunda estimativa do desvio padrão (sR):
sR = Kn R (eq. 23)
onde R é a amplitude, ou seja, a diferença entre o valor (resultado analítico) maior e o valor
menor. O valor de Kn é obtido da Tabela A7.1.
3. Avaliação da exatidão
Na realidade, erro de exatidão é o erro sistemático, que seria corrigido pelo próprio
método analítico, conforme afirmado acima. Entretanto, o analista pode cometer erros operacionais que
resultem em erro sistemático (ex.: uso de solventes contendo impurezas que interfiram na identificação). O
erro sistemático pode ser avaliado com auxílio do teste t (de Student), que compara a concentração real de
uma solução padrão, preparada com todo critério (por exemplo, preparada por um Laboratório de
Referência) com a concentração do padrão empregado na calibração do equipamento. A equação seguinte
é aplicada, com auxílio da Tabela A7.2:
Tabela A7.1 - Valores de Kn para cálculo de sR.
n 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Kn 0,8862 0,5908 0,4857 0,4299 0,3946 0,3698 0,3512 0,3367 0,3249
X−µ n
t= (eq.24)
s
onde X é a média aritmética das n determinações, µ é a concentração real, s é calculado de
acordo com a eq. 22 (p. 72) e t é comparado com o valor tabelado (Tabela A7.2). Se o valor de
tcalc for menor ou igual ao de ttab na coluna P = 95%, para o correspondente valor de n-1, o
Laboratório em avaliação está correto.
Tabela A7.2 - Valores de t para aplicação do teste t.
P (%)
n-1 90 95 99
1 6,314 12,706 63,657
2 2,920 4,303 9,925
3 2,353 3,182 5,841
4 2,132 2,776 4,608
5 2,015 2,571 4,032
6 1,943 2,447 3,707
7 1,895 2,365 3,499
8 1,860 2,306 3,355
9 1,833 2,262 3,250
10 1,812 2,228 3,169
4. Avaliação da reprodutibilidade
O objetivo é comparar a precisão de um Laboratório, de um analista, de um

equipamento ou de um método (ou um determinado procedimento) com outro. Aplica-se o teste
F, que compara a dispersão de um conjunto de dados com a de outro. Se as diferenças em
precisão forem estatisticamente significativas, o valor de Fcalc será maior que o valor de Ftab
(Tabela A7.3). Para uso da eq. 25, o maior desvio padrão é colocado no numerador, de modo a
ter-se um valor de F maior que 1.
s2A
F= 2 (eq. 25)
sB
Tabela A7.3 - Valores de F para aplicação do teste F
(n -1) (n - 1) PARA O MÉTODO A

de B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 161 200 216 225 230 234 237 239 241 242
2 18,5 19 19,2 19,2 19,3 19,3 19,4 19,4 19,4 19,4
3 10,1 8,6 9,9 9,1 9,0 8,9 8,8 8,8 8,8 8,8
4 7,7 6,9 6,6 6,4 6,3 6,2 6,1 6,1 6,0 6,0
5 6,6 5,8 5,4 5,2 5,1 5,0 4,9 4,8 4,8 4,8
6 6,0 5,1 4,8 4,5 4,4 4,3 4,2 4,2 4,1 4,1
7 5,6 4,7 4,4 4,1 4,0 3,9 3,6 3,7 3,6 3,6
8 5,3 4,5 4,1 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3 3,3
9 5,1 4,3 3,9 3,6 3,5 3,4 3,3 3,2 3,1 3,1
10 5,0 4,1 3,7 3,5 3,3 3,2 3,1 3,1 3,0 3,0
5. Número ideal de repetições
O número ideal de repetições (em paralelo) é calculado com aplicação das eq. 26 e 27:
t.s
∆ = R
n
(eq. 26) L = 100∆/µ (eq. 27)
Os dados são organizados no Quadro abaixo (os valores são exemplo fictício),
para facilitar a interpretação. Na última coluna é indicada a diferença entre o valor de L atual e o
da linha anterior. No momento em que a diferença (vale dizer, a diminuição na dispersão dos
valores, ou ainda o aumento na precisão) fica desprezível, a critério do analista, este adota o
número anterior como sendo o número ideal de repetições.
6. Expressão do resultado final
Para explicitar o grau de confiabilidade em uma análise, é necessário indicar os

limites de confiança. Na prática, é comum definir os limites a partir da amplitude. Assim, um
resultado Re é representado como:
Re = X + R/2
Na realidade, caso o método tenha sido submetido a uma avaliação estatística

completa, emprega-se a relação:
R
Re = X + t.Kn.
n
amostra A: µ = 1%
n
∆ L Dif.
2 0,260 26,0 -
3 0,072 7,2 18,8
4 0,046 4,6 2,6
5 0,036 3,6 1,0
6 0,030 3,0 0,6
7. Cálculo do coeficiente de correlação (r)
Na Seção 7.3 (p. 44) foi solicitado o cálculo do coeficiente de correlação. Este
cálculo é realizado com uso da eq. 28:
(eq. 28)
Para ordenar os cálculos, faz-se uso do quadro abaixo, onde x e y são,

respectivamente, concentração e área do pico.
Ponto no x y x.y x2 y2
1 x1 y1 x1.y1 x12 y12
2 x2 y2 x2.y2 x22 y22
... ... ... ... ... ...
... ... ... ... ... ...
... ... ... ... ... ...
n xn yn xn.yn xn2 yn2
Totais Σx Σy Σx.y Σx2 Σy2
APÊNDICE 8
Outros parâmetros cromatográficos
Além do tempo de retenção absoluto (tr) e da retenção relativa (RR) e do

número de pratos teóricos (n), já estudados anteriormente, outros parâmetros são igualmente
importantes para uma completa avaliação de um procedimento analítico. São eles o tempo de
retenção corrigido (t’r), o fator capacidade (k’), a seletividade (α) e o número efetivo de pratos
(Nef), que podem ser determinados pela adição à amostra de uma substância inerte, que não tem
afinidade alguma com a fase estacionária, eluindo no volume morto da coluna (junto com a FE).
A figura A8 exemplifica, apresentando também o procedimento para cálculo parâmetros. Os
dados obtidos do cromatograma (to, tr e L) são inserindo nas equações abaixo, que conduzem ao
cálculo desejado.
Figura A8 – Cromatograma com substância inerte.
Equações:
tr − to t'r (tolueno)  t' 

2
t 'r = t r − t o k' = α= N ef = 16  r 
to t'r (benzeno) L

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Alexandre Schuler

(detectores, aquisição de dados, validação e avaliação estatística)

Décima Primeira Edição

(detectores, aquisição de dados, validação e avaliação estatística)

Décima Primeira Edição

2 - Tipos de Processos Cromatográficos, 3

2.1. Cromatografia de adsorção, 3

3 - Tratamento teórico da Cromatografia, 15

3.1. A equação de Van Deemter, 15

4.1. O Cromatógrafo a Gás, 19

7. Otimização do processo analítico, 40

7.2. Projetando um método analítico, 42

8. Técnicas adicionais de identificação, 50

8.1 Tempo de retenção e retenção relativa, 50

Apêndice 1 (Túnel do Tempo), 54

Apêndice 2 (Características Básicas dos Detectores), 59

Apêndice 3 (Técnicas de introdução da amostra), 61

Apêndice 4 (Sistemas de aquisição de dados), 65

Apêndice 5 (O desenvolvimento cromatográfico), 66

Apêndice 6 (Outros detectores utilizados em Cromatografia), 68

Apêndice 8 (Outros parâmetros cromatográficos), 76

Cromatografia é um termo genérico, aplicado a um processo de separação físico-

Um processo cromatográfico envolve uma fase móvel e uma fase estacionária.

Figura 1.1 - O Processo Cromatográfico.

A fase móvel pode ser um líquido ou um gás. No primeiro caso, denomina-se o

Cromatografia em Fase Líquida de Alto Desempenho

• Cromatografia de Permeação∗ em Gel (GPC)

GPC (do inglês Gel Permeation Chromatography) é empregada na análise de

2 - TIPOS DE PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS

2.1. Cromatografia de Adsorção

Adsorção é um fenômeno físico-químico através do qual um sólido

a) Cromatografia de Adsorção b) Cromatografia de Partição

Figura 2.1 - Diferença entre Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição.

2.2. Cromatografia de Partição

Se uma substância é adicionada a um recipiente contendo dois líquidos não

Se a substância estava inicialmente dissolvida no solvente 1, m1 é a massa que

Substituindo na eq. 2 o valor de m1 (eq. 1), fica

m2 = mo [kpV1/(V2 + kpV1)] 2 (eq. 3)

É possível generalizar a eq. 3 para

mn = mo [kpV1/(V2 + kpV1)] n (eq. 4)

se enriquecendo de B, a cada etapa do processo. Os números da esquerda, em cada quadrícula 1,

ETAPA 1 ETAPA 2 ETAPA 3

1 3/4 1/4 9/32 3/32

Esquema 2.1 - Distribuição (partição) de duas substâncias (A e B), em dois líquidos (1 e 2)

A partição, como entendida neste segundo exemplo, descreve o processo

2.3. Distribuição em contracorrente

O procedimento descrito a seguir é um exemplo típico de extração líquido-

. 2.4. Cromatografia em Fase Líquida

O exemplo mais simples de cromatografia a líquido é a separação em uma camada

Figura 2.2 – Esquema do Aparelho de Craig para distribuição em contracorrente.

O líquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os componentes

Fig. 2.3 - Cromatografia em Camada Delgada.

Neste exemplo, a amostra contém dois componentes, A e

A necessidade de se controlar a vazão da fase móvel e a temperatura da coluna, além da

O ponto A’ indica o nível da fase estacionária e o ponto A indica o

2.5. Fatores que influem na separação

Independentemente do processo envolvido na separação cromatográfica

Natureza da fase estacionária Vazão da fase móvel

A polaridade da fase estacionária é um fator importante a se considerar. Em

A concentração da fase estacionária líquida também influi na separação, como

FE: Esqualano (hidrocarboneto de baixíssima FE: TCEP (tris cianoetoxipropano)

B ⇒ ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0oC)

Figura 2.5 – Separação em função da Figura 2.6 - Efeito da polaridade sobre a