Preparación de cultivos organotípicos en rodajas para el estudio de la función del receptor de glutamato

Resumen

Los cultivos de cortes organotípicos permiten el estudio de receptores de glutamato en un entorno

estrechamente relacionado con la situación in vivo pero con fácil acceso a la manipulación genética de los
receptores y las cascadas de señalización reguladoras, así como una intervención farmacológica más
precisa. Describimos un método para preparar cortes organotípicos de hipocampo que se pueden adaptar
fácilmente a otras regiones del cerebro. Se colocan rodajas de cerebro sobre membranas porosas, y se
permite que el medio de cultivo forme una interfaz. Este método conserva la funcionalidad y la arquitectura
macroscópica del hipocampo durante hasta 2 semanas en cultivo.

Introducción
Circuitos neuronales subyacentes al procesamiento de entradas sensoriales,formación de memoria, y todo tipo
de comportamientos son el resultado de finamente conexiones sinápticas esculpidas entre neuronas. La
conectividad sináptica en el cerebro, a su vez, es el resultado de un delicado equilibrio entre sinaptogénesis,
plasticidad sináptica y eliminación de sinapsis. Los cambios en la conectividad sináptica impulsan el
refinamiento de la neuronal circuitos durante el desarrollo [1] y se cree que subyacen a la formación de nuevos
recuerdos [2]. La interrupción de este equilibrio tiene se ha relacionado con un desarrollo cerebral anormal y
neuropsiquiátrico trastornos como la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia [3]. En todo estos procesos,
los receptores de glutamato y la actividad sináptica juegan un papel rol critico.
Si bien las neuronas cultivadas disociadas son un sistema ampliamente utilizado para interrogar las
propiedades, regulación y función del glutamato receptores, la preparación de tales cultivos implica la formación
de novo de procesos dendríticos y axonales y el establecimiento de sinapsis bajo actividad sináptica sin patrón
que puede afectar a los receptores de glutamato de una manera insospechada. Esto es particularmente
importante cuando estudiar cuestiones como la expresión de proteínas, la inserción sináptica y la regulación de
los receptores de glutamato porque son muy dependientes en niveles de actividad sináptica correlacionada; por
lo tanto, al estudiar el propiedades, regulación y función de los receptores sinápticos de glutamato, un sistema
estrechamente relacionado con el entorno in vivo donde estos existen receptores es altamente deseable.
Los cultivos organotípicos mantienen una organización sináptica que es crítico para comprender la función de
sinapsis de una manera más naturalista contexto que los métodos de rutina de neuronas disociadas de cultivo.
Además, este sistema tiene la ventaja de que los genes pueden manipularse fácilmente y es posible una
intervención farmacológica más precisa que in vivo
Aquí presentamos un método para preparar y cultivar el hipocampo, rodajas que se pueden adaptar fácilmente
a otras regiones del cerebro [6]. Esta El método permite una fácil manipulación genética de los receptores de
glutamato utilizando diferentes enfoques como infección viral [7, 8] o biolística Además, las rodajas se pueden
recuperar fácilmente para ensayos bioquímicos o transferido a microscopios para imágenes [11] o experimentos
electrofisiológicos

Materiales
Todas las soluciones deben prepararse con agua desionizada en autoclave y manejado dentro de una campana
de flujo laminar apropiada para cultivo de tejidos.
Todo el equipo quirúrgico debe limpiarse y limpiarse con etanol y colocarse bajo una lámpara UV en la campana
de cultivo de tejidos al menos 30 min antes del procedimiento.

1. Solución madre de rojo de fenol: 0,5% (v / v) de rojo de fenol en Dulbecco solución salina tamponada con
fosfato (DPBS).
2. Solución madre de L-glutamina: L-glutamina 200 mM. Almacenar en 20 C en alícuotas de 2.5 ml.
3. Solución madre de ácido ascórbico: 25% (p / v) de ácido ascórbico. Almacenar en 20 C en alícuotas de 100
μL.
4. Solución madre de insulina: 1 mg / ml de insulina disuelta en HCl 0.01 N.
5. Solución de disección baja en Na + líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF): CaCl2 1 mM, D-glucosa 10 mM,
KCl 4 mM, 5 mM MgCl2, NaHCO3 26 mM, sacarosa 234 mM y 0.1% v / v rojo fenol como indicador de pH. Uso
desionizado y estéril H2O Revuelva la solución ~ 30 minutos hasta que todo se haya disuelto completamente.
Esterilice la solución por esterilización por filtro. utilizando un filtro de 0.22 μm. Haga alícuotas de 50 ml y

almacene a 4 C No más de 2 meses .

6. Medio de cultivo en rodajas (SCM): mínimo esencial de 8.4 g / L Medio Eagle (MEM), 20% de suero de caballo
inactivado por calor (ver Nota 1), L-glutamina 1 mM, CaCl2 1 mM, MgSO4 2 mM, 1 mg / L de insulina, 0,00125%
de ácido ascórbico, 13 mM D-glucosa, NaHCO3 5,2 mM y Hepes 30 mM. Es crítico que esta solución se prepare
de manera estéril con productos desionizados y estériles. H2O y se mantuvo así. Mezcle la solución hasta que
se disuelva completamente y lleve a temperatura ambiente. Ajuste el pH a 7.27–7.28 con NaOH 1 N. Mida la
osmolaridad y ajústela a 320 mmol / kg con H2O desionizada y esterilizada. Esperar agregue aproximadamente
25–40 ml. Verifique la osmolaridad nuevamente. Los El pH puede cambiar ligeramente mientras se ajusta la
osmolaridad, y esto es Okay; es más importante que la osmolaridad esté en el correcto rango (317–323). La
osmolaridad correcta es crucial para la salud rodajas Esterilice la solución mediante esterilización por filtro
usando un Filtro de 0,22 μm. Haga alícuotas de 20 ml y almacene hasta 2-3 semanas a 4 C.

Herramientas de disección y materiales de cultivo

1. Cortadora de tejidos.
2. Lámina de teflón de 0,78 mm de espesor.
3. Herramienta de disección del hipocampo.
4. Perfección grandes tijeras de utilidad.
5. Pinzas de laminectomía Dumont # 2.
6. Aguja de disección, filo simple.
7. Espátula de iris, curva.
8. Espátula de iris, recta.
9. Pequeñas tijeras de disección.
10. Espátula redondeada / recta.
11. Placas de seis pocillos.
12. Inserciones de cultivo celular.

Metodo
1. Prepare la cortadora de pañuelos colocando una nueva pieza de lámina de teflón 1/32 pulgadas de grosor
en la cama de disección y montaje de una nueva cuchilla de afeitar estándar de doble filo (Fig. 1). Use cinta
para mantener La lámina de teflón en su lugar. Es importante la lámina de teflón para ser plano
2. Limpie la campana de cultivo de tejidos con etanol al 70% y ajuste el microscopio de disección en el interior.
Esterilizar la campana, microscopio, cortadora de tejidos y todos los instrumentos de disección durante al menos
15 minutos con luz UV (Fig. 2).
3. Prepare placas de cultivo de tejidos de seis pocillos. Añadir 750 μL de cultivo en rodajas
medios (SCM) por pocillo, y coloque insertos de cultivo celular en cada bien. Asegúrese de que las membranas
estén completamente húmedas sin Burbujas debajo. Coloque las placas en la incubadora a 35 ° C. gaseado
con 5% de CO2 hasta que sea necesario
4. Vierta 50 ml de bajo contenido de Na + ACSF (solución de disección) en 100 ml vaso de precipitados y
colóquelo en una mezcla de hielo y sal. Bubble the low Na + ACSF con 5% CO2 / 95% O2 hasta que el color
cambie y ACSF forme un mezcla de lechada de solución congelada y líquida (10-20 min).
5. Obtenga un cachorro de rata posnatal de 5 o 7 años (P5 – P7). Hasta tres cachorros puede ser usado.

Hipocampo
Preparación de rebanadas (Ver
Nota 2

Use equipo de protección personal, sobre todo guantes y mascarilla para evitar la contaminación del tejido (ver
Nota 3).
1. Corte la cabeza del animal con unas tijeras afiladas. Corta el piel y exponer el cráneo. Abre el cráneo cortando
de lado a un lado a lo largo de la línea interaural y luego a lo largo del sagital
sutura con tijeras pequeñas. Un corte opcional de lado a lado en El frente se puede hacer para facilitar la
extracción de los huesos y Exposición del cerebro. Saque el cerebro rápidamente con un micro espátula cuchara
redondeada, y colóquelo en la lechada de Solución de disección para enfriar durante ~ 1 min. Verter ~ 10 ml de
solución de disección helada en un plato de 60 mm y transferir El cerebro del vaso de precipitados al plato. El
cerebro debe ser cubierto con solución de disección
2. Mueva el tejido hacia la campana de cultivo de tejidos. Coloca el cerebro bajo el microscopio de disección y
sosténgalo en la línea media con las pinzas de disección presionadas al fondo de los 60 mm plato. Use la
herramienta de disección del hipocampo para separar hemisferios dejando fuera el mesencéfalo. Los
hipocampos son luego expuesto en cada hemisferio. Luego saque suavemente hipocampo con la herramienta
de disección del hipocampo. Utilizar la aguja de disección para aislar completamente el hipocampo, y limpiarlo
tanto como sea posible.
3. Usando una punta cortada de una punta de pipeta de filtro de 1000 μL (P1000), aspire suavemente el
hipocampo y transfiéralo al teflón hoja en la cortadora de tejidos. Coloque el hipocampo sobre su
lado cóncavo
4. Alinee los hipocampos perpendiculares a la cuchilla para obtener secciones coronales, y drene el exceso de
líquido.
5. Corte el hipocampo cada 300–400 μm.
6. Vierta ~ 10 ml de SCM frío en un plato de 60 mm y transfiera en rodajas hipocampo de la rebanadora usando
otro filtro P1000 cortado punta y frío SCM. Evita hacer burbujas.
7. Con la ayuda de una espátula de iris y una espátula recta, suavemente separe las rodajas entre sí.
8. Separe las rebanadas bien definidas y no dañadas de las dañadas rodajas.

Hipocampo Cultura de corte

1. Traiga las placas de seis pocillos con SCM e insertos de cultivo celular de la incubadora en la campana de
cultivo de tejidos. Con la ayuda de otra punta de filtro P1000 cortada, transfiera rebanadas individuales a
La membrana. Coloque 4–5 rebanadas por membrana. Ten cuidado no para colocar las rodajas cerca de la
pared de inserción o cerca de cada otro. Cuando sea necesario, use una espátula de iris para separar las
rodajas. Eliminar el exceso de medio. Toque las rebanadas lo menos posible una vez
están en la membrana (ver Nota 5).
2. Mueva la placa de regreso a la incubadora y cultivo a 35 ° C y 5% CO2
3. Cambie SCM cada 48 h dentro de la campana de cultivo de tejidos por aspirando el SCM con una pipeta
Pasteur. Añadir 750 μL de SCM precalentado fresco por pozo. Asegúrese de que no haya burbujas
formado debajo de la membrana (ver Nota 6).

Notas
1. Diferentes fuentes de suero pueden influir en la calidad de las rodajas. Recomendamos probar varios lotes
primero.
2. Este método se puede adaptar a otras regiones del cerebro proporcionadas que la densidad del tejido permite
una oxigenación adecuada y penetración de nutrientes
3. Este método se basa en el método descrito por primera vez por Stoppini et al. [16] y ofrece una manera rápida
de cultivar el hipocampo rodajas El aspecto más importante de este protocolo es mantener rodajas estériles;
por lo tanto, es crítico usar un estéril apropiado técnicas y para desinfectar y esterilizar adecuadamente todos
los materiales en contacto con el tejido. Si la contaminación es recurrente problema, verifique la incubadora y
la campana de cultivo de tejidos para ver si es posible fuentes de contaminación. Uso adecuado de técnicas
estériles. Durante todo el procedimiento es esencial. La contaminación se detecta fácilmente moviendo motas
negras en el medio o turbidez. de la SCM. Cuando se coloca bajo el microscopio, la superficie de la rebanada
debe verse limpia después de 4 días en cultivo con una clara y discerniblemente cuerpos celulares. Si no se
ven cuerpos celulares claros y mucho los desechos cubren la superficie después de 4 días, entonces no es una
rebanada saludable.
4. El tiempo total desde la decapitación hasta colocar las rodajas en el membrana y en la incubadora no debe
ser más de 1,5 h. Si el procedimiento lleva demasiado tiempo, comprometerá el salud de las rodajas.
5. Colocar las rodajas en una membrana porosa garantiza adecuadamente oxigenación y nutrición a través de
una capa delgada de SCM que es formado por capilaridad. Por lo tanto, la densidad del tejido limita este método.
a tejido joven. Para el hipocampo, rodajas de 300–400 μm de grosor de p6 a p7, los animales parecen dar los
mejores resultados. Este tipo de rodajas se puede obtener rápidamente con una cortadora de tejidos que
disminuye el tiempo El tejido está expuesto al aire.
6. Importante para aquellos que estudian fisiología sináptica, después de algunos días en cultivo, todos los
restos de las células muertas han sido eliminados, dejando una superficie limpia muy adecuada para
electrofisiología o experimentos de imagen. Además, hipocampo organotípico las rebanadas continúan
desarrollando conectividad normal comparable a rodajas agudas [17]. Sin embargo, después de 2 semanas en
cultivo, esto es normal. la conectividad desaparece a medida que las neuronas comienzan a formar demasiadas
conexiones que aumentan la actividad sináptica en el segmento.