Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
Muscle Cell Culture System of Chick Embryo For Examine Growth Factor
Activity From Shochu Distillery By-Product
L.D. Mahfudz1 dan K. Hayashi2
Faculty of Animal Science Diponegoro University, Semarang
Faculty of Agriculture, Kagoshima University, Japan
Email: ludfimahfudz@yahoo.com
Abstract
Background: Shochu is a common name for alcohol beverage from Japan. Shochu distilllery by-product
(SDBP) containt an unidentified growth promoting factor (UGF) for chicken. This experiment was
conducted to study in vitro activity of growth factor from SDBP due to its difficulty to examine in vivo,
related by very small amount of UGF.
Methods: The material of this experiment is chicks embryo muscle cell culture and UGF from SDBP. The
parameters for examined UGF from SDBP were creatine-kinase activity, protein and DNA content from
chick embryo muscle cells culture. The growth factor was separated by Sephadex LH-20 with 60 x 750mm
column, used solvent system of water, methanol and ethylene dichloride (10 : 90 : 20). The fraction 1, there
are contain UGF than added to chick embryo muscle cells culture. Rosalki (1967), protein content by
modification of Lowry method, examined the creatine kinase activity and Erwin, et al. (1981) method,
examined DNA content.
Result: The protein content and creatine kinase activity was increase by SDBP addition, but not the DNA. The
increaseing of protein content and creatine kinase activity showed that UGF from SDBP stimulated the
growth and maturity of myotubes. Eventhough, proliferation of myotubes has not existed, with signed by
same amount of DNA content. It could be concluded that chick embryo muscle cell culture can be used for
evaluate UGF activity from SDBP.
Key word: chick embryo, muscle cell, cell culture, growth factor, shochu.
Abstrak
Latar Belakang: Shochu adalah nama umum yang dipakai untuk minuman beralkohol khas Jepang. Limbah
Distilasi Shochu (LDS) mengandung “unidentified growth promoting factor” (UGF) untuk ayam. Penelitian
dilakukan untuk mencari cara menguji aktivitas faktor pertumbuhan dari limbah distilasi shochu secara in vitro,
karena sangat sulit untuk menguji secara in vivo berkenaan dengan jumlah growth factor yang sangat sedikit.
Metode: Materi dari penelitian ini adalah kultur jaringan sel dari embrio anak ayam, growth factor dari LDS.
Adapun parameter untuk menguji growth factor dari LDS adalah aktivitas kreatin kinase, kandungan protein dan
DNA dari kultur jaringan embrio anak ayam. Faktor pertumbuhan dipisahkan dengan menggunakan Sephadex
LH-20 dengan kolom 60 x 750 mm menggunakan pelarut air, methanol dan ethylene dikloride (10 : 90 : 20).
Fraksi 1 yang diketahui mengandung UGF kemudian ditambahkan pada kultur jaringan sel embrio ayam.
Aktivitas keratin kinase di ukur menurut metode Rosalki (1967), kandungan protein dengan modifikasi metode
Lowry, sedang DNA ditentukan menurut Erwin., et al (1981).
Hasil: Kandungan protein dan aktivitas kreatin kinase meningkat dengan pemberian UGF dari LDS, namun
konsentrasi DNA tidak dipengaruhi oleh UGF dari LDS. Peningkatan konsentrasi protein dan aktivitas keratin
kinase menunjukan bahwa UGF menstimulasi perkembangan dan pemasakan myotub-myotub. Walaupun belum
terjadi proses proliferasi ditandai dengan kandungan DNA yang sama. Disimpulkan bahwa sistem kultur sel
jaringan embrio ayam dapat digunakan untuk mengecek aktivitas UGF dari LDS.
Kata kunci: embrio ayam, kultur sel, aktivitas growth faktor, limbah shochu
60
Mahfudz, Jurnal PROTEIN
61
Volume 15 No. 2 Tahun.2007 Chciks Embryo Muscle Cell Culture System for Examine Growth Factor Activity
Gambar 1. Pemisahan UGF dari LDS menggunakan Sephadex LH-20 dengan pelarut
terdiri dari : air : methanol : 1,2-dichloroethane (10 : 90 : 20) pada kecepatan
aliran 1,5 ml/min. menggunakan kolom (60 x 750 mm) dimonitor pada
absorben 292 nm
Tabel 1. Komposisi Medium Basal untuk Kultur Sel dan Kondisi Inkubasi
Komposisi / Kondisi Level
Medium m-199 (%) 82,5
Serum Anak Sapi (%) 15,0
Ekstrak Embrio Ayam (%) 2,5
Streptomycin (mg/l) 100,0
Penicillin (U/l) 105
Kelembaban Udara (%) 95,0
CO2 (%) 5,0
Temperatur (ºC) 37,0
Setelah 24 jam medium diganti dengan dengan Polytron homogeniser dan disentrifuse
medium yang mengandung UGF dari LDS pada kecepatan 2.500 rpm selama 10 min, pada
fraksi 1, dan medium diganti setiap hari temperatur 4ºC. Aktivitas Creatin Kinse (CK),
berturut-turut selama 6 hari. Frakksi 1 yang kandungan protein dan DNA, dicari pada
ditambahkan kedalam medium pada level 0; supernatan yang dihasilkan.
0,001; 0,01 dan 0,1%. Pada hari ke 6 medium
dikumpulkan, dan lapisan sel dicuci dengan Analisis Aktivitas Creatin Kinase ,
PBS dingin sebanyak 3 kali dan sel-sel Kandungan Protein dan DNA
dikumpulkan dengan disekrap dan dilarutkan Aktivitas Creatin kinase (CK) ditentukan
dalam buffer Tris-HCl (Ph 6). menggunakan modifikasi metode Rosalki
Medium dan sel-sel yang terkumpul (1967). Campuran subtrat sebanyak 2,9ml yang
disimpan pada temperatur –80ºC, sampai mengandung adenosin phosphate (ADP),
dianalisis. Sel-sel kemudian dihomogenkan creatin phosphat (CP), glukosa, magnesium
62
Mahfudz, Jurnal PROTEIN
klorid, hexokinase, glucose 6-phosphat (G6P) Fluorescensi (Hitachi F-2000), pada eksitasi
dan nicotinamid adenine dinucleotide panjang gelombang 314nm dan emisi panjang
phosphate (NADP) pada konsentrasi terpilih gelombang 520nm.
untuk mengoptimalkan kondisi reaksi.
Kemudian ditambahkan adenosine mono HASIL DAN PEMBAHASAN
phosphate (AMP) dan cystine hydroclorid
untuk menghambat aktvitas myokinase. Semua Penelitian ini untuk mengevaluasi respon
reagen dilarutkan dalam buffer Tris pada pH kultur jaringan terhadap UGF dari limbah
6,8 dan temperatur 25ºC. Ambil 2,5ml larutan distilasi shochu (LDS) yag dipisahkan
tersebut dan tambahkan 0,1 ml sample dan menggunakan Sephadex LH-20 kolom ukuran
inkubasikan pada 30±1ºC selama 6 min. 60 x 750mm, untuk mengkonfirmasi bahwa
Aktivitas CK di tentukan dengan melihat system kultur sel dapat dipakai untuk mengecek
kenaikan optical density per menit pada 340nm, aktivitas UGF. Tabel 2 memperlihatkan
akibat konsumsi NADP. konsentrasi protein, aktivitas CK dan
Konsentrasi protein ditentukan dengan kandungan DNA dari kultur sel jaringan embrio
modifikasi metode Lowry menggunakan ayam.
standar bovine serum albumin (BSA). Penanaman myoblas pada kultur telah
Kandungan DNA ditentukan berkembang menjadi multi nucleated myotub,
menggunkan modifikasi metode Erwin et al. yang merupakan akumulasi dari protein
(1981). Suspensi sel-sel di sentrifuse dengan jaringan yang spesifik. Sehingga konsentrasi
kecepatan 3.000 rpm pada 4ºC selama 15 min., protein dari kultur sel adalah indek yang baik
dan endapannya di suspensikan kembali dengan untuk pertumbuhan sel-sel jaringan (Erwin, et
memvortex pada 500μl TCA 5%. Suspensi sel- al., 1981; Florini dan Magri, 1989 dan Gulve
sel kemudian dihodrolisa pada 90ºC selama dan Dice, 1989).
30min. Sampel kemudian didinginkan pada 4ºC Konsentrasi protein dari kultur sel
dan disentrifus dengan kecepatan 3.000 rpm jaringan embrio ayam nyata (P<0,05)
pada 4ºC selama 15min. Sebanyak 500μl meningkat jika fraksi 1 UGF ditambahkan
supernatan ditambah 200μl diaminobenzoic kedalam medium. Hasil ini memperlihatkan
acid dihydrocloride (DABA) dan dijaga pada bahwa farksi 1 mengandung UGF untuk
temperatur 60ºC selama 1 jam, kemudian pertumbuhan myotube dari sel jaringan embrio
ditambahkan 1N HCl untuk menghentikan ayam.
reaksi. DNA dihitung dengan Spektrofotometer
Tabel 2. Pengaruh UGF yang Dipisahkan dengan Spadhex LH-20 Terhadap Kandungan Protein,
Aktivitas CK dan Kandungan DNA pada Kultur Sel Jaingan Embrio Ayam.
UGF dari LDS (fraksi 1)
Parameter Yang Diamati
0 0,001 0,01 0,1
Konsentrasi Protein (mg/plet) 1,11±0,5a 3,01±0,5 b
1,54±0,3 ab
2,73±0,1b
Aktivtas CK (IU/plet) 25,8±1,5a 29,7±0,9b 27,5±0,6ab 24,7±0,7a
Kandungan DNA (μg/plet) 17,8±4,8 16,7±3,6 14,6±2,9 15,9±3,2
Keterangan : Superskrip dengan huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukan
perbedaan yang nyata (P<0,05)
Penambahan UGF fraksi 1 dari LDS (Florini, et al., 1991; Jacobs, et al., 1992 dan
nyata meningkatkan aktivtas CK pada kultur sel Silverman, et al., 1995). Peningkatan aktivitas
jaringan embrio ayam. Penambahan 0,001% CK pada penelitian ini menunjukan bahwa
fraksi 1, meningkatkan 15,12% aktivitas CK, fraksi 1 telah mensuport pemasakan myotub.
namun peningkatan penambahan fraksi 1 lebih Pemasakan myotub adalah tahapan untuk
dari 0,1 tidak meningkatkan aktivitas CK. proliferasi dari pertumbuhan sel (Jacobs, et al.,
Aktivitas CK adalah parameter yang baik untuk 1992 dan Silverman, et al., 1995).
mengetahui kematangan myotub pada kultur sel
63
Volume 15 No. 2 Tahun.2007 Chciks Embryo Muscle Cell Culture System for Examine Growth Factor Activity
64
Mahfudz, Jurnal PROTEIN
65