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CHLAMYDIA TRACHOMATIS MAb
ACCHTR: Kit para tinción de Chlamydia trachomatis mediante técnica
de inmunofluorescencia. 80 test.
INTRODUCCIÓN:
Chlamydia es una bacteria intracelular obligada no móvil con un ciclo de
vida único que incluye dos fases: cuerpos reticulados y cuerpos
elementales.
Chlamydia trachomatis se encuentra en dos biovars humanos: el
linfogranuloma venéreo, remarcable por su tropismo hacia células linfoides
y su habilidad para causar enfermedades sistémicas, y el biovar
tracomático, limitado inicialmente a células epiteliales de las membranas
mucosas y capaz de provocar tracoma, una enfermedad de transmisión
sexual, y conjuntivitis inclusiva neonatal y neumonía. C. trachomatis es
uno de los microorganismos bacterianos de transmisión sexual más
frecuentes. Causa uretitis en hombres y cervitis y salpingitis en mujeres.
Los niños de madres infectadas pueden desarrollar conjuntivitis inclusiva
neonatal y neumonía.
El diagnóstico de la infección de Chlamydia trachomatis puede realizarse
por métodos directos (detección directa de antígenos en muestras clínicas,
técnicas de cultivo o test de ácidos nucleicos) o en test serológicos. El
cultivo celular (preferentemente en células McCoy) es el único método
para aislar nuevas cepas de muestras clínicas. Los anticuerpos
monoclonales dirigidos contra la proteína mayor de membrana externa son
específicamente de esta especie y puede ser usada para la tinción de los
cultivos infectados y extensiones directamente preparadas de especimenes
de pacientes.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO:
El método de inmunofluorescencia está basado en la reacción de los
anticuerpos específicos contenidos en el kit con el antígeno de la muestra.
Los anticuerpos reaccionan con el antígeno y los no unidos son eliminados
con el lavado. El complejo antígeno-anticuerpo es visualizado gracias a la
fluoresceína que está conjugada al anticuerpo bien directamente bien
mediante un conjugado secundario.
CARACTERÍSTICAS:
Todos los reactivos a excepción del VIRCELL PBS 2 vienen listos para su
uso. Los componentes del equipo se presentan numerados para facilitar su
identificación inequívoca. En el Procedimiento del Ensayo se indican los
números de los reactivos que han de utilizarse en cada etapa.
CONTENIDO DEL KIT:
1 VIRCELL CHTR FITC-MAb: 2 ml de anticuerpo monoclonal marcado
con isotiocianato de fluoresceína frente a la proteína mayor de membrana
externa de Chlamydia trachomatis diluido en una solución tampón con
fosfatos, seroalbúmina bovina, azida sódica y Azul de Evans como
contracolorante.
2 VIRCELL PBS: 1 vial para preparar 1 l de PBS pH 7,2.
3 VIRCELL CHTR CONTROL: 2 portaobjetos de control positivo
(células McCoy infectadas con Chlamydia trachomatis, biovar LGV) y
negativo (células McCoy no infectadas).
6 VIRCELL MOUNTING MEDIUM: 3 ml de medio de montaje: glicerol
tamponado (contiene azida sódica).
Material necesario no contenido en el kit.
-Pipetas de precisión adecuadas.
-Centrífuga de cabezal oscilante que alcance al menos 1500 g.
-Incubador termostatizado.
-Agua destilada.
-Cubreobjetos de 24x60 mm.
PRODUCTO PARA INVESTIGACIÓN
Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Dominguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712
http://www.vircell.com
-Microscopio de fluorescencia y filtros apropiados según recomendaciones
del fabricante.
-DPX.
-Cámara húmeda.
CONSERVACIÓN:
Conservar entre 2 y 8ºC. No utilizar los componentes del kit después de la
fecha de caducidad. La caducidad indicada será válida siempre que los
componentes se mantengan cerrados y conservados a la temperatura
indicada.
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS COMPONENTES
UNA VEZ ABIERTOS:
COMPONENTE ESTABILIDAD
4 meses a 2-8ºC, siempre dentro de su fecha de
PBS reconstituido
caducidad
Resto de componentes Fecha indicada en envase a 2-8ºC
ESTABILIDAD Y USO DE LOS REACTIVOS:
Usar todos los reactivos en condiciones asépticas para evitar
contaminaciones microbianas.
Utilizar sólo la cantidad de cada componente necesaria para la realización
de la prueba. No devolver a los viales el exceso sobrante.
VIRCELL SL no se responsabiliza de la inadecuada utilización de los
reactivos contenidos en el kit.
RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES:
1. Este producto es sólo para investigación y está destinado al uso por
personal sanitario cualificado.
2. Usar sólo componentes del kit. No mezclar los componentes de
diferentes kits o fabricantes. Sólo el VIRCELL PBS y el VIRCELL
MOUNTING MEDIUM son compatibles con los equivalentes en
otras referencias y lotes de VIRCELL MAb. El resto de los
componentes son compatibles entre distintos equipos cuando
coincida el lote.
3. Utilizar puntas de pipeta diferentes y limpias para cada fase del
ensayo. Utilizar sólo material limpio y preferentemente desechable.
En el proceso de inoculación utilizar material estéril.
4. No utilizar en caso de deterioro del envase.
5. No pipetear con la boca.
6. El VIRCELL FITC-MAb de este equipo contiene material de origen
animal. El VIRCELL CONTROL contiene antígenos fijados. Las
muestras procesadas pueden contener microorganismos infecciosos;
es necesario manejar el VIRCELL CONTROL y las muestras del
paciente como potencialmente patógenos. Ningún método actual
puede asegurar por completo la ausencia de agentes infecciosos.
Todo el material debe ser manipulado y desechado como
potencialmente infeccioso. Observe la regulación local en materia de
residuos clínicos.
7. Por contener azida sódica (concentración <0,1%), debe evitarse el
contacto del VIRCELL FITC-MAb y el VIRCELL MOUNTING
MEDIUM con ácidos y metales pesados.
8. Por contener glicerol, debe evitarse el contacto del VIRCELL
MOUNTING MEDIUM con ácidos. No exponer a temperaturas
elevadas.
9. El Azul de Evans (concentración <0,1%), es cancerígeno. Evite el
contacto con la piel o los ojos. En caso de contacto lavar la superficie
afectada con agua y solicitar asistencia médica.
10. Use únicamente los protocolos descritos en este prospecto. Si los
intervalos o temperaturas de incubación empleados en la prueba no
son los especificados, los resultados pueden ser erróneos.
11. La óptica del microscopio, el mantenimiento y el tipo de fuente de
luz pueden afectar la calidad de la fluorescencia.
12. No dejar los reactivos a temperatura ambiente más tiempo del
absolutamente necesario.
13. El kit contiene elementos de vidrio que en caso de rotura podrían
provocar lesiones físicas. Manipular con precaución.

PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS:
El único reactivo que es necesario preparar con antelación a la realización
de la prueba es el VIRCELL PBS 2. Para ello, agregar el contenido del
vial 2 a 1 litro de agua destilada y agitar hasta completa disolución. Una
vez preparada conservar entre 2 y 8ºC.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO:
TÉCNICA DE TINCIÓN PARA SHELL-VIAL
1.-Tirar el medio de cultivo y fijar 10 minutos con metanol.
2.-Extraer el cubreobjetos mediante una aguja enmangada caliente
perforando el fondo del tubo de plástico y empujando el cubreobjetos.
Quitar el tapón y mediante pinzas recoger el cubreobjetos teniendo cuidado
de no dañar la monocapa. Secarla con la ayuda de un secador de mano.
3.-Pegar con una gota pequeña de DPX en un portaobjetos, teniendo en
cuenta que la cara que contiene la monocapa celular quede hacia arriba
(cuando se examina el cubreobjetos bajo la luz, la cara opaca es la que
contiene la monocapa). Presionar ligeramente la monocapa contra el
portaobjetos con una punta de pipeta para evitar que se formen burbujas.
4.-Añadir 25 µl de VIRCELL FITC-MAb 1. Extender cuidadosamente el
reactivo para que cubra toda la monocapa.
5.-Incubar durante 30 minutos a 36-38ºC en cámara húmeda.
6.-Enjuagar brevemente el portaobjetos con PBS (evitar verter
directamente el PBS sobre los pocillos). Sumergir el portaobjetos durante
10 minutos en PBS. Dar un ligero lavado con agua destilada.
7.-Secar y añadir una gota de VIRCELL MOUNTING MEDIUM 6.
8.-Colocar un cubreobjetos presionando suavemente para eliminar
burbujas.
9.-Observar al microscopio de fluorescencia 400x.
TÉCNICA DE TINCIÓN PARA DETECCIÓN DIRECTA EN
MUESTRAS
Las muestras para detección directa podrían ser escobillones conjuntivales
y escobillones genitales.
Las muestras en escobillón deben transportarse en 1 o 2 ml de medio de
transporte. No prepare portaobjetos a partir de escobillones secos.
Si las muestras no son procesadas inmediatamente, conservar entre 2ºC y
8ºC hasta máximo de 48 horas. Para periodos más prolongados conservar
entre -70 y -90ºC.
PREPARACIÓN DE SPOT DE CÉLULAS:
1.-Estas muestras deben transportarse en medio de transporte. Agitar en un
Vortex el tubo que contiene el escobillón para desprender las células.
2.-Transferir la muestra a un tubo de centrífuga cónico y centrifugar a 300-
500 g durante 10 minutos a 2-8ºC.
3.-Retirar y descartar el sobrenadante.
4.-Golpear el tubo suavemente para soltar las células, añadir PBS y
resuspender las células pipeteando suavemente.
5.-Repetir la centrifugación.
6.-Retirar y descartar el sobrenadante.
7.-Golpear el tubo y añadir suficiente PBS para obtener una suspensión
celular opalescente.
8.-Poner aproximadamente 5-15 µl de la suspensión celular en un pocillo
de un portaobjetos recubierto de Teflon o un portaobjetos normal y
observar al microscopio para asegurar que la concentración celular es
adecuada.
9.-Dejar secar el portaobjetos completamente a temperatura ambiente.
10.-Fijar las células introduciendo el portaobjetos en un baño de acetona
durante 10 minutos a 2-8ºC.
11.-Sacar los portaobjetos de la acetona y dejar secar completamente a
temperatura ambiente.
Los portaobjetos pueden conservarse durante 2 o 3 dias a 2-8ºC en un
recipiente hermético con desecante o a temperatura inferior a –20ºC para
almacenamientos más prolongados. Antes de sacar el portaobjetos del
recipiente, dejar que alcance temperatura ambiente.
PRODUCTO PARA INVESTIGACIÓN
Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Dominguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712
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PROCEDIMIENTO DE TINCIÓN:
1.-Añadir 25 µl de VIRCELL FITC-MAb 1 a cada pocillo o portaobjetos e
incubar durante 30 minutos a 36-38ºC en cámara húmeda.
2.-Lavar con PBS durante 10 minutos.
3.-Secar y añadir una gota de VIRCELL MOUNTING MEDIUM 6.
Colocar un cubreobjetos y presionar suavemente para eliminar burbujas.
4.-Observar al microscopio de fluorescencia a 400 x.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO:
Cada lote se somete a Control de Calidad Interno antes de su liberación.
PROTOCOLO DE VALIDACIÓN POR EL USUARIO:
Un control positivo y uno negativo deben incluirse para comprobar el
correcto funcionamiento del test cada vez que un nuevo kit es abierto. Su
utilización permite la validación de la prueba y el equipo.
El modelo de fluorescencia que debe observarse será:
Control positivo: inclusiones fluorescentes verde manzana.
Control negativo: ausencia de fluorescencia.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
DETECCIÓN DIRECTA EN MUESTRAS
Una muestra positiva es aquella en que una o más células intactas
muestran un patrón de fluorescencia verde manzana característica con una
intensidad igual o superior a 2+.
Una muestra negativa es aquella que contiene un adecuado número de
células típicas y en la que todas ellas muestran una mínima fluorescencia
(<1) o ausencia de fluorescencia (0).
Las muestras con una tinción débil y/o una sola célula positiva deben ser
consideradas dudosas.
Una muestra inválida es aquella que presenta una fuerte tinción no
específica o contiene demasiadas pocas células intactas.
Las muestras deben contener varias células en varios campos 100x.
DETECCIÓN TRAS CULTIVO CELULAR
La visualización de inclusiones fluorescentes verde manzana en una
muestra indica un resultado positivo.
La ausencia de fluorescencia en una muestra indica un resultado negativo.
El control positivo es la mejor herramienta para determinar las
características de la tinción.
LIMITACIONES DEL MÉTODO:
1.-El uso de este kit requiere la cuidadosa lectura y comprensión del folleto
de instrucciones. Es necesario seguir estrictamente el protocolo para
obtener resultados fiables.
2.-Un resultado negativo no excluye una infección por Chlamydia
trachomatis.
3.-Los resultados de las muestras deben ser valorados junto con la
sintomatología clínica y otros procedimientos diagnósticos.
PRESTACIONES:
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD
Se ensayaron 59 muestras con CHLAMYDIA TRACHOMATIS MAb
frente a un equipo de otra casa comercial, obteniendo los siguientes
resultados:
Nº MUESTRAS SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD
59 94.7% 100%
PRECISIÓN INTRAENSAYO
Se ensayaron 3 muestras, (2 positivas y 1 negativa), ensayadas
individualmente en grupos de 5 en un único ensayo realizado por el mismo
operador en condiciones de trabajo idénticas.
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En todos los ensayos se observaron resultados similares. BIBLIOGRAFÍA:

PRECISIÓN INTERENSAYO 1. Barnes, R. C. 1989. Laboratory diagnosis of human chlamydial

Se ensayaron 3 muestras, (2 positivas y 1 negativa), ensayadas
individualmente en 5 condiciones diferentes en las que variaron el
operador o el día de realización.
En todos los ensayos se observaron resultados similares.
REACCIÓN CRUZADA E INTERFERENCIAS
Se ensayaron muestras caracterizadas positivas frente a otros
microorganismo del grupo sindrómico (Chlamydophila pneumoniae).
Las muestras ensayadas dieron resultados negativos, demostrando la
reacción específica del ensayo sin reacción cruzada o interferencias
ocasionadas por los agentes descritos.
SÍMBOLOS UTILIZADOS EN EL PRODUCTO:
Producto para investigación
infections. Clin Microbiol Rev 2:119-36.
2. Benes, S. 1990. Spread and persistence of infection with a trachoma
biovar strain of Chlamydia trachomatis in multiplying and nonmultiplying
McCoy cells. Sex Transm Dis 17:1-6.
3. Gibson, J. P., R. M. Egerer, and D. L. Wiedbrauk. 1993. Improved
isolation of Chlamydia trachomatis from a low-prevalence population by
using polyethylene glycol. J Clin Microbiol 31:292-5.
4. Hammerschlag, M. R., P. M. Roblin, M. Gelling, and M. Worku. 1990.
Comparison of two enzyme immunoassays to culture for the diagnosis of
chlamydial conjunctivitis and respiratory infections in infants. J Clin
Microbiol 28:1725-7.
5. Maurin, M. and D. Raoult. 2000. Isolation in endothelial cell cultures of
chlamydia trachomatis LGV (Serovar L2) from a lymph node of a patient
with suspected cat scratch disease. J Clin Microbiol 38:2062-4.
6. Pate, M. S. and E. W. Hook 3rd. 1995. Laboratory to laboratory
variation in Chlamydia trachomatis culture practices. Sex Transm Dis
22:322-6.

Fecha de caducidad
Para cualquier aclaración o consulta, contactar con:
8ºC customerservice@vircell.com
Conservar entre 2-8ºC
2ºC

∑
REVISADO: 03/2012
x Contiene suficiente para <X> pruebas

Lote

Referencia (catálogo)

Consultar instrucciones de uso

<X> pocillos

PRODUCTO PARA INVESTIGACIÓN

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