FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

ASIGNATURA : Análisis Clínicos II

PRACTICA N ° 2

TEMA: Determinación de HDL - C

DOCENTE: Mg. Enrique León Mejía

TURNO: Mañana CICLO: VII

INTEGRANTE: Jacobe Quichca, Carmen.

FECHA DE LA PRÁCTICA: 20/02/20 FECHA DE ENTREGA: 26/02720

2020-I

LAB Nº02: LIPOPROTEÍNAS; DETERMINACIÓN DE HDL-C.

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 INDICE

Pág.

1. Introducción ........................................................................ 3

2. Marco teórico ....................................................................... 4

2.1. Lipoproteínas……………………………………………….4

2.2. Estructura……………………………………………………4

2.3. Clasificación………………………………………………...5

2.4. Lipoproteínas de alta densidad (HDL)………………….7

2.4.1. Metabolismo de HDL-c………………………………….7

2.4.2. Función de HDL-c………………………………………..9

2.5. Fundamento de la determinación de HDL-c…………..9

3. Parte experimental ............................................................ 10

4. Resultados ......................................................................... 13

5. Interpretación .................................................................... 13

6. Cuestionario ...................................................................... 14

7. Referencias bibliográficas ................................................ 16

DETERMINACIÓN DE HDL-C

LAB Nº02: LIPOPROTEÍNAS; DETERMINACIÓN DE HDL-C.

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 1- INTRODUCCION:

El HDL-C constituye la parte de las lipoproteínas de alta densidad (High Density

Lipoproteins), formadas por el 50.0% de proteínas (de las cuales el 90% apoA);
el 18%, colesterol; el 2%, triglicéridos; y el 30%, fosfolípidos. El colesterol HDL
es producido en el hígado. El colesterol que se encuentra en las células está
inmerso en las secreciones biliares y, a través de la bilis, es eliminado en el
intestino. Las fracciones de lipoproteínas de baja densidad (LD) y las
lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) son precipitadas del suero o plasma,
por medio del reactivo de cloruro de magnesio/dextran sulfato, de acuerdo a
Finely et al. Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) son determinadas en el
fluido sobrenadante, utilizando el factor de dilución derivado en el cálculo.

El objetivo de esta práctica es determinar correctamente la concentración de

HDL-C en sobrenadante la cual es un procedimiento analítico básico para el
diagnóstico y seguimiento de enfermedades metabólicas, primarias o
secundarias.

2- MARCO TEÓRICO:

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 2.1. lipoproteínas.

Las lipoproteínas son complejos macromoleculares compuestos

por proteínas y lípidos que transportan masivamente las grasas por todo el
organismo. Son esféricas, hidrosolubles, formadas por un núcleo
de lípidos apolares (colesterol esterificado y triglicéridos) cubiertos con una
capa externa polar de 2 nm formada a su vez por apoproteínas, fosfolípidos y
colesterol libre. Muchas enzimas, antígenos y toxinas son lipoproteínas.

Las apolipoproteínas de las lipoproteínas tienen, entre otras funciones, la de la

estabilización de las moléculas de lípidos como triglicéridos,
fosfolípidos, colesterol, en un entorno acuoso como es la sangre. Actúan como
una especie de detergente y también sirven como indicadores del tipo de
lipoproteína de que se trata.

2.2. Estructura.

La lipoproteínas son agregados moleculares esféricos con una cubierta de unos

20 Å de grosor formada por lípidos anfotéricos cargados, como colesterol no
esterificado y fosfatidilcolinas; entre ellos se insertan las apolipoproteínas. Estas
moléculas dirigen sus regiones apolares hidrófobas hacia el interior y sus grupos
cargados hidrofilicos hacia el exterior, donde interaccionan con el agua. Esto se
debe a que las grasas, no se pueden disolver en un medio acuoso (son
hidrofóbicas) por su naturaleza apolar, para eso necesitan proteínas que las
recubran para dejar expuestos solo la parte polar de dicha proteína y de esta
manera se pueda disolver la grasa en el plasma.

2.3. Clasificación.

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La nomenclatura más utilizada para las lipoproteínas se basa en la separación
por ultra centrifugación a diferentes densidades, características para cada familia
lipoproteica. Las variaciones en la densidad de estas partículas están
determinadas por su composición relativa en lípidos y proteínas. Las
lipoproteínas también pueden separarse por sus diferencias de tamaño,
movilidad electroforética y composición apoproteica. Las principales
lipoproteínas son:

 Quilomicrones
 Lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL)
 Lipoproteínas de densidad intermedia (IDL)
 Lipoproteínas de baja densidad (LDL)
 Lipoproteína a [Lp(a)]
 Lipoproteínas de alta densidad (HDL).

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LAB Nº02: LIPOPROTEÍNAS; DETERMINACIÓN DE HDL-C.

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 2.4. Lipoproteínas de alta densidad (HDL)

Las lipoproteínas de alta densidad tienen diferentes orígenes: pueden provenir

de la síntesis hepática, intestinal o resultar del catabolismo de las lipoproteínas
ricas en triglicéridos (Quilomicrones y/o VLDL) en la circulación plasmática. Las
HDL recién sintetizadas o nacientes son discoidales y se las conoce como pre-
beta HDL, denominación que surge de la electroforesis bidimensional utilizada
para su detección. Estas partículas nacientes migran en posición pre-, mientras
que el resto de las HDL migran en posición . Las pre- HDL están constituidas
por apo A-I, fosfolípidos y colesterol libre. En el plasma estas partículas maduran
adquiriendo forma esférica (HDL3 y HDL2).

Pueden distinguirse por lo menos dos subfracciones de HDL: HDL2 y HDL3 que
varían en su densidad, tamaño y composición. Las HDL2 (d= 1,063 a 1,120 g/ml)
tienen mayor tamaño y son más ricas en fosfolípidos y colesterol que las HDL3
(d= 1,120 a 1,210 g/ml). El nivel de la HDL2 está influenciado por variables
fisiológicas como las hormonas sexuales, insulina, ejercicio físico y dieta, a
diferencia de la HDL3 cuyo nivel depende directamente de la síntesis y secreción
hepática o intestinal. A su vez, las HDL2 y HDL3 pueden ser subfraccionadas,
destacándose la alta capacidad antiaterogénica de las partículas más pequeñas
y más densas HDL3c.

2.4.1. Metabolismo de HDL-C

La HDL se origina en hígado e intestino en forma de Apo A-I naciente, siendo el

hígado el principal órgano de producción. Esta proteína es secretada y capta
fosfolípidos y colesterol por medio de la proteína ABCA1 del hígado y de células
extrahepáticas originando una partícula Apo A-I pobre en lípidos de forma
discoidal, llamada preβ-HDL, Apo A-I naciente o HDL naciente, de diámetro entre
7-12 nm. ABCA1 es una proteína de membrana perteneciente a la superfamilia
de transportadores ABC que transportan diferentes lípidos a nivel de la

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membrana y que tienen un dominio de unión al ATP. La Apo A-I que no
es lipidada es catabolizada a nivel renal.

La preβ-HDL se transforma en una partícula esférica por acción de la

enzima Lecitin-colesterol-aciltransferasa (LCAT) en una reacción donde
transforma el colesterol libre en colesterol esterificado (CE). La partícula esférica
se considera una HDL madura, que es capaz de captar colesterol de células
extrahepáticas por medio de las proteínas ABCG1 y SR-BI y ser sustrato de la
acción de la LCAT para producir más colesterol esterificado. De esta forma por
medio de la acción combinada de la ABCG1, SRBI y LCAT la HDL se carga de
CE y aumenta su tamaño para pasar de HDL3 a HDL2. Además, la HDL madura
intercambia CE por TAG con las lipoproteínas VLDL, LDL y QM (HDL dona CE
a esas lipoproteínas y recibe TAG de las mismas). Este intercambio es mediado
por CETP. La HDL madura recibe también fosfolípidos de la VLDL por medio de
la Proteína Transferidora de fosfolípidos (PLTP).

Por acción de las enzimas HL y/o Lipasa endotelial (EL), ambas presentes en el
hígado, puede darse una interconversión de HDL2 a HDL3 originando un ciclo
de interconversión de HDLs maduras. La HL hidroliza principalmente TAG y la
EL hidroliza fosfolípidos de la HDL madura. En ese ciclo
de interconversión puede liberarse Apo A-I. La Apo A-I también puede liberarse
por la acción de la PLTP, mediante la fusión de dos partículas de HDL con la
liberación subsecuente de esta proteína. La Apo A-I liberada tiene dos destinos:
ser lipidada por acción de la ABCA1 o ser eliminada renalmente. Entonces
puede decirse que hay un reservorio de Apo A-I formado por
la apoliproteína recién sintetizada a nivel hepático e intestinal y la liberada por
acción de la HL, EL y de la PLTP.

Finalmente, la partícula de HDL llega al hígado e interactúa con SR-BI y

descarga su contenido de CE y puede también reaccionar con la HL y sufrir
hidrólisis de TAG. Esto es seguido por el desprendimiento de la HDL y su retorno
al torrente sanguíneo para iniciar un nuevo ciclo (al perder parte de su contenido
se reduce su tamaño y su contenido de CE). Adicionalmente a SR-BI el hígado
posee también un receptor endocítico de HDL, la cadena beta de la

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ATP sintetasa, que se une e internaliza HDL para su degradación. El resultado
final es la descarga de CE en el hígado para su posterior eliminación.

2.4.2. Función.

La función más conocida de las HDL es vehiculizar el colesterol, desde los tejidos
periféricos hacia el hígado, para su reciclaje o catabolismo a ácidos biliares. Este
proceso de denomina transporte inverso del colesterol. Además, las HDL poseen
otras propiedades ateroprotectoras, como son: a) inhibición de la oxidación de
LDL, b) inhibición de la síntesis y expresión de moléculas de adhesión
endoteliales, c) inhibición de la apoptosis de células endoteliales, d) capacidad
antiinflamatoria, etc.

2.5. fundamento de la determinación de HDL-C.

La separación del HDL-colesterol, está basada en la selectividad de los iones

fosfotungstico y magnesio para precipitar todas las Lipoproteínas con
excepción del HDL-colesterol. Después de la centrifugación, el HDL-
colesterol contenido en el líquido sobrenadante, se determina con el mismo
método que se determinó el colesterol total.

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 3- PARTE EXPERIMENTAL:

3.1. Materiales y Equipos a usar:

Tubos de ensayo 13x100mm. Espectrofotómetro.

Gradilla de metal. Centrifuga

Baguetas. Equipo para toma de muestra de

sangre venosa.

Micropipetas 10,50,1000uL.

3.2. Reactivo Precipitante:

 Sulfato de dextrano.
 Acetato magnésico.
 Solución estándar: [200mg/dl]

3.3. Muestra:
 Suero sanguíneo.

3.4. Procedimiento:
Extraer sangre venosa para luego proceder a centrifugar por 10 minutos
3000RPM, con el fín de obtener el suero sanguíneo.

Luego de centrifugar

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A. Reacción Precipitante.
En un tubo de ensayo colocar 300ul de suero con una gota de reactivo
precipitante, luego mezclar y dejar reposar por 10 minutos para luego
llevar a centrifugar por 10 minutos a 2000RPM. Luego de este proceso se
obtendrá dos fases en la cual la parte inferior será lo que se precipitó (LDL
y VLDL) y la parte superior será el sobrenadante(HDL-C).

Presencia de dos fases en la

cual la parte inferior será lo que
se precipitó (LDL y VLDL) y la
parte superior será el
sobrenadante(HDL-C).

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B. Determinación de HDL-C.
Colocar la cantidad indicada en el cuadro de la solución sobrenadante
HDL-c, y mezclar con las soluciones indicadas y llevar a incubar por 10
minutos a temperatura ambiente y luego proceder a leer en el
espectrofotómetro a 5050 nm. Con los resultados de la lectura tanto del
estándar como del HDL-C realizar los cálculos correspondientes.

BLANCO STANDAR DESC.

R. Enzimático (ml) 1.0 1.0 1.0

Sol. Stand. (ml) ------ 0.01(10uL) -------

Sobrenadante (ml) ------ -------- 0.01(10uL)

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 C. Cálculos.

HDL-c (mg/dl) = Abs. Desc. x (200) x (1,13)

Abs.St.

Abs. Desc. Abs. St.

Alexandra 0.073 0.412
María 0.182 0.412

HDL-c (mg/dl) Alexandra = 0.073 x (200) x (1,13) = 40.044 mg/dl

0.412

HDL-c (mg/dl) María = 0.182 x (200) x (1,13) = 99.835 mg/dl

0.412

4- RESULTADOS:

HDL-c Valores normales:

Alexandra 40.044mg/dl
<40.0 mg/dl
María 99.835mg/dl

5- INTERPRETACION:
Los resultados obtenidos en ambas muestras se encuentran en valores óptimos
de HDL-c en su organismo y esto nos indica que disminuye el riesgo padecer de
enfermedades cardiacas.

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 6- CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es la importancia clínica de la determinación del HDL –

colesterol?
Su importancia clínica es por sus concentraciones ya que son de indiscutible
valor diagnóstico y pronóstico porque están directamente correlacionadas con el
inicio y progresión de las enfermedades vasculares de tipo ateroscleróticos. Las
cuales constituyen las primeras causas de muerte en el mundo.

HDL significa lipoproteínas de alta densidad en inglés. A veces se le

llama colesterol "bueno" porque transporta el colesterol de otras partes de su
cuerpo a su hígado.

2. ¿Cuál es el fundamento de la determinación del HDL-C?

La separación del HDL-colesterol, está basada en la selectividad de los iones

fosfotungstico y magnesio para precipitar todas las Lipoproteínas con
excepción del HDL-colesterol. Después de la centrifugación, el HDL-
colesterol contenido en el líquido sobrenadante, se determina con el mismo
método que se determinó el colesterol total.

3. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de VLDL?

La VLDL contiene la cantidad más alta de triglicéridos. Este se considera un tipo

de "colesterol malo", debido a que ayuda a que el colesterol se acumule en las
paredes de las arterias.

La determinación de las concentraciones de lípidos, lipoproteínas y proteínas

relacionadas circulantes permite el diagnóstico, el tratamiento y el seguimiento
de las diferentes dislipemias.
El aumento en los niveles de VLDL está ligado a ateroesclerosis. Esta afección
puede provocar enfermedad cardíaca coronaria.

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 4. ¿Qué patologías se presentan cuando existe incremento o
disminución del LDL-c?

El colesterol elevado puede provocar la hipertensión arterial y la diabetes

mellitus. También puede ser causa de enfermedad cardiovascular el aumento
de los triglicéridos y un colesterol-HDL bajo.

Los médicos todavía están tratando de averiguar más sobre la conexión entre el
colesterol bajo y los riesgos para la salud. No hay consenso sobre cómo definir
el colesterol LDL muy bajo, pero el LDL se consideraría muy bajo si es menor de
40 miligramos por decilitro de sangre.

Aunque los riesgos son raros, los niveles muy bajos de colesterol LDL pueden
estar asociados con un mayor riesgo de lo siguiente:

 Cáncer
 Accidente cerebrovascular hemorrágico
 Depresión
 ansiedad
 Nacimiento prematuro y bajo peso al nacer si tienes el colesterol bajo
mientras estás embarazada

El riesgo potencial de reducir el colesterol LDL a niveles muy bajos no ha sido

confirmado, y su asociación con ciertos riesgos para la salud sigue siendo objeto
de debate.

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7- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
1. Daniels T. Killinger K. Michael J. Wright R. Jiang Z. Lipoproteínas,
homeostasis del colesterol y salud cardíaca. International J Biological
Sciences 200): 5 (5): 474-488. Disponible en:
https://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=514210&pid=S1409-
0015201400020001000001&lng=en

2. Movva R. Rader D. Laboratory assessment of HDL

heterogeneity an function. Clinical Chemistry 2008: 54(5):788-800.
Disponible en:
https://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=514275&pid=S1409-
0015201400020001000034&lng=en

3. Ballantyne CM. Lipidología clínica: un compañero de la enfermedad

cardíaca de Braunwald. Ed. Ballantyne CM. Editorial Elsevier Health
Sciences. 2008.

4. Assmann G. Gotto A. Colesterol HDL y factores protectores en

ateroscleroris. Circulación 2004: 15: III-8 - III-13. Disponible en:
https://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=514273&pid=S1409-
0015201400020001000033&lng=en

5. Camejo G, Hurt-Camejo E. Consideraciones fisicoquímicas sobre las

lipoproteínas y su metabolismo.En: Hiperlipemias: Clínica y tratamiento.
Capítulo 1 (pág. 1-39). Eds. Carmena R, Ordovas JM.Ediciones Doyma.
1999. Barcelona.

6. El panel de expertos. Tercer informe del Panel de expertos del Programa

nacional de educación sobre el colesterol (NCEP) sobre detección,
evaluación y tratamiento del colesterol alto en sangre en adultos. (Panel
de tratamiento para adultos III). Reporte final. Circulación 2002; 106:
3143-3421. Disponible en:
https://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=514252&pid=S1409-
0015201400020001000022&lng=en

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