PRACTICA No.

6: DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IgG DE TOXOPLASMA POR LA TÉCNICA

DE MICRO ELISA

6.1 INTRODUCCIÓN

Toxoplasma gondii es un parásito ampliamente distribuido en el mundo, que infecta a

especies animales y puede provocar problemas graves en individuos
inmunocomprometidos. Es el parásito que causa la toxoplasmosis, una enfermedad
común, en México la prevalencia es del 15 al 50%, mayor en las zonas costeras, hay
regiones en la costa del Golfo de México y la península de Yucatán con prevalencia mayor
al 70%. Los anticuerpos IgG e IgM al toxoplasma pueden ser detectados entre dos y tres
semanas con posterioridad al contagio. El IgG permanece positivo, y con el tiempo los
niveles del anticuerpo decrecen. [10]

El Método ELISA (enzima ligada a un inmunoabsorbente), fue introducido por Engvall y

Perlman en 1971, como una alternativa al radioinmunoanálisis. La técnica ELISA se
fundamenta en la premisa de que luego de acoplar antígenos solubles o anticuerpos a una
matriz sólida insoluble, éstos retienen la actividad inmunológica y en que estas
biomoléculas también pueden unirse a una enzima, reteniendo el conjugado resultante,
tanto la actividad enzimática como inmunológica. En este ensayo, el suero diluido del
paciente, se deposita en los micropozos de la microplaca del kit comercial, los cuales están
recubiertos con antígeno purificado. El antícuerpo IgG específico (en caso de estar
presente en el paciente) se une al antígeno purificado de los micropozos. [11]

Como se muestra en la Figura 1, el pocillo de la microplaca, está cubierto con el antígeno

correspondiente específico para el anticuerpo de interés. Si este anticuerpo está presente
en la muestra (por ejemplo, suero), este se unirá al antígeno. Un anticuerpo secundario
conjugado con una enzima (por ejemplo, el fragmento Fab de un anticuerpo de oveja
dirigido contra la IgG humana), se unirá al anticuerpo de interés en el siguiente paso. En
presencia de la enzima, el sustrato (generalmente H2O2) reacciona con un indicador no
coloreado (por ejemplo, tetrametilbenzidina o TMB) generando un producto coloreado. La
concentración del anticuerpo en la muestra se puede determinar comparando la
intensidad del color del producto de la reacción con un estándar de concentración
conocida. [11]

Existen algunas variantes de la prueba de ELISA, el de tipo Sándwich, es un método para

determinar antígenos. El anticuerpo contra el antígeno de interés, está unido a la fase
sólida en el pocillo de la microplaca. La cantidad del antígeno en la muestra, se determina
añadiendo un anticuerpo secundario conjugado con una enzima, el cual forma un
complejo tipo sándwich con el antígeno y el anticuerpo unido a la placa. [11]
 Indicador (no coloreado) Indicador-H (coloreado)
+ Sustrato + H2O
(H2O2)
Reacción de
color

Anticuerpo de
anti-ratón
Ig monoclonal
Antígeno
Ig policlonal (por
ejemplo, anti xy
de conejo)
Detección de anticuerpos específicos dirigidos ELISA tipo sándwich para la
contra un antígeno mediante anticuerpos detección de antígenos (por
secundarios acoplados a enzimas (conjugado) ejemplo, citocinas)

Anticuerpo Antígeno Anticuerpo secundario acoplado a enzima

Figura 1. Ensayo de enzima ligada a inmunoabsorbente (ELISA), editada de Burmester and

Pezzutto (2003). Color Atlas of Immunology. Stuttgart: Basic Sciencies.

6.1.1 Principio del método en el kit comercial Toxoplasma IgG ELISA

Se lleva a cabo una reacción enzimática entre la unión de los antígenos y un conjugado
enzimático. Todos los materiales no unidos al antígeno son lavados, quedando
únicamente el conjugado enzimático (anticuerpo policlonal específico de las cadenas
gamma humanas marcado con la peroxidasa) el cual se agrega para unirse al complejo
antígeno-anticuerpo.

La microplaca se incuba a efectos de permitir la hidrolización del sustrato por la enzima.

Tras incubación, la reacción enzimática se detiene mediante la adición de una solución de
frenado (ácido sulfúrico 1N).
La microplaca se coloca en un lector de ELISA y es leída a una DO450. La intensidad de color
generada es proporcional a la cantidad de anticuerpo IgG específico anti T. gondii
presente en la muestra probada.
Esta determinación generalmente se procesa con un kit para IgG o IgM dependiendo lo
que se solicite si es primer contacto o segundo contacto a Anticuerpos toxoplasma. [12]

6.2 OBJETIVO

Detección de anticuerpos IgG de Toxoplasma en suero humano aplicando la técnica de

Micro-ELISA.
6.3 MATERIALES Y METODOS

6.3.1 Materiales
 Lector de micro Elisa con emisión de 450 nm de longitud de onda con banda de
amplitud de 10 nm o menor y un rango de densidad óptica de 0.2 OD o mayor
 Suero del paciente
 Micropozos o microplacas para las muestras (por duplicado)
 Gradilla para micropozos
 Tubos de ensaye 13 x 100 mm
 Micropipetas de 10, 100 y 200 μL
 Puntas de pipetas desechables
 Agua destilada
 Papel absorbente

6.3.2 Reactivos
 kit para la cuantificación de Anticuerpos Toxoplasma por IgG o IgM (Bio-Toxo IgG),
o el kit comercial existente (seguir el procedimiento del inserto indicado por el
fabricante).

6.3.3 Preparación de los reactivos

1. Los reactivos deben utilizarse a temperatura ambiente (18 -26 °C) antes de ser
usados.
2. El amortiguador de lavados deberá diluirse de 20x a 1x (Dilución 1:20) preparando
el volumen de solución de lavado suficiente para el corrimiento.
3. Si usted va a poner sueros pareados, su toma deberá hacerse tan pronto como
aparezcan los síntomas agudos de la infección, esto ocurre entre los 14 y 21 días
después de la aparición de la infección. Ambas tomas de muestras deberán
correrse por duplicado en la misma placa para verificarse seroconversión en pozos
consecutivos.

6.3.4 Procedimiento
1. Coloque en la gradilla el número de micropozos cortados en forma de tira que vaya
a utilizar y regrese los micropozos sobrantes a la bolsa de aluminio. Guarde en
refrigeración con el desecante. Por cada lectura, incluya un control negativo,
control positivo y calibrador.
2. Los controles (positivo y negativo) y el calibrador están listos para su uso, pero el
suero no. Realice una dilución del suero problema (1:21) agregando en un tubo de
ensaye (rotulado) 10 μL del suero de su paciente más 200 μL del diluyente
(diluyente de la muestra, frasco listo para usar).
3. En pozos individuales coloque 100 μL de control negativo, calibrador, control
positivo y suero problema diluido. Incluya como blanco de reactivo 100 μL de
 diluyente en el pozo A-1; evite las burbujas de aire, mezcle con movimiento
rotatorio durante un minuto.
4. Incube a temperatura ambiente (21-25 °C) durante 20 minutos.
5. Al término de la incubación, vacié el contenido de los pozos y lave en tres tiempos
colocando 300 μL de solución de lavado 1x en cada pozo.
6. Coloque 100 μL del conjugado en cada uno de los pozos, incluyendo el blanco de
reactivo, mezcle con movimiento rotatorio durante un minuto.
7. Incube todos los pozos a temperatura ambiente (21-25°C) durante 20 min.
8. Repita los lavados como se indica en el paso 5.
9. Adicione 100 μL del sustrato TMB a cada uno de los pozos incluyendo el blanco de
reactivo, mezcle con movimiento rotatorio durante un minuto.
10. Incube todos los pozos a temperatura ambiente durante 10 min.
11. Coloque a todos los pozos incluyendo el blanco de reactivo. 100 μl de solución de
frenado (H2S04 1N). Agite la placa manualmente para mezclar el contenido de los
pozos durante 30 segundos.
12. Espere un mínimo de 5 min para realizar la lectura. Haga la lectura ajustando a
cero el lector, con el blanco de reactivo.
13. Anote las lecturas de cada pozo.
14. El blanco de reactivo, deberá reportar una densidad óptica menor a 0.150. Sí el
blanco nos da un valor mayor a 0.150 deberá repetirse el corrimiento.

6.3.5 Control de calidad

Esta prueba puede considerarse valida siempre que se siga el siguiente criterio
metodológico:
1. La DO del calibrador debe ser mayor que 0.250
2. El Anticuerpo Índice para control negativo debe ser menor que 0.9
3. El Anticuerpo Índice para control positivo debe ser menor que 1.2

6.3.6 Interpretación de resultados

1. Multiplique el valor de absorbancia del calibrador por el factor asignado en el kit
comercial, éste es el valor del calibrador. El factor es individual para cada lote de
kit de reactivos y aparece impreso en la etiqueta del calibrador.
2. El valor de anticuerpos índice para cada paciente, se calcula dividiendo la
absorbancia de la muestra de suero entre el valor del calibrador (ver Tabla 1).

Tabla 1. Interpretación de anticuerpos índice

Valor Anticuerpos índice

<0.9 Anticuerpos no detectado de Toxoplasma IgG por ELISA

Sobre el límite positivo se recomienda otra

0.9 -1.1
identificación clínica

>1.1 Anticuerpo detectado de Toxoplama IgG por ELISA

 3. Las muestras con valor 0.9 a 1.1, si al repetirse siguen en el mismo rango deberán
correrse por otros métodos como inmunofluorescencia (IFA). Si aun así
permanecen en el mismo rango se deberá tomar una muestra adicional al
paciente.
4. En la evaluación de sueros pares, si la muestra es tomada en la fase aguda de la
infección pro toxoplasma, y el resultado negativo. Por otro lado, en la fase de
convalecencia es el resultado es positivo y significa que ha habido una
seroconversion. Esto significa que los anticuerpos se han elevado y el paciente
tiene una infección primaria.
5. Para valorar sueros pares, donde hay seroconversion, ambas muestras de suero
del paciente deberán correrse por duplicado en el mismo ensayo. El promedio de
anticuerpo índice de ambas muestras (aguda y convaleciente) debe ser mayor a
1.00 para valorar los sueros pares, sobre su aumento en su nivel de anticuerpos.

6.4 RESULTADOS
6.5 DIAGRAMA DE FLUJO
6.6 CUESTIONARIO
1. ¿Qué es un método inmunoenzimático?

2. Mencione el lugar de la célula donde se lleva a cabo la síntesis de los anticuerpos.

3. ¿Qué significado tiene la palabra ELISA?

4. ¿Cuántos métodos de ELISA existen?

5. ¿Para qué se utilizan los siguientes métodos de ELISA?

Directo:

Indirecto:

Sandwich:
6. ¿Cómo se visualizan los precipitados antígeno-anticuerpo?
a. Fase líquida:

b. Soporte Semisólido:

c. Soporte Semisólido en los que se ha incluido el anticuerpo:

 7. ¿Cuáles son los bloqueadores más utilizados en ELISA?

8. ¿Qué son las técnicas de inmunoelectrotransferencia?

9. ¿Qué es una técnica de inmunofluorescencia? Y, ¿para qué se utiliza?

10. ¿Qué es la técnica de ELISPOT? Y, ¿cuál es su uso?

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

Texto Autor Páginas Editorial

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