Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
1. Eșantionarea probelor
Pentru efectuarea analizelor microbiologice, probele de analizat trebuie să reflecte
condiţiile microbiologice existente în momentul recoltării și să reprezinte fidel lotul din care
provine. De modul în .care se face recoltarea și transportuI probelor la laborator depinde
de multe ori rezultatul analizei. De aceea, o etapă foarte importantă constă în stabilirea
eșantioanelor, a condiţiilor de recoltare a probelor și de transport în condiţii
corespunzătoare la laboratorul de analize.
În activitatea de prelevare a probelor există o terminologie generală, și anume:
! lotul - reprezintă cantitatea de produse cu aceleași caracteristici, realizate în
condiţii tehnologice uniforme, într-o şarjă, schimb de producţie sau într-o perioada
limitată de timp;
! elementul - este partea indivizibilă a lotului;
! eșantionul global - reprezintă probă formată prin mai multe prelevări din același lot;
! eșantionul redus - este fracțiunea reprezentativă dintr-un eșantion global;
! eșantionul de laborator - este fracțiunea din eșantionul global sau redus destinată
analizelor de laborator;
! prelevarea (recoltarea) - reprezintă tehnica de recoltare a unui eșantion elementar
dintr-un lot sau a unui element indivizibil.
Sunt posibile două tipuri de recoltare a eșantioanelor:
prelevarea elementelor cu defecte pentru a evidenţia cauza producerii
acestora;
prelevarea la întâmplare a unor elemente care aparţin unor condiţii normale
de producţie, pentru controlul calităţii microbiologice. În acest caz sunt aplicate
metode statistice, astfel încât eșantionul să fie statistic semnificativ.
Eşantioanele se aleg prin tragere la sorţi, după scheme prestabilite, pe baza tabelelor de
recoltare ce conţin numere echivalente numărului de probe din lot, dar dispuse la
întâmplare (tabelul 1). După numerotarea elementelor lotului, se corelează aceste numere
cu cele din tabel, şi, apoi, se prelevează probele corespunzătoare numerelor din tabel în
succesiunea stabilită de echipa de control. Astfel, pornind de la un punct şi într-o ordine
arbitrar aleasă se compune eşantionul cu elementele corespunzătoare. De exemplu, dacă
se doreşte ca dintr-un lot de 80 bucăţi să se preleveze la întâmplare 5 probe, se vor
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR
preleva elementele corespunzătoare numerelor primei linii din tabel: 07; 59; 66; 63; 46
(valoarea 97 este exclusă pentru că nu există).
Tabelul 1. Exemplu de ordonare aleatorie a elementelor unui lot în vederea eşantionării
07 59 66 97 63 46 18 42 62 56 68 93 43 12 48 68 87
45 01 64 32 48 85 43 84 10 24 32 26 62 65 90 57 06
32 36 52 26 54 28 95 13 08 32 92 24 87 91 13 18 72
62 44 03 61 09 37 48 42 28 49 58 54 36 07 15 68 12
84 88 65 64 14 01 20 79 16 11 22 54 46 39 79 14 89
96 44 92 77 26 52 29 34 45 04 45 37 23 66 02 05 92
74 50 33 45 66 25 42 27 25 09 39 18 08 90 72 75 26
54 41 90 46 51 73 98 35 84 59 78 96 05 59 89 61 38
80 95 01 67 22 84 05 97 09 46 62 73 17 63 46 45 83
96 47 23 51 45 37 83 09 17 71 96 79 58 92 78 70 80
53 62 97 78 95 08 84 61 71 59 49 20 83 56 61 85 88
52 50 28 59 26 29 62 89 83 10 13 25 32 72 83 58 75
45 53 94 02 22 22 08 91 36 76 59 69 05 89 14 98 14
98 26 99 26 14 91 52 01 85 24 45 52 95 27 25 94 63
89 39 07 26 11 26 45 52 63 65 79 03 12 93 28 37 45
N
x= sau x = N
n
în care: N = numărul elementelor unui lot;
n = numărul eşantioanelor de prelevat.
Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR
2. Tehnici de prelevare
De cele mai multe ori prelevările se efectuează pe elemente indivizibile (cutii de conserve,
sticle, produse de dimensiuni mici, pachete mici ş.a.). În alte cazuri, probele se recoltează
din produse în vrac sau parţi dintr-un element de dimensiuni mari.
Prelevările ce corespund primului caz sunt simple și nu necesită masuri de precauţie
suplimentare.
Condiţii generale de prelevare (recoltare)
Cantitatea de probă recoltată depinde de natura analizei și de planul de eşantionare.
Omogenizarea
Repartizarea microorganismelor în produsul analizat nu este întotdeauna omogenă, mai
ales în cazul produselor voluminoase sau cu structuri eterogene. În asemenea cazuri se
recomandă ca prelevările să se realizeze din mai multe zone. De aceea este foarte
important să se cunoască zonele cu riscuri mari de contaminare, sau se impune
omogenizarea produselor vrac înainte de prelevarea probelor.
Măsuri aseptice
Este absolut necesar să se evite contaminarea suplimentară a probelor în timpul recoltării
sau după această etapă. Pentru aceasta recipientele utilizate și instrumentele de recoltare
trebuie să fie sterile și protejate în ambalaje sterile.
Unele instrumente trebuie sterilizate la locul de recoltare.
Recoltarea produselor lichide
Se realizează apelând la diferite tehnici, în funcţie de natura produsului, de forma și
volumul recipientului. Înainte de recoltare se recomandă omogenizarea probei, care se
poate realiza manual, cu ajutorul unei baghete, sau cu ajutorul unui agitator mecanic steril,
precum și prin utilizarea sistemelor de omogenizare mecanică cu care sunt prevăzute
recipientele. În funcţie de volumul de produs ce trebuie recoltat se pot utiliza pipete sterile
sau instrumente speciale de recoltare (polonic steril sau flacon special). În cazul în care
recoltarea se face de la reţea, se flambează gura robinetului, se lasă ·să curgă o parte din
produs pentru a elimina microorganismele stagnante pe conductă și apoi se face
recoltarea propriu-zisă.
Recoltarea produselor solide
În funcţie de natura produsului, pentru recoltare se foloseşte scalpelul, sonda (de exemplu,
pentru brânză), pipeta tip harpon, etc.
Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR
Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR
diverse tratamente precum: mojarare manuală cu nisip steril sau bile de sticlă sau
mărunţire mecanică .
Pentru mojararea cu nisip steril sau bile de sticlă se utilizează un mojar care conţine 5-20
g nisip special, steril, sau bile din sticlă (Φ=0,5 mm). Mojararea se realizează manual în
apropierea becului Bunsen. Pe parcursul mărunţirii se adaugă 2-5 volume de apă sterilă.
Proba se lasă în repaus timp de 5 minute, apoi se colectează supernatantul într-un vas
steril. Această metodă nu este întotdeauna practică, dar este simplă şi nu necesită
aparatură specială.
Tehnicile moderne de omogenizare prevăd utilizarea sistemelor performante, care permit
menţinerea condiţiilor aseptice şi o bună eliberare a microorganismelor în lichidul de
extracţie. Pentru acest scop sunt comercializate diferite tipuri de omogenizatoare
peristaltice: Stomacker (Stomacker / Seward-Bioblock-OSI-Prolabo), Digi-system,
Ultraturax, Waring Biender/ Bioblock-OSI-Prolabo, etc.
În cazul utilizării omogenizatorului Stomacher proba de analizat (dimensionată, g) şi un
volum corespunzător de lichid de extracţie (diluţie) sunt introduse într-o pungă de plastic
sterilă (de unică folosinţă), care se închide ermetic şi se montează în aparat pentru
omogenizare, prin intermediul unor palete speciale. Pungile sterile din material plastic
trebuie să aibă o capacitate suficientă pentru a permite amestecarea corectă a probei cu o
cantitate echivalentă de lichid de diluare. În general, volumul recipientului trebuie să fie
egal cu aproape de două ori volumul probei plus volumul soluţiei de diluare.
Recent, a fost realizat un nou aparat, care funcţionează după un principiu similar cu
aparatul tip Stomacher, la care însă s-a îmbunătăţit tehnica de omogenizare prin vibraţii
(fig.1). Acest tratament (viteză vibratorie mare) oferă o eliberare a microorganismelor (în
general a bacteriilor) în lichidul de diluare similar cu cazul prelucrării probei în stomacher
(grad de similaritate a rezultatelor de 96%), însă asigură obţinerea unui extract clar cerinţă
impusă de analizele moderne precum: evaluarea cantitativă a microbiotei prin ATP
bioluminiscenţă, teste imunologice şi analize PCR (din limba engleză Polymerase Chain
Reaction) (Fung 1999).
Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR
1) Proba este topită pe baie de apă la 45oC şi omogenizată. Se prepară diluţia 1:10
prin prelevarea a 10 ml produs topit şi transferare într-un flacon de 200 ml, care conţine 90
ml soluţie Ringer ¼ cu 0,1% geloză, pentru stabilizarea emulsiei. Diluantul şi pipetele
trebuie să aibă temperatura de 45oC. Alte diluţii şi analizele microbiologice trebuie
realizate în următoarele 10 minute.
2) Se prelevează în condiţii aseptice 2,5 g produs, care sunt apoi transferate într-o
eprubetă de analiză conţinând 2,1 ml de soluţie Ringer ¼, şi se termostatează la 45oC
până la topire. După omogenizare, amestecul este menţinut pe baie de apă (la 45oC) până
la separarea celor două faze. Faza apoasă este utilizată pentru analiza microbiologică .
3) O cantitate de 50 g de probă se suspendă în 42 ml de soluţie 0,1 M tampon fosfat
(pH=7,5–8,0), apoi se termostatează la 40…45oC până la topire (timp de maximum 1 h, cu
agitare intermitentă ). Separarea fazelor este realizată în final prin centrifugare în condiţii
aseptice, timp de 1÷10 minute, la 2000-3500 rpm. Faza apoasă este utilizată pentru
examen microbiologic.
O altă îmbunătăţire a vizat tehnica de realizare a diluţiilor. Prin realizarea unui instrument
de dispersie (dispersor) este posibil transferul automat şi aseptic a unui volum cunoscut de
lichid de diluare pentru realizarea suspensiei iniţiale sau a diluţiilor decimale.
Astfel, cu ajutorul unui dispozitiv denumit DILUFLO pot transfera volume variabile de lichid
de diluţie, cuprinse între 0,1 ml şi 100 ml, direct în pungi sau vase sterile, în care s-a
introdus în prealabil aseptic proba de analiză .
Instrumentul poate fi programat pentru a realiza diluţii 1:10, 1:50, 1:100 sau orice raport de
diluţie, realizând transferul automat a unui volum corespunzător de lichid, în funcţie de
greutatea probei solide sau volumul probei lichide luate în analiză (fig. 2).
Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
DEFINIŢII
Microorganismele aerobe sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvoltă la suprafaţa
lichidelor, a mediilor solide.
Bacteriile mezofile reprezintă grupul majoritar cu temperaturi minime la 15-20°C,
temperaturi optime în intervalul 30 - 40°C și maximum la temperaturi peste 45°C
MODUL DE LUCRU
Se iau două cutii Petri sterile. Cu o pipetă sterilă se introduc, în fiecare cutie, câte 1 cm2
probă de analizat, dacă produsul este lichid sau câte 1 cm2 diluţie iniţială, în cazul altor
produse. Se realizează apoi prima diluţie decimală a probei de analizat (10-1). Se repetă
aceste operaţii cu diluţiile următoare, folosind câte o nouă pipetă sterilă pentru fiecare
diluţie decimală.
Se toarnă în fiecare cutie Petri câte cca. 15 cm2 mediu PCA (Plate Count Agar) cu
temperatura de 45±5°C.
Mediile se uniformizează rapid în plăci, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt
lăsate în repaus până se produce solidificarea lor.
Se notează pe capacul plăcilor numele probei, mediul utilizat, diluţia inoculată,
temperatura la care se va face termostatarea.
Plăcile ce conţin mediul solidificat se plasează cu capacul în jos, pentru 48 de ore, în
termostat cu temperatura de 37°C.
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
ufc / g (ml ) =
∑C
(n1 + 0,1 ⋅ n 2 ) ⋅ d
ufc / g (ml ) =
∑C =
232 + 244 + 33 + 28
=
537
= 24409 ⇒ 2,4 ⋅ 10 4
( n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d [2 + (0,1 ⋅ 2)] ⋅ 10 −2
0,022
(prin rotunjire la două cifre semnificative*)
Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
* Exemplu:
ufc calculat ufc
estimat
12700 13000
12400 12000
15500 16000
14500 14000
Prin analiză statistică s-a stabilit că în 95% din cazuri limitele de încredere ale acestei
metode variază de ± 12% la ± 37% (pentru numărul total de microorganisme aerobe) şi
între ± 16% la ± 52%. În practică însă se pot obţine variaţii mai mari ce derivă din condiţiile
de analiză aplicate şi experienţa analistului.
2) Plăcile inoculate din două diluţii succesive conţin mai puţin 25 colonii. Se aplică
modul de calcul prezentat mai sus. Plăcile inoculate în paralel din proba de analizat (d = 1,
produse lichide) sau suspensia iniţială (d =10-1, produse solide), conţin mai puţin de 25
colonii:
ufc / g (ml ) =
∑C
2⋅d
Conform SR ISO 4833, pentru o abatere medie pătratică r2=0,95, intervalele de variaţie a
numărului posibil de ufc, pentru plăcile în care se dezvoltă mai puţin de 15 colonii, sunt
prezentate în tabelul 1.
Tabelul 1. Limite de încredere pentru estimări în cazul unui număr de colonii sub baremul
minim
Număr de Interval posibil de Număr de Interval posibil de
colonii/placă variaţie a ufc colonii/placă variaţie a ufc
1 <1÷2 9 4÷14
2 <1÷4 10 4÷16
3 <1÷5 11 5÷18
4 1÷6 12 6÷19
5 2÷9 13 7÷20
6 2÷10 14 7÷21
7 2÷12 15 8÷23
8 3÷13
Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
4) Când plăcile conţin mai mult de 250 (sau 300) de colonii, numărarea se poate
realiza:
Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
1
2
3
4
Proba 1 _______________
Proba 2 _______________
Proba 3 _______________
Proba 4 _______________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
DEFINIŢII
Drojdii – microorganisme eucariote, mono sau pluricelulare, care se reproduc asexuat
prin înmugurire sau, mai rar, prin sciziune. Unele drojdii se pot reproduce si sexuat
(meioză). Majoritatea drojdiilor sunt saprofite şi multe dintre ele au activitate
fermentativă.
Mucegaiuri – microorganisme eucariote, care prezintă organe de reproducere
diferenţiate. Sunt agenţii mucegăirii.
Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza (Anexa 1)
PRINCIPIUL METODEI
Prin această metodă, numărul de drojdii şi mucegaiuri se apreciază indirect, pe baza
coloniilor generate de celulele acestor microorganisme prezente în proba de analizat,
care se formează când proba sau o diluţie a acesteia vine în contact cu un mediu
nutritiv gelozat, după termostatare la 25°C timp de 72 de ore.
ECHIPAMENTE
Omogenizator
Balanţă analitică
Termostat reglat la 25°C
Baie de apă pentru fluidificarea mediului de cultură reglată la 45°C
MATERIALE ŞI STICLĂRIE
25g produs alimentar
225 ml 0.1% apa peptonată
Cutii Petri Φ10 cm sterile
Pipete de 1 cm3 şi 10 cm3 sterile
Eprubete cu ser fiziologic steril, câte 9 cm3 per eprubetă
Baloane cu ser fiziologic steril
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos, pentru 3-5 zile la
temperatura de 25-28°C.
REZULTATE
Se reţin cutiile care conţin 15…300 de colonii. Numărul de ufc de drojdii şi mucegaiuri
per ml sau gram de produs se calculează ca medie ponderată, cu formula următoare:
ufc / g (ml ) =
∑C
(n1 + 0,1 ⋅ n 2 ) ⋅ d
unde
ΣC – suma coloniilor numărate în toate cutiile reţinute;
n1 – numărul de cutii reţinute dintr-o diluţie
n2 – numărul de cutii reţinute din diluţia succesivă
d – factorul de diluţie corespunzător primei diluţii din care s-a realizat reţinerea
plăcilor.
Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative.
Se exprima gradul de contaminare printr-un număr cuprins între 1,0 şi 9,9 multiplicat cu
10x, unde x este puterea atribuită lui 10.
Dacă cele două cutii Petri, la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluţiei
iniţiale (alte produse) conţin mai puţin de 15 colonii, se face media aritmetică, m, a
coloniilor numărate în cele două cutii.
Rezultatul se exprima sub forma:
- număr de ufc de drojdii şi mucegaiuri estimat per ml:
NE=m (produse lichide)
- număr de ufc de drojdii şi mucegaiuri estimat per gram
NE=m·d-1 (alte produse), în care d este factorul de diluţie al diluţiei iniţiale (alte produse).
Dacă cele două cutii Petri , la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluţiei
iniţiale (alte produse) nu conţin nicio colonie, rezultatul se exprima sub forma:
- mai puţin de o ufc de drojdii sau mucegaiuri per ml (produse lichide);
- mai puţin de 1·d-1 ufc de drojdii sau mucegaiuri pe gram (alte produse)
Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
ANEXA 1
6. Băuturi alcoolice
7. Băuturi nealcoolice
Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
ANEXA 2
Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
OGA (OGYE)
(Oxitetraciclina glucoză agar)
Extract de drojdie ......... 5g
Glucoză ...................... 20g
Agar-agar ................... 16g
Apă până la ........... 1000ml
pH=7,2
În momentul utilizării, în mediul fluidificat se
adaugă 100 ml soluţie 1mg/ml oxitetraciclină.
Geloză nutritivă (geloză alba)
Agar-agar ......................... 12…18g
Apă până la ...................... 1000 ml
Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
1
2
3
Proba 1 _______________
Proba 2 _______________
Proba 3 _______________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
DEFINIŢII
Bacteriile sporulate aerobe sunt bacterii care aparţin genului Bacillus. Sunt bacterii
Gram+, mobile, cu celule de forma cilindrica, cu dimensiuni diferite, cu capetele
drepte sau rotunjite, singulare sau asociate in unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanţuri.
Sporii nu se colorează prin colorare Gram, sunt sferici sau ovali, cu diametru mai mic
sau egal decât al celulei, fiind poziţionaţi central sau terminal.
Bacteriile sporulate anaerobe sunt bacterii care aparţin genului Clostridium. Sunt
bacterii Gram+, mobile, cu celule de forma cilindrica cu dimensiuni mai mari decât
cele din genul Bacillus, singure sau in lanţuri, care formează endospori dispuşi
central sau terminal, care dau celulelor forma de suveică sau paleta.
Tipurile de produse alimentare pentru care se recomandă analiza sunt prezentate în
Anexa 1.
PRINCIPIUL METODEI
Determinarea microorganismelor sporulate aerobe şi anaerobe estimează numărul
microorganisme in stare sporulata prezente per g sau ml de produs.
Proba de analizat sau diluţii succesive se supun pasteurizării la 80°C timp de 10
minute, pentru a distruge toate formele vegetative , apoi se răceşte si se inoculează
in medii specifice, cultivarea realizându-se in condiţii particulare in condiţii aerobe
sau anaerobe.
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
Manipularea eşantioanelor
În laborator, înainte de analiză, cu excepţia produselor alimentare care nu necesită
condiţii speciale de depozitare, probele se păstrează fie la frigider la temperatura de
0-5°C, fie congelate, în funcţie de natura produsului.
Prepararea mediilor de cultură
Se pregăteşte mediul Trypticase Soy Agar în cantităţi corespunzătoare şi se
sterilizează.
Se temperează mediul de cultură într-o baie de apă la temperatura de 45°C,
asigurându-se că nivelul apei este de 1 cm peste nivelul de mediu din eprubete.
Se curăţă zona de lucru cu un dezinfectant adecvat.
Se marchează în mod clar plăcile Petri cu numărul probei, diluţia şi data
termostatării.
Pregătirea diluţiilor
Se prepară un raport de diluţie de 1:10 a produsului alimentar, prin suspensionare a
de 10g (ml) produs în 90 ml apă peptonată. Probele se omogenizează:
- timpul de amestecare nu trebuie să depăşească 2.5 min, în scopul prevenirii
supraîncălzirii.
- în cazul produsele alimentare care au tendinţa de a spuma, este indicată
agitarea moderata.
- diluţiile se omogenizează prin menţinere pe vortex ( de 25 de ori, printr-un arc
de 30 cm, în aproximativ 7 sec).
Pentru fiecare probă de analizat, se pipetează 20-25 ml din diluţia 10-1 într-o
eprubetă sterilă. Se plasează eprubetele în baia de apă la 80°C. si se menţin timp de
20 de minute. După răcire se prepară diluţii (diluţii recomandate sunt de 10-1,10-2, şi
10-3).
Inocularea si termostatarea probelor
Cu o pipetă sterilă se transferă în fiecare placă Petri sterilă, câte 1 ml probă de
analizat.
Se toarnă în fiecare placă Petri câte cca. 15 ml mediu de cultură cu temperatura de
45±5°C.
Mediile se uniformizează rapid, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt lăsate
în repaus până se produce solidificarea.
După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos.
Pentru bacteriile aerobe sporulate, plăcile se termostatează la 35oC ± 0.5oC timp
de 48 ± 2 ore.
Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
REZULTATE
Numărul de bacterii formatoare de spori per ml sau gram de produs se calculează cu
următoarea formula:
Plăcile din două diluţii succesive conţin 25÷250 colonii pe placă:
ufc / g (ml ) =
∑C
(n1 + 0,1 ⋅ n 2 ) ⋅ d
Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
ANEXA 1
1. Făinuri
2. Lapte
5. Conserve alimentare
7. Produse deshidratate
Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
ANEXA 2
CONDIŢII DE CULTIVARE ŞI COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ PENTRU
NUMĂRAREA MICROORGANISMELOR
Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
ANEXA 3
SISTEME DE CULTIVARE IN ANAEROBIOZA
Pag 7
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
1
Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in unităţi formatoare de colonii
(ufc) per gram sau ml produs
Proba 1 _______________
Proba 1 _______________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
PRINCIPIUL METODEI
Drojdiile, mucegaiurile şi bacteriile osmofile sunt microorganisme capabile să se
crească într-un mediu cu concentraţii ridicate de zahăr sau sare producând alterări care
conduc la modificarea calităţii senzoriale şi a valorii nutritive a alimentelor (Anexa 1).
Prin această metodă, numărul de microorganisme osmofile se apreciază prin examen
cultural indirect, pe baza coloniilor formate microorganismele prezente în proba de
analizat, sau o diluţie a acesteia, prin cultivare pe medii specifice solidificate,
suplimentate cu 10% zahar sau sare, după termostatare optimă.
Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza: zahăr şi produse
derivate, produse conservate prin adaos de zahar, lapte condensat, amestecuri de
sărare, saramuri şi produse conservate prin sărare.
MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE
1. Mediu de baza (Anexa 2):
• Pentru bacterii: dextroză, 110 g; Plate Count Agar 23.5 g, apă distilată,
1.000 ml.
• Pentru drojdii şi mucegaiuri: mediu hiperglucidic
2. Mediul de diluare:zaharoză sau NaCl 400 g; apă distilată 1000 ml.
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
Cu o pipetă sterilă se transferă în 2 placi Petri in paralel, câte 1ml probă de analizat. Se
repartizează în fiecare cutie Petri câte cca. 15ml mediu de cultură fluidificat şi temperat
la temperatura de 45±5°C.
Mediile se uniformizează rapid în plăci, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt
lăsate în repaus până se produce solidificarea lor1.
După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos in următoarele
condiţii:
A. Bacterii osmofile
Plăcile Petri se termostatează la 35-37°C timp de 48 ± 3 ore (2 zile). Se reţin plăcile
care conţin 25…250 de colonii. Se numără colonii formate, realizându-se media
aritmetică a plăcilor realizate în dublu exemplar şi se stabileşte numărul de unităţi
formatoare de colonii per ml sau gram de produs.
B. Drojdii şi mucegaiuri osmofile
Plăcile Petri se termostatează la 25-30°C timp de 72 h (3 zile). Daca coloniile formate
sunt de dimensiuni mici, se extinde perioada de termostatare la 96-120 h (4-5 zile). Se
numără colonii formate, realizându-se media aritmetică a plăcilor realizate în dublu
exemplar şi se stabileşte numărul de unităţi formatoare de colonii per ml sau gram de
produs.
Se înregistrează numărul de drojdii/mucegaiuri per ml sau gram de produs
REZULTATE
Numărul de microorganisme osmofile per ml sau gram de produs se calculează cu
următoarea formula:
ufc/g(ml) = n·d
unde
n este numărul mediu de colonii/placă
d este factorul de diluţie.
Se aplica aceeaşi formula de calcul ca şi la bacterii aerobe mezofile sau drojdii şi
mucegaiuri
1
Pe capacul plăcilor Petri se notează: denumirea şi numărul probei, mediul de cultura, diluţia din care se realizează
inocularea, temperatura la care se realizează termostatarea.
Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
ANEXA 1
MICROORGANISME OSMOFILE CONTAMINATE ALE PRODUSELOR
ALIMENTARE
aW min
Microorganism
Drojdii
Debaryomyces 0.83
Bacterii
Genul Hallobacterium (H. salinarium, H. morrhnae)
Genul Hallococcus
Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
ANEXA 2
Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
1
2
Proba 1 _______________
Proba 2 _______________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
PRINCIPIUL METODEI
Bacteriile de putrefacţie sunt microorganisme care produc hidroliza proteinelor de
origine animală până la produşi simpli, gaze, NH3, H2S, amine biogene, compuşi indolici.
Primele semne ale alterării prin putrefacţie sunt formarea de mucus, apariţia mirosului
neplăcut şi modificarea gustului.
Bacteriile de putrefacţie aparţin următoarelor genuri: Pseudomonas, Bacillus,
Enterobacter, Escherichia, Proteus, Clostridium etc.
Determinarea lor are la bază două principii:
I. Evidenţierea hidrolizei substratului de natură proteică, astfel se determină
bacteriile cazeinolitice (produc hidroliza cazeinei).
II. Evidenţierea produşilor finali ai hidrolizei proteinelor prin realizarea de teste
biochimice reunite in testul HIL (H - evidenţierea producerii de hidrogen
sulfurat; I - evidenţierea producerii de indol; L- capacitatea de a lichefia
gelatina)
Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza sunt: carnea,
preparatele din carne sau peşte, brânzeturile.
MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE1
1. Mediul de baza:Plate Count Agar cu 1% cazeină sau 10% lapte;
2. Mediul de diluare: apă peptonată;
3. Reactivi pentru testele biochimice: reactiv Erlich sau Kovacs, acetat de plumb.
1
Anexa 1
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
Mediile se uniformizează rapid în plăci Petri sterile, prin rotirea plăcilor în plan orizontal,
apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea lor2.
După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos, timp de 48h, la
temperatura de 37°C.
Bacteriile care prezintă capacitatea de a hidroliza cazeina vor prezenta în jurul coloniilor
o zonă clară incoloră comparativ cu restul mediului care este opac. Aceasta deoarece,
bacteriile cazeinolitice produc enzime proteolitice extracelulare care difuzează în
exteriorul coloniilor şi hidrolizează cazeina.
2
Se notează pe capacul plăcilor numele probei, mediul utilizat, diluţia inoculată, temperatura la care se va face termostatarea.
3Înainte de analiza, probele se menţin timp de 30 min la frigider
Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
ANEXA 1
Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
1
2
Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in unităţi formatoare de colonii
(ufc) per gram sau ml produs
Proba 1 _______________
Proba 2 _______________
1
2
Proba 1 _______________
Proba 2 _______________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR
PROBA REDUCTAZEI
PRINCIPIUL METODEI
Proba reductazei este o metodă indirectă de apreciere a numărului de microorganisme
vii dintr-un produs, in funcţie de corelaţia dintre gradul de contaminare si durata în care
se produce modificarea culorii unor indicatori redox (albastru de metilen şi resazurina),
sub acţiunea enzimelor din categoria reductaze sintetizate de celulele vii prezente în
produs. Indicatorii redox au in forma oxidata culoare albastru (in cazul albastrului de
metilen) si albastru violet (in cazul resazurinei), iar prin reducere (in prezenta
reductazelor) se transforma in leucoderivaţi incolori. Analiza se pretează cel mai bine
pentru evaluarea calităţii microbiologice a laptelui materie prima.
In funcţie de tipul indicatorului si concentraţia acestuia variază durata analizei si
culoarea probei, parametrii in funcţie de care se poate aprecia gradul de contaminare si
calitatea microbiologica a produsului. Astfel, in cazul utilizării albastrului de metilen,
iniţial, proba are culoarea albastru care in timp se transforma in incolor. Resazurina îşi
schimbă culoarea de la albastru la violet spre roz şi apoi incolor.
MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE
1. Soluţie de albastru de metilen 1%
2. Soluţie de resazurină 0,05%
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR
REZULTATE
a. Proba reductazei cu albastru de metilen
Aprecierea calităţii laptelui se face in conformitate cu specificaţiile din tabelul 1.
Tabelul 1. Aprecierea calităţii laptelui în proba reductazică cu albastru de metilen
Durata decolorării probei, minute Număr bacterii per ml Calitatea laptelui Categoria
5
330 180 5·10 Buna I
5 6
120-330 60-180 5·10 - 4·10 Satisfăcătoare II
6 6
20-120 8-60 4·10 – 20·10 Slaba III
6
20 8 20·10 Foarte slaba IV
b. Proba cu resazurina
In proba cu resazurina aprecierea calităţii laptelui si a gradului de contaminare se face
realizează in conformitate cu datele înscrise în tabelul 2.
Se apreciază că la temperaturi de 38-40°C, o capacitatea reductazică superioară o au
lactobacilii, streptococii şi bacteriile coliforme. Dacă probele se menţin la temperatura
de 22°C la reducere participă şi bacterii din genurile Achromobacter, Bacillus,
Enterococcus.
5
După 1h Albastru 5·10 Buna I
5 6
După 1h Albastru violet 5·10 - 4·10 Satisfăcătoare II
6 6
După 1h Roşu-alb 4·10 – 20·10 Slaba III
6
După 20 min. Alb 20·10 Foarte slaba IV
Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR
PROBA REDUCTAZEI
Durata decolorării
PROBA probei, minute Număr bacterii per ml Calitatea laptelui
Metoda rapida
1.
2.
Timp de
Culoare Număr bacterii per Calitatea
PROBA modificare a
proba ml laptelui
culorii
1.
2.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR
Metodele culturale sunt în prezent mult simplificate prin utilizarea unor sisteme
comerciale, denumite Petrifilme (în limba engleză, Petrifilms), în care mediul de cultură
specific (în general, un mediu selectiv), deshidratat, dar uşor rehidratabil este fixat sub
forma unui film (cu diametru şi grosime variabilă) pe un suport din carton plastifiat şi
acoperit cu o folie din plastic. Prin inocularea suspensiei de celule, lichidul hidratează
mediul şi prin termostatare este posibilă dezvoltarea microorganismelor.
Petrifilmele au fost concepute în vederea satisfacerii conceptelor sistemului HACCP
(analiza hazardului, punctele critice de control), care prevăd aplicarea unor măsuri
corective, pe tot parcursul procesului de producţie, fără ca acesta să stagneze, ceea ce
impune analiza unui număr mare de probe, cu obţinerea unor rezultate prompte şi în
scurt timp, obiective ce nu pot fi realizate prin aplicarea metodelor clasice de control
microbiologic (Bahrim, 2003).
Practica a demonstrat că Petrifilmele constituie sisteme eficiente de analiză
microbiologică, aplicabile mai ales pentru evaluarea calităţii materiilor prime şi controlul
în punctele critice pe parcursul procesării acestora, oferind numeroase avantaje, care
se regăsesc în reducerea timpului de analiză, reducerea costului analizei per probă,
creşterea numărului de probe analizate, asigurarea inocuităţii alimentelor şi
îmbunătăţirea substanţială a productivităţii (Jordano şi Medina, 1999).
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR
Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR
Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR
1
|Anexa 1
Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR
Garanţia utilizării Petrifilmelor este validată oficial de numeroase asociaţii de renume din
întreaga lume (tabelul 2). Validarea s-a realizat pe trei criterii de bază: reproductibilitate,
repetabilitate şi precizie.
Tabelul 2. Validarea oficială a utilizării Petrifilmelor pentru evaluarea calităţii microbiologice a
alimentelor
Organizaţia Produse pentru care s-a Indicator microbiologic
internaţională* realizat validarea
AOAC Majoritatea alimentelor Drojdii şi mucegaiuri
Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme şi Escherichia coli
Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC) pentru
determinarea rapidă a bacteriilor coliforme
ANFOR Majoritatea alimentelor Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme şi Escherichia coli Petrifilm seria
2000 (P 2000 CC) pentru determinarea rapidă a
bacteriilor coliforme
Enterobacterii
NMKL Majoritatea alimentelor Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme şi Escherichia coli
VDIA Lapte şi produse lactate Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme
HPB Lapte şi produse lactate Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme
Alte alimente Drojdii şi mucegaiuri
Evaluarea calităţii mediului Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme şi Escherichia coli
Test Kit HEC
* AOAC – Association of Official Analytical Chemists (SUA); AFNOR – French Standardization Association (Franţa);
NMKL – Nordic Committee of Food Analysis; VDIA – Victorian Dairy Industry Authority (Australia);
HPB – Health Protection Branch, Compendium of Analytical
Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR
Datele obţinute, exprimate ca valori medii, stabilite prin calcul statistic (P > 0,05), pentru
cinci probe în paralel (n = 5), certifică fidelitatea şi acurateţea analizelor realizate cu
Petrifilme, amplificarea preciziei realizându-se prin asigurarea condiţiilor selective de
cultivare şi interpretare a rezultatelor, ceea ce permite evaluarea corectă şi distinctivă a
speciilor analizate (fig. 5).
1 2
3 4
Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR
Pag 7
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR
ANEXA 1
Tipuri de Petrifilme comerciale
Tip Petrifilm/ Grup de Exemple Tip Petrifilm/ Grup Exemple
microorganisme analizate de microorganisme
analizate
Pag 8
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI
BACTERII COLIFORME.
COLIFORMI FECALI SI ESCHERICHIA COLI
Bacteriile coliforme conform definiţiei ISO sunt bacterii Gram negative nesporulate,
oxidazo-negative, aerobe sau facultativ anaerobe, ce pot să se înmulţească în prezenţa
sărurilor biliare (care inhibă dezvoltarea bacteriilor Gram pozitive sau a altor agenţi cu
proprietăţi echivalente), capabile de a produce fermentaţia heterolactică a lactozei cu
producere de acid lactic şi gaze, in timp de 48 ore si la temperaturi de 35-37°C.
Grupul bacteriilor coliforme cuprinde speciile: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloaceae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter
freundii, Citrobacter diversum, Citrobacter amalonatica
Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza sunt: lapte şi
produse lactate, carne şi produse din carne, peşte şi produse din peşte, băuturi
alcoolice, băuturi nealcoolice, produse de cofetărie şi patiserie
PRINCIPIU METODEI
Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include trei etape diferite de analiza
concretizate in: testul prezumtiv, testul de confirmare şi testul complet, bazate pe
capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO2, H2, în
timp de 48 ore la 35°C.
Testul prezumtiv constă in inocularea probei în mediu nutritiv cu lactoză. Aprecierea
probelor pozitive se face fie în funcţie de prezenţa gazelor acumulate în tubul Durham,
fie ca urmare a scăderii pH-ului prin acumularea de acid lactic.
Testul de confirmare constă in transferul si inocularea din eprubetele pozitive ale
testului prezumtiv in medii selective care favorizează dezvoltarea bacteriilor coliforme
de origine fecala.
Testul complet permite identificarea speciilor grupului bacteriilor coliforme şi se bazează
pe testarea unor proprietăţi biochimice caracteristice.
Din grupul bacteriilor coliforme specia Escherichia coli, este indicatorul care certifica o
contaminare fecală recentă.
MODUL DE LUCRU
DETECTIA COLIFORMILOR TOTALI
Analiza se efectuează în două etape, după cum urmează:
1. Etapa de îmbogăţire (testul prezumtiv) are rolul de a previziona prezenţa
bacteriilor coliforme şi multiplicarea acestora, dacă sunt în concentraţii reduse, în
vederea evidenţierii lor facile în etapa următoare.
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI
Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI
10 ml 10 ml 10 1 ml 1 ml 1 ml Idem Idem
ml
+ + + + + +
10 ml 10 ml 10 10 10 ml 10
1) 1) 2)
Mîdc Mîdc ml ml Mîsc ml
1) 2) 2)
Mîdc Mîsc Mîsc
Etapa de
confirmare
+* + -
10 ml 10 ml 10 10 10 ml Idem Idem
3)
BLBV BLBV ml ml BLBV
BLBV BLBV
Fig. 1. Schema de lucru pentru evaluarea cantitativă a bacteriilor coliforme prin tehnica
numărului probabil
Legendă:
1)
Mediu selectiv de îmbogăţire dublu concentrat (Mîdc) + tub Durham
2)
Mediu selectiv de îmbogăţire simplu concentrat (Mîsc) + tub Durham
3)
Mediu selectiv de confirmare + tub Durham
4)
Temperatura de termostatare poate fi 30ºC, 35ºC sau 37ºC şi este stabilită în funcţie de scopul analizei şi anume: scop
tehnologic sau evaluarea riscului privind siguranţa alimentară; în anumite cazuri testul pozitiv poate fi evidenţiat şi după o
perioadă de termostatare de 24 h ± 2h
* Probă pozitivă: modificarea turbidităţii; reducerea pH-ului; acumularea de gaz în tubul Durham
** Probă pozitivă: modificarea turbidităţii; virajul culorii mediului din verde în galben; acumularea de gaz în tubul Durham
Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI
Interpretarea rezultatelor
Pentru fiecare eşantion examinat se reţin trei diluţii consecutive, care, după caz,
corespund uneia dintre situaţiile următoare:
1) Cel puţin o diluţie prezintă trei eprubete pozitive. Se alege diluţia cea mai mare
(adică cea care corespunde celei mai mici concentraţii de eşantion inoculat) care
prezintă trei eprubete pozitive, şi încă două diluţii succesive. Dacă schema de diluţie
adoptată este necorespunzătoare, adică nu există diluţii la care să se fi înregistrat şi
probe negative, se aleg cele mai mari trei diluţii succesive din serie (adică cele care au
cea mai scăzută concentraţie de probă inoculată).
2) Nu există cazuri e să prezinte trei eprubete pozitive. Cazul 1 nu poate fi aplicat.
Se aleg cele mai mari trei diluţii succesive din serie (adică cele care au cea mai
scăzută concentraţie de probă inoculată), care conţin cel puţin un răspuns pozitiv.
3) Cazuri particulare. În toate cazurile în care mai mult de una dintre cele trei diluţii
de la pct. 1) şi 2) nu prezintă eprubete pozitive (adică cea în care s-a inoculat cea mai
mare cantitate de probă) şi cele două diluţii consecutive mai mici (adică cele în care
concentraţiile de probă inoculată sunt de 10 şi respectiv 100 de ori mai mici decât în
prima diluţie aleasă), excluzând cazul în care se înregistrează probe pozitive, doar la
prima diluţie preparată, pornind de la eşantion. În acest ultim caz, se vor reţine primele
trei diluţii, chiar dacă seria include două diluţii care nu prezintă nici o probă pozitivă.
Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI
Calcul MPN1
Pentru a stabili MPN/g sau ml probă se recomandă utilizarea aproximaţiei
propusă de Thomas, stabilită prin formula:
P
MPN / g (ml ) =
(N + T ) 12
în care: P – numărul de eprubete pozitive;
N – cantitatea de probă inoculată în probele negative, g sau ml
T – cantitatea totală de probă luată în analiză (inoculată în toate seturile de
probe realizate în paralel), g sau ml
Pentru fiecare analiză trebuie să se decidă categoria de rezultate acceptată,
adică 1, 1 şi 2, sau 1, 2 şi 3. Astfel, gradul de contaminare va corespunde cu MPN
calculat, conform specificaţiilor din tabelul 1.
Tabelul 1. Măsuri privind interpretarea şi acceptabilitatea rezultatelor analizei
Categoria Definiţie
1 Rezultatul este unul din cele care au cea mai mare şansă de a fi obţinute.
Şansa de a obţine acest rezultat (care este mai puţin probabil decât cel mai puţin
probabil) este de cel mult 5% în această categorie.
2 Rezultatul este unul din cele care au cea mai mică şansă de a fi obţinute, chiar
decât cel mai puţin probabil din categoria 1.
Există şansa de cel mult 1% de a obţine un rezultat mai puţin probabil decât cel mai
puţin probabil în această categorie.
3 Rezultatul este unul dintre cele care au cea mai mică şansă de a fi obţinute, chiar
decât cel mai puţin probabil din categoria 2.
Există şansa de cel mult 0,1% de a obţine un rezultat care este mai puţin probabil
decât cel mai puţin probabil în această categorie.
0 Rezultatul este unul dintre cele care au cea mai mică şansă de a fi obţinute, chiar
decât cel mai puţin probabil din categoria 3.
Nu există decât o şansă de 0,1% de a obţine un rezultat în această categorie, fără
erori de analiză
După alegerea setului de trei diluţii reprezentative pentru stabilirea MPN, care,
conform uneia din situaţiile de mai sus, sunt acceptabile din punct de vedere statistic.
Acceptabilitatea depinde totodată de numărul de eşantioane analizate şi de decizia de a
accepta sau refuza rezultatele din categoria 2.
Un exemplu de alegere a diluţiilor pentru calculul valorii MPN este prezentat în
tabelul 2.
Acceptarea rezultatelor va ţine seama de categoria impusă. Astfel, atunci când
sunt acceptate numai rezultate numai din categoria 1, combinaţia 221 nu poate fi
1
numărul cel mai probabil (MPN)
Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI
reţinută decât dacă au fost examinate 10 probe în paralel (din lotul considerat). În cazul
când sunt acceptate mai puţin probabile (din categoria 2), combinaţia 221 va fi reţinută
în cazul în care au fost examinate 2, 3 sau 5 probe în paralel. Dacă combinaţia 221 este
rezultatul unei singure analize, acesta nu poate constitui o bază pentru stabilirea MPN.
Tabelul 2. Stabilirea valorii MPN în funcţie de diagrama probelor pozitive (adaptare după SR
ISO 4831, 1992)
2)
Exemplu Numărul de eprubete pozitive corespunzător seturilor de trei MPN
eprubete termostatate, corespunzând următoarelor cantităţi
1)
de eşantion inoculate în fiecare eprubetă
-1 -2 -3
Produs 10 ml 1ml 10 ml 10 ml 10 ml MPN/ml MPN/g
lichid
-1 -2 -3 -4
Alt produs 1g 10 g 10 g 10 g 10 g
1 3 3 2 1 0 1,5·101 1,5·102
2 3 3 3 0 2,4·101 2,4·102
3 2 2 1 1 0 7,4 7,4·10
4 3 3 0 0 0 2,4 2,4·10
5 2 2 0 1 1 2,1·10-1 2,1
1)
Seria (combinaţia) de eprubete aleasă
2)
Conform datelor din tabelele întocmite pe baze statistice
Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI
ANEXA 1
COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ
Pag 7
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI
BACTERII COLIFORME.
COLIFORMI FECALI SI Escherichia coli
Proba
Diluţia
1
2
b. Etapa de confirmare
Proba
Diluţia
1
2
Proba 1 _______________________
Proba 2 _______________________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
PRINCIPIUL METODEI
Prin această metodă, numărul de bacterii aparţinând speciei Staphylococcus aureus se
apreciază indirect, pe baza numărului de colonii generate de celulele acestei bacterii
prezente în proba de analizat, care se formează când proba sau o diluţie a acesteia
vine în contact cu un mediu nutritiv gelozat (inoculat în două probe în paralel), după
termostatare la temperatura de 35°C sau 37°C, timp de 24-48 de ore.
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
Cerinţe:
Apa folosită trebuie să fie distilată sau demineralizată, lipsită de substanţe care
să inhibe dezvoltarea celulelor de Staphylococcus aureus în condiţiile analizei;
Reactivii chimici utilizaţi trebuie să fie de calitate recunoscută;
Pentru prepararea soluţiilor de diluare şi a mediilor de cultură se vor utiliza
componente de bază deshidratate sau medii comerciale deshidratate;
Pentru emulsia de gălbenuş de ou se recomandă utilizarea unui preparat
comercial, respectând cu stricteţe instrucţiunile fabricantului.
MODUL DE LUCRU
Pentru evidenţierea bacteriilor Staphylococcus aureus se fac inoculări în mediul Baird-
Parker cu geloză, prin metoda încorporării în mediul nutritiv. Din probele lichide se pot
realiza diluţii decimale direct în eprubete, în timp ce pentru probele solide sau
semisolide se realizează o omogenizare şi suspendare în ser fiziologic steril.
Se cântăresc în condiţii aseptice 10 g din produsul de analizat, folosind drept suport o
pungă sterilă. Se adaugă 90 cm3 ser fiziologic steril, se închide punga şi se introduce în
omogenizator. Se omogenizează timp de 1 min în treapta a doua, după care se
continuă diluarea în eprubetele cu ser fiziologic steril.
Inoculările se fac din 3 diluţii succesive ale probei, alese convenabil, în funcţie de gradul
presupus de contaminare a probei. Pentru fiecare din diluţiile alese, se inoculează câte
1 cm3 în câte două plăci Petri. Pentru a obţine colonii uniform repartizate, după turnarea
în plăci a mediului fluidificat şi răcit la 47±1°C, se omogenizează conţinutul cutiei Petri
prin mişcări de rotaţie executate în plan orizontal, după care se lasă în repaus până la
solidificare totală.
După inoculare, probele sunt termostatate timp de 24-48 de ore la temperaturi de 35±
1°C sau la 37±1°C, apoi se marchează pe reversul mediului coloniile caracteristice. Se
continuă termostatarea la temperatura de 35± 1°C sau la 37±1°C, timp de încă 22-24
de ore şi se marchează toate coloniile caracteristice; se marchează şi coloniile
necaracteristice eventual prezente. Se reţin pentru numărare plăcile Petri care conţin
între 15-150 colonii caracteristice şi/sau necaracteristice.
Prin numărare se stabileşte numărul de ufc (unităţi formatoare de colonii) care
reprezintă numărul prezumtiv de bacterii ale speciei Staphylococcus aureus, prezente
în proba de analizat.
Din fiecare placă Petri se aleg pentru confirmare cinci colonii caracteristice şi/sau
necaracteristice (după caz).
Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
Pentru confirmarea prin proba coagulazei se procedează astfel: din fiecare colonie
reţinută se prelevează biomasă cu ajutorul unei anse sterile şi se inoculează în câte o
eprubetă ce conţine 10 ml bulion inimă-creier. Probele inoculate se termostatează la
37±0,5°C, timp de 18-24 de ore. Se amestecă în eprubete sterile 0,1 ml cultură
recoltată în condiţii sterile 0,3 ml plasmă de iepure şi se termostatează la temperaturi de
35-37°C, timp de 1-6 ore.
Se consideră că reacţia este pozitivă când coagulul ocupă mai mult de trei pătrimi din
volumul ocupat iniţial de lichid.
Pentru control, se adaugă 0,1 ml bulion inimă-creier steril în 0,3 ml plasmă de iepure şi
termostatează în condiţii similare cu probele de analizat. Plasma din eprubeta martor nu
trebuie să prezinte semne de coagulare.
INTERPRETAREA REZULTATELOR
În interpretarea rezultatelor se vor ţine cont de următoarele recomandări:
- coloniile caracteristice sunt negre, strălucitoare şi convexe, diametrul de 1..1,5
mm, după 24 de ore de termostatare, şi de 1,5-2,5 mm, după 48 de ore de
termostatare, şi sunt înconjurate de o zonă clară sau parţial opacă;
- coloniile necaracteristice au caractere culturale asemănătoare, dar sunt lipsite
de zonă clară; coloniile necaracteristice sunt constituite adesea de tulpini de
Staphylococcus aureus care contaminează produsele lactate;
- dacă la o diluţie predomină un tip de colonii, iar la o diluţie diferită predomină alt
tip de colonii, se reţin plăcile corespunzătoare ambelor diluţii.
Pot fi întâlnite următoarele situaţii:
1) Dacă cel puţin 80% dintre coloniile selecţionate sunt coagulazo-pozitiv se ia ca
număr prezumtiv de Staphylococcus aureus, numărul de ufc obţinut prin numărarea
coloniilor selectate pentru numărare.
2) În toate celelalte cazuri, numărul se calculează pornind de la procentul de
Staphylococcus aureus prezumtiv, care sunt coagulazo-pozitiv.
Calculul pentru determinarea bacteriilor Staphylococcus aureus prin numărare
Pentru plăcile care conţin între 15 şi 150 de colonii caracteristice şi/sau necaracteristice
pentru două diluţii consecutive, numărul de ufc de Staphylococcus aureus se calculează
media aritmetică a valorilor obţinute, exceptând cazul când raportul dintre valoarea cea
mai mare şi valoarea cea mai mică este mai mare decât 2; în acest caz se reţine ca
rezultat valoarea cea mai mică. Dacă în plăcile Petri alese pentru numărare sunt
Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
inoculate cu eşantionul de analiză sau o diluţie a acestuia este mai mic de 15 ufc sunt
prezentate în tabelul de mai jos:
Limite de încredere pentru estimări de numere mici
Staphylococcus aureus Limita de încredere la nivelul de 95%
ufc/ml sau ufc/g inferioară superioară
1 <1 2
2 <1 4
3 <1 5
4 1 6
6 2 9
7 2 12
8 3 13
9 4 14
10 4 16
11 5 18
12 6 19
13 7 20
14 7 21
15 8 23
Dacă nu există nici o colonie confirmată rezultatul se exprimă sub forma:
a) pentru produse lichide:
- - mai puţin de 1 x ne Staphylococcus aureus per mililitru
b) pentru alte tipuri de produse:
- - mai puţin de 1 x Ne Staphylococcus aureus per gram
Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
ANEXA 1
Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
ANEXA 2
Prepararea mediilor de cultură şi a reactivilor pentru determinare
Soluţie de sulfamezatină (sulfadimidină, INN) se foloseşte numai în cazul în care se suspectă prezenţa
bacteriilor din genul Proteus).
Compoziţie:
Sulfamezatină ..............................................................0,2g
Soluţie hidroxid de sodiu 0,1M .................................... 10ml
Apă ............................................................................ 100ml
Preparare: Se dizolvă sulfmezatina în soluţie de hidroxid de sodiu. Se completează volumul până la 100
ml cu apă.
Pag 7
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
Preparare: Se dizolvă piruvatul de sodiu într-un volum de apă. Se completează cu apă până la volum
final. Se sterilizează prin filtrare. Soluţia poate fi conservată maxim o lună la temperaturi de 0°C-5°C.
2. Bulion de inimă-creier
Compoziţie:
Peptonă ............................................................................................ 10g
Extract deshidratat din creier de viţel ............................................ 12,5g
Extract deshidratat de inimă de bou ............................................... 5,0g
Glucoză ........................................................................................... 2,0g
Clorură de sodiu .............................................................................. 5,0g
Ortofosfat disodic (Na2HPO4) .......................................................... 2,5g
Apă ............................................................................................ 1000 ml
Preparare: Se dizolvă componentele sau mediul complet în apă, aducând la fierbere. Se ajustează pH-ul
astfel încât, după sterilizare, acesta să fie 7,4 la temperatura de 25°C. Se repartizează mediul de cultură,
câte 10 ml, în eprubete. Se sterilizează mediul la temperatura de 121°C, timp de 20 de minute. Mediul
poate fi conservat timp de mai multe luni la temperatura de 0°C-.5°C.
3. Plasmă de iepure
Se foloseşte plasmă de iepure deshidratată din comerţ, care se rehidratează conform instrucţiunilor
fabricantului. Se adaugă o soluţie de EDTA (acid etilen-diamino-tetra acetic) (plasma oxalată sau
heparinizată nu necesita EDTA), astfel încât să se obţină o concentraţie de 0,1% EDTA în plasma
rehidratată.
Se poate utiliza plasmă de iepure proaspătă sterilă şi apă sterilă, în raport de 1:3. Înainte de a fi utilizat,
fiecare lot de plasmă trebuie controlat cu tulpini de Staphylococcus aureus slab şi intens pozitive, precum
şi cu tulpini de stafilococi coagulazo-negativi.
Pag 8
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
GENUL LISTERIA
Genul Listeria cuprinde 7 specii, dintre care cea mai importantă este L.
monocytogenes.
TEHNICI DE ÎMBOGĂŢIRE
Bulionul Fraser este un mediu asemănător mediului UVM, dar conţine clorura de litiu şi citrat
de fier. Înnegrirea mediului indică posibila prezenţă a bacteriilor din genul Listeria.
TEHNICI DE IZOLARE
Geloza Oxford conţine amidon, esculină şi citrat de fier. Selecţia se datorează clorurii de litiu
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
Geloza PALCAM conţine glucoză, amidon, manitol, esculină şi citrat de fier. Selecţia este
datorată prezenţei clorurii de litiu şi inhibitorilor: ceftazidină, polimixină şi acriflavină. După o
perioadă de termostatare de 24 h la temperatura de 37°C, Listeria monocytogenes formează
colonii verde-oliv cu halou negru. Aceste medii sunt foarte selective, dar pe ele pot creşte
stafilococi şi enterococi (colonii galbene datorate fermentaţiei manitolului din mediul
PALCAM). Se pot utiliza şi alte medii:
geloză Despierre, geloză cu sânge sau geloză Columbia sau tripticază soia conţinând
acid nalidixic, polimixina şi ramnoză;
TEHNICI DE IDENTIFICARE
Bacteriile din genul Listeria sunt bacili mobili, aero-anaerobi, catalazo +, oxidazo -.
Principalele caractere biochimice studiate pentru identificarea genului sunt: VP (+), RM(+),
indol (-), urează (-), H2S (-) etc. Geloza cu esculină este inoculată prin înţepare şi
termostatată timp de 48 h la temperatura de 37°C. Speciile genului Listeria şi, în particular, L.
monocytogenes, dau un răspuns pozitiv (culoare neagră).
Caracterul hemolitic este studiat cu testul Camp. Tulpinile de studiat se inoculează prin
metoda striilor pe o geloză cu sânge de oaie şi, perpendicular pe aceştia, se inoculează o
tulpină de S. aureus şi de Rhodococcus equi. L. monocytogenes şi L. seeligeri produc
hemoliza β cu S. aureus, în timp ce L. ivanovii produce hemoliza cu R. equi.
Pentru identificare rapidă se pot utiliza următoarele teste: API Listeria (Biomerieux), ID32
(Biomerieux), Micro ID (AES), sistemul VITEK Biomerieux (VITEK GPI), etc.
Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
L. welshimeri
L. seeligeri
L. innocua
L. ivanovii
L. murrayi
Caracteristica
L. grayi
L.
β-hemoliză - - + + - + -
Testul Camp (S. aureus) - - - + - + -
Testul Camp (R. equi) - - + - - - -
Nitrat reductază - - - - + V V
Amidon + - - - + N N
Ramnoză - V - + V - V
Xiloză - - + - - + +
Manitol + - - - - - -
Hipurat - + + + V V
V - Variabil
N - Nedeterminat
Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
GENUL BACILLUS
Bacillus cereus
Bacteriile aparţinând genului Bacillus sunt bacterii Gram+, mobile, cu celule de formă
cilindrică, cu dimensiuni diferite, cu capetele drepte sau rotunjite, singulare sau asociate în
unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanţuri. Sporii nu se colorează prin colorare Gram, sunt
sferici sau ovali, cu diametru mai mic sau egal decât al celulei, fiind poziţionaţi central sau
terminal.
Aptitudinea de a sporula poate fi pusă în evidenţa prin testul termorezistenţei (10 min la
temperatura de 80°C). Bacteriile genului Bacillus sunt catalazo+, aerobe sau anaerobe. Se
clasifică în funcţie de morfologia sporului studiat prin examen microscopic sau în funcţie
de mai multe criterii, care includ caracterul respirator sau fermentativ, termofilia, etc.
TEHNICI DE IZOLARE
Izolarea şi numărarea bacteriilor sporulate aerobe se pot aplica fie formelor sporulate
singure, fie ansamblului de forme vegetative şi sporulate, astfel încât, de multe ori se
realizează doar izolarea sau numărarea.
Proba plasată într-o eprubeta este supusă unei încălziri de 10 min pe baie de apă, la o
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
temperatură de 70-80°C. Aceasta serveşte apoi la efectuarea unei serii de diluţii destinate
numărării bacteriilor pe mediu cu geloză, în plăci Petri. În unele cazuri particulare tratamentul
termic se poate face prin menţinere timp de 10 min la temperatura de 100°C. În acest caz,
sporii supravieţuitori corespund speciilor termorezistente.
Mediul de izolare şi de numărare al bacteriilor sporulate aerobe selectate prin tratament termic
nu trebuie să fie specific, deoarece, practic, sporii de bacterii din genul Bacillus, care au
rezistat tratamentului termic şi pot apoi să se dezvolte în condiţii aerobe, nu mai au concurenţi.
În continuare, este necesar să se utilizeze un mediu bogat, care să favorizeze germinarea
sporilor. Uneori, sporii manifestă fenomenul de repaus, ceea ce generează o întârziere a
dezvoltării lor. Fenomenul este limitat prin adăugarea în mediu a amidonului, compus care
poseda proprietăţi de stimulare a germinării şi de detoxificare.
Pentru numărare sau izolare pe mediu solid, cel mai frecvent folosite sunt geloza
glucozată conţinând BCP sau laptele gelozat, aceste două medii fiind îmbogăţite cu 0.2%
amidon solubil. Geloza nutritivă obişnuită cu gălbenuş de ou permite diferenţierea
speciilor lecitinazo + şi -. Termostatarea diferenţiată a mediilor permite selecţionarea
următoarelor grupe de bacili: bacili mezofili (termostatare la temperatura de 30°C) şi bacili
termofili (termostatare la temperatura de 55°C).
Numărarea în mediu lichid pe bulion glucozat cu BCP sau bulion TSB (bulion triptonă soia)
este mai puţin specifică, fiind urmarea unui anumit grad de anaerobioză care poate să
existe la baza eprubetelor.
Pentru numărarea formelor vegetative (numărare realizată pentru anumite specii) trebuie
să facă apel la medii mai selective sau de diferenţiere.
! Mossel a descris un mediu de izolare pentru Bacillus cereus, care este bazat pe
prezenţa manitolului, clorurii de sodiu, roşului de fenol, gălbenuşului de ou şi polimixinei.
Coloniile de Bacillus cereus sunt rugoase, uscate, roz (manitol -) şi înconjurate de un
halou albicios (produşi de hidroliză insolubili formaţi pornind de la lecitină). Alte medii se
bazează pe un principiu asemănător (geloză manitol - gălbenuş de ou - polimixina MYP).
Mediul PEMBA (polimixina - gălbenuş de ou - manitol - albastru de bromtimol - agar),
mediu selectiv pentru B. cereus, poate fi şi el utilizat: B. cereus formează colonii albastre,
dantelate, înconjurate de un precipitat de gălbenuş de ou. Mediul Reuter conţine piruvat,
tiocianat, actidionă şi gălbenuş de ou.
TEHNICI DE IDENTIFICARE
Capacitatea de sporulare
Pentru caracterizarea sporilor sunt utilizate mai multe colorări specifice, dintre care citam doar
două:
metoda Bartholomew şi Mittwer - frotiul fixat termic (20 de treceri ale lamei prin
flacără) este colorat timp de 10 min cu ajutorul unei soluţii apoase, saturate, de verde
malahit, apoi spălat rapid, timp de 10 min, cu apă rece. Frotiul este recolorat cu safranină
25% timp de 15 min, apoi este spălat rapid cu apă, uscat şi examinat. Sporii sunt coloraţi
în verde, iar corpul bacterian în roşu. Această metodă este mai practică, dar este mai
puţin sigură decât precedenta.
Caractere fiziologice
tipul respirator - este studiat prin inocularea unei geloze profunde VF sau pe
mediu glucozat în anaerobioză. Acest test constă în inocularea unui bulion cu extract de
drojdie şi glucoza (YG) dintr-o eprubetă, după regenerare. Suprafaţa mediului se acoperă
cu un strat de parafină lichidă. După termostatare se observa dezvoltarea.
Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
hidroliza lecitinei - este studiată în mod clasic, prin inocularea unei geloze
nutritive obişnuite cu gălbenuş de ou (10%) sau pe mediu McLung. Acest mediu
termostatat în anaerobioză permite diferenţierea bacteriilor Bacillus şi Clostridium prin
reacţia LV legată de haloul caracteristic obţinut: tulpinile LV+ formează precipitat şi o zonă
luminoasă (reacţia Nagler la lecito-vitelina);
Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
GENUL CLOSTRIDIUM
Clostridium perfringes
Bacteriile aparţinând genului Clostridium sunt bacterii Gram +, mobile, cu celule de formă
cilindrică cu dimensiuni mai mari decât cele din genul Bacillus, singure sau în lanţuri, care
formează endospori dispuşi central sau terminal, care dau celulelor formă de suveică sau
paletă.
Reprezentanţii genului Clostridium sunt catalazo - şi sunt strict anaerobi. Totuşi, câteva
specii rare sunt aero-tolerante.
TEHNICI DE IZOLARE
Tehnici generale
Bacteriile sporulate anaerobe sunt cultivate pe medii foarte reducătoare, cum ar fi mediul
VL sau VF (lichid sau semi-solid) sau chiar pe medii lichide protejate de oxigenul din aer
printr-un strat de parafină: mediu Rosenow simplu sau cisteinat, eventual adiţionat cu
amidon, sau mediu RCM (Reinforced Clostridium Medium sau mediul Hirch şi Grinsted).
Acest ultim mediu este folosit ca diluant pentru operaţia de numărare.
Principiul de izolare şi numărare al bacteriilor din genul Clostridium este foarte apropiat de cel
indicat pentru bacteriile genului Bacillus. În afara de termorezistenţa sporilor, selecţia este
bazată pe cultivarea în anaerobioza strictă (sau în mediu foarte reducător). Sunt utilizate
tehnicile clasice de cultivare în anaerobioză: condiţiile de anaerobioză trebuie respectate
atât pentru cultivări, cât şi pentru diluări. Temperatura de termostatare variază între 30 şi
37°C, în cazuri particulare fiind mai mare.
Pentru numărare se utilizează fie tehnica pe mediu lichid sau solid în eprubetă,
folosind un mediu reducător sau protejat de parafină, fie tehnica de numărare pe mediu
solid în plăci Petri, termostatate în anaerobioză. Aceasta ultima metodă este preferabilă,
deoarece facilitează prelevarea coloniilor izolate pentru studiile ulterioare.
Selecţia formelor sporulate este realizata prin încălzire timp de 10 min la temperatura de
80°C. Când termorezistenţa sporilor este scăzută sau când se doreşte să se tină cont de
celulele vegetative, nu este posibilă utilizarea acestei tehnici. În acest caz, va trebui să se
folosească medii conţinând compuşi inhibitori specifici, permiţând astfel dezvoltarea
speciilor de Clostridium (de ex. antibioticele). Sporii tuturor speciilor de Clostridium pot fi
Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
izolaţi şi număraţi după încălzirea necesară realizării selecţiei, prin inoculare în mediul
RCM gelozat (geloză Hirch şi Grinsted) adiţionat cu amidon şi repartizat în eprubete sau
plăci Petri (în acest caz, termostatarea trebuie să aibă loc obligatoriu în mediu anaerob).
Pentru numărări în medii lichide se poate utiliza mediul Rosenow sau alte medii lichide
enunţate mai sus.
Izolări specifice
Există medii de izolare relativ specifice pentru grupele de Clostridium, adaptate sporilor şi,
uneori, celulelor vegetative.
Există medii bazate pe acelaşi principiu, care sunt specifice pentru Clostridium perfringens
şi care, prin compoziţia lor chimică, permit evitarea pasteurizării şi selecţionarea deodată
a formelor vegetative şi a sporilor. Este vorba de mediul TSN Marshall cu neomicina şi
polimixină, care este termostatat la temperatura de 46°C, mediul SPS Angelotti cu
polimixină şi sulfadiazină, care este termostatat la temperatura de 37°C, sau de mediul
TSC triptoză - sulfit - cicloserină, care este termostatat la temperatura de 46°C.
Termostatarea se efectuează în anaerobioză (eventual, cu îmbogăţire de CO2):
coloniile colorate în negru sunt colonii prezumtive de Clostridium perfringens. Se poate
confirma apartenenţa la specie prin teste simple: nitrat reductazo +, lactozo+, gelatino+.
Confirmarea se poate face repicând coloniile pe geloza Willis şi Hobbs cu ou, plasată
într-o placă Petri, pe a cărei jumătate din suprafaţă se depun câteva picături de ser anti -
Clostridium perfringens (6000 unităţi/ml). Coloniile care nu se vor dezvolta pe mediul
adiţionat cu toxine sunt desigur Clostridium perfringens.
TEHNICI DE IDENTIFICARE
Identificarea lui Clostridium este bazată pe studiul morfologiei sporilor şi caracterelor
biochimice. Termostatarea are loc obligatoriu în mediu reducător sau în anaerobioză, în
general la o temperatura de 30-37°C timp de 24-48 h. Unele specii trebuie termostatate la
temperaturi superioare. Nu mai precizam că aceasta cultură trebuie să aibă loc în
anaerobioză, deoarece acest fapt nu mai este necesar, ca urmare a puterii reducătoare a
mediului utilizat. Mediile studiate sunt inoculate pornind de la o cultură pe mediu lichid
reducător, de exemplu bulion VL sau VF , conţinând cistină (sau pe mediu Rosenow).
Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
Acesta este un mediu lichid reducător recomandat pentru cultivarea bacteriilor anaerobe.
Conţine, printre altele, peptonă, glucoză, un indicator colorat, un fragment redus de creier şi
o bucăţică de marmura albă. După o regenerare de 15 min realizată pe baie de apă la
fierbere şi răcire, mediul este inoculat şi acoperit cu un strat de parafină sterilă, care asigură
anaerobioza. După o termostatare de 24 h sau mai mult, examinarea acestui mediu
permite studierea următoarelor caracteristici:
fermentaţia glucozei se indică prin virajul indicatorului de la roz la roşu: acest viraj
trebuie să fie observat la începutul cultivării. Virajul indicatorului la verde indică
prezenţa bacteriilor reducătoare;
Mobilitatea
Mobilitatea este observată între lamă şi lamelă, pornind de la o prelevare efectuată din
mediul Rosenow. Prelevarea trebuie efectuată la formarea biomasei de celule, iar
examinarea trebuie realizată rapid, deoarece contactul cu aerul inhibă rapid mobilitatea.
Morfologia sporului
Morfologia sporului este studiată prin examen microscopic pe un frotiu colorat Gram sau
prin colorarea specifică a sporilor. Examenul poate fi realizat pornind de la o cultură mai
veche obţinută în mediul Rosenow. Sporularea nu intervine în toate mediile. Sporii nu se
formează uneori decât pe medii uşor alcaline. Unele bacterii sporulează greu în mediu
artificial: este cazul lui Clostridium perfringens care trebuie cultivat pe ser din carne de cal
cu 0.5% extract de came şi 0.1% sulfat de magneziu.
Hidroliza gelatinei
Hidroliza gelatinei este studiată utilizând un disc de gelatină Kohn cu cărbune, care se
plasează pe mediul Rosenow. După termostatare, degradarea gelatinei este indicată de
eliberarea particulelor de cărbune. Anaerobioza se obţine cu ajutorul unui strat de parafină.
Se poate efectua experimentul şi într-o placa Petri, în anaerobioză, folosind geloza
Columbia îmbogăţită cu albumină serică bovină.
Pag 7
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
Acest studiu este realizat cu ajutorul medii lor VL, VF sau TY semisolide. Mediul este
regenerat înainte de folosire şi se completează cu unul din următoarele glucide, adăugate în
proporţie de 1%: maltoză, lactoză, zaharoză, manitol, xiloză, glicerol, amidon şi eventual
alţi compuşi. Nu este necesară parafinarea acestui mediu reducător, cu condiţia ca el să
aibă o suprafaţă de contact cu aerul extrem de redusă (eprubetă mică). După 24 h sau
mai mult de termostatare la temperatura de 37°C, se introduc în mediul de cultură 10
picături dint-un indicator de pH, pentru a sesiza dacă exista aciditate sau nu. Cu
indicatorul universal Prolabo, acidifierea este indicată de virajul în roşu al mediului, când
cantitatea de acid este mare, sau în galben, când cantitatea produsă este mică. Este
recomandat să se inoculeze şi o eprubetă fără glucid, ca martor.
Producerea indolului
Este pusă în evidenţă prin cultivarea pe mediu VL sau VF semisolid în eprubete, apoi prin
caracterizare cu reactivul Kovacs sau Ehrlich. Inocularea mediului este realizată în masă,
după regenerare, dar fără amestecare, astfel încât inoculul să rămână pe fundul eprubetei,
sau prin înţepare centrală profundă.
Producerea de H2S este pusă în evidenţă pe mediul VL (sau VF) semisolid sau solid,
îmbogăţit cu 0.2 g/l sulfat feros şi cu 0.3 g/l hiposulfit de sodiu. Producerea hidrogenului
sulfurat provoacă înnegrirea mediului. Se pot utiliza geloze "sulfit" sau "sulfit-fier".
Caracterul hemolitic
Caracterul hemolitic este determinat prin inocularea pe suprafaţa unui mediu solid îmbogăţit
cu 10% sânge de oaie sau de cal defibrinat sau cu citrat, care este apoi termostatat, în
anaerobioză, la temperatura de 37°C.
Producerea acetoinei
Acetoina este evidenţiată după cultivare pe mediu lichid VL (sau VF) prin reacţia Voges
Proskauer. Pe mediul gelatina-lactoză, după 24 h de termostatare la temperatura de 37°C,
prezenţa gazului, acidifierea (îngălbenirea) şi lichefierea gelatinei sunt puse în evidenţă
pentru C. perfringens.
Pag 8
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE
Pag 9