INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA

DE BIOTECNOLOGÍA

PRODUCCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE UN ANTIBIÓTICO

POR ELECTROFORESIS CAPILAR

INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA

MODALIDAD DE:

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

INGENIERO BIOTECNOLÓGO

PRESENTA:

LEÓN LEÓN CLAUDIA

Director del Proyecto: M. en C. Yolanda de las Mercedes Gómez y Gómez.

Evaluadores: Dra. Olivia Franco Hernández
Dr. Edgar Salgado Manjarres

México, D.F. Mayo 2008

Agradecimientos

Le doy gracias a Dios antes que a nadie por darme la oportunidad de existir por
brindarme una familia tan hermosa que siempre esta conmigo apoyándome en las
buenas y en las malas, por guiarme por el camino correcto, y permitirme conocer
amigos que no se cambian por todo el oro del mundo.

A mis Padres

Por amarme quienes sin escatimar esfuerzo alguno, han sacrificado gran parte de su
vida para formarme y educarme y llegar a ser lo que hasta el momento soy. Por las
desveladas constantes que pasaron a mí lado enseñándome que nunca hay que
rendirse por difíciles que parezcan las cosas aunque tropiece hay que levantarse y
seguir luchando.

A mis Hermanos

Gracias a mis hermanitos Karina y Marco porque siempre han estado junto a mí
cuando mas los necesite brindándome palabras reconfortantes y muchas alegrías.

A la M en C. Yolanda de las Mercedes Gómez y Gómez

Que fue la base primordial de este trabajo, pues gracias a su apoyo, dedicación,
paciencia, enseñanza y esfuerzo me impulsaron a salir adelante
Inculcándome defender mis ideales y luchar por ellos, por transmitirme todos sus
conocimientos, y guiarme para el desarrollo de este proyecto.

A la Ing. Verónica Chávez Infante

Por su apoyo y paciencia durante todo este tiempo, por sus enseñanzas por permitirme
conocerla y ver la gran persona que es; gracias por alentarme en los momentos mas
difíciles. Siempre recordare que “todos los días se aprende algo nuevo”.

A la Maestra María Esther Bautista Ramírez

Por su ayuda desinteresada para la elaboración de este trabajo, por sus consejos y
enseñanzas que me sirvieron para una mejor presentación del mismo.

A todos mis grandes Amigos

Laura, Diana, Lorena, Selene, Jonás, Yuri, Johana, Cristian, Cesar, Oscar, por
apoyarme incondicionalmente y por que su amistad ha servido como columna para
sostener lo que conlleva el estar en esta Institución
A Luis por mostrarme siempre su cariño, apoyo, compresión, aliento y confianza para
la culminación de este proyecto, por aparecer cuando menos lo esperaba y mostrarme
que todo se puede en esta vida trabajando con dignidad y dedicación.

Claudia
INDICE
Página

1. Resumen...………...…..……….………...………………………………….….….1

2. Introducción…………………….....……………………………………….…..….2

2.1. Penicilina…………………..………………………………………....…….……2

2.1.1 Mecanismo de acción……………………………….……….………..…....4

2.1.2 Mecanismo de resistencia……..……………………………………..….…4
2.1.3 Producción de penicilina…………………………………….....….….…....5

2.2. Fermentación Sólida…………………………………………………….…......5

2.2.1 Ventajas y desventajas de la FEO comparada con el cultivo

sumergido en líquido……………………………………………………...……….6
2.2.2 Influencia de factores ambientales en la FES………………..….….……7
2.2.3 Humedad y la actividad del H2O………………………………………...…7
2.2.4 pH……………………………………………………………………..…...….8
2.2.5 Temperatura……...…………………………………………………….……9
2.2.6 Concentración y disponibilidad del sustrato…………………………….10
2.2.7 Aireación……………..……………………………...……………………...10
2.2.8 El tamaño de partícula…………………………………………………….11
2.2.9 El inóculo…………………………………………………………….…......11
2.2.1.0 Cinética y actividad metabólica del cultivo batch…………………….11

2.3. Electroforesis Capilar……..………………………………………………….13

2.3.1 Principio de separación…………………………………………………....13

2.3.2 Instrumentación…………………………..…………….……………….….15
2.3.3 Ventajas de la Electroforesis Capilar………………………………..…...16
2.3.4 Diferencias entre los tipos de Electroforesis Capilar………….….….…17
2.3.5 Aplicaciones…………………………………………………………...……18

3. Objetivos………………..…………………………………………..….…………19

4. Justificación………….……………………….…………….…………….……...19

5. Metodología…………….……………………..……..…………………….……..20

6. Resultados y discusión………………………………………………….……..27

7. Conclusiones…………..………………………………………………….……..41

8. Bibliografía….……………………………………………………………….……43
ÍNDICE DE FIGURAS
Página

FIG.1 Morfología colonial de Penicillium..................................................................2

FIG.2 Estructura básica de penicilina.......................................................................3

FIG.3 Proceso de separación electroforético.........................................................12

FIG.4 Representación del principio de separación de los grupos silanol en el

Capilar de sílice fundida…...…..……………………………….……...……………….14

FIG.5 Sistema general de Electroforesis……………………………..……….………15

FIG.6 Salvado usados para la fermentación sólida …………………..……….…….23

FIG.7 Medios para la producción de Penicilina …….…………………………….…23

FIG.8 Bioensayo en placa……………………...……………………………..……….26

INDICE DE GRAFICOS

GRAFICO .1 Determinación de pH para fermentación líquida….…………….…....28

GRAFICO .2 Determinación de Biomasa para fermentación líquida………….……28

GRAFICO .3 Curva Estándar de Azúcares reductores………………………………29

GRAFICO .4. Determinación de Azúcares reductores para fermentación líquida

………………………………………..………………….……………..…….…………....31

GRAFICO .5 Determinación de pH para fermentación sólida………..…………..…32

GRAFICO .6 Determinación de Humedad para fermentación sólida………...........33

GRAFICO .7 Determinación de Azúcares reductores para fermentación sólida

……………………………………………………………………………….………….....35

GRAFICO .8 Determinación de curva tipo de penicilina…………………..………...36

GRAFICO .9 Barrido de penicilina estándar 1mg/mL………...………….………..…37

GRAFICO.10 Análisis de linearidad para datos de penicilina……..….………...…..38

GRAFICO.11.Electroferograma de detección para penicilina………………....……39

GRAFICO.12.Electroferograma de muestras de penicilina obtenidas durante

fermentación sumergida…………………….……………………………….…………..40
ÍNDICE DE TABLAS

Página

TABLA.1 Parámetros cinéticos de Fermentación líquida para Penicillium

chrysogenum …………………………………………………………….……………….27

TABLA.2 Parámetros cinéticos de Fermentación líquida para Penicillium expasum

……………………………………………………………..………………………..……..27

TABLA.3 Curva Estándar de azúcares reductores…………..……………………...29

TABLA.4. Concentración de azúcares reductores en Fermentación Líquida para

P. chrysogenum……………………………………………………………………….….30

TABLA.5 Concentración de azúcares reductores en Fermentación Líquida para P.

expansum………….……………………………………………….………………..……30

TABLA.6 Parámetros cinéticos de Fermentación Sólida por Penicillium

chrysogenum…………………………………………………………………………...…31

TABLA.7 Parámetros cinéticos de Fermentación Sólida por Penicillium

expansum……………………………………………………………………………...….32

TABLA.8 Determinación de azúcares reductores en Fermentación sólida para P.

chrysogenum…………………………………………………..……………………….…34

TABLA.9 Determinación de azúcares reductores en Fermentación sólida para P.

expansum……………………………………………………………………………….…34

TABLA.10. Curva tipo de Penicilina……..………………………………….……..…..35

TABLA.11. Resultados obtenidos para las diluciones de Penicilina G…….………38

 PRODUCCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PENICILINA POR ELECTROFORESIS CAPILAR

Claudia León León, Yolanda de las Mercedes Gómez y Gómez *

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología-IPN, ygomezipn@hotmail.com Tel 75296000 Ext. 56342

Palabras clave: penicilina G, electroforesis capilar, P. chrysogenum

Introducción. La penicilina es un antibiótico de los grupos de los Durante el análisis por EC se obtuvo una buena detección de
beta-lactamicos, se produce por fermentación, utilizando Penicillium Penicilina G en un tiempo de 3.7 min en las condiciones probadas
chrysogenum o P. notatum y los métodos de análisis incluyen que equivalen a 900 µ g/mL, donde el limite de detección obtenido
ensayos microbiológicos, titulaciones yodométricas o fue de 6.25 µ g/mL.
potenciométricas o bien ensayos cromatograficos. Una vez establecida la metodología y las variables para la detección
La electroforesis capilar (EC) es una técnica de gran importancia, de penicilina se procedió a determinar las muestras de la
utilizada en diversas áreas de investigación y en muchas industrias fermentación de penicilina. Estas se identificaron satisfactoriamente
como biotecnológica, farmacéutica, alimenticia y medioambiente, con una pequeña variación de la concentración y un leve
ofrece ventajas como son tiempos cortos de análisis, utiliza desplazamiento de tiempo de detección.
pequeñas cantidades de muestra y el uso de pequeñas cantidades
de fase móvil que además de ser un ahorro en reactivos representa 0.20 PDA - 200nm
pen1
PDA - 200nm
mu1219/12/2007 08:35:16 a.
PDA - 200nm
mu12aa19/12/2007 08:46:42 a.
0.20

menor contaminación al ambiente comparado con las técnicas 0.18 pen1.dat mu12.dat mu12aa.dat
0.18

mencionadas anteriormente. Es una técnica de separación basada 0.16 0.16

en la velocidad de migración de las distintas especies cargadas bajo 0.14 0.14

la acción de un campo eléctrico. El equipo tiene una fuente de
0.12 0.12
voltaje, sistema de detección UV y sistema de análisis.
Esta investigación pretende mostrar la capacidad de la técnica para AU

AU
0.10 0.10

resolver problemas en el área de investigación concernientes con 0.08 0.08

análisis y cuantificación de penicilina G. 0.06 0.06

Objetivo. Desarrollar y adaptar un método analítico para el 0.04 0.04

monitoreo en la producción de penicilina G utilizando Penicillium 0.02 0.02

chrysogenum.
0.00 0.00
Metodología. El medio de producción utilizado consta básicamente 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Minutes
de lactosa, agua de cocimiento de maíz, farmamedia y sales Figura 1. Detección del estándar de Penicilina G (negro) y de dos de
minerales, se añadió acido fenilacetico al 0.05%, se realizaron las muestras de la fermentación (azul y rosa)
determinaciones de consumo de azucares (DNS), pH, biomasa
(peso seco) y bioensayo en placa. Para su detección por Conclusiones y perspectivas. Los resultados de esta investigación
electroforesis capilar se utilizo un equipo Beckman P/ACE MDQ demuestran que fue posible la producción y el establecimiento de la
Capillary electrophoresis system utilizando un buffer de fosfatos metodología adecuada para la detección de penicilina G por
10mM, pH 7.0,un capilar de sílice de 50 cm y 75 micras de diámetro, electroforesis capilar con buena resolución y amplitud en los picos
aplicando un voltaje de separación de 20 kV e inyección detectados, en tiempos cortos de análisis.
hidrodinámica 0.5 psi 5seg y fue detectada a 200nm. El método analítico desarrollado permitió la identificación de
Resultados y discusión. Se obtuvo una producción considerable de penicilina producida en las fermentaciones en estado sólido y
penicilina en las fermentaciones realizadas con Penicillium líquido, además de la cuantificación de esta con la metodología
chrysogenum durante las 72 y 96 horas en un intervalo de establecida dando una buena resolución y especificidad en los
producción de 0.77-1 U/mL, monitoreando cada uno de los resultados.
parámetros como lo es pH, humedad y temperatura para obtener Se pretende realizar posteriormente técnicas de preconcentración
una mayor producción y evitar que se inactive por hidrólisis. para aumentar los límites de detección.
En la tabla 1 se puede observar el promedio de área y tiempo de Agradecimientos. M. en C. Yolanda Gómez y Gómez, a la maestra
detección obtenidas en las diluciones empleadas para observar la María Esther Bautista Ramírez y a la Ing. Verónica Chávez Infante
concentración de cada una de las muestras. Referencias.
1. Altria Kevin D.; Creasey E.; Howells J.S.,1998 Routine capillary
Tabla 1. Tiempo de detección y áreas de las diluciones realizadas electrophoresis trace level determinations of pharmaceutical and
de penicilina G estándar detergent residues on pharmaceutical manufacturing equipment.
Dilución Concentración Promedio Promedio Journal of liquid chromatography, 21, pp.10931105
mg/mL Área (AU) Tm (min) 2. Barber M. S. 1993. The Manufacture of Penicillin; Pharmaceutical
D0 0.1 97729 3.715 Manufacturing International; Sterling Publications Limited; Londres,
D1 0.05 48379 3.825 Inglaterra.119-123
D2 0.025 23770 3.938 3. Rivera, A.L., Vargas M., 2002. El uso de la electroforesis capilar
D3 0.0125 11542 3.991 en la industria farmacéutica, Parte II, Revista Mexicana de la
D4 0.0065 5346 4.008 Asociación Farmacéutica, Vol. 34 pp18-25.

1
 UPIBI-IPN

2. INTRODUCCIÓN

Los antibióticos son por definición moléculas con actividad antimicrobiana, que incluyen
una gran cantidad de compuestos pertenecientes a diferentes familias químicas. Son
metabolitos secundarios que inhiben el crecimiento de otros organismos incluso cuando
se les utiliza a bajas concentraciones. Los primeros procesos para la producción de
penicilina, que fue el primer antibiótico conocido, implicaban el crecimiento de Penicillium
notatum sobre la superficie de un medio líquido (Czapek-Dox-glucosa). El período de
incubación era usualmente de 6-12 días y posteriormente la penicilina se extraía con
solventes previa separación del micelio. Los antibióticos pueden ser clasificados de
acuerdo con su espectro antimicrobiano, mecanismos de acción, cepa productora, forma
de biosíntesis o estructura química.

2.1 PENICILINA

Las penicilinas son producidas por hongos, particularmente especies de Penicillium y

Aspergillus. Las penicilinas naturales son efectivas contra numerosas bacterias Gram
positivas. Son lábiles en medio ácido y pueden ser inactivadas por hidrólisis del anillo β-
lactamico con penicilinazas. Debido a su baja toxicidad pueden ser utilizadas en
grandes dosis de penicilina; solamente un pequeño porcentaje de pacientes desarrolla
alergia.

Fig.1 Morfología colonial de Penicillium

2
 UPIBI-IPN

Los antibióticos β-lactamicos son inhibidores específicos de la síntesis de la pared

celular bacteriana (peptidoglicano). Se combinan específicamente con las denominadas
proteínas que unen penicilina (PBP) de la célula bacteriana e inhibiendo la actividad
enzimática de estas proteínas producen la muerte celular.

Su estructura básica es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), que consiste en un anillo

tiazolidinico con un anillo β-lactámico condensado. El 6-APA lleva una mitad variable
acilada en la posición 6, como se muestra en la figura 2. (Crueguer Wulf, 1993, Pp.263-
275).

Fig. 2 Estructura básica de penicilina

La historia de las innovaciones en la producción de penicilina comenzó en 1945 con el

descubrimiento de una nueva especie, P. chrysogenum, la cual permitió incrementar los
rendimientos del producto y trabajar en cultivo sumergido empleando lactosa como
fuente de carbono y energía, y agua de macerado de maíz (corn-steep liquor) como
fuente de nitrógeno. De esta época es también el hallazgo de que precursores tales
como el fenilacetato incrementan los rendimientos del antibiótico, produciéndose en este
caso predominantemente penicilina G en lugar de una mezcla de distintos tipos.

Las distintas penicilinas son producidas a partir de P. chrysogenum por adición de una
apropiada cadena carboxílica en cantidad adecuada en el medio de cultivo, pero
solamente tienen valor terapéutico la penicilina G y la V. Ambas tienen un espectro y
actividad similar, pero la penicilina V es más estable a pH ácido, lo que permite su
administración por vía oral.

La producción de penicilina como otros procesos biotecnológicos está dominada por su

aspecto competitivo entre los grandes laboratorios productores, que realizan
permanentes esfuerzos de mejoramiento en cada área del proceso: cepa, fermentación
y separación.

3
 UPIBI-IPN

El proceso implica el cultivo de P. chrysogenum en reactores de volumen creciente hasta

una escala de 500.000 l, separación del micelio por filtración y extracción del antibiótico
del caldo, seguida por la cristalización o precipitación ácida del mismo (Sargantanis,
1994, Pp. 149-158).

2.1.1 Mecanismo de acción

La penicilina interfiere en la síntesis de la pared celular y en el medio relativamente

hipotónico en que viven normalmente los microorganismos, ello causa tumefacción y lisis
de las células, por lo tanto, la penicilina es bactericida. Estudios muy complejos han
demostrado que la penicilina actúa inhibiendo la formación de uniones transversales
peptidicas en la etapa final de la síntesis de la pared. Puede considerarse que las
penicilinas están compuestas de dipéptidos ascilados de L-cisteína y L-valina. Se ha
sugerido que la unión L-cisteína-D-valil en el anillo β-lactamico de la penicilina actúa
como análogo de la porción L-alanil-c-D-glutamil de la cadena pentapeptidica de la
pared celular y que bloque la parte de la enzima transpeptidasa que se combina
normalmente con esta porción del sustrato. Sin embargo, este mecanismo no explicaría
que el grupo carboxilo de la molécula de la penicilina sea esencial para la actividad
antibacteriana completa. Otra de las explicaciones que han sugerido gira alrededor de
un hecho: la D-alanina terminal del pentapéptido de la pared celular tiene el único grupo
carboxilo libre que pudiera semejarse al de la molécula de penicilina, y los modelos
moleculares indican que una de las posibles conformaciones de la acil-D-alanil-D-alanina
es muy similar a la de la penicilina. Se ha dicho que la penicilina activa la enzima
transpeptidasa uniéndose a ella y asilando el sitio que normalmente se une a la porción
D-alanil-D-alanina de la cadena pentapeptídica. (Neway O., 1998 Pp. 20;Barber, 1997,
Pp.111-119)

2.1.2. Mecanismo de resistencia

Las bacterias pueden tener resistencia natural a la penicilina o adquirirla después de

exponerse a ella. Tratándose de la penicilina en la mayor parte de los casos la
resistencia in vivo depende de la producción de β-lactamasa (penicilinasa) por los
gérmenes resistentes. Las penicilinas son elaboradas por una variedad de
microorganismos que incluyen estafilococos resistentes a la penicilina, algunas cepas
E.Coli, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Vibrio, Mycobacterium y Brucilla. Sin
embargo, Streptococcus pneumonie y Streptococcus pyogenes no poseen resistencia
natural ni la adquieren. (Bowman, W.C., 1984, Pp.34.24-5)

4
 UPIBI-IPN

2.1.3 Producción de Penicilina

En la industria la producción de penicilina se lleva acabo por una fermentación

sumergida. Esta fermentación consta de las siguientes etapas:

• Fermentación
• Separación del micelio del caldo fermentado y extracción de la penicilina por medio
de disolventes.
• Purificación con disolventes y formación de la sal sodica de la penicilina.
• Ensayos de control, almacenamiento y venta.

El caldo de cultivo para la fermentación se obtiene por infusión acuosa de maíz,

añadiendo de un 2 a un 3 % de lactosa, y también se adicionan compuestos inorgánicos
conteniendo hidrogeno, oxigeno, fósforo, azufre, potasio, magnesio, nitrógeno y trazas
de hierro, cobre y zinc. La adición de ciertos compuestos que favorecen el crecimiento
del hongo debe evitarse, ya que podrían ser tolerados al administrar el producto, ni su
eliminación seria económica.

Después de ajustar el pH a 4,5 - 5,0, el medio de cultivo se pasa al fermentador, que

esta equipado con un agitador vertical, con un sistema de introducción de aire
esterilizado por filtración y con serpentines para mantener la temperatura deseada. El
hongo se introduce por medio de conducciones estériles y con ayuda de aire a presión.
Durante el crecimiento el medio se esteriliza con vapor a presión, y la temperatura se
mantiene entre 23 y 25 ºC. El aire estéril permite el crecimiento del hongo aerobio, y la
agitación facilita su uniforme distribución en el seno del líquido. Se requiere un volumen
de aire por minuto y por volumen de medio de cultivo. El proceso se controla intervalos
que oscilan entre 3 y 6 horas; al cabo de unas 50 a 90 horas el crecimiento se va
haciendo más lento, lo que indica que el hongo se ha desarrollado por completo. La
masa se enfría a 5 ºC a causa de la inestabilidad de la penicilina a la temperatura
ambiente, y se separa el micelio en un filtro de tambor rotatorio (Barber M.S., 1997,
Pp.119-123)

2.2. Fermentación sólida (FES)

"Es un método de cultivo de microorganismos sobre y/o dentro de partículas sólidas". El

líquido ligado a las partículas sólidas debe estar en una cantidad que asegure la
actividad del agua adecuada para el crecimiento y el metabolismo de los
microorganismos, pero sin exceder el máximo poder de retención de este líquido en la
matriz sólida.

5
 UPIBI-IPN

Una definición mas general plantea que "es un proceso microbiológico que ocurre
comúnmente en la superficie de materiales sólidos que tienen la propiedad de absorber
y contener agua, con o sin nutrientes solubles". Esta definición abarca a procesos donde
el soporte sólido es inerte y los sustratos que utiliza el microorganismo pueden ser
sustancias solubles en agua, como el proceso de bioconversión de etanol y el
crecimiento de Cándida utilis sobre amberlita (Losane B., 1995, Pp. 134).

2.2.1 Ventajas y desventajas de la fermentación en estado sólido comparada con el

cultivo sumergido en líquido.

• Los medios de cultivo son simples, generalmente subproductos agrícolas que

presentan un alto contenido de los nutrientes necesarios.
• La baja actividad del agua es de gran ayuda para evitar las contaminaciones,
especialmente de bacterias y levaduras.
• La concentración natural del sustrato permite utilizar reactores más pequeños en
comparación con los utilizados en otro tipo de fermentación. Tienen mayor
productividad volumétrica.
• La aireación forzada es facilitada por la porosidad del soporte, lo que permite una
alta transferencia de oxígeno al microorganismo.
• Pueden emplearse, frecuentemente conidios como inóculo en los procesos de
crecimiento de hongos, lo cual disminuye los costos y las manipulaciones en la
preparación del inóculo.
• Los conidios de los hongos que se producen son mucho más resistentes y tienen
mejor adaptabilidad a las condiciones en las que se aplican como agente de
biocontrol.
• El proceso de recobrado es simplificado. Algunos productos son utilizados
integralmente, como alimento animal, productos para el control biológico, etc.
• Los procesos se consideran generalmente como tecnologías limpias.
• Entre las principales desventajas se encuentran:
• Su aplicación se limita a microorganismos que crecen en bajos contenidos de
humedad.
• La extracción del calor metabólico puede ser un problema, sobre todo cuando se
trabaja a gran escala y no se controla el proceso.
• La naturaleza sólida del sustrato trae problemas al medir los parámetros de la
fermentación tales como el pH, la temperatura, el contenido de humedad y la
concentración de sustrato y productos.
• Los procesos de transferencia de masa son limitados por la difusión.

6
 UPIBI-IPN

• Muchos aspectos ingenieriles como el diseño de reactores y el escalado están

muy poco caracterizados.
• El tiempo de fermentación es mayor debido a que generalmente se utilizan
microorganismos que presentan bajas velocidades específicas de crecimiento.

Es bueno recalcar que algunas de estas desventajas son relativas, por ejemplo, el
tiempo de fermentación ya que actualmente se están empleando bacterias en los
procesos de FES.

Para el caso específico del control biológico, en la producción de hongos por

fermentación sumergida, en determinados casos, se obtienen blastosporas, que si bien
son estructuras infectivas, resultan poco resistentes a los cambios de las condiciones
climáticas (temperatura, radiación, humedad, etc.), a diferencia de los conidios que se
producen en las fermentaciones en fase sólida. Se caracterizan las primeras por
presentar cubiertas delgadas y lisas, que influyen negativamente en cuanto a su
eficiencia y persistencia después de las aplicaciones (Raimbault M., 1992, Pp.259-273;
Losane B., 1995, Pp.240-258; Mudgett., 2001, Pp. 66-83)

2.2.2 Influencia de factores ambientales en la fermentación en estado sólido.

Las condiciones ambientales tales como la humedad, la actividad del agua, el pH, la
temperatura, la concentración y disponibilidad del sustrato, la aireación, el tamaño de
partículas y la forma de inoculación afectan significativamente tanto el crecimiento como
la formación de productos. En el cultivo líquido agitado el control de las condiciones
ambientales es relativamente simple, ya que estos sistemas son homogéneos desde el
punto de vista de la concentración celular, nutrientes y productos. Sin embargo se
presentan serios problemas en los sistemas sólidos con el mezclado, la transferencia de
oxígeno, el intercambio de calor y el control de la humedad y el pH, debido,
principalmente, a la heterogeneidad y la consistencia del sistema.

2.2.3 La Humedad y la actividad del agua (aH2O).

El por ciento de humedad en la fermentación sólida puede variar entre 30 y 80%, en

dependencia del sólido utilizado, el microorganismo y el objetivo del proceso (formación
de producto, crecimiento de la biomasa). Aunque el por ciento de humedad es una de
las variables que comúnmente se optimiza en los sistemas de fermentación sólida, hoy
se reconoce que no es solo la cantidad de agua presente en el sistema la que ejerce su
influencia sobre la eficiencia del proceso, sino el carácter de las interacciones entre el
agua y el medio sólido.

7
 UPIBI-IPN

Por eso no es contradictorio observar que un mismo microorganismo se desarrolle

plenamente en dos sustratos diferentes con por cientos de humedad bastante disímiles.
La actividad del agua (aH2O) es el parámetro que se ha utilizado para caracterizar
cuantitativamente esas interacciones físicas y/o químicas del agua en el sistema.

La actividad del agua se define como la humedad relativa de la atmósfera gaseosa en

equilibrio con el sustrato. La humedad relativa de un sistema gas - vapor de agua se
determina por %H. R. = (p H2O / p°H2O) 100, de manera que la actividad del agua es igual
a la relación entre la presión parcial del vapor de agua en la solución gaseosa (p H2O ) en
el estado de equilibrio con el agua adsorbida en el sólido y la presión de vapor del agua
pura (p°H2O ) a esa misma temperatura .

Se demostró que la actividad del agua no sólo ejerce influencia sobre el crecimiento,
sino también sobre la formación de productos y, en muchos casos, el valor mínimo
requerido de aH2O para la formación del producto difiere del necesario para el crecimiento
(Pandey, 1992, Pp. 109-117; Mudgett, 2001, Pp.70)

2.2.4 El pH.

El pH es otra variable que afecta el desarrollo de los procesos de fermentación en

estado sólido, al igual que lo hace en los cultivos sumergidos. Por otra parte, el
mezclado de sólidos es un proceso complejo por lo cual se dificulta el control de esta
variable durante el desarrollo de la fermentación.

El pH cambia por diferentes razones; normalmente disminuye por la secreción de ácidos

orgánicos como acético y láctico durante el proceso. No obstante, la fuente de nitrógeno
utilizada influye mucho en la tendencia que sigue el pH.

Estos conocimientos han sido utilizados por algunos investigadores para formular un
medio de cultivo que permita mantener, de manera natural, el pH en un intervalo
deseado durante el proceso. Así por ejemplo, Raimbault y Alazard (1980) propusieron
para el crecimiento de Aspergillus niger en harina de yuca una mezcla de sulfato de
amonio - urea de 3 a 2 (calculado en base al nitrógeno) y se logró mantener el pH
durante el proceso en el intervalo de 5 a 6.2 favorable para el crecimiento del
microorganismo.

8
 UPIBI-IPN

2.2.5 La temperatura.

El crecimiento y la formación de productos son resultados de complejas reacciones

químicas, y al igual que cualquier otra reacción, están afectados por la temperatura, la
que ejerce una acción determinante en el conjunto de actividades celulares.

La temperatura es la variable cuyo control, en una fermentación sólida, se considera el

más crítico debido a la alta concentración de sustrato por unidad de volumen y a la baja
conductividad térmica del sistema heterogéneo sólido - líquido - gas, lo que favorece la
acumulación del calor metabólico en el sistema y un aumento de la temperatura del
cultivo.

El aumento de la temperatura favorece tres aspectos negativos:

• La actividad microbiana se desacelera o se detiene.

• Se deshidrata el medio sólido.
• El metabolismo se desvía como un mecanismo de defensa ante el calor o ante la
deshidratación (Gutierrez y col., 1995)

El control de la temperatura se ha tratado a través de métodos convencionales de

extracción de calor y de métodos no convencionales. Los métodos convencionales
incluyen el intercambio de calor por los mecanismos de conducción y convección
forzada. Los métodos de extracción de calor por convección, para ser efectivos,
requieren de elevadas tasas de aireación que con frecuencia deshidratan al medio. Los
métodos no convencionales se refieren a la utilización del calor latente de vaporización
del agua para eliminar el calor metabólico de manera rápida y efectiva.

Sobre esto se han pronunciado diferentes autores(Rathbun y Schuler, 1983; Raimbault,

1980), pues plantean que el control de temperatura es uno de los problemas que se ha
detectado desde siempre en las FES y que, a la fecha, no tiene una solución clara. Poco
se conoce sobre la magnitud del calor metabólico generado en las FES.

Existe un compromiso entre las soluciones drásticas y efectivas (métodos no

convencionales) contra las menos efectivas (métodos convencionales) pero que
respeten la integridad del sistema biológico en su conjunto. Resulta también claro que
los sistemas de control de las FES deberán tomar en cuenta, simultáneamente, la
humedad del medio, la humedad relativa del aire y la temperatura. También el tipo de
reactor utilizado (con o sin agitación) juega un papel fundamental en la eficiencia del
control de la temperatura (Vienegra, 1988, Pp. 793-798).

9
 UPIBI-IPN

2.2.6 La concentración y disponibilidad del sustrato.

El medio de cultivo debe tener todos los nutrientes necesarios de forma balanceada para
favorecer el crecimiento del microorganismo. Las relaciones entre algunos de sus
elementos son de particular importancia, por ejemplo, carbono-nitrógeno y fósforo-
oxígeno, esta última de manera relevante en lo referido a la eficiencia de conversión
energética y a la respiración.

La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir, debe
establecer las concentraciones a ser utilizada de cada componente. Una primera
aproximación con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el
conocimiento de la composición de la biomasa del microorganismo empleado.

Mediante el conocimiento de los coeficientes de rendimiento para la formación de

biomasa y producto, y los valores de la energía de mantenimiento será posible
establecer también los requerimientos de las fuentes de carbono necesarios para
formular un medio.

Al igual que en los cultivos sumergidos, la concentración de sustrato ejerce una

influencia sobre el desarrollo del microorganismo. Hasta el momento, tal influencia no
está caracterizada en términos de limitación o inhibición como en los cultivos
sumergidos; pero se piensa que los efectos de limitación sean mayores en las
fermentaciones sólidas, debido a la baja velocidad de difusión de los nutrientes en la
fase líquida. Si se ha encontrado que la relación carbono a nitrógeno tiene una gran
importancia y su valor óptimo puede variar en el intervalo de 10 a 100 en dependencia
del proceso de fermentación (Crueguer Wulf, 1993, Pp.263-275).

2.2.7 La aireación.

En la mayoría de los procesos de fermentación en estado sólido participan

microorganismos aerobios, y resulta la aireación un factor fundamental para el desarrollo
del proceso. La aireación se utiliza para suministrar el oxígeno necesario, para extraer el
CO2 formado, así como para extraer el calor metabólico evolucionado, de manera que el
flujo óptimo de aire debe tomar en consideración la naturaleza del microorganismo
utilizado, los requerimientos de oxígeno para el crecimiento y/o la formación del producto
deseado, la velocidad de generación de calor metabólico, la concentración crítica del
dióxido de carbono y otros metabolitos volátiles, el espesor de la masa de sólido, entre
otros.

10
 UPIBI-IPN

La aireación en las FES es más fácil que las fermentaciones sumergidas, porque la
superficie de contacto es mayor entre el aire y el líquido que está absorbido en las
partículas.

2.2.8 El tamaño de partícula.

El tamaño de partícula está muy ligado a la transferencia de masa en el sistema de

fermentación en estado sólido, y para considerar este fenómeno se ha propuesto dividir
el análisis en la transferencia de masa intrapartícula y la interpartícula. En el primer
caso, influye más el tamaño y la forma del poro de la partícula, así como la porosidad,
aunque también influye el tamaño de la partícula. En el segundo caso, el espacio
interpartícula es lo más importante y es afectado por el tamaño de la partícula, su forma
y la humedad. Otro aspecto que influye en la transferencia de masa durante el proceso,
es el cambio de estructura de las partículas de sustrato resultado de la acción de los
microorganismos.(Bernard, 1992, Pp. 341)

2.2.9 El inóculo.

Otro factor que influye en los procesos de FES lo representa el tipo de inóculo y la forma
de inoculación. Dos tipos fundamentales de inóculo en la producción de hongos, tanto a
nivel de laboratorio como industrial son: micelio o esporas. Las principales ventajas del
uso de micelio como inóculo son: una mejor competitividad del hongo, una reducción de
la posible colonización del sustrato por microorganismos contaminantes y la colonización
más rápida debido a que se reducen los tiempos de incubación (la fase de latencia o de
adaptación principalmente)(Hesseltine C., 1999, Pp.517-533; Losane B.,1995, Pp.258-
270)

2.2.1.0 Cinética y actividad metabólica del cultivo batch.

La cinética de un proceso; representa la variación de una o más variables de dicho

proceso en el tiempo. En los procesos fermentativos las variables de mayor importancia
y que más se han estudiado son: contenido de biomasa en el sistema, la naturaleza del
sustrato, la síntesis de uno o varios metabolitos, el consumo de oxígeno y la producción
de dióxido de carbono.

Dentro de estas variables, la síntesis de biomasa en el proceso y el consumo de sustrato

han permitido establecer una serie de criterios y parámetros que caracterizan cualquier
proceso fermentativo.

11
 UPIBI-IPN

Los estudios cinéticos permiten determinar aspectos tan importantes como:

• La velocidad específica de crecimiento.

• El rendimiento del proceso.
• La productividad del sistema.
• El calor generado en el sistema.
• La estrategia a seguir en cuanto a la producción de un metabolito específico.

Una de las principales dificultades encontradas en el estudio y desarrollo de los

procesos de fermentación en estado sólido viene dada por las características intrínsecas
de estos sistemas heterogéneos, la imposibilidad del muestreo durante la fermentación
para determinar las concentraciones correspondientes de biomasa, sustrato y productos.
Este hecho se refleja de manera particularmente aguda cuando se tiene la necesidad de
realizar estudios cinéticos del proceso. No obstante, existen diferentes alternativas que
permiten desarrollar estos estudios de manera objetiva y satisfactoria.

La determinación de la biomasa por métodos indirectos se ha empleado por diferentes

investigadores. El O2 consumido y el CO2 producido son el resultado de los procesos
metabólicos a través de los cuales los microorganismos aeróbicos obtienen la energía
necesaria para su crecimiento. Por tanto, estas actividades metabólicas están asociadas
al crecimiento del microorganismo y pueden usarse para estimar la biomasa sintetizada
(Nielsen J.; 1993, Pp. 715-727)

12
 UPIBI-IPN

2.3. Electroforesis Capilar (CE)

Es un método analítico en donde los analitos (iones) se mueven y separan bajo la

influencia de un campo eléctrico en función de su distinta velocidad de migración. Las
partes básicas de dicho sistema son un par de electrodos, una fuente de poder, un
detector (UV), un capilar, sistema de enfriamiento y un medio conductor (Marina, 1994,
Pp.1411-1433; Skoog, 1994, Pp.785)

Fig.3 Proceso de separación electroforético

La electroforesis capilar es una técnica alternativa de la electroforesis convencional y

surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a
medida que aumenta el campo eléctrico aplicado. Esta afirmación no nos permite
aumentar el potencial, aun sabiendo que existe una dependencia directa de éste con el
campo eléctrico. Esto se debe a que el calentamiento de Joule aumenta hasta afectar la
calidad de la separación. Para solucionar esta dificultad es que se realiza la
electroforesis en un tubo capilar con un diámetro interno entre 10 y 200 µm y una
longitud de 50 cm. a 1 m. El mecanismo de separación está basado en las relaciones
carga/masa de los analitos.

2.3.1 Principio de separación

El componente efector más importante en la EC es la electroendosmosis o corriente

electroendosmótica, o fuerza electroosmótica (FEO).
Surge como consecuencia de aplicar un campo eléctrico que genera una doble capa
eléctrica entre la solución y la pared del capilar.

13
 UPIBI-IPN

En condiciones acuosas, la fase sólida posee un exceso de cargas negativas, como

resultado de dos procesos físico-químicos, la ionización de la superficie (que es un
equilibrio ácido-base) y por otra parte la absorción de especies iónicas sobre la superficie
del capilar.
Estos procesos ocurren en el capilar al paso de la corriente eléctrica y la FEO se
encuentra altamente controlada por los numerosos grupos silanoles (SiOH) que también
pueden existir como SiO. (Figura 4a)
Los círculos en rojo representan las moléculas de silica transformadas por hidratación en
silanoles en medio acuosos cuando pasa la corriente eléctrica. (Figura 4b).
Los contraiones (cationes en la mayoría de los casos) mantienen el balance de cargas; a
este potencial se le conoce como potencial Zeta. Cuando se aplica el voltaje a través
del capilar, los cationes que forman la doble capa eléctrica migran hacia el polo positivo
(Figura 4c).Por consiguiente, la doble capa eléctrica tiene un balance que está a su vez
en equilibrio con la pared que corresponde al potencial zeta. A pH elevados los grupos
silanol son desprotonados y la FEO es significativamente mayor que a pH bajo donde
son protonados (Marina, 1994, Pp. 1411-1433; Heiger, 1997. Pp.31-32).

Grupo
silanol
(SiOH) A)

B)

C)

Figura 4. Representación del principio de separación de los grupos silanol en el Capilar

de sílice fundida

14
 UPIBI-IPN

2.3.2 INSTRUMENTACIÓN

Un sistema de EC consiste básicamente en las siguientes unidades, como se muestra

en la figura 5:

· Electrodos (ánodo y cátodo)

· Depósito (viales) donde se colocan los electrodos respectivamente
· Capilar (compartimiento de la separación)
· Un sistema de enfriamiento capilar (típicamente en la forma de convección de aire
forzado o de líquido)
· Un sistema de inyección automático
· Un detector (UV

Figura 5. Sistema general de electroforesis

El capilar comúnmente empleado es de sílice fundida los cuales permiten el paso de la

radiación ultravioleta y visible a distintas longitudes de onda, generando los espectros
para la identificación de los compuestos separados por electroforesis capilar. También
pueden ser hechos de vidrio, sílice fundida o teflón (Foret, 1998, Pp. 135-186).
Los capilares de sílice fundida son química y eléctricamente inertes y baratos. Los tubos
capilares empleados miden de 50 a 100 cm. de largo, usualmente con un diámetro
interno entre 10 y 200 µm y un diámetro externo entre 200 y 500 µm. Se encuentran
recubiertos generalmente de poliamida, la cuál facilita su manipulación dándoles
flexibilidad. Las modificaciones que se le realizan al capilar ayudan a controlar el flujo
electroosmótico FEO, mejora la reproducibilidad del FEO, previene las interacciones
pared-analito.

15
 UPIBI-IPN

La función que ejerce el sistema de enfriamiento es el de aislar al capilar de los

cambios ambientales y disipar el calor generado durante la separación, estos son de dos
diferentes modos de enfriamiento, el primero es empleando aire, por medio de un
ventilador y el segundo emplea un líquido (refrigerante). (Heiger, 1997, Pp. 77-108

Otro de los componentes importantes en el sistema es la fuente de poder la cual es

usada para aplicar hasta 30 Kv y niveles de corriente de 100 a 300 mA. La regulación
del voltaje es requerida para mantener la alta reproducibilidad en el tiempo de migración.
La fuente de poder debe tener la capacidad de poder cambiar la polaridad, es decir, que
el ánodo sea ahora el electrodo a la salida del capilar, lo cual por supuesto afectará la
dirección del FEO (Foret, 1998, Pp. 135-186;Heiger, 1997 Pp. 77-108).

2.3.3 Ventajas de la Electroforesis Capilar

La implementación de la Electroforesis en tubos capilares ha mejorado realmente la

modalidad clásica de electroforesis introduciendo sistemas completamente
automatizados. Entre sus ventajas encontramos:

1) La disipación del calor en el tubo capilar es buena y, por lo tanto, los cambios de
temperatura son muy pequeños y los resultados presentan mayor reproducibilidad.

2) Dada la rápida disipación del calor, es posible utilizar voltajes muy altos (hasta de
30kV), lo cual disminuye los tiempos de análisis y aumenta la resolución entre los picos.

3) El gasto en disolventes, aditivos y demás reactivos es mínimo, de ahí sus bajos

costos y los casi nulos daños al medio ambiente.

4) La cantidad de muestra necesaria se reduce a unos cuantos microlitros.

5) El valor de cada capilar es insignificante en comparación con el de una columna

cromatografíca u otra columna en general.

6) Se pueden utilizar una gran variedad de detectores tanto “en línea” o “fuera de línea”
o bien varios a la vez.

7) Se cuenta con equipos completamente automatizados que permiten analizar más de

100 muestras sin necesidad de atención en el equipo.

8) Es posible acoplar los equipos de electroforesis capilar a otros equipos analíticos.

16
 UPIBI-IPN

2.3.4 Diferencias entre los tipos de Electroforesis Capilar

Podemos diferenciar varios tipos de electroforesis capilar:

La electroforesis capilar en gel combina la técnica de electroforesis con la cromatografía
de reparto. Permite la separación en función de la migración electroforética y también en
función del peso molecular de las muestras. Se lleva a cabo en una matriz polimérica
con estructura de gel poroso, cuyos poros contienen una mezcla tampón donde ocurre la
separación. Estos geles están contenidos en un tubo capilar. Los geles utilizados son
también de agarosa y poliacrilamida.

Electroforesis capilar de zona: es una de las técnicas más importantes y más

utilizada debido, probablemente a su simplicidad y elevado poder de separación. Está
basada en la separación de los analitos según la relación carga/tamaño.
En esta técnica la composición del tampón es constante en toda la zona de separación.
El potencial aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren
cada uno según su propia movilidad y se separen en zonas que puedan estar
completamente resueltas o parcialmente solapadas. Entre las zonas completamente
resueltas hay huecos ocupados por el tampón. Su principal inconveniente es que no
permite separar los compuestos neutros.
Enfoque isoeléctrico: la diferencia de los puntos isoeléctricos de las proteínas se
aprovecha para separarlas por el método de isoelectroenfoque. Este método se basa en
establecer un gradiente de pH estable en una disolución o gel. Este gradiente se
establece por un conjunto de tampones especiales llamados anfolitos que migran por sí
mismos hasta que alcanzan sus puntos isoeléctricos. Cuando al gradiente de pH se le
introduce una proteína, cada zona intercambia protones con la muestra proteica,
generando una separación isoeléctrica conocida como electroenfocado.
La isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme. Esto significa que el
tiempo de recorrido en el capilar bajo condiciones isotacoforéticas es independiente de
la velocidad. Es una técnica de separación por desplazamiento.
En la isotacoforesis las bandas siempre están en contacto con la zona adyacente. Esta
característica es necesaria para mantener la continuidad eléctrica a lo largo del sistema,
dado que no hay un electrolito de soporte.
Esta técnica puede ser utilizada para determinar cationes y aniones. Se requiere
usualmente corridas separadas para determinar cada forma iónica.
La electrocromatografía capilar es un híbrido entre la HPLC y la CE donde se
reúnen algunas de las mejores características de cada técnica por separado, por lo que
tiene ventajas sobre ellas. De esta manera la electrocromatografía capilar puede usarse
para la separación de especies no cargadas.

17
 UPIBI-IPN

Proporciona una elevada eficacia en las separaciones de microvolúmenes de disolución

de muestra, sin necesidad de aplicar un bombeo de alta presión. Se diferencian dos
tipos de electrocromatografía capilar:

-Electrocromatografía rellena, en la cual un disolvente polar se conduce por el flujo

electroosmótico a través de un capilar que contiene un relleno típico de HPLC en fase
inversa. Las separaciones dependen de la distribución de los analitos entre la fase móvil
y la fase estacionaria líquida retenida por el relleno.

-Cromatografía capilar electrocinética micelar. Esta técnica requiere la utilización de un

tensoactivo en un nivel de concentración en el cual se formen micelas. Estas micelas
son capaces de alojar compuestos no polares en su interior. La interacción de las
micelas y los solutos es la que produce la separación.

En resumen la cromatografía y la electroforesis son en la actualidad técnicas

ampliamente utilizadas en la resolución de macromoléculas de interés en la industria
biotecnológica, biológica y bioquímica. Se destaca en las últimas décadas un mayor uso
de la electroforesis capilar. Esta versión instrumental de la electroforesis convencional
resulta más ventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para el
estudio en cuestión y los resultados se obtienen en un tiempo mínimo. Estos aspectos la
hacen preferida entre las técnicas de separación. (Heiger, 1997, Pp. 42-75; Sam F. y Li.
1998, Pp. 232-236, Sánchez, 2001, Pp. 34)

2.3.5 Aplicaciones

El explosivo avance de la electroforesis capilar se ha extendido en el área

biotecnológica, en el campo de las proteínas, péptidos, ADN, análisis de líquidos de
perfusión, monitoreo de drogas, marcadores genéticos tumorales y neurobioquímicos,
drogas xenobióticas, de abuso, y pericias forenses.
En el área biofarmacéutica, para el control de calidad de productos farmacéuticos y
biotecnológicos, quimioterápicos y de estructura quiral.
En el área de alimentos, se la aplica al fraccionamiento y cuantificación de aminoácidos,
hidratos de carbono, ácidos orgánicos, aditivos y contaminantes.
En el área de control ambiental, permite la identificación de contaminantes y sus
metabólitos, pesticidas, metales pesados e hidrocarburos (Vargas M., Revilla V., 2001 en
prensa).

18
 UPIBI-IPN

OBJETIVOS:

Objetivo General

• Producción y cuantificación por electroforesis capilar de penicilina G.

Objetivo Especifico

• Desarrollo de un método analítico en el equipo de electroforesis capilar para el

monitoreo y cuantificación de la producción de Penicilina G durante el proceso de
fermentación utilizando P. chrysogenum.

6. JUSTIFICACIÓN

La producción de penicilina como otros procesos biotecnológicos está dominada

por su aspecto competitivo entre los grandes laboratorios productores, que realizan
permanentes esfuerzos de mejoramiento en cada área del proceso: cepa, fermentación,
separación y cuantificación de sus productos.

El desarrollo de mejores métodos analíticos que nos permita detectar y

cuantificar concentraciones altas o bajas de nuestro metabolito de interés de forma más
rápida, sencilla y económica evitando el menor consumo de solventes, de muestras y
tiempo de análisis.

El hecho de poder determinar antibióticos por electroforesis capìlar facilitara su

identificación y cuantificación, así como la evaluación de su estabilidad y pureza en el
campo de la investigación mientras que en la industria se contaría con una nueva
alternativa de análisis para antibióticos.

19
 UPIBI-IPN

METODOLOGÍA

Medios, reactivos y materiales

Microorganismos

Penicillium chrysogenum ATCC 9840. Productor de penicilina G

Penicillium expansum ATCC28896. Productor de penicilina
Staphylococcus aureus ATCC6538P. Microorganismo de prueba

Soporte

Se emplea salvado de trigo como soporte.

Medio de crecimiento microorganismo de prueba

Medio empleado para el crecimiento del microorganismo de prueba de Staphylococcus

aureus 6538P. Caldo Nutritivo Bioxon.

Peptona de gelatina 5.00 g

Extracto de carne de res 3.00 g
Agua destilada c.b.p. 1.00 l

Medio para Antibióticos 1

Medio empleado para la prueba de Bioensayo en placa Bioxon.

Peptona de gelatina
Peptona de caseína
Extracto de levadura
Extracto de carne
Dextrosa
Agar
Agua destilada c.b.p.

20
 UPIBI-IPN

Medio para Antibióticos 2

Medio empleado para la prueba de Bioensayo en placa Bioxon.

Peptona de gelatina 6.00 g

Extracto de levadura 3.00 g
Extracto de carne 1.50 g
Agar 15.00 g
Agua destilada c.b.p. 1.00 l

Medio de Producción 1

Medio de producción para la producción de Penicilina G en fermentación líquida

empleando Penicillium chrysogenum ATCC 9840 y Penicillium expansum ATCC28896.

Lactosa 3.00 g
Agua de cocimiento de maíz 5.00 g
Pharmamedia 1.00 g
Fosfato monobasico de potasio 0.30 g
Fosfato dibasico de potasio 0.20 g
Cloruro de calcio 0.01 g
Agua destilada c.b.p. 1.00 l
El pH se ajusta a 5

Medio de Producción 2

Medio de producción para la producción de Penicilina en fermentación sólida

empleando Penicillium chrysogenum ATCC9840 y Penicillium expansum ATCC28896

Lactosa 3.00 g
Agua de cocimiento de maíz 5.00 g
Pharmamedia 1.00 g
Fosfato monobasico de potasio 0.30 g
Fosfato dibasico de potasio 0.20 g
Cloruro de calcio 0.01 g
Agua destilada c.b.p. 1.00 l
El pH se ajusta a 5

21
 UPIBI-IPN

Componentes para Electroforesis Capilar

Se emplea un buffer de fosfatos 10 mM, pH 7.0, aplicando un voltaje de 20 kV e

inyección hidrodinámica 0.5 psi 5seg.

Estandar y muestras del antibiótico

Como estándar se empleo Penicilina G obtenida de los laboratorios Sigma. Las

muestras analizadas son las que se obtuvieron cada 24 horas durante las
fermentaciones realizadas.

Sistema de electroforesis capilar

Las determinaciones se realizaron en un equipo de electroforesis capilar Beckman

Coulter P/ACE MDQ, com um detector UV, un capilar de sílice fundida de 50 cm de
longitud y diámetro interno de 75 µm.

Métodos

Parámetros evaluados en la fermentación.

- Concentración del antibiótico por el Método Bioensayo en placa (6).

- Determinación del pH del caldo de fermentación (pH).
- Determinación de azúcares reductores por el Método de AC. 3,5 DNS
- Determinación de humedad relativa mediante peso seco (%HR).
- Determinación de Biomasa.

Preparación del inoculo

El inicio de la fermentación se comenzó con la conservación del microorganismo:

Para la conservación y uso de la cepa en el laboratorio se empleo el medio de
esporulación o propagación en tubos inclinados para ser inoculados por estría cruzada,
a continuación se colocan los tubos en una incubadora a 30°C durante un periodo de 4
o 5 días, al termino de estos, las esporas son cosechadas en solución salina isotónica
previamente preparada y esterilizada para su posterior uso durante la fermentación
donde se inocularan 1 X10 8 esporas por cada gramo de soporte empleado.

Método de Producción para Fermentación Sólida

En la preparación del medio de producción empleado para la fermentación es importante

considerar la cantidad suficiente dependiendo de la cantidad de substrato a emplear, 10
ml de medio de producción por 10 mg de soporte. Mientras que el salvado de trigo es
preparado por separado para su posterior esterilización.

22
 UPIBI-IPN

Para el ajuste y control de humedad se hace uso de agua destilada la cual es

esterilizada junto con el medio de producción. Después de haber esterilizado se deja que
el medio alcance una temperatura ambiente, para ser adicionado al salvado y
homogenizado mediante agitación ;en condiciones de esterilidad se toma una muestra
del soporte para determinar la humedad por el método de peso seco; si se requiere el
ajuste de humedad solo se adiciona agua destilada y estéril(Figura 6). Finalmente el
salvado de trigo, con los nutrientes, es inoculado con la suspensión de esporas al 1% y
homogenizado mediante agitación.

Fig.6 Salvado usado para fermentación sólida

Sistema

Después estos matraces son llevados a una estufa de humedad y temperatura

controladas; durante 8 o 7 días de la fermentación los matraces son agitados esto con el
fin de favorecer el intercambio de gases en el interior de los mismos (Figura 7).

Fig.7 Medios para la producción de penicilina

23
 UPIBI-IPN

Seguimiento de la fermentación

Cada 24 horas se tomaron muestras para monitorear la fermentación. Se determinan

parámetros como %HR, pH, concentración de azúcares reductores y concentración de
antibióticos.
Se toman dos matraces para tomar el material y colocarlo en un vaso de precipitados;
posteriormente se toman 1.0 g d salvado para determinar la humedad.

El material restante es adicionado con un volumen de agua, se agita a temperatura

ambiente durante cinco minutos y se determina el pH mediante un potenciómetro.
El permeado es filtrado a través de una membrana de 0.45µm. para la determinación de
azúcares reductores mediante el método de DNS. El resto del permeado es filtrado al
vacío a través de un filtro de 0.22 µm. para la prueba de bioensayo en placa y análisis
de Electroforesis Capilar.

d) Métodos de producción por fermentación líquida

El método de producción es preparado, en la cantidad requerida para un volumen

mínimo de 600 mL, por matraz ajustándose al pH a 5.0. El medio de producción es
vaciado a los matraces de 1000mL para posteriormente ser esterilizados; enfriado el
medio, este es inoculado con la solución de esporas y finalmente el precursor en
solución es adicionado al tercer día de fermentación.

Sistema
Se emplean matraces de vidrio de 1000mL en los cuales se adicionan 600 mL de medio
de producción para posteriormente ser esterilizados; se adiciona a cada matraz el
inoculo con 1% de la suspensión de esporas, los matraces son colocados en la
incubadora con agitación orbital (150 rpm) con temperatura controlada (28ªC).

Seguimiento de la fermentación

Cada 12 o 24 horas se realiza el muestreo con el fin de monitorear y así controlar la

fermentación. Se determinan parámetros como pH, concentración de azúcares
reductores y concentración de antibiótico.
Se toman dos alícuotas de 5mL cada una en dos diferentes vasos de precipitados para
la determinación de pH mediante un potenciómetro.

24
 UPIBI-IPN

Los 5 mL de la otra alícuota son filtrados a través de una membrana de 0.45µm. para la
determinación de azúcares reductores mediante el método de DNS. El resto del
perneado es filtrado al vació a través de un filtro de 0.22 µm. para la prueba de
bioensayo en placa o su análisis por electroforesis capilar.

Determinación de la concentración de Penicilina

La técnica empleada para la determinación de la concentración es el bioensayo en

placa.
En una caja petri se colocan 20mL del medio para antibióticos No. 2, se deja solidificar;
Posteriormente se adicionan 10mL del medio para antibióticos No. 1 previamente
mezclado y homogenizado con 0.1 mL de caldo de cultivo para el crecimiento de
Staphylococcus aureus y se deja solidificar. Se colocan dos penicilindros en la superficie
de la caja, en cada orilla del medio, y se agrega a cada uno mediante una micropipeta
50µl de la muestra, se mantienen en refrigeración por espacio de una hora para facilitar
la difusión de la muestra en el medio, posteriormente se incuban a 36°C durante 24
horas. Al finalizar la incubación se miden los halos de inhibición del crecimiento del
microorganismo de prueba y extrapolan en la curva tipo de penicilina para obtener la
concentración de la muestra.

Determinación del pH

Se mide una muestra de 5mL mediante un electrodo normal de hidrogeno con referencia
de calomel conectado a un potenciómetro digital. Previamente a la determinación del pH,
el sistema es ajustado mediante el empleo de soluciones buffer de pH 4.0 y pH 7.0.

Determinación de Azúcares Reductores por el método de AC 3,5 DNS

Para la cuantificación de los azúcares residuales primero se prepara una curva tipo con
diferentes diluciones en tubos de ensaye que contienen glucosa, agua destilada, Ac 3,5
DNS previamente preparado, ajustando a un volumen de 4.5mL, después estos se
llevan a baño Maria a ebullición durante 5 minutos posteriormente se enfrían en baño de
hielo y se determina la As a 540 nm utilizando como blanco el tubo que solo contenga
agua destilada y Ac 3,5 DNS. Al mismo tiempo se procesan las muestras tomadas a los
diferentes tiempos. Si es necesario deberá realizar diluciones. Calentar a ebullición,
enfriar y determinar la As a 540 nm.

25
 UPIBI-IPN

Curva Tipo de Penicilina

Se prepara una solución madre de penicilina y se realizan diferentes diluciones a partir

de esta para obtener las concentraciones de 1, 2, 3, 4, 6 y 8 Unidades de Penicilina G.
Posteriormente se monta un bioensayo en placa (Fig. 8) para cada una de las
concentraciones de acuerdo a lo descrito en la determinación para la concentración de
penicilina. Una vez determinado el halo de inhibición, se obtiene la relación de
concentración de penicilina vs. halo de inhibición.

Fig.8. Bioensayo en placa

Preparación de la solución estándar

Una solución estándar de 0.1mg/mL fue preparada para penicilina G. se pesaron 10mg
de penicilina estándar y se disolvieron en un matraz aforado de 100 mL con agua grado
HPLC, se tomaron alícuotas de 500 µL y se diluyeron con agua 1:1 %v/v hasta alcanzar
una concentración mínima detectable (con el buffer y condiciones de corrida
establecidas) de 6.25 µg/mL (dilución 4); las diluciones se colocaron en viales de 1.5 mL
teniendo siempre cuidado de que las muestras no pasaran el tiempo de degradación de
estas para su lectura en el equipo.

Acondicionamiento del equipo para el corrimiento de la muestra

Al realizar cada corrida primero se lavó el capilar con una solución 1 de NaOH 0.1N
durante 5 min posteriormente se lavó con una solución 2 de Buffer de fosfatos 10 mM
con pH 7.0. Las muestras fueron inyectadas a 0.5 psi por 10 s. En la separación el
voltaje aplicado fue de 25 Kv, una temperatura de 25 °C y un buffer de fosfatos 10 mM y
un PH 7.0. Durante el desarrollo del método la polaridad siempre fue directa (ánodo a
cátodo).

26
 UPIBI-IPN

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Producción de Penicilina en Fermentación líquida

Durante la fermentación líquida con Penicillium chrysogenum y expansum se

determinaron los parámetros cinéticos de interés como pH, Biomasa y Azúcares
Reductores con la metodología anteriormente mencionada; los datos que se obtuvieron
de esta fermentación para Penicillium chrysogenum se muestran a continuación en la
tabla 1, y los resultados obtenidos para Penicillium expansum se muestran en la tabla 2.

Tabla 1. Parámetros cinéticos de Fermentación líquida para Penicillium chrysogenum

Tiempo Parámetros cinéticos

(h) Biomasa (g) pH
24 0.3491 5.4
48 0.3526 5.83
72 0.532 5.92
96 0.5562 6.11
120 0.3134 6.24

Tabla 2. Parámetros cinéticos de Fermentación líquida para Penicilliun expansum

Tiempo Parámetros cinéticos

(h) Biomasa (g) pH
24 0.267 6
48 0.2314 6.28
72 0.2558 6.25
96 0.3418 6.41
120 0.3484 6.48

27
 UPIBI-IPN

En la grafica No.1 se observa el pH de la fermentación de Penicillium chrysogenum y

expansum durante 5 días, la variación de este para cada una de las cepas fue mínima y
se mantuvo dentro del intervalo de datos de pH óptimo para el crecimiento del
microorganismo y producción de Penicilina G, ya que se logró mantener el pH durante
la fermentación en el intervalo de 5 a 7 favorable para el crecimiento de
microorganismo.

7,5

6,5
Penicillium
6
pH

chrysogenum
Penicillium
5,5 expansum
5

4,5
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo(h)

Gráfica No.1 Determinación de pH para Fermentación Líquida

En la siguiente grafico No.2 se puede apreciar la obtención de biomasa que se alcanzo

durante la fermentación para Penicillium chrysogenum en la cual se logro la mayor
cantidad de biomasa a las 100 h (0.556g)de la fermentación en comparación con
Penicillium expansum que solo alcanzo una cantidad de 0.348 g como máxima en el
mismo tiempo que P. chrysogenum.

0,7
0,6
0,5
Biomasa(g)

Penicillium
0,4 chrysogenu
m
0,3 Penicillium
expansum
0,2
0,1
0
0 50 100 150
Tiempo (h)

Grafico No.2.Determinación de Biomasa para Fermentación Líquida

28
 UPIBI-IPN

Dentro de la realización de los parámetros también se efectúo la determinación de

azúcares reductores para cada microorganismo usando el método de DNS la cual se
basa en la colorimetría pues su eficacia consiste en la reacción de azúcares reductores
y el 3.5 ácido dinitrosalicilico. A continuación se presenta en la tabla No.3 la
concentración y absorbancia para la curva tipo de azúcares reductores y de acuerdo a
estos datos se graficaron y se obtuvo la curva tipo como se muestra en el grafico No.3
puesto que en base a ella se realiza una regresión lineal que al ser interpolada con los
resultados de la fermentación se determina la concentración de azúcares reductores en
cada muestra.

Tabla No.3 Curva estándar de Azúcares reductores

Absorbancia Concentración de glucosa

Tubos 540 nm (mg/mL)
1 0.060 0.022
2 0.169 0.044
3 0.379 0.088
4 0.509 0.110
5 0.724 0.150
6 1.063 0.220

Grafico No.3 Curva estándar de azúcares reductores

29
 UPIBI-IPN

Para la determinación de azúcares reductores en muestras de P. chrysogenum y P.

expansum se empleó el método de DNS y se obtuvieron los siguientes resultados donde
se aprecia el consumo de azúcares para los dos microorganismos según lo registrado
en las tablas No.4 y 5.

Tabla No.4 Concentración de Azúcares reductores en Fermentación Líquida para

P. chrysogenum.

Concentración
Tiempo Absorbancia de Azúcares
(h) nm mg/mL
24 0.7500 0.4737
48 0.5630 0.3585
72 0.3560 0.2311
96 0.1188 0.0850
120 0.0678 0.0536
144 0.0735 0.0571
168 0.1052 0.0766

Tabla No.5 Concentración de Azúcares reductores en Fermentación Líquida para

P. expansum

Concentración
Tiempo Absorbancia de Azúcares
(h) nm mg/mL
24 0.871 0.5439
48 0.653 0.4161
72 0.405 0.2703
96 0.054 0.0642
120 0.066 0.0476
144 0.077 0.0518
168 0.103 0.062

Del análisis de resultados efectuado en la determinación de la concentración de

antibiótico muestra que la máxima concentración de penicilina se obtuvo entre las 72 y
96 horas de la fermentación para ambos microorganismos.
También como vemos en el grafico No.4 se tiene un rápido consumo de azúcares que
trae consigo un decremento en la biomasa sin que la humedad y pH se vean afectados
significativamente.

30
 UPIBI-IPN

Concentracion de Azúcares (mg/mL)

0,7
0,6
0,5
Penicillium
0,4
chrysogenum
0,3 Penicillium
0,2 expansum

0,1
0
0 50 100 150 200
Tiempo (h)

Grafico No.4 Determinación de Azúcares Reductores en Fermentación líquida

Producción de Penicilina por Fermentación Sólida

La determinación de parámetros cinéticos llevada en la fermentación líquida también se

realizó para fermentación sólida, esto con el fin de observar en que tipo de
fermentaciones se tiene una mayor producción de penicilina G. Durante la fermentación
sólida para Penicillium chrysogenum y expansum se determino pH, % humedad,
azúcares reductores y concentración del antibiótico; los datos que se obtuvieron de esta
fermentación para Penicillium chrysogenum son los que se muestran a continuación en
la tabla No.6, y los resultados obtenidos de Penicillium expansum se muestran en la
tabla No.7.

Tabla 6. Parámetros cinéticos de Fermentación Sólida para Penicillium chrysogenum

Tiempo Parámetros cinéticos

(h) pH %Humedad
24 5.74 41.7212
48 5.52 34.2642
72 5.77 34.6113
96 5.88 33.4694
120 7.13 33.5395
144 7.50 29.6932
168 7.78 29.2951
192 7.80 29.6273

31
 UPIBI-IPN

Tabla 7. Parámetros cinéticos de Fermentación Sólida para Penicillium expansum

Tiempo Parámetros cinéticos

(h) pH %Humedad
24 5.81 38.5757
48 6.60 38.2211
72 6.62 36.3680
96 6.14 40.0167
120 7.10 37.6565
144 7.53 39.4030
168 7.84 35.7613
192 7.79 33.7856

Como se puede apreciar en el grafico No.5 el comportamiento que se obtuvo durante la

fermentación sólida para P. chrysogenum y expansum en la determinación de pH, es la
adecuada puesto que se mantiene este parámetro en el intervalo optimó (5.5-7.8), la
producción del antibiótico y así analizar cada una de estas muestras para su posterior
lectura en electroforesis capilar.

Grafico No.5 Determinación de pH en Fermentación sólida

32
 UPIBI-IPN

La determinación de la humedad óptima para la producción de penicilina se realizó

empleando matraces de vidrio con salvado de trigo como soporte a temperatura de
28°C y diferente porcentaje de H2O. Una vez determinada la humedad óptima, se realizó
la fermentación a lo largo de siete días y se registro el % de humedad durante el
proceso (grafica No.6) donde la variación dentro de la fermentación de estos dos
microorganismos fue similar.
La humedad óptima para el crecimiento y producción de penicilina G fue de 30 a 40% de
agua en 10 g de salvado de trigo.

60
Penicillium
50
% Humedad

expansum

40 Penicillium
chrysogenum
30

20

10
0 100 200 300
Tiempo(h)

Grafico 6. Determinación de Humedad en Fermentación sólida

La determinación de azúcares reductores para esta fermentación obtuvo un

comportamiento similar a la fermentación líquida debido a que conforme va
incrementando la biomasa el consumo de azúcares disminuye esto debido a que el
microorganismo necesita energía durante la producción del antibiótico, en las tablas 8 y
9 se muestran los datos de consumo de azúcares durante la fermentación que se les
determinaron a través de la absorbancia de cada una de las muestras y se comparo con
la curva tipo de azucares.
Por otra parte la mayor concentración de penicilina alcanzada se encontró dentro de las
72 y 96 horas de la fermentación aunque también con una disminución.

33
 UPIBI-IPN

Tabla No.8. Determinación de azúcares reductores en Fermentación sólida para P.

chrysogenum

Concentración
Tiempo Absorbancia de Azúcares
(h) nm mg/mL
24 0.434 0.6855
48 0.324 0.5080
72 0.431 0.1904
96 0.546 0.1177
120 0.460 0.1009
144 0.462 0.1013
168 0.339 0.0772
192 0.537 0.1046

Tabla No.9 Determinación de azúcares reductores en Fermentación sólida para P.

expansum

Concentración
Tiempo Absorbancia de Azúcares
(hrs) nm mg/mL
24 0.887 0.7380
48 0.468 0.3075
72 0.405 0.2703
96 0.054 0.0642
120 0.082 0.0538
144 0.057 0.0440
168 0.103 0.0620

En el grafico.No.7 se representa el consumo de azúcares durante la fermentación para P.

chrysogenum y P. expansum. El gasto de azúcares fue mas rápido que para Penicillium
expansum debido a su crecimiento de biomasa en la fermentación.

34
 UPIBI-IPN

1,2

Concentracion de Azúcares
1

0,8
Penicillium

mg/mL
0,6 chrysogenum
Penicillium
0,4 expansum

0,2

0
0 100 200 300
Tiempo(h)

Grafico No.7. Determinación de azúcares reductores en Fermentación sólida

Curva estándar de Penicilina G

La determinación de la curva estándar de penicilina se realizó mediante el método de

bioensayo en placa; las concentraciones de penicilina empleadas así como el
correspondiente halo de inhibición obtenido se presentan en la tabla No. 10.

. Tabla No.10 Curva estándar de Penicilina G

ln
Concentración Concentración Halo de
de Penicilina de penicilina inhibición
U/ml (U/mL) mm
1 0.0000 10.0
2 0.6931 20.0
4 1.3863 40.0
8 2.0794 80.0
16 2.7726 160.0

La relación entre la concentración y el halo de inhibición es de tipo lineal de acuerdo con

los datos obtenidos y como se observa en el grafica No.8. Al hacer regresión lineal de
estos datos podemos calcular las concentraciones de penicilina de las muestras
obtenidas a lo largo de la de fermentación sólida y líquida.

35
 UPIBI-IPN

Curva Tipo de Penicilina

30
Halos de inhibición mm
25

20

15

10 y = 5,2586x + 10,34
2
R = 0,9842
5

0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
ln concentración de penicilina (U/mL)

Grafico 7. Curva tipo de Penicilina

Grafico No. 8 Determinación de curva estándar para penicilina

Posteriormente se interpolan los datos de halos de inhibición alcanzados en esta curva

tipo para determinar cual es la producción que se logro durante los dos tipos de
fermentaciones.
La producción de penicilina obtenida por P. chrysogenum fue de 0.77-1.22 U/mL
mientras que para P. expansum fue de 0.77-1.00 U/mL (1 U= 0.6 ug). Lo cual nos indica
que Penicillium chrysogenum tubo la mayor producción de penicilina comparado con P.
expansum.

36
 UPIBI-IPN

Electroforesis capilar

Para iniciar el análisis en el equipo de electroforesis capilar de cada una de las

muestras de concentración de penicilina, se prosiguió a implementar un método analítico
eligiendo las condiciones adecuadas para la lectura de cada una de las muestras, donde
lo primero que se realizo fue un barrido de penicilina G estándar en el espectro de UV.
En el grafico No. 8 se observa el barrido realizado donde se obtuvo que la longitud de
onda a emplear en el análisis de penicilina G fue de 200 nm.

Grafico No.9 Barrido de penicilina estándar 1mg/mL

Posteriormente se realizo una curva tipo estándar de Penicilina G para su análisis en el

equipo de electroforesis capilar, con una concentración de 0.1 mg/mL como solución
madre y a partir de esta se realizaron varias diluciones, la mínima concentración
detectada fue la dilución 4 (c=0.0065mg/mL).
una vez preparadas las diluciones se corrieron de mayor a menor concentración y se
registraron tiempos de detección.
Con las áreas obtenidas de cada una de las diluciones y las concentraciones realizadas,
se realizo una regresión lineal donde el coeficiente de correlación fue de 1.Este análisis
se realizó por duplicado para cada dilución.

37
 UPIBI-IPN

Como se puede observar en la tabla 10 hay una disminución en las áreas de manera
equivalente conforme disminuye la concentración del estándar de penicilina G. Los
tiempos de migración variaron entre ambas repeticiones de manera mínima.

Tabla 11. Resultados obtenidos para las diluciones de Penicilina G

Concentración Área Tm Área Tm Promedio Promedio

Dilución
mg/ml (AU) (min) (AU) (min) Área (AU) Tm(min)

D0 0.1 99743 3.729 95716 3.719 97729.5 3.724

D1 0.05 49522 3.753 47237 3.742 48379.5 3.747

D2 0.025 24368 3.772 23172 3.783 23770 3.777

D3 0.0125 11435 3.879 11649 3.991 11542 3.935

D4 0.00625 5410 4.013 5282 4.109 5346 4.016

(Tm= tiempo de migración, AU= Unidades de absorbancia)

Posteriormente se graficaron las áreas promedio en el eje Y (unidades de absorbancia

“AU”) contra las concentraciones de sus respectivas diluciones en el eje X. Con los datos
se realizó la regresión lineal y se determino el coeficiente de correlación como se
muestra en el siguiente grafico 9.

120000

100000

80000

AU 60000
y = 985229x - 824,21
40000 2
R =1
20000

0
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

Penicilina G( mg/mL)

Grafico No.10 Análisis de linearidad para datos de penicilina

38
 UPIBI-IPN

La linearidad obtenida de penicilina es buena ya que la farmacopea recomienda un valor

arriba de 0.99.

En el Grafico 10 se muestra el electroferograma de las diluciones del estándar de

penicilina G. Se han colocado desglosadas con la finalidad de que se aprecie bien como
disminuye el área detectada cuando la concentración es menor.

Grafico No.11 Electroferograma de Penicilina G y sus cuatro diluciones (recorridas a

propósito por visualización).

En el grafico 11 se muestra el electroferograma de las muestras obtenidas de una de las

fermentaciones de penicilina G, el tiempo de detección fue 3.7 y 4.2 min.

39
 UPIBI-IPN

0.5 PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm
0.5
PDA - 200nm
m6 m12 m12 m11 m3 m2
m6.dat m12.dat m12.dat m11.dat m4.dat m3.dat m2.dat
0.4 0.4

0.3 0.3

0.2 0.2

0.1 0.1
AU

AU
0.0 0.0

-0.1 -0.1

-0.2 -0.2

-0.3 -0.3

-0.4 -0.4

-0.5 -0.5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Minutes

Grafico No.12.Electroferograma de muestras de penicilina obtenidas durante

fermentación sumergida

Como se logra observar los electroferogramas nos muestran que es posible detectar
muestras de penicilina en tiempos cortos de entre 3.7 y 4.2 min, con buena resolución.

40
 UPIBI-IPN

Conclusiones

Se estableció la metodología adecuada para la detección de penicilina G por

electroforesis capilar la cual fue de 900 µg/mL a los 3.7 min con buena resolución y
amplitud en los picos.

Del análisis de linealidad de penicilina se obtuvo un excelente coeficiente de

correlación es decir mayor a 0.99.

La electroforesis capilar permite cuantificar las muestras directas de la

fermentación de penicilina a concentraciones bajas, del orden de microgramos por
mililitro de muestra, con picos finos, bien definidos y con una resolución aceptable entre
ellos.

Esta técnica muestra grandes ventajas como son menor cantidad de solventes
utilizados que presentan un beneficio con menos gastos económicos y algo muy
importante menor cantidad de deshechos, lo cual tiene un impacto directo con la
conservación del medio ambiente

La fermentación sólida al igual que la liquida es una alternativa viable para la

producción de Penicilina G con una producción de 0.70 -1.2 U/mL.

La humedad y pH son un parámetro crítico en el control de la fermentación

puesto que estos pueden impactar fuertemente en la formación del producto de interés
inhibiendo la formación de éste.

41
 UPIBI-IPN

Un punto a considerar es la concentración de precursor ya que es importante

para la formación del metabolito de interés, puesto que se tiene una variación en la
concentración del precursor trae consigo la inhibición de la producción del antibiótico
cual reditúa en el rendimiento del proceso de la fermentación.

Este método presenta una alternativa para ser aplicado en áreas de

investigación y llevando a cabo su validación puede ser utilizado en la industria, con una
gran cantidad de ventajas ya mencionadas que ayudarían a sustituir equipos alternativos
utilizados actualmente.

42
 UPIBI-IPN

BIBLIOGRAFIA

Aiddo K. E., Hendry R., Word B.J.B.; 1982. Solid Substrato Fermentation: Advances and
Applications in Microbiology. pp. 201-237

Altria Kevin D.;Creasey E.; Howells J.S., 1998 Routine capillary electrophoresis trace
level determinations of pharmaceutical and detergent residues on pharmaceutical
manufacturing equipment. Journal of liquid chromatography, 21, pp.10931105

Barber M. S.; 1997. The Manufacture of Penicillin; Pharmaceutical Manufacturing

International; Sterling Publications Limited; Londres, Inglaterra; pp119-123.

Bowman, W.C.: 1984, Farmacología. Bases Bioquímicas y Patológicas. Aplicaciones

clínicas. Editorial Interamericana, 2ª edición, México

Cárdenas A.L.; 1991. Hechos en Biotecnología; Agt Editor S.A.; 1a edición; México, D.F.;
pp17

Castillo Rodríguez, M., Revilla Vázquez, A, L, López-Arellano, R., Cervantes, A., 2005.
Fundamentos de electroforesis capilar. UNAM. México.

Crueguer Wulf, Crueguer Anneliese; 1993. Biotecnología: Manual de Microbiología

Industrial Editor Acribia, S.A.; 3a edición, España; pp263-275

Desfarges C., Larroche C., Gros J. B.; Spore production of Penicillium roqueforti by solid
state fermentation: Stoichiometry, Growth and sporulation behavior.

43
 UPIBI-IPN

Gramse M.J, Jacobson P.E., 2005, Determination of penicillin G in feeds by liquid

chromatography with solid-phase extraction, pp 88(3):679-83

Goodman G.A., Goodman S.L, Gilman A.; 1982. Las Bases Farmacológicas de la
terapéutica; sexta edición. Ed. Médica Panorámica, México, D.F; pp1106-1140

Gotti R, Calleri Enrica, Massolini G, 2006, Penicillin G acylase as chiral selector in CE

using a pullulan-coated capillary, pp 4746-4754

Heiger, 1997. High performance Capillary Electrophoresis.;3ra Edición. Hewlett Packard

Company, Francia, Pp. 77-108.

Hesseltine C. W.;1990. Solid-State Fermentation; Biotechnology and Bioengineering 14

Pp. 517-533

Losane B. K. Ghildyal N.P., Budiatman S., Ramakrishna S.; 1990 ;Engineering Aspects
of Solid State Fermentation; Enzyme Microbiology Technology 7,258. Pp. 134

Losane B. K., Sauceso-Castañeda G., Raimbault M., Roussos S., Viniegra-Gonzalez G.,
Ghildyal N.P., Krishnaiah M. M.; 1995 ;Review Scale for Solid State Fermentation
Systems; Process Biochemistry 27. Pp. 259-273.

Maheva E.,Djelveh G., Larroche C., Gros J. B.; (1994) Sporulation of Penicillium
roqueforti in solid substrate fermentation; Biotechnology Letters 6, pp 97-102.

Meyers F., Fawcetz, Goldfien; 1980, Manual de Farmacología Clínica. Editorial Moderno,
4ª edición. México, pp 609.

44
 UPIBI-IPN

Mudgett R. E.; 2002; Solid State Fermentation; Chapter 7; Pp. 66-83.

Nielsen J.; 1993. A Simple Morphologically Structured Model Describing the Growing of
Filamentous Microorganisms; Biotechnology and Bioengineering; pp 715-727.

Pajchel G, Michalska K, Tyski S, 2004, Application of capillary electrophoresis to the

determination of various benzylpenicillin salts, pp 1032(1-2):265-72

Pandey Ashok; 1992; Recent Process Developments in Solid State Fermentation;

Process Biochemistry 27. Pp. 109-117.

Pecsok, R.L., Shields, LD.1983. Métodos modernos de análisis químico. Ed. Limusa,
S.A.

Rivera, A.L., Vargas M., 2002. El uso de la electroforesis capilar en la industria

farmacéutica, Parte II, Revista Mexicana de la Asociación Farmacéutica, Vol.34 pp. 18-
25

Rivera Vega, María P. 1996. Electroforesis capilar, una nueva herramienta para la
química analítica, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN. México. pp. 1-13.

Sargantanis J., Karim M. N., Murphy V. G., Ryoo D.; 1993; Effect of Operating Conditions
on Liquid Substrate Fermentation; Biotechnology and Bioengineering 42. Pp.149-158.

45
 UPIBI-IPN

Skoog, West. Holler, Crouch. 1990. Cromatografía de gas-liquido de alta resolución. 728-
732. Química Analítica, 4ta Edición, Mc. Graw – Hill, España.

S.S.A.; Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos; Secretaria de Salud; Editorial

Porrua; México D.F. (1988); pp. 921, 1500

The United Stated Pharmacopeia; Nineteen Revision; United Stated Pharmacopeia

Convection Inc.; U.S.A (1975); PP1324

Thomas A, Ukpoma O.K., Inman J.A., Roberts K.P.,2007, Quantification of penicillin G

during labor and delivery by capillary electrophoresis.

Vandame E. J.; (1994), Biotechnology of industrial antibiotics; Marce Dekker Publishing,

Co.New York, E.U. A. ; pp 24

Vargas M., Revilla V., 2001 “El uso de Electroforesis Capilar en la Industria
Farmacéutica” parte I, Revista Mexicana de la Asociación Farmacéutica, Julio-
Septiembre.

Vienegra- González J., Tomasini A., López J.; 1988, Penicillin Production by Solid State
Fermentación; Biotechnogy Letters 10 No.11; pp 793-798.

46