1

COURS DE CULTURE DES TISSUS II

« CULTURE DES CHAMPIGNONS = MYCICULTURE ou

FUNGICULTURE »
I.Introduction

1.1. Définitions
La culture des champignons ou myciculture (fungiculture) est la culture du
mycélium du champignon sur des milieux nutritifs qui lui permettent de croître
et de produire des fructifications. Cette culture s’intéresse essentiellement aux
champignons d’intérêt alimentaire (champignons comestibles) et d’intérêt
médical. Ce cours s’intéresse donc aux champignons, qui aujourd’hui forment
un règne à part , celui des Fungi (Eumycota). Leur appareil végétatif appelé
thalle est constitué du mycélium. Les organismes formés de thalle ont autrefois
fait partie du groupe des thallophytes qui ont en commun la reproduction par
des spores. Une spore contrairement à la graine, est microscopique,
unicellulaire et n’a pas d’embryon en son sein. En germant, la spore donne un
thalle (mycélium chez les champignons).

1.2. Objet du cours

Ce cours vise :
• La conservation des ressources génétiques (fongiques) ;
• La valorisation des déchets organiques divers (principalement
d’origine végétale) ;
• La mise au point des souches à haut rendement (par des
croisements intersouches) ;
• La satisfaction des besoins socio-économques et aussi la
curiosité scientifique.

La culture des champignons fait partie des biotechnologies. Les biotechnologies

des organismes vivants reposent principalement sur les cultures in vitro basées sur la mise en
culture d’une partie de l’organisme vivant en milieu artificiel contrôlé à l’abri de toutes
contaminations.

Les techniques in vitro cherchent à contrôler les facteurs de l’environnement (température,

lumière, humidité…), la composition du milieu de culture, du fragment (ou cellule)
d’organisme mise en culture afin de l’orienter vers un programme d’évolution déterminé.

1.3. Aperçu historique

La culture des champignons comestibles (fungiculture ou myciculture) est une activité humaine fort
ancienne ; stimulée par l'intérêt gastronomique mais aussi par les applications médicinales, elle a
évolué parallèlement au maintien de la cueillette traditionnelle des espèces sauvages. Les documents
chinois situent autour des années 1200-1300 après J.-C. la domestication du shiitake (ou « champignon
 2

parfumé »), Lentinula edodes. Le champignon « oreille de Judas » (Auricularia auricula-judae) a été
cultivé en Asie depuis 600 après J.C. C'est vers 1630 que des horticulteurs de la région parisienne ont
débuté la culture du champignon de couche (ou champignon de Paris), Agaricus bisporus. En France ,
La Quintinie , le célèbre jardinier de Louis XIV à Versailles, fournissait à la table royale des
champignons de couche cultivés en plein air (les cultures en plein air n’ont permis ni les productions
d’hiver à cause du froid, ni celles d’été à cause de la chaleur et des parasites). Chambry fut le premier
horticulteur (1810) à les cultiver dans des anciennes carrières abandonnées, les catacombes de Paris
(au sud de Paris). Au début du 19ème siècle, la culture en cave se répandit dans les régions de France où
l’on trouvait ces types de caves, ainsi que dans le Limbourg en Italie et en Angleterre. Mais il a fallu
attendre la seconde moitié du xxe siècle pour pouvoir véritablement parler de trufficulture.

Aux Etats-Unis d’Amérique, la culture des champignons débuta à New-York en 1880. C’est durant
cette période que furent réalisées les premières cultures de Pleurotes (Thomas, 1966)

La première culture « en maison », fut réalisée en 1817 en Russie et la « maison »de production fut
construite vers 1900 aux USA.

Les substrats dits synthétiques, à base de sciure de bois firent leur apparition au Japon, en 1946.
Pendant les années 50 et 60 se développèrent notamment en Hongrie, les cultures sur rondins de bois,
également en Chine. Voyant le danger que présentait cette dernière méthode sur l’avenir des forêts en
Chine, le Professeur Lin Zhanxi (1983) mit au point la technique JUNCAO (jun, champignon, cao,
herbe en chinois) qui consiste à cultiver les champignons sur les herbes, des déchets d’origine végétale
(herbes de savane, déchets d’origine agricole ou agro-industrielle). Dès lors apparut et s’imposa
ensuite l’utilisation de paille comme fondement des systèmes intensifs européens.

Longtemps confinée dans l’empirisme, la culture des champignons s’est, depuis une trentaine
d’années, fortement ouverte aux services et aux techniques modernes.

Actuellement, une trentaine d’espèces de champignons sont cultivées mais un petit nombre seulement
est commercialisé

La production mondiale de champignons cultivés est en augmentation rapide : environ 2,18 millions
de tonnes en 1986, et 7,5 millions de tonnes en 2001. Le champignon de couche est toujours le plus
cultivé, mais sa part diminue (56 p. 100 en 1986, 32 p. 100 en 1997) au profit du shiitake (14 p. 100 en
1986, 25 p. 100 en 1997), des pleurotes (8 p. 100 en 1986, 14 p. 100 en 1997) et d'espèces asiatiques
(volvaire...) aussi cultivées hors de l'Asie du Sud-Est (en Europe ou en Amérique du Nord) depuis
1970. Quelques espèces occidentales apparaissent susceptibles depuis peu de diversifier les entreprises
ou les étalages : coprins, pieds-bleus, strophaires, etc. On doit cependant constater que les
champignons les plus appréciés par le consommateur européen sont encore en majorité non cultivables
(cèpes, girolles, etc.). Le tableau ci-dessous donne l’évolution de la culture des champignons dans le
monde.

Tableau 1. Evolution de la culture des champignons dans le monde

PRODUCTION EN TONNES. CHIFFRES 2003- 2004 [données des FAOSTAT (FAO)]

Chine 1.309.455 42 % 1.359.335 42 %
Etats-Unis d’Am. 391.000 12 % 391.000 12 %
Pays-Bas 263.000 8% 260.000 8%
 3

France 167.647 5% 170.000 5%

Pologne 120.000 4% 120.000 4%
ESpagne 115.165 4% 115.165 4%
Italie 90.000 3% 90.000 3%
Canada 78.100 2% 80.000 2%
Royaume-Uni 77.100 2% 80.000 2%
Islande 69.000 2% 70.000 2%
Japon 67.000 2% 67.000 2%
Autres pays 403.726 13 % 404.232 13 %
Total 3.149.111 100 % 3.206.738 100 %

Pour le champignon de couche, des entreprises industrielles de grande taille intègrent maintenant
toutes les étapes de la filière, de la production jusqu'à la transformation. Parallèlement, il y a place
pour une production plus extensive, parfois saisonnière, associée à d'autres sources de revenus
(maraîchage par exemple). Des cultures d'amateurs, approvisionnées par les jardineries ou la vente par
correspondance, se développent dans les pays anglo-saxons et, plus récemment, en France.

1.4.Intérêt de la culture des champignons

La culture des champignons présente plusieurs avantages entre autres :

• Elle contribue à la réduction de la pollution environnementale et elle est elle-même

respectueuse de l’environnement car elle n’utilise pas de terre arable et peut se réaliser sur des
espaces très réduit ;
• Elle permet le recyclage des déchets végétaux divers, se réalisant sur des substrats organiques
notamment d’origine agricole et agro-industrielle, sur rondins de bois, souches ou bûches et
sur les herbes ou plantes sauvages;
• Elle permet la bioconversion des déchets, en convertissant les molécules comme des protéines
abandonnées dans ces déchets en molécules alimentaires pour l’homme. Ces molécules étant
incorporées et assimilées par l’organisme fongique ; elle permet également la bioremédiation
en dépolluant des matériaux organiques ou milieux pollués ;
• Les substrats usés peuvent être utilisés comme engrais pour amender ou fertiliser le sol,
comme source d’énergie, comme fourrage pour les animaux, ou encore peuvent servir pour
plusieurs cultures successives des champignons (des décomposeurs secondaires comme les
champignons de couche) ;
• La culture des champignons comestibles (et ou médicinaux) met à la portée des populations
des aliments offrant toutes les garanties de consommation et cela en toutes saisons et donne
une production élevée par surface cultivée ;
• Elle permet de rendre disponible du mycélium et des spores desquels on peut extraire des
molécules à usage médicinal ; notamment des polysaccharides, comme la schizophyllane, la
lentinane, la pleurotine etc qui, pour la plupart ont une activité anti-tumorale, de renforcement
du système de défense (système immunitaire) ; sont régulatrices de la pression sanguine et du
taux de cholestérol ( sont anticholestérolemiantes).

1.4.Aperçu sur la culture des champignons dans le monde

 4

Il y a presque cent espèces de champignons qui peuvent être cultivées .Tous sont
saprophytes. Agaricus bisporus, Lentinula edodes et Pleurotus spp.dominent les
marchés commerciaux , et ceux-ci représentent presque trois quarts des champignons
de culture cultivés dans le monde entier (Chang, 1999). Les espèces principales de
culture sont cultivées sur une variété de substrats organiques, incluant les déchets de la
production de coton et de café. Les technologies sont bien établies et des industries de
champignon à succès ont été établies dans beaucoup de pays. Il y a eu une énorme
augmentation de la production ces dix dernières années, surtout suite à une capacité
accrue en Chine.
Des rapports d'Afrique (Mshigeni et Chang, 2000), du Mexique (Martinez-Carrera et
autres, 2001) et d'Amazonie au Brésil (Pauli, 1999) suggèrent que la culture de
champignons offre des occasions économiques aussi bien qu'alimentaires et des
bénéfices de santé. La culture à petite échelle a lieu partout en Chine et pourrait
fournir un modèle approprié pour le transfert de technologie. La culture du
champignon de paille (Volvariella volvacea) est intégrée avec la production de riz au
Viêt Nam. Partout où des espèces saprotrophes sont cultivées ils exigent une provision
stable en matières premières. L'expansion de production du shiitake au Qingyuan en
Chine («la capitale mondiale du champignon») a entraîné un sérieux épuisement des
forêts locales qui ont fourni le bois sur lequel cultiver ce champignon comestible
(Pauli, 1998). C’est ainsi que naît la technique JUNCAO mise au point par le prof. Lin
Xhanxi (1983).
Le nombre d'espèces saprotrophes cultivées augmente régulièrement et des conseils et
de l'information pratique sont facilement accessibles (Stamets, 2000). Les
champignons ectomycorhiziens peuvent aussi être «cultivés». Les arbres sont inoculés
avec le champignon de truffe qui doit alors infecter les racines et former
l'ectomycorhize. Les arbres sont soigneusement entretenus pour encourager la
production des truffes. Les méthodes pour la «culture» des truffes sont constamment
raffinées et améliorées (Hall et al., 1998).

CHAPITRE II. CULTURE DES CHAMPIGNONS SAPROTROPHES

2.0. Introduction

Les champignons saprotrophes, ce sont ceux qui poussent de façon autonome sur du
bois mort, sur des feuilles mortes, sur des débris végétaux, bref sur des cadavres des
organismes vivants donc sur la matière organique en voie de décomposition. Du point
de vue pratique on distingue des champignons de souche et des champignons de
couche. Les premiers sont des décomposeurs primaires, ce sont des champignons
lignivores ou lignivores (poussant sur les bois morts) ; les seconds sont décomposeurs
secondaires, ce sont des champignons humicoles (dont les mycéliums se développent
dans les couches organiques ou organo-minérales du sol à l’exception de la litière) et
des champignons foliicoles (sur des feuilles ou aiguilles ou brindilles peu
décomposées).

Les champignons saprotrophes se répartissent en 4 sous-groupes (d’après Guillot,

1993 ; Moreau, 2002) :
 5

Les champignons qui poussent sur du bois presque frais non décomposé :
Lentinus, Pleurotus, Flammulina, Agrocybe, Ganoderma etc ;
Ceux qui poussent sur des matériaux ligno-cellulosiques un peu décomposés :
Volvariella, Stropharia, Coprinus etc ;
Ceux qui poussent sur des matériaux bien décomposés ou totalement
compostés : Agaricus etc ;
Ceux qui poussent sur le sol et l’humus : Lepiota (Macrolepiota), Lepista,
Morchella etc

Ce sont ces champignons saprotrophes qui sont les plus cultivés à cause du fait
qu’ils poussent de façon autonome, ils permettent la bioconversion d’une grande
diversité de déchets organiques.

La diversité des champignons saprotrophes surtout lignicoles est déterminée en

grande partie par l’essence considérée (par exemple la souche d’Auricularia
cornea poussant sur le manguier est différente de celle poussant sur les Acacia) et
par le stade de décomposition, mais aussi par le calibre du bois. Ces espèces
fongique produisent divers types de pourriture en fonction de leurs capacités
enzymatiques. Ainsi, on distingue les champignons causant la pourriture blanche
(white root fungi) en dégradant la cellulose et la lignine, et ceux causant la
pourriture brune en dégradant la cellulose et l’hémicellulose.

2.1. Cycle de vie des champignons saprotrophes et les étapes de leur culture
artificielle

2.1.1 Cycle de vie et importance du blanc de semis (source de mycélium pur)

Lors de la culture d’un champignon on peut couvrir en peu de temps les différentes
étapes de son cycle de vie allant de la spore pour aboutir à la spore en passant par
son isolement dans un milieu nutritif in vitro, à la multiplication du mycélium issu
de cette spore sur divers supports pour l’obtention de la ‘’semence ‘’ et sur des
déchets divers pour obtenir les sporophores (comestibles) qui ont pour rôle naturel
d’assurer la dispersion ou la dissémination des spores qui ont été produites

Figure 1. Cycle de vie des champignons (selon Baek Cho, 2004)

 6

Le premier objectif lors d'une culture de champignons est d'obtenir une source de
mycélium pur sur gélose afin d'inoculer un substrat de colonisation à base de céréales.

Commander directement ce substrat de colonisation ou essayer de produire votre

mycélium à partir d’une empreinte de spores, mais aussi en clonant un morceau de tissu
d’un champignon. Toute cette première étape doit être effectuée en respectant au
maximum les précautions de stérilité afin d’éviter une contamination de la culture par
d’autres organismes. Une solution nutritive contenant un gélifiant (agar-agar) doit être
chauffée puis coulée dans un récipient en verre ou en plastique appelé boite de Pétri ou
tube à essai. Une fois refroidie cette solution se solidifie et devient une gélose nutritive. Le
prélèvement du morceau de tissu (ou l’empreinte de spores) sert à inoculer ce milieu
nutritif gélosé qui sera placé dans un incubateur afin de favoriser le développement du
mycélium. Si toute les étapes sont réalisées stérilement, un mycélium pur commencera à
se former. Lorsque la gélose est complètement recouverte par ce mycélium, il faut alors
couper, à l’aide d’un scalpel stérile, un morceau de 1cm2 pour inoculer le substrat de
colonisation: il s’agit pour la plupart du temps de maïs, seigle ou blé mais d’autres
céréales peuvent aussi être utilisées. Ces céréales sont préalablement stérilisées, dans des
bocaux en verre (pots de confiture) ou des sacs en plastiques (résistant à la chaleur). Une
cocotte minute peut être utilisée pour la stérilisation des céréales. Après inoculation, le
substrat de colonisation est à son tour placé dans un incubateur jusqu’à ce que le
mycélium le colonise complètement.

Le deuxième objectif est d’inoculer (ensemencer ou larder) un substrat de fructification

avec les céréales colonisées par le mycélium ou autres semis comme celui obtenu sur la
sciure de bois. Chaque espèce de champignon cultivable a ses préférences pour ce
 7

substrat. On devra stériliser ou pasteuriser ce substrat avant de l’ensemencer puis le placer

dans le noir dans un incubateur à une température variable. La plupart des espèces
développent très bien leur mycélium entre 20° et 25°. Lorsque le substrat de fructification
sera complètement colonisé on devra essayer de favoriser la production de champignons
(sporophores) en provoquant un changement de température, d’éclairage, de ventilation et
d’humidité puis contrôler ses paramètres jusqu’à la récolte.

La culture de champignon peut être réalisée en intérieur en appartement, dans un garage

ou une cave, mais aussi en extérieur dans votre jardin ou en forêt.

Figure 2. Schéma de Paul Stamets sur les étapes de la culture d’un champignon.
 8

Figure 3. Simplified diagram of processes in mushroom cultivation DANG

LELAMURNI BINTI ABD. RAZAK ( 2013)
 9

Figure.4. Germination de la spore

Cette germination en culture artificielle est obtenue après isolement de la spore sur
milieu nutritif sur gélose d’agar, d’habitude le PDA (Potatoes Dextrose Agar) et le
MA (Malt extract Agar 1,2 et 4), SDA. Quand la spore germe, un filament mycélien
apparait. Des filaments mycéliens peuvent aussi être obtenus en se servant d’un
morceau de chair « tissu » interne du champignon (clonage). Différents filaments
provenant de la germination de plusieurs spores vont former un feutrage mycélien qui,
lorsqu’il a colonisé complètement le milieu mis à sa disposition et qu’il a touché les
parois du contenant (tube à essai par exemple), il va être transféré sur de nouveaux
milieux où il sera soit conservé au froid. Le transfert ou « bouturage » ou encore
repiquage du mycélium sur de nouveaux milieux peut se faire plusieurs fois à partir
d’une culture-mère (starter). Ce transfert se fait tout au plus 7 fois pour avoir d’autres
cultures sur agar (du T1 au T8, en augmentant de préférence la capacité des contenant)
comme le montre la figure 3.
 10

Figure 4. Multiplication du mycélium sur milieux de culture

La spore qui germe n’a souvent qu’un seul noyau et elle est haploïde (chez les espèces
dites hétérothalliques voir figure 4). Ainsi, cette spore en germant, donne un mycélium
primaire (c’est-à-dire monocaryotique). Très rapidement une fusion (plasmogamie) se
produit entre deux filaments d’un mycélium ou avec d’autres mycéliums pour donner
naissance à un filament possédant deux types de noyaux dont la multiplication
cellulaire est très particulière, par crochet dangeardien ou dangeardie ; c’est le
mycélium secondaire (dicaryotique) dont on se sert pour obtenir le blanc de semis ou
la « semence » du champignon sur un support fait de matériaux divers (qui une fois
envahi par le mycélium deviendront la véritable semence du champignon appelée
blanc de semis). Ces supports sont souvent faits de grains de céréales (maïs, sorgho,
millet, orge, etc), de sciure de bois etc. Dans la nature ce mycélium contournant
d’éventuels obstacles , se propage concentriquement et fructifie à point nommé.
 11

Un moyen simple de distinguer si deux souches de Lentinus edodes par exemple n’en
forme qu’une seule, est d’inoculer une boîte de Pétri avec les deux souches. Si le
mycélium des deux souches pousse entremêlé, il s’agit de la même souche. Si les
souches sont différentes , il se formera une zone distincte (ligne de démarcation ou
zone de confrontation) entre les deux mycéliums. Par cette méthode on peut identifier
90 % des souches de Shii-take mais celles de Pleurotus .

Par le croisement de plusieurs espèces , on peut associer diverses caractéristiques

favorables. Pour l’hybridation c’est le type sexuel du champignon qui doit être pris en
compte. Les champignons présentent des modes de reproduction sexuelle différents :
certains forment des mycéliums fertiles à partir d’une seule spore, tandis que d’autres
ont besoin de deux spores compatibles. Les champignons dont le mycélium secondaire
fertile est issu d’une seule spore sont dits homothalliques. On en distingue deux
sortes : primaire et secondaire. Dans l’homothallisme primaire une seule spore
uninucléée intervient. Dans le type secondaire, les spores possèdent au moins deux
noyaux.

Figure 5. Cycle de vie de Volvariella (à gauche)

comparé à celui d’Agaricus bisporus (droite).

L’hétérothallisme fonctionne différemment. Le mycélium issu d’une seule spore

(mycélium monocaryotique) doit fusionner avec le mycélium provenant d’une spore
compatible. Le système de fusion peut nécessiter un facteur de compatibilité
(unifactoriel= un gène) ou deux (bifactoriel).
 12

Les espèces bifactorielles sont plus faciles à croiser que les espèces homothalliques,
car il est facile de séparer des spores provenant de différentes souches et de les laisser
fusionner. Des techniques spéciales ont donc été mis au point pour croiser aussi des
espèces homothalliques telles qu’Agaricus bisporus étant donné son importance
économique.

Figure 6. Cycle de vie d’Agaricus bitorquis et de Lentinula edodes

Tableau 2. Liste des champignons et de leurs caractéristiques sexuelles

Volvariella volvavacea Homthallisme primaire

Agaricus bisporus Homothallisme secondaire
Agaricus bitorquis Hétérothallisme unifactoriel
Auricularia auricula Hétérothallisme unifactoriel (probable)
Lentinula edodes Hétérothallisme bifactoriel
Pleurotus spp Hétérothallisme bifactoriel
Auricularia cornea Hétérothallisme bifactoriel
Flammulina velutipes Hétérothallisme bifactoriel, bien que présentant parfois des
fructification monocaryotiques
Lentinus spp Hétérothallisme bifactoriel chez beaucoup d’espèces
Tremella fusiformis Hétérothallisme bifactoriel, reproduction asexuée,
compliquée, impliquant à la fois des monocaryotes et des
dicaryotes

Le croisement peut être réalisé par inoculation d’une boîte de Pétri avec deux souches différentes et
isolement du mycélium à partir des lignes de confrontation (voir figure 6)
 13

Figure 7. Croisement intersouche LT 1 et LT2, dans boîte de Pétri(Lentinus squarrosulus)

Figure 8. Sporophores de LT1 et LT2 obtenus Fig. 9. Sporophores de LT3 ( hybrides )

sur les rafles de maïs obtenus les rafles de maïs

2.3. Formation des sporophores

Quand les conditions sont devenues favorables , on voit se former sur le mycélium, de petites boules
(ou petits grains) appelés primordiums ou primordia et contituent la 1ère phase de la fructification. En
culture artificielle on obtient la fructification sur blocs ou ballots mycéliens obtenus sur des supports
colonisés par le mycélium qui sont faits de déchets végétaux d’origines diverses et des rondins
(bûches) de bois. Souvent aux supports de base (sciure de bois , copeaux de bois, pailles diverses
notamment de riz et de blé, rafles de maïs, linter de coton, parche de café, fanes de haricot, d’arachide,
feuilles , rachis et pseudotronc de bananier etc) on ajoute d’autres ingrédients groupés sous le terme
d’additifs pour améliorer la texture du support de base ou pour l’enrichir. On ajoute par exemple la
sciure de bois, le son de riz ou de blé, les farines (soja) et le carbonate de calcium ou tout simplement
la chaux éteinte pour régler le pH car le mycélium a tendance à baisser le pH du milieu lors de la
culture alors qu’il soit proche de la neutralité.

Le sporophore a pour rôle naturel d’émettre des spores c’est-à-dire les cellules de dissémination qui
assurent la pérennité de l’espèce. Souvent pour former ce sporophore le mycélium réagit à un stress
(manque d’eau ou de nutriment dans le substrat : idiophage ) ou tout simplement à un choc de froid.
 14

Fig. 10. Formation des primordia Fig.11. Formation des sporophores

2.1.3. Sporulation

Sauf cas particulier, le sporophore et le mycélium qui l’a produit renferme dans toutes leurs cellules
des noyaux de deux sexes opposés ; il en est de même pour la baside et l’asque dans leur jeunesse.
Mais à certain moment, il s’y produit une fusion entre ces deux noyaux haploïdes, on appelle cette
fusion , fusion dangeardienne, parce que découverte par le grand botaniste français Dangeard et c’est
l’ « acte sexuel » essentiel des champignons ; il a pour résultat la constitution d’un noyau unique
diploïde. Un certain temps après la fusion dangeardienne, le noyau diploïde se divise une ou plusiers
fois de suite, c’est la réduction chromosomique pour le retour à l’état haploïde. Ces noyaux fils ou
seulement certains d’entre eux deviennent ceux de tant de spores qui restent jusqu’au bout dans
l’asque chez les ascomycètes mais sortent rapidement de la baside chez les basidiomycètes à
l’extrémité des stérigmates (formé à partir de la membrane et de la paroi de la baside).

Le cycle de la spore à la spore par l’intermédiaire du mycélium et du carpophore se trouve ainsi

bouclé. Il est à noter cependant que l’hyménium mûrit régulièrement chez les ascomycètes et chez les
basidiomycètes. Chez ces derniers, il existe des cas particuliers :
 15

Chez les coprins, la maturation commence dans la région la plus voisine de l’arête que l’on
voit se colorer la première et s’étend progressivement vers le fond , tandis que le plus souvent
, la lamelle se détruit elle-même par liquefaction ;
Chez les espèces dont les lamelles sont papilionacées ou encore pommelées ou nuageuses
comme par exemple Panaeolus, on observe sur les flancs de »s lamelles, des petites tâches
plus ou moins claires ou foncées qui correspondent à une maturation plus ou moins poussée de
l’hyménium. C’est quand l’hyménium a achevé de mûrir que les spores ont atteint la forme , la
taille, l’aspect définitif, celle-ci sont envoyées hors du sporophore pour accomplir leurs
fonctions reproductrices.

Chez les ascomycètes, les dispositifs très variés assurent, quand la goutte de liquide intérieure de
l’asque atteint une certaine intensité, une véritable projection des spores au loin.(N.B. Il existe des
asques operculés et d’autres inoperculés ).

Figure 13. Sporulation chez les asomycètes

Le mécanisme de libération des basidiospores est beaucoup plus simple et plus uniforme que celui des
ascospores : 5 à 40 secondes avant la projection, on voit sourdre (sortir) au niveau de l’appendice
hilifère (ou hilaire) de la spore une gouttelette de liquide dont le volume s’accroît jusqu’à ce qu’elle
atteigne un diamètre maximum égal à peu près un demi-diamètre de la basidiospore. Si cette
gouttelette n’est pas excrétée ou si elle est trop volumineuse, la projection n’a pas lieu.

Lorsque la gouttelette a atteint son volume normal, la basidiospore est brusquement et violemment
projetée avec la gouttelette attachée à sa surface concave à une distance qui varie de 100µm à 1 mm.
Ce processus de libération varie selon les familles et les genres.
 16

Figure 14. Sporulation chez les basidiomycètes

Chez les champignons souterrains hypogés, qu’ils soient à baside (comme Scleroderma, Calvatia etc)
ou à asque (comme Tuber (Truffe), le péridium ne s’ouvre pas du tout. Il est indéhissant et les spores
ne sont libérées que par putréfaction.

Chapitre III. Culture des champignons ectomycorhiziens

3.1. Qu’ce qu’une mycorhize?

La mycorhize (du grec «mukês» pour champignon et «rhiza» pour racine) est l’association
symbiotique d’un champignon avec les racines d’une plante. En d’autres termes, c’est une
racine colonisée par un champignon mycorhizien qui en a modifié la morphologie. En effet, le
champignon entoure d’un épais tissu de filaments (appelé le mycélium) l’extrémité des
radicelles. C’est ainsi qu’apparaît le manteau fongique. L’aspect des racines mycorhizées
varie largement d’un champignon à l’autre. Près d’un tiers des macromycètes (fructifications
de champignon visibles à l’oeil nu) de nos forêts sont des champignons mycorhiziens. Nous
en comptons quelque 2000 espèces, dont de nombreux champignons comestibles très
appréciés, comme les Truffes, le Bolet cèpe, le Bolet bai, la Russule charbonnière, le Lactaire
délicieux, ou la Chanterelle. Mais beaucoup de champignons vénéneux en font aussi partie; ce
sont entre autres l’Amanite tue-mouches, l’Amanite phalloïde, le Bolet Satan ou le Cortinaire
couleur de rocou. Bon nombre de champignons. Dans le langage populaire, les champignons
représentent ce que l’on cueille en forêt et que l’on met dans son panier. Au sens strict du
terme, cette définition n’est pas correcte car le produit de la récolte n’est que la fructification
du champignon. La partie principale, le mycélium, est un lacis de filaments ouateux qui
pousse dans le sol où il vit, invisible à nos yeux. Ce mycélium forme des fructifications si les
conditions y sont favorables. Les mycéliums peuvent atteindre une taille considérable et vivre
longtemps. Une colonie d’armillaires (Armillaria bulbosa) a été examinée à l’aide de
méthodes moléculaires. Elle occupe 5 ha, pèse dix tonnes et a 1500 ans, selon les estimations.
Ainsi, les champignons font partie des plus gros et des plus vieux organismes vivants.
Aujourd’hui, quelque 70 000 espèces fongiques ont été recensées: on estime à plus d’un
million le nombre d’espèces existant sur notre planète. Elles sont beaucoup plus nombreuses
que les plantes à fleurs. Les champignons présentent des formes les plus diverses: de
l’unicellulaire aux pluricellulaires. Les mycorhiziens sont tributaires d’hôtes spécifiques,
c’est-à-dire qu’ils colonisent des espèces ligneuses bien déterminées et qu’on ne les trouve
que sur ces arbres (comme le Bolet du mélèze ou le Lactaire sanguin de l’épicéa). D’autres ne
sont présents que dans des forêts de feuillus ou de résineux. Les champignons
ectomycorhiziens, ascomycètes et basidiomycètes, sont associés surtout à des espèces
ligneuses de familles telles que les Myrtacées, Pinacées, les Abiétacées, les Fagacées, les
 17

Tiliacées, les Ulmacées et les Salicacées. Les arbres qui dépendent de cette symbiose ne
représentent pas plus de 3 % des taxons végétaux, mais ils constituent cependant les essences
dominantes des forêts des régions boréales, tempérées et montagneuses. En régions tropicales
on dénombre les arbres hôtes d’ectomycorhizes parmi les espèces des familles des Fabacées
(sous familles des Césalpinioïdées), des Dipterocarpacées (Monotes, Dipterocarpus), des
Uapacacées ou Phyllantacées . On les reconnaît les mycorhizes ectotrophes ou
ectomycorhizes par la présence d’un épais manteau fongique qui entoure les radicelles et
progresse entre les cellules corticales Fig. ci-dessous.

ECTOMYCORHIZES

ENDOMYCORHIZES
ECTENDOMYCO
VA
RHIZES
arbutoïdes

ENDOMYCORHIZES ENDOMYCORHIZES
des Ericacées à peloton des
Orchidacées

Figure 15. Schéma de différents types de mycorhizes

 18

Figure 16. Champignon responsable de la mycorhization.

2.3.2. Les étapes de la culture

1 ère étape : Maîtrise du partenaire fongique :

- Isolement en culture pure ;

-production d’inoculum ;
2ème étape : Choix et maîtrise de la plante-hôte (multiplication)
3ème étape :Réalisation de la symbiose

a) Isolement et production d’inoculum

Les champignons ectomycorhiziens peuvent être cultivés en culture pure, isolés de leurs
plantes hôtes, mais ils ne peuvent former des sporophores en l’absence de leur hôte. Diverses
méthodes d’inoculation de jeunes arbres sont possibles ; Marx aux USA en 1976 a utilisé les
spores du champignon Pisolithus tinctorius pour mycorhizer diverses espèces de Pins à raison
de 1,3 1010 spores par m2 de sol.

L’inoculation par spore peut s’effectuer par enrobage des graines de la plante à mycorhizer.
L’autre technique consiste à faire l’inoculation par culture pure du mycélium du champignon.
Actuellement la plupart de chercheurs produisent l’inoculum sur un mélange de tourbe et de
vermiculite saturé par une solution nutritive et cet inoculum est ensuite incorporé au substrat
de culture ou au sol.

Une des méthodes consiste à prélever les radicelles de la plante mycorhizée, ces radicelles
sont stérilisées au peroxyde d’hydrogène (H2O2) pendant 5 secondes et rincées à l’eau stérile
(2 minutes avant eur mise en culture dans des boîtes de Pétri stériles, faisant usage d’un
 19

milieu gélosé de type milieu de Melin Norkkrans modifié (Marx et Bruyan, 1975) aseptisé à
l’autoclave pendant 20 minutes à 120 °C. On ajoute des antibiotiques streptomycine,
chlorotétracycline, dans des proportions 1-1 et du benomyl pour prévenir les contaminations.

Un milieu de Norkkrans modifié contient notamment : 3,75 g/l de dextrose liquide auxquels
on ajoute 306,8 mg/l de fructose et 320 mg/l de sucrose.

Tableau 3. Composition et proportion des ingrédients du milieu MMN

N° 133 NaCl 25 mg/l

N° 117 KH2PO4 500 mg/l
N° 36 (NH4)2HPO4 25 mg/l
N° 50 CaCl2.2(H20) 500 mg/l
N° 121 MgSO4.7(H20) 15 mg/l
N° 69 FeCl2.6(H2O) 10 mg/l

Micro-éléments
KCl 0,20 mM 14,91 g/l
H3BO3 0,10 mM 6,183 g/l
MnSO4.H2O 22 mM 3,718 g/l
ZnSO4 8,0 mM 1,292 g/l
CuSO4 2,1 mM 335,3 mg/l
(NH4)2Mo7O24 58 µM 67,5 mg/l
Ce milieu peut être modifié pour certaines souches (Cenococcum geophilum) par l'ajout de
carbone (MMNC)

N° 219 Hydrolysât de caséine 1 g/l

N° 207 Glucose 2,5 g/l
N° 218 Extrait de malt 10 g/l

- Le MMNC et le MMN peuvent être utilisés liquides ou solides (20g/l d'agar agar - n°200)

Une seringue est utilisée pour prélever le milieu gélosé liquide et inoculer le substrat en sac
(tourbe, vermiculite à raison de 50 ml d’hyphes en suspension par sac, sous la hotte à flux
laminaire. La culture ainsi obtenue après inoculation est utilisée pour l’inoculation du substrat
en pépinière, qui doit être soumis à une période d’incubation de 2,5 mois.

L’inoculation du substrat « mousse de tourbe fumigée au bromure de méthyle » est effectuée

en incorporant l’inoculum dans les proportions de 1 dans 4 par exemple dans une bétonnière
pour répartir l’inoculum le plus uniformément possible dans le substrat.
 20

On peut isoler un morceau de chair interne du sporophore pour démarrer la culture fongique
(Fig. ci-dessous).

b) Choix et maîtrise de la plante-hôte (multiplication) et réalisation de la symbiose

-Les plantes à inoculer sont préparées par micropopagation à partir de boutures. Ces
vitroplants, souvent âgés de 3 mois, présentent un système racinaire bien développé. La tige
aérienne porte quelques feuilles vertes (pour le Chêne 6 à 8 feuilles par exemple.

-Mycorhization contrôlée :

Généralement, dans la nature, les racines des végétaux portent spontanément des mycorhizes :
celles-ci s'installent grâce aux champignons présents naturellement dans le sol. Cependant,
dans les sols très pauvres ou perturbés par l'activité humaine, ou dans le cadre de culture sur
supports "artificiels" (terreau, sol stérilisé...), ces champignons symbiotiques font défaut, et la
plante ne bénéficie pas des avantages de la symbiose mycorhizienne (à savoir : meilleure
résistance à la sécheresse, meilleure utilisation des nutriments du sol, meilleure résistance aux
champignons pathogènes, système racinaire plus dense et plus ramifié, meilleure croissance
du végétal...).

Il est donc intéressant d'apporter des mycorhizes aux végétaux

Le milieu de synthèse mycorhizienne renferme un mélange de tourbe-vermiculite et de la

solution MMN (Marx, 1969). Les proportions, en volume, sont tourbe : 1, vermiculite : 4,
solution MMN : 1,5. Le milieu est stérilisé à 120°C pendant 30 minutes. Puis une petite
quantité d’inoculum (1/10 du volume total) est ajouté au milieu.

Le vitroplants sont prélevés stérilement dans leur tube de culture. Leur système racinaire est
lavé soigneusement par l’eau distillée pour éliminer toute trace de culture, puis ils sont
transplantés sur le mélange tourbe-vermiculite inoculé avec le champignon. Les récipients de
culture (bocaux de 1000 ml ou tubes 300 ml par exemple) sont entourés de parafilm et mis
dans une chambre de culture avec par exemple 10 heures de lumière par jour (cas de la
Chêne).

Après plus ou moins un mois (pour la chêne), les vitroplants repiqués sur le milieu de
mycorhization ont développé un système racinaire important. Certaines racines appliquées sur
la paroi de verre des récipients peuvent être observées directement sous la loupe binoculaire.
 21

Fig. Culture sur gélose Fig. Culture sur milieu liquide Fig. Prélèvement

Notamment milieu de Pachlewiski

 22

Fig. Substrat de production des champignons (tourbe fumigée)

 23

Figure : Schéma montrant la succession et la diversité fongiques en fonction du vieillissement de

l’écosystème forestier (D’après J. Guinberteau).

Exemples EcM comestibles : Suillus, Lactarius (sect. Dapetes ou Deliciosi), Tuber

Cas des EcM non comestibles mais auxiliaires de croissance
Laccaria, Hebeloma, Scleroderma, Rhizopogon, Pisolithus,Telephora,

C) Fonctions de la mycorhize

1° Un échange d’éléments nutritifs

vitaux

La mycorhize est un organisme dans lequel l’arbre et le champignon mycorhizien s’échangent

des matières – un peu comme à la bourse. Tandis que l’arbre fournit au champignon les sucres
élaborés lors de la photosynthèse, ce dernier lui offre en échange des éléments nutritifs,
comme l’azote (N) et le phosphore (P), qu’il a prélevés dans de minuscules espaces poraux du
sol, à l’aide de ses hyphes fins. Étant donné que les hyphes se répandent largement dans le
sol, la surface d’absorption est beaucoup plus grande que celle occupée par les poils
absorbants des plantes non mycorhizées (fig. 6). Ainsi, les tissus des plantes mycorhizées
contiennent souvent des concentrations accrues d’azote et de phosphore (fig. 5). L’échange de
ces éléments entre le champignon et l’arbre passe par une zone spécifique appelée le réseau
intercellulaire de Hartig (d’après T. Hartig, botaniste forestier allemand). Ce réseau est
composé d’un épais tissu fongique qui s’installe entre les cellules racinaires et les radicelles,
assurant ainsi un contact étroit entre les deux partenaires. Si l’on observe au microscope la
 24

coupe transversale d’une mycorhize, on voit que son tissu fongique ressemble à un filet, d’où
le nom de réseau de Hartig. Le manteau fongique et le réseau de Hartig ont la particularité
d’emmagasiner le phosphore et de l’accumuler sous forme de polyphosphates à longue
chaîne, ou granule de polyphosphates, qui sont stockés dans les cellules fongiques sous forme
solide. Le développement d’une mycorhize dure de quelques jours à quelques semaines.Il a
pour effet de stopper la croissance longitudinale des radicelles et d’inhiber la formation des
poils absorbants (fig. 3). Les hyphes de la mycorhizeprélèvent alors pour les racines les
éléments nutritifs et l’eau nécessaires à l’arbre. Une mycorhize vit généralement durant une
ou deux périodes de végétation. Mais sa présence n’empêche pas les racines, au printemps, de
s’extraire du manteau fongique qui les entoure ni d’être colonisées par un nouveau
champignon mycorhizien

Fig.. Les hyphes d’un champignon mycorhizien se répandent largement dans le sol et
augmentent ainsi la surface d’absorption d’eau et d’éléments nutritifs. Ces derniers sont
transportés directement aux mycorhizes par la voie des rhizomorphes (cordon composé
d’hyphes mycorhiziens).
 25

2°. Protection contre les polluants

Les mycorhizes protègent aussi l’arbre des effets toxiques des polluants. Depuis le début de
l’industrialisation au 19e siècle, les émissions de polluants contiennent entre autres des
métaux lourds qui se déposent aussi en forêt. Si certains de ces éléments, tels le fer, le zinc ou
le cuivre, sont indispensables à la plante, d’autres sont toxiques, comme le plomb, le
cadmium, le nickel, le mercure ou le chrome. Les métaux lourds n’étant pas décomposables,
ils s’accumulent dans la biosphère et constituent ainsi un danger croissant pour les organismes
vivants. Mais une partie des champignons mycorhiziens y résistent particulièrement bien,
même lorsque leurs teneurs dans le sol sont élevées. Tout comme l’aluminium, certains
métaux lourds se fixent dans le mycélium; on les trouve dans les granules de polyphosphates,
à l’intérieur des cellules, sur les parois et noyaux cellulaires ainsi que dans des protéines
spéciales (fig. 8). Chez les plantes mycorhizées, ils sont retenus dans le manteau fongique
déjà et ils ne parviennent à la racine de la plante qu’en quantités réduites. Ici, la mycorhize est
comparable à un filtre. Le revers de la médaille: ces métaux lourds s’accumulent dans les
fructifications du champignon, au risque de rendre les champignons comestibles impropres à
la consommation. Les substances radioactives ont un comportement semblable. Elles sont
aussi véhiculées par l’air et se déposent en forêt. Du césium radioactif fut identifié pour la
première fois après les essais nucléaires dans les années 50 et 60. En Europe, la principale
source de radioactivité a été créée par la catastrophe de Tschernobyl, en 1986. Tout comme le
strontium, le césium fait partie des substances radioactives les plus significatives, notamment
à cause de sa longue demi-vie biologique (30 ans). Dans nos sols forestiers, les teneurs en
césium radioactif varient largement. Les valeurs les plus élevées ont été mesurées au Tessin.
Le césium contenu dans le sol se fixe aux champignons et aux bactéries. C’est pour cela que
les plantes n’en absorbent que de petites quantités et qu’il ne peut être éliminé de
l’écosystème. Au même titre que les métaux lourds, le césium s’accumule dans les hyphes;
ses concentrations sont parfois très élevées, notamment dans les fructifications de certains
champignons mycorhiziens.

3° Autres fonctions des mycorhizes

Comme nous l’avons déjà mentionné, les mycorhizes favorisent l’absorption par les racines
des éléments nutritifs et de l’eau et améliorent la protection de la plante contre les polluants.
Par ailleurs, les plantes mycorhizées tolèrent mieux les facteurs stressants d’ordre abiotique et
biotique. Le champignon élabore des sucres, comme le mannitol ou l’arabitol, qui rendent les
racines plus résistantes au gel. En outre, il synthétise des antibiotiques, induit la formation du
tanin et favorise la flore microbienne dans le manteau fongique, ce qui augmente le pouvoir
défensif des plantes contre les pathogènes contenus dans le sol. Enfin, les phytohormones
formées par les champignons mycorhiziens (p. ex. auxine, gibérelline, cytokynine, éthylène)
favorisent la croissance des plantes.

4° Les champignons mycorhiziens et les interventions sylvicoles

Les champignons mycorhiziens et les arbres forestiers vivent en interdépendance. Si l’un des
partenaires est en mauvaise santé, l’autre en souffre. Ainsi, dès qu’un arbre est abattu par le
vent ou récolté lors d’une coupe de réalisation, le champignon mycorhizien ne fructifie plus
car son partenaire ne lui fournit plus les hydrates de carbone dont il a besoin. Si le
champignon ne trouve pas un nouveau partenaire, il peut encore vivre quelques années grâce
aux réserves d’hydrates de carbone présentes dans le rhizome. Mais ces ressources ne sont pas
suffisantes pourqu’il puisse former des fructifications.
 26

Que faire lorsque des arbres sont abattus ou arrachés par vent? Lors du déblaiement de ces
zones, le plus grand soin devrait être accordé aux jeunes arbres encore sur pied. Ils sont un
véritable refuge pour les champignons mycorhiziens qui ont perdu leur partenaire et ils les
aident à s’implanter dans la nouvelle génération d’arbres.

Chapitre IV. Conditions de production des sporophores de champignons saprotrophes

3.1. Compatibilité et mécanisme de fusion entre deux mycéliums

3.1.1. Notions de compatibilité et de fertilité

La spore est libérée de la baside ou de l’asque quand le basidiome (sporophore) ou l’ascome

(stroma de fructification) a atteint sa maturité, elle peut germer et engendrer un mycélium,
mais celui-ci ne fructifie qu’après sa rencontre et sa fusion avec un second mycélium portant
l’information génétique complémentaire : un « hétérocaryon » se forme et le cycle
recommence. Les diverses espèces présentent de nombreuses variations par rapport à ce
schéma simple. L’exception la plus typique est celle du champignon de couche dont le nom
latin Agaricus bisporus, indique que la baside porte seulement deux spores, avec chacune 2
noyaux à son sein. Le mycélium issu de telles spores est directement fertile, sans fusion avec
un autre mycélium. Ainsi le champignon de couche est plus facile à cultiver, parce que l’on
obtient facilement des mycéliums fertiles. Pour la majorité des basidiomycètes, les fusions
entre mycéliums complémentaires ne sont pas toujours possibles car deux systèmes
génétiques d’incompatibilité empêchent certains mariages. Le premier est un système
bipolaire que l’on trouve notamment chez les coprins : un mycélium n’est fertile que s’il
résulte de la fusion entre un mycélium possédant la forme ( +) d’un gène, et un mycélium
possédant la forme (-) du même gène ; les combinaisons (+) X (+) ou (-) X(-) sont stériles.

D’autre part, les pleurotes et les lentins, par exemple comportent un système plus complexe,
« tétrapolaire », qui met en jeu deux gènes A et B et leurs diverses formes ou allèles A1,A2….et
B1,B2….Les croisement entre des mycéliums monocaryotiques ou monocaryons respectivement de
type A1B1et A2B2 (ou A1B2, A2B1) sont fertiles et engendrent quatre types de spores : A1B1, A2B2,
A1B2, A2B1. En revanche, la présence d’un allèle commun (par exemple A1B1 et A1B2) ou de deux
allèles communs (A1B1 et A1B1) supprime la fertilité du mycélium résultant d e la fusion. Ces
limitations de mariages handicapent l’amélioration génétique des espèces mais ils n’interdisent pas les
croisement dans la nature, entre un mycélium A1B1 et un filament émis par une spore provenant d’un
autre champignon, possédant des allèles tous différents (A3B3 et A4B4). Dans tous ces cas, les
résultat sera fertile. Ce système permet des recombinaisons et favorise la diversité de la population.

3.1.2. Mécanisme de fusion entre deux mycélium complémentaires

Naturellement les fusions possibles n’ont lieu que si les mycéliums qui se sont rencontrés ont
« reconnu » qu’ils appartiennent à la même espèce : la fusion n’a lieu que si les parois cellulaires se
sont dissoutes au point de contact et que si les filaments ont accepté ou donné un noyau
complémentaire ; comme beaucoup de systèmes biologiques, la tendance est à un rejet du non-soi, au
profit du soi. Les systèmes d’incompatibilité végétative restent mal connus chez les basidiomycètes, et
on s’interroge sur leur rôle dans la formation des réseaux et sur le maintien (en cohabitation, voire en
compétition, mais non en coopération) de deux réseaux voisins issus des spores du même sporophore ;
ils pourraient réduire les possibilités d’exploitation du sol (substrat). Le phénomène particuli-rement
aigu dans le cas du champignon de couche ; le mycélium fertile d’une variété peut fusionner avec celui
de toute colonie de la même espèce, mais de patrimoine génétique différent provoque la stérilité de
l’ensemble.
 27

3.1.3. Importance de la connaissance des caractéristiques de reproduction.

Les caractéristiques reproductives déterminent les techniques de production du matériel fongique

utilisé pour l’ensemencement des supports de culture. Comme tout cultivateur, le champignonniste
« sème », bien que ce qu’il sème ne soit pas une semence, c’(est-à-dire un ovule fécondé (comme la
graine , pour le champignon la spore), mais du « blanc » du mycélium pur u axénique, c’est-à-dire un
mycélium produit par avance dans des conditions aseptiques.

Notons que seuls les laboratoires de génétique (ou de biologie) recourent à des spores afin de réaliser
des croisements contrôlés et délicats. Le cultivateur a besoin d’un matériel homogène stable, et produit
en grande quantité. On obtient par multiplication végétative, c’est-à-dire par « bouturage » sur un
support solide, par exemple des grains de céréales, du mycélium et on le repartit ultérieurement sur un
support nutritif (pailles, rafles, etc.) pour les saprotrophes ou système racinaire pour les mycorhiziens.

3.1.4. Aperçu sur les substrats de production et sur les milieux de culture multiplication du
mycélium

3.1.4.1.. Principe de culture pure

Le principe est d’ensemencer des spores ou des fragments de thalle sur des milieux préalablement
stérilisés et combinés de manière à offrir aux champignons les aliments qui peuvent les mieux
favoriser leur développement.

La mycologie emprunte à la bactériologie les principes de cultures en phase stérile sur milieux
stérilisés de façon à assurer la pureté de la culture. Mais la préparation ey la composition des milieux
sont différentes. Les milieux des bactériologistes sont en principe neutralisés et à base des bouillons de
viande. Les milieux des mycologues sont de préférence acides ou à pH voisin à des pH neutres, l’azote
l’y est présenté par de la peptone et non par du bouillon des viandes.
D’autres milieux ne cesse d’être testé, il s’agit par exemple le carton. Le carton est un milieu de
culture « selectif » car il est pauvre en nutriment et sucre. La plupart des contaminants ont besoin de
sucre dans le substrat pour se développer. Ils les trouve sur la gélose d’agar où ils peuvent entrer en
compétition avec le mycélium alors que le mycélium (d’espèces poussant sur du bois) peut se
contenter de carton. Lors du clonage d’un champignon sur carton, le mycélium pousse sur un substrat
qui augmente les chances de stérilité de la culture. l s’agira de découper un morceau de carton (brun et
non imprimé_ d’environ 3 cm de côté et de le tremper dans l’eau enrichie avec un peu de sucre (5 g de
sucre dans 100 ml d’eau).

3.1.4.2. Types de milieux

Les champignons ont besoins dans leur alimentation des matières organiques et la connaissance des
besoins nutritionnels des champignons a abouti à la connaissance des milieux de culture.
On peut diviser les milieux en trois catégories : milieux naturels, milieux semi-synthétiques et milieux
synthétiques.
- Les milieux naturels sont des milieux de composition chimique indéfinie ;
- Les milieux semi-synthétiques sont des milieux de composition naturelle, dans lesquels on
ajoute quelques oligo-éléments et des substances de croissance en quantité définie comme par
exemple la thiamine.
- Les milieux synthétiques sont des milieux auxquels on a composé des substances.
Pour composer ces milieux, on doit avoir :
• Une source de carbone (glucides) ;
• Une source d’azote ;
• Une source d’éléments minéraux.
Les milieux synthétiques sont dans certains cas non seulement utiles mais nécessaires par exemple
pour les travaux de physiologie, pour étudier la valeur de tel ou tel aliment ou encore pour obtenir un
rendement pondéral maximum.
 28

Les milieux naturels les plus utilisés sont : racines des carottes (Daucus carotta) , les tubercules de
pomme de terre ou de patate douce , les grains de céréales (blé, orge, riz), les crottins de chéval.

Les principaux milieux utilisés dans notre laboratoire de myciculture sont le PDA (Potato Dextrose
Agar) , MA (Malt Extract Agar), SDA (Son, Dextrose Agar).

En règle générale, on parle des milieux pauvres et des milieux riches. Un milieu riche est celui qui
compred tous les éléments nécessaires à la croissance tandis qu’un milieu pauvre contient peu de
glucides et pousse les organismes à entrer dans une phase de la reproduction sexuée. De ce fait, les
milieux pauvres sont utilisés pour éviter la différenciation des champignons.

3.1.4.3. Qualités d’un bon substrat de fructification

Un bon substrat de fructification doit :

- Assurer une bonne aération au mycélium ;
- Avoir une bonne texture (composition physico-chimique adéquate en faisant une bonne
combinaison des ingrédients et un mélange homogène), ainsi les particules qui le composent
ne sont ni trop liées ni trop peu liées ;
- Avoir une bonne capacité de rétention d’eau.

Chapitre V. Conservation des souches

5.1. Pourquoi conserver ?

Au bout d’un certain temps d’utilisation, une souche peut perdre certaines de ses caractéristiques
génétiques qui la rendaient intéressante. Une culture à partir d’une souche dégénérée engendrera une
culture dégénérée. Il faut donc s’attacher à conserver les caractères génétiques. Les cellules des
champignons peuvent dégénérer du fait du manque de substances nutritives, ou d’oxygène, d’infection
(notamment par des virus), de modifications du pH du substrat, et d’une accumulation de métabolites
défavorables.

L’objectif de la préservation des souches est de ralentir le taux de croissance, mais aussi de conserver
la vigueur et la stabilité génétique du mycélium pur. Chaque centre de recherche et fabriquant du blanc
doit posséder ses propres collections, certains préservent plusieurs milliers de souches (cas de la
Mycothèque de l’Université Catholique de Louvain-la-Neuve, MUCL qui préserve plus de 3500
souches), d’autres ne préservent que les souches qu’ils utilisent régulièrement.

5.2. Précaution à prendre pour mieux conserver les souches

On doit étiqueter correctement chaque culture, de façon fiable. Sans étiquetage, il est impossible de
reconnaître la souche dont il s’agit. Dans les grandes collections, les éprouvettes sont étiquetées sous
leur nom scientifique et leur numéro de collection. On peut ajouter au numéro de collection, le numéro
de culture pour retrouver rapidement une culture. La préparation et la maintenance de collection
nécessitent des connaissances spécialisées dans différents domaines, tels que la taxonomie et
techniques microbiologiques. Les petites entreprises de culture des champignons ne peuvent conserver
que leurs propres cultures dans de bonnes conditions. Se procurer des cultures ou blancs auprès
d’institutions scientifiques ou producteurs de blanc est préférable.

5.3. Techniques de conservation

Plusieurs techniques ont été développées pour préserver les cultures :

- Transfert sur l’agar ;
- Transfert de la culture sur agar dans l’huile minérale,
- Transfert de la culture sur agar dans l’eau déminéralisée au réfrigérateur ;
- Congélation cryogénique et
 29

- Lyophilisation.

4.3.1. Transfert sur agar

Cette technique présente des risques de rupture et de dégénérescence car la culture est encore en
croissance. Par contre c’est une technique simple et réalisable dans n’importe quel laboratoire de
blanc. C’est une technique très laborieuse car elle demande beaucoup de main-d’œuvre lorsqu’il faut
préserver un grand nombre de souches. Aussi il faut transférer les souches tous les 2 à 6 mois. Cette
technique est identique au repiquage pour le blanc. Une fois que l’on a obtenu la culture pure du
champignon désiré, il faut la multiplier, inoculer davantage de tubes. Le nombre de transferts se
limitera à 7 ; il faut étiqueter les cultures d’origine isolées T1, les tubes suivants T2 (isolés à partir de
T1), T3 (isolés de T2), etc. Ne pas aller au-delà de T7 pour l’inoculation finale du blanc. Si les cultures
successives poussent sur le même milieu, la dégénérescence se produira plus vite que si l’on passe
alternativement d’un milieu pauvre à un milieu riche en substances nutritives. Les cultures peuvent
être protégées du desséchement en obturant les tubes avec de la paraffine mélangée à de la cire. Si des
acariens s’introduisent dans les cultures, les souches se trouvent menacées. Les acariens transportent
avec eux toutes sortes de contaminants et de morceaux de mycélium qui compromettent la pureté de la
culture. Couvrir les bouchons de cultures avec du papier à cigarette qui laisse l’air, arrête les acariens.

4.3.2. Culture sur agar conservée dans l’huile minérale

Les cultures stockées sous huile minérale peuvent aussi bien être conservées à température ambiante
ou au réfrigérateur. L’huile empêche l’infection par des acariens et évite à l’agar de se dessécher. Il
faut stériliser l’huile pendant une demi-heure et, quand elle est refroidie, la verser sur les cultures en
observant les règles d’asepsie.
On devra utiliser de l’huile d’une densité spécifique de 0,865 à 0,890, et des tubes à essai minus de
bouchons à vis ou des bouteilles. Quand on désire utiliser cette culture il faut d’abord égoutter l’huile
(la conserver pou pouvoir la réutiliser après sa stérilisation).

4.3.3. . Culture sur agar conservée dans l’eau déminéralisée au réfrigérateur

Cette technique consiste à transférer des section d’agar totalement envahies de mycélium dans de
nouveaux tubes à essai. Une technique simple consiste à faire pousser la culture sur un milieu d’agar et
à conserver des petits morceaux d’agar colonisé flottant dans de l’eau déminéralisée. Si l’on utilise des
bouteilles de 100 ml, il faut les remplir de 75 ml d’eau déminéralisée. Stériliser des bouteilles pendant
deux heures, les laisser refroidir puis réaliser un transfert aseptique des petits éléments de culture
d’agar. Disposer 3 ou 4 morceaux de 0,5 X 0,5 mm dans chaque bouteille. Par précaution, inoculer
toujours au moins 3 bouteilles de chaque souche. On peut facilement récupérer les souches en
prélevant un morceau d’agar et en le transférant dans un nouveau tube. Cette opération n’est pas aussi
salissante qu’avec l’huile minérale. Les souches peuvent être conservées pendant au moins un an sans
perdre de leur vigueur (excepté Volvariella volvacea).

4.3.4. Congélation cryogénique

La cryogénie est l'étude et la production des basses températures (inférieures à −150 °C ou

120 K). La cryoconservation a pour but de suspendre l'évolution des cellules et de pouvoir
les remettre en mouvement par la suite. Elle est utilisée pour conserver le sperme, les tissus
etc. Ainsi, la congélation cryogénique est la meilleure méthode de préservation des souches,
mais aussi la plus chère. Seuls les grands instituts de recherche et les entreprises de blanc
peuvent s’offrir de l’azote et des conteneurs d’azote. Il faut des biologistes spécialisés et des
assistants de laboratoire pour entretenir l’équipement. Les ampoules sous vide contenant le
mycélium sont maintenues à une température de – 150 à – 180°C (vapeur d’azote) ou à -
196°C (azote liquide). A cette température, aucune croissance mycélienne n’est possible. Par
 30

contre, le mycélium conserve toutes ses caractéristiques génétiques ; il suffira ensuite de le

« réveiller ».

Si l’on réussit à isoler un mutant aux caractères intéressants (tels qu’une température de fructification
supérieure à la plupart des souches de l’espèce, de meilleur rendement sur un substrat particulier, une
colonisation plus rapide, etc.), il faut en faire parvenir à l’une des grandes collections mondiales de
cultures types. Il est possible, contre paiement, de réserver la souche à son propre usage. On peut aussi
la diffuser sous forme de commandes passées par des intéressés, auprès de scientifiques et des
fabricants de blanc du monde entier.

4.3.5. Lyophilisation

La lyophilisation, appelée autrefois cryodessiccation, est une opération de déshydratation à basse

température qui consiste à éliminer par sublimation, la majeure partie de l’eau contenue dans un
produit. Elle autorise une conservation à long terme grâce à l’abaissement de l’activité de l’eau du
produit.
La lyophilisation extrait rapidement l’eau. Les cultures de champignons ne peuvent se conserver de
cette manière, mais les spores restent viables plus de 20 ans. Les spores sont de préférence prélevées
sur un jeune champignon, au voile encore fermé et on laisse le champignon s’ouvrir et libérer ses
spores sous conditions stériles. L’empreinte de la spore (ou sporée) est congelée-desséchée. Il faut se
souvenir qu’une culture dérivant de spores peut différer du mycélium parent. Si l’on utilise une
multitude de spores pour obtenir une nouvelle culture, les caractères seront alors probablement très
semblables à ceux d’origine. La lyophilisation requiert un équipement spécial, la technique par contre
est assez simple. Une fois lyophilisés, les champignons se conservent à température ambiante ou dans
un réfrigérateur.
 31

La lyophilisation consiste à ôter l’eau d’un produit liquide, pâteux ou solide, à l’aide de la
surgélation puis une évaporation sous vide de la glace sans la faire fondre. Le principe de base
est que lorsqu’on réchauffe de l’eau à l’état solide à très basse pression, l’eau se sublime,
c’est-à-dire qu’elle passe directement de l’état solide à l’état gazeux. La vapeur d’eau (ou de
tout autre solvant) quitte le produit et on la capture par congélation à l’aide d’un condenseur,
ou piège froid. Cette technique permet de conserver à la fois le volume, l’aspect et les
propriétés du produit traité. Elle peut avoir lieu naturellement (séchage en montagne), ou, plus
rapidement, dans un lyophilisateur.

On distingue trois phases majeures dans un cycle de lyophilisation :

• la congélation, où les produits sont réfrigérés à des températures de l’ordre de −20 °C à

−80 °C ; l’eau se transforme alors en glace.
• la dessiccation primaire, sous vide, qui consiste à sublimer la glace libre (interstitielle), donc
sans effet d’ébullition (pas d’eau en phase liquide).
• la dessiccation secondaire, qui permet d’extraire par désorption les molécules d’eau piégées à
la surface des produits séchés.

À la fin du cycle, le produit ne contient plus que 1 % à 5 % d’eau, ce qui est extrêmement
faible.

Chapitre V. Aperçu sur la culture des lichens

5.1. Isolement et culture du phycosymbionte

Malgré d’importants travaux anciens (Chodat, Jaag, Waren…) ou plus récents (Ahmadjan, Geitler,
Henssen, Tschermak…) les phycosymbiontes des lichens sont encore trop mal connus. L’une des
difficultés principales réside dans le fait qu’ils n’ont souvent, au sein de lichen ni le même aspect
morphologique ni les mêms comportements biologiques que lorsqu’ils sont libres dans la nature ou
isolés en culture pure in vitro : de plus leur isolement même en masse, par centrifugation ou
 32

individuellement par micromanipulation est difficile et source d’erreurs car les algues et des
cyanobactéries épiphytes vivent à la surface du lichen, et peuvent se trouver isolés à la place du
véritable phycosymbionte.

5.2. Isolement et culture du mycosymbionte

Le mycosymbionte peut être isolé en culture pure grâce aux techiniques mises au point par Werner
(1927) pour la récolte et l’ensemencement des spores ; mais la croissance est fort lente. Souvent les
spores ne germent pas et on peut aussi isoler pour les mettre en culture, parfois avec succès un fiament
du champignon par micromanipulation (Ahmadjan, 1967). Quelle que soit la méthode adoptée, les
risques de contamination sont d’autant plus grand qu’il est à peu près impossible de désinfecter le
lichen d’origine sans le tuer lui-même et que la vitesse de croissance de la culture est extrêmement
lente.
Une autre méthode mise au point en 1963 par Ahmadjan permet la culture du mycosymbionte du
lichen en réhydratant le lichen et en découpant un organe reproducteur ; cette fructification est collée
au couvercle d’une boîte de Pétri, les spores sont éjaculées, se collent sur la gélose. Une spore qui a
germé est transférée sur un cube de gélose dans un tube de culture où elle donne naissance à un amas
de filaments à l’origine de la culture du mycosymbionte.

5.3. Culture et synthèse du lichen

Des essais de synthèse artificielle de lichens à partir de 2 symbiontes ont été aussi fait dans des
conditions définies sur un milieu contenant un extrait de terre. Les nombreuses tentatives indiquent
toutes qu’un desséchement et un milieu peu nutritif sont des conditions essentielles pour réussir un
début de synthèse ; il a un enroulement des hyphes mycéliens autour des cellules algales etc.
Ahmadjan, Jacobs et Russel (1978) au microscope à balayage, ont mis en évidence chez Lecidea
alboreatrulescens l’émission par le phycosymbionte d’un revêtement extracellulaire semblant jouer un
rôle dans l’attachement du mycosymbionte et dans la reconnaissance de deux partenaires. Dans le
même temps en utilisant la mycosymbionte du Peltigera polydactyla et diverses algues, Lockard,
Rowell et Stewart mettaient en évidence le rôle de phytohemaglutinine pour la reconnaissance de deux
partenaires.

Les travaux de Scott (1959) ont montré que la germination des spores du mycosymbionte ne pouvait
intervenir qu’en présence d’un extrait aqueux du phycosymbionte. Il est donc vraisemblable qu’une
substance hydrosoluble émise par le partenaire phycosymbionte joue un rôle inducteur.

Le mycosymbionte obéit donc au cours du développement du thalle lichenique aux inductions émises
par le partenaire phytosymbionte. Mais lorsqu’il est cultivé isolement le mycosymbionte est capable
d’un grand nombre de comportement morphogénétiques différents.

Ainsi, le mycosymbionte possède une plasticité morphogénétique remarquable, en d’autres termes, des
potentialités génétiques fort nombreuses au niveau de la morphogénèse et sans doute à d’autres
niveaux qui ne s’expriment que lorsqu’elles sont induites par des conditions convenables.

L’évolution a donc laissé subsisté des « gènes inutiles » ou des gènes délétères comme l’indique la très
faible vitesse de croissance du mycosymbionte ainsi cultivé (de quelques mm à 1ou 2 cm/an) ; cette
même évolution ; au lieu d’opérer une sélection des gènes, a sélectionné le mécanisme d’induction et
de régulation entre symbiontes, mécanisme qui habituellement s’exerce au cours de l’ontogénèse entre
cellules génétiquement semblables issues d’une même cellule mère par mitoses successives. C’est là
l’originalité évolutive de la symbiose lichenique.

Bibliographie