UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO (UFOP)

DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA

LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA E BIOTECNOLOGIA DE

LEVEDURAS (LBBL)

Cíntia de Castro Severiano

Ouro Preto 2013

1|Página
Cíntia de Castro Severiano

Relatório técnico apresentado como requisito

parcial para obtenção de aprovação na
disciplina Biotecnologia II – FAR 408, no
Curso de Farmácia, na Universidade Federal
de Ouro Preto.
Prof.Rogeri Lopes Brandão
Florência Alvarez

Ouro Preto 2013

2|Página
 RESUMO
A biotecnologia é uma área que se destaca cada vez mais no cenário
econômico nacional, recebendo investimentos públicos e privados para a
pesquisas científicas.O biotecnólogo precisa desenvolver habilidades
técnico-científicas para criar e aprimorar produtos e processos na área da
saúde humana, animal, pecuária, agricultura, indústria, prestação de
serviços, proteção e sustentabilidade do meio ambiente. Assim, os módulos
apresentados pelo curso, visam aplicar o aluno em âmbito prático e
fornecer conhecimento e experiência na área da biotecnologia. Estes
módulos e seus decorrentes resultados serão apresentados e discutidos no
presente trabalho em forma de relatório final.
Palavras chave: Biotecnologia, área prática, relatório final.

3|Página
 Sumário

INTRODUÇÃO...................................................................................6
MÓDULO I..........................................................................................7
Crescimento de Fusarium oxyspoum em diferentes fontes de carbono.

Introdução..............................................................................7
Objetivo.......................................................................................7
Desenvolvimento
Preparação do inóculo...........................................................................................7
Curva de crescimento............................................................................................7
Medição do pH......................................................................................................8
Medição do peso seco...........................................................................................8
Medição da densidade óptica................................................................................8
Gráficos e análise dos resultados..........................................................................8
Conclusão...................................................................................15
MÓDULO II........................................................................................16
Produção da enzima β-galactosidase de Fusarium oxysporum.

Introdução.............................................................................16
Objetivo......................................................................................15
Desenvolvimento
Preparação dos reagentes.....................................................................................16
Obtenção do extrato protéico...............................................................................17
Quantificação da atividade da β-galactosidase.....................................................17
Produção da β-galactosidase de F.oxysporum.....................................................18
Resultados.................................................................................19
Conclusão..................................................................................21
MÓDULO III....................................................................................22
Introdução.................................................................................22
Objetivo.....................................................................................22
Desenvolvimento
Cromatografia de troca iônica.............................................................................23
Cromatografia de filtração molecular.................................................................25
Eletroforese em gel de poliacrilamida.................................................................26

4|Página
 Tabela de purificação....................................................................................29
Conclusão.............................................................................29
MÓDULO IV................................................................................30
Introdução............................................................................30
Objetivo................................................................................30
Desenvolvimento
Obtenção do fermento...................................................................................31
Produção do mosto........................................................................................32
Maltagem.......................................................................................................33
Brasagem.......................................................................................................34
Fermentação..................................................................................................37
Maturação......................................................................................................38
Envase e engarrafamento...............................................................................39
Conclusão..............................................................................39

5|Página
 INTRODUÇÃO

Biotecnologia define-se pelo uso de conhecimentos sobre os processos biológicos e sobre as

propriedades dos seres vivos, com o fim de resolver problemas e criar produtos de utilidade. A
definição ampla de biotecnologia é o uso de organismos vivos ou parte deles, para a produção
de bens e serviços. Nesta definição se enquadram um conjunto de atividades que o homem vem
desenvolvendo há milhares de anos, como a produção de alimentos fermentados
(pão, vinho, iogurte, cerveja, e outros). Por outro lado a biotecnologia moderna se considera
aquela que faz uso da informação genética, incorporando técnicas de DNA recombinante.
Neste trabalho realizou-se estudos sobre o crescimento do fungo Fusarium oxysporum, da
produção da enzima β-galactosidase de Fusarium oxysporum e de seus métodos de purificação,
e posteriormente, fermentação alcoólica. Os fungos tem sido cada vez mais utilizados para
produção de substâncias de interesse industrial e médico, como na produção de etanol através de
fermentação; ou outros biocombustíveis, antibióticos, vitaminas, aminoácidos entre outros, já as
bebidas alcoólicas são produzidas através da fermentação do açúcar por diversos fungos. Assim,
por seu amplo campo de aplicação, o estudo do comportamento desses fungos e possíveis
aplicações têm se tornado cada vez mais imprescindível para o desenvolvimento de novas
tecnologias.

6|Página
 MÓDULO I
Crescimento de Fusarium oxysporum em diferentes
fontes de carbono.

INTRODUÇÃO
Os fungos são organismos encontrados em todos os ecossistemas da terra. O reino
Fungi é um grande grupo de organismos eucariotas, que inclui micro-organismos tais
como as leveduras, os bolores, bem como os mais familiares cogumelos.A capacidade
dos fungos de usar diferentes fontes de carbono determinará se ele poderá se
desenvolver sob determinadas condições e esse fator é muito importante quando se
pensa em utilizá-los em processos industriais como por exemplo, na produção de
antibióticos, enzimas, etanol, etc. O fungo Fusarium oxysporum é utilizado
industrialmente na produção de enzimas e outras substâncias, e na agricultura, embora
muitas vezes seja inofensiva, muitas cepas dentro do complexo F. oxysporum são
patogênicos para as plantas.

OBJETIVO:
Avaliar qual melhor fonte de carbono para o crescimento de Fusarium oxysporum e
qual melhor parâmetro (pH, densidade óptica ou peso seco) para acompanhamento
deste crescimento.

DESENVOLVIMENTO:

1)Preparação do inóculo
Um fragmento de hifas crescidas de F.oxysporum foi inoculado em meio ágar batata
dextrose (BDA) e incubado por 4 dias em estufa a 30° C. O meio BDA é ideal para
promover a esporulação do fungo. Foi preparada uma lâmina e os esporos de
F.oxysporum foram observados ao microscópio.

2)Curva de crescimento
Após 4 dias pegou-se três tubos de BDA contendo o inóculo e adicionou-se 8 mL de
água estéril a cada um. Raspou-se o ágar para soltar o fungo e a suspensão foi
transferida pra um erlenmeyer e misturou-se de forma que o ‘’pool’’de esporos ficasse
homogêneo.
Foram inoculados 10 mL da suspensão de esporos em 3 erlenmeyers com 100mL de
YP contendo diferentes fontes de carbono (sacarose, glicose e lactose). Os erlenmeyers
contendo as culturas foram colocados em agitador do tipo ‘’shaker’’ (30°C/200 r.p.m)
pra que houvesse o crescimento.
A cada 12 horas, aproximadamente, por um período de 72 horas foram coletadas
alíquotas de 5 mL para medida do pH, 1 mL para medida do peso seco e 1 mL para
densidade óptica.

7|Página
3)Medição do pH
O eletrodo foi retirado da solução de KCl 3M , lavado com água destilada e seco com
papel higiênico. Inseriu-se o eletrodo na solução a ser medida e ligou-se o aparelho.
Após estabilização do pH a medida foi anotada e o aparelho desligado. Lavou-se o
eletrodo com água destilada e inseriu-o novamente na solução de KCl 3M.

4)Medição do peso seco:

Pesou-se eppendorfs de 1,5 mL vazios. Adicionou-se 1 mL do inoculo e centrifugou-se
por 5 minutos a 13000 rpm. Posteriormente retirou-se o sobrenadante e o eppendorf
contendo o pellet foi colocado em estufa a 80°C por cerca de 12 horas ou até a
estabilização do peso. Este foi então esfriado em dessecador e procedeu-se a pesagem.
A diferença entre o peso do tubo com o fungo e o peso do tubo vazio vazio, forneceu o
peso seco (em gramas) contido em 1 mL da suspensão.

5)Medição da densidade óptica:

A densidade óptica foi medida em espectrofotômetro a 600 nm. Foi preparado um
branco (meio de cultura sem o fungo) para cada das fontes de carbono utilizadas e
zerou-se o aparelho. Coletou-se 1 mL de cada amostra que foram inseridas na cubeta e
procedeu-se a leitura da absorbância. Os valores foram anotados. Para valores maiores
que 0,8; a amostra foi diluída 20 vezes em água estéril e procedeu-se a leitura
novamente.

6)Gráficos e análise dos resultados:

Dados obtidos em YP + Glicose 2%

Temp DO600 Peso Peso Peso Peso (mg) p

o tubo tubo+fun (g) H
vazio go
1,1
Repetição:6,8
0 0,049 1,042 1,0431 0,0011 4 6,7
5 0,099 1,0954 1,1012 0,0058 5,8 6,4
8,5 0,389 1,0856 1,09 0,0044 4,4 6,3
15 2,13 1,042 1,056 0,014 14 5,3
21 6,77 1,0729 1,0896 0,0167 16,7 4,7
24 6,43 1,0782 1,0964 0,0182 18,2 4,7
31 13,14 1,0526 1,0822 0,0296 29,6 4,8
40 8,4 1,0569 1,0853 0,0284 28,4 6,1
46 12,8 1,0872 1,1097 0,0225 22,5 6,4
48 15,08 1,0792 1,1142 0,035 35 6,6
70 11,94 1,0861 1,1047 0,0186 18,6 7,0

8|Página
Dados obtidos em YP + Lactose 2%

Tempo DO600 Peso Peso Peso Peso pH

tubo tubo+fungo (g) (mg)
vazio
0 0,021 1,0919 1,0959 0,004 4 6,6
5 0,103 1,0748 1,0817 0,0069 6,9 6,7
8,5 0,351 1,0845 1,0878 0,0033 3,3 6,7
15 2,815 1,086 1,1019 0,0159 15,9 7,09
21 4,07 1,0409 1,0574 0,0165 16,5 7,14
24 7,13 1,0548 1,0754 0,0206 20,6 8,02
31 7,4 1,0851 1,116 0,0309 30,9 8,7
40 6,88 1,0912 1,1132 0,022 22 7,5
46 8 1,0538 1,0764 0,0226 22,6 7,64
48 7,32 1,0305 1,0512 0,0207 20,7 8,48
70 8,58 1,0897 1,1043 0,0146 14,6 8,1

Dados obtidos em YP + Sacarose 2%

Temp DO600 Peso Peso Peso Peso (mg) pH

o tubo tubo+fungo (g)
vazio
1,2
Repetição:4,2
0 0,046 1,041 1,0422 0,0012 2,7 6,7
5 0,055 1,0668 1,0741 0,0073 7,3 6,71
8,5 0,199 1,056 1,0618 0,0058 5,8 6,6
15 3,5 1,059 1,0767 0,0177 17,7 6,5
21 6,35 1,0705 1,0889 0,0184 18,4 5,2
24 7,1 1,0679 1,0822 0,0143 14,3 4,97
31 7,64 1,0592 1,0758 0,0166 16,6 5,79
40 8,4 1,0551 1,0817 0,0266 26,6 6,2
46 12,8 1,0878 1,1128 0,025 25 6,2
48 13,86 1,0115 1,036 0,0245 24,5 6,2
70 11,18 1,0612 1,0793 0,0181 18,1 7,9

Gráficos de leitura DO 600nm

Tempo DO Glicose DO Lactose DO Sacarose

0 0,049 0,021 0,046

9|Página
 5 0,099 0,103 0,055
8,5 0,389 0,351 0,199
15 2,13 2,815 3,5
21 6,77 4,07 6,35
24 6,43 7,13 7,1
31 13,14 7,4 7,64
46 12,8 8 12,8
48 15,08 7,32 13,86
70 11,94 8,58 11,18

16
14
12
10
DO 600nm

8
DO Glicose
6 DO Lactose
DO Sacarose
4
2
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
horas

Dados em LN

Tempo LN Glicose LN Lactose LN sacarose

0 -3,015934981 -3,863232841 -3,079113882
5 -2,312635429 -2,273026291 -2,900422094
8,5 -0,944175935 -1,046969056 -1,614450454
15 0,75612198 1,034962262 1,252762968
21 1,912501087 1,403642999 1,848454813
24 1,860974538 1,964311234 1,960094784
31 2,575661013 2,00148 2,033397603
46 2,549445171 2,079441542 2,549445171
48 2,713369363 1,990610328 2,629006994
70 2,479894108 2,149433913 2,414126468

10 | P á g i n a
 4
3
2
1
LN DO 600nm 0
-1 LN Glicose
LN Lactose
-2
LN sacarose
-3
-4
-5
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
horas

Calculo das velocidades específicas do crescimento (µ)

Tempo LN Glicose Valores de µ

5 -2,312635429
8,5 -0,944175935 0,3 h-1
15 0,75612198

Tempo LN Lactose Valores de µ

5 -2,273026291
8,5 -1,046969056 0,33 h-1
15 1,034962262

Tempo LN sacarose Valores de µ

5 -2,900422094
8,5 -1,614450454 0,42 h-1
15 1,252762968

11 | P á g i n a
 LN Glicose
1
f(x) = 1.53 x − 3.9
0.5 R² = 1

0
LN Glicose
-0.5 Linear (LN Glicose)
-1

-1.5

-2

-2.5
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

LN Lactose
1.5
f(x) = 1.65 x − 4.07
1 R² = 0.98

0.5
0 LN Lactose
Linear (LN Lactose)
-0.5
-1
-1.5
-2
-2.5
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

LN Sacarose
1.5
f(x) = 2.08 x − 5.24
1 R² = 0.95
0.5
0
-0.5 LN sacarose
Linear (LN sacarose)
-1
-1.5
-2
-2.5
-3
-3.5
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

12 | P á g i n a
Gráfico peso seco (mg)

Tempo Glicose Lactose Sacarose

0 4 4 2,7
5 5,8 6,9 7,3
8,5 4,4 3,3 5,8
15 14 15,9 17,7
21 16,7 16,5 18,4
24 18,2 20,6 14,3
31 29,6 30,9 16,6
40 28,4 22 26,6
46 22,5 22,6 25
48 35 20,7 24,5
70 18,6 14,6 18,1

Devido às discrepâncias de alguns dados (em vermelho), estes foram retirados para
se construir o gráfico.

Tempo Glicose Lactose Sacarose

0 4 4 2,7
5 5,8 6,9 7,3
15 14 15,9 17,7
24 17,45 18,55 18,4
35,5 29 26,45 21,6
47 28,75 21,65 24,75
70 18,6 14,6 18,1
35

30

25
Peso seco (mg)

20

15 Glicose
Lactose
10 Sacarose
5

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
horas

Cálculo do rendimento da biomassa (Y):

13 | P á g i n a
Y= [Peso seco final (g) - Peso seco inicial (g)] / [concentração de açúcar inicial (g) –
concentração de açúcar final (g)]

Y em glicose = [0,0186 - 0,004] / [2 - 0] x 100 mL (volume final de meio)

Y Glicose = 0,75 g/g (em cada 1 g de glicose o fungo produz 0,75 gramas de
biomassa)
Y em lactose = [0,0146 - 0,004] / [2 - 0] x 100
Y Lactose = 0,53 g/g
Y em sacarose = [0,0181 - 0,0027] / [2 - 0] x 100
Y Sacarose = 0,77 g/g

Gráfico de pH:
Tempo Glicose Lactose Sacarose
0 6,7 6,6 6,7
5 6,4 6,7 6,71
8,5 6,3 6,7 6,6
15 5,3 7,09 6,5
21 4,7 7,14 5,2
24 4,7 8,02 4,97
31 4,8 8,7 5,79
40 6,1 7,5 6,2
46 6,4 7,64 6,2
70 7,05 8,1 7,9
10

7
pH

6 Glic
Lac
5 Sac

3
0 10 20 30 40 50 60 70
horas

Conclusão:
Dos parâmetros utilizados para se avaliar o crescimento do Fusarium oxysporum,
podemos dizer que o mais adequado é o peso seco já que representa todas as células de

14 | P á g i n a
uma amostra. Quanto maior o peso seco, maior a concentração de células no meio de
cultura e, portanto demonstra diretamente o crescimento do microrganismo.
Observamos também que o pH não é um bom parâmetro pois sua alteração não ocorre
de maneira uniforme, variando de acordo com a fonte de carbono utilizada (na presença
de glicose e sacarose ocorre acidificação do meio devido a produção de CO 2 e na
presença de lactose ocorre alcalinização do meio devido ao mecanismo de transporte
utilizado). A densidade óptica, também não é o método mais adequado, pois apresenta
grande interferência das hifas de F. oxysporum que estão em suspensão (o feixe de luz
pode atravessar regiões mais ou menos concentradas gerando interferências na leitura).

MÓDULO II

15 | P á g i n a
 Produção da enzima β-galactosidase de Fusarium
oxysporum.

INTRODUÇÃO
O metabolismo celular dos animais, vegetais e microrganismos é comandado por uma
série de reações bioquímicas que, por sua vez, dependem da ação contínua de
catalisadores (as enzimas).
Enzimas são proteínas especiais que têm ação catalisadora e são produzidas pelas
células, estimulando ou desencadeando reações químicas importantíssimas para a vida,
que dificilmente se realizariam sem a presença delas. Esses biocatalisadores orgânicos
são produzidos pelas células, mas podem evidenciar a sua atividade intra ou
extracelularmente.
Atualmente as enzimas são empregadas em diversos setores industriais (químico,
farmacêutico, alimentício, têxtil, papel celulose, curtume), em dispositivos analíticos
(eletrodos enzimáticos, por exemplo) e em métodos analíticos e de diagnóstico (por
exemplo, enzima imuno ensaio).
Nesse presente trabalho, produzimos a enzima B-galactosidade (ou lactase) de F.
oxysporum, enzima que catalisa a clivagem de galactose e glicose. A produção
industrial desta enzima é importante na indústria de alimentos (para a produção de
sorvetes e sobremesas congeladas), assim como na Medicina, onde esta enzima pode ser
administrada para pacientes com intolerância á lactose.

OBJETIVO
Diferenciar uma enzima indutível de uma constitutivamente expressa e avaliar quala
melhor forma de induzir uma enzima.
Familiarização com protocolo de extração de proteínas e com avaliação da atividade
especifica de uma enzima.
Familiarização com processos de escalagem industrial.

DESENVOLVIMENTO

1)Preparação dos reagentes

1.1) Meio Mineral

Pesou-se os constituintes do meio mineral que estão descritos nos materiais e os diluiu-
se em água destilada para 90% do volume final. A solução foi esterilizada em autoclave,
por 20 minutos à 120oC.

1.2) Lactose 20%

A lactose foi pesada para uma concentração final de 20% em 500 ml de água destilada.
A solução foi esterilizada por filtração.

16 | P á g i n a
1.3) ONPG 32 mM
Pesou-se quantidade suficiente para 32 mM (PM= 301,25) e diluiu-se em tampão
acetato de sódio 5 mM, pH 5,0.

2) Obtenção do extrato proteico celular

Passado o tempo necessário para o crescimento do fungo, as culturas foram coletadas
em tubos de 50 mL e centrifugadas (3750 r.p.m; 5 minutos; 4°C) utilizando-se
centrifuga Allegra X-12R. O sobrenadante foi descartado e o precipitado restante foi
homogeneizado e filtrado a vácuo em membrana de 0,45 µm. A biomassa obtida foi
pesada.
As células obtidas (biomassa) foram colocadas em um cadinho de porcelana e
adicionou-se nitrogênio líquido, afim de conservar a matéria biológica. Com o uso de
pistilo, a biomassa foi triturada e adicionou-se 5 g de areia tratada e lavada, responsável
por promover o rompimento das células do fungo, formando uma pasta rala. Adicionou-
se tampão de extração (acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 contendo 10% de PMSF 50mM
um inibidor de serino-proteases) na proporção de 1,5 vezes a biomassa, ou seja, 3,75ml.
O macerado foi homogeneizado, transferido para tubo de 15 mL e centrifugado (4° C,
3750 r.p.m, 5 minutos). O sobrenadante foi coletado, transferido para erlenmeyer de 250
mL e congelado a -20°C. As células foram submetidas a choque térmico (50°C, 15
minutos) com o intuito de assegurar que todas as proteínas estariam sendo liberadas. E
em seguida, novamente centrifugadas. O sobrenadante foi coletado (contém a β-
galactosidase) e armazenado a -20°C até o momento do uso.

3)Quantificação da atividade da β-galactosidase

3.1) Quantificação da proteína pelo método de Lowry

É um método de quantificação colorimétrico que se baseia na redução do reagente de
Folin-Ciocalteau (molibdato, tungstato e ácido fosfórico) promovida pelas proteínas
presentes na solução. Íons de cobre (Cu2+) catalisam a reação produzindo coloração
azul que é lida em espectrofotômetro a 546 nm.
Preparou-se a curva-padrão de albumina bovina sérica (Solução estoque de BSA =
1mg/mL), conforme mostrado na tabela abaixo:

As amostras a serem quantificadas foram diluídas 40 vezes (10 µL de amostra + 395 µL

de água destilada). O branco foi preparado com 400 µL de água destilada. A cada um
dos tubos foi adicionado 2 mL da mistura das soluções A e B (na proporção de 100:1),

17 | P á g i n a
homogeneizou-se e incubou-se por 10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente
adicionou-se 200 µL da solução C diluída em água (na proporção de 1:1), que foi
preparada no momento do uso, a fim de se evitar degradação, e incubou-se por 30
minutos à temperatura ambiente. Em seguida, realizou-se a leitura da absorbância à 546
nm. Os valores obtidos foram multiplicados por 40 (inverso da diluição) e substituídos
na curva-padrão. Desta forma foi calculada a concentração total de proteína obtida
através do crescimento do Fusarium oxysporum nas diferentes fontes de carbono
(glicose, sacarose e lactose).

3.2) Quantificação da atividade enzimática da β-galactosidase

Essa técnica se baseia na degradação do ONPG (análogo da lactose) promovida pela
ação da β-galactosidase. Essa degradação libera ONP que em pH alcalino se torna
amarelo permitindo a quantificação em espectrofotômetro a 420 nm.
Preparou-se a curva-padrão de ONP (Solução estoque de ONP = 5mM), conforme
mostrado na tabela abaixo, em triplicata. Foram adicionados a cada tubo 400 µL de
Na2CO3 1 M e posteriormente realizou-se a leitura da absorbância a 420 nm.

Para o preparo das soluções teste foram adicionados 800 µL de ONPG 32 mM em cada
tubo e estes foram incubados a 55°C durante 5 minutos. Adicionou-se a cada um deles
200 µL de amostra e incubou-se por 10 minutos à 55°C. Após este tempo adicionou-se
400 µL de Na2CO3 1 M para parar a reação, responsável pela alcalinização do meio,
prejudicando o funcionamento da enzima. Realizou-se a leitura a 420 nm. Os valores de
absorbância foram substituídos na curva-padrão e os valores encontrados foram
divididos por 10 (nmoles de ONP gerados/minuto) e multiplicado por 5 (nmoles de
ONP gerados /minuto/mL)

4) Produção da β-galactosidase de F. oxysporum em larga escala

4.1) Inóculo de F. oxysporum em fermentador de 10 litros
Verificou-se o crescimento do Fusarium oxysporum nos tubos BDA (ágar batata)
inoculados no módulo I (as colônias se apresentavam esbranquiçadas, indicando a
produção de esporos). A estes tubos foram adicionados 10 mL de água destilada estéril
e a superfície do ágar foi raspada com alça bacteriológica, de modo a formar uma
suspensão opaca de esporos. Foi feito um ‘’pool’’ com as soluções de esporos. Um
volume de 10 mL desta suspensão foi inoculado para cada 1-1,5 L de meio mineral
(foram usados 9 litros de meio mineral contendo 2% de lactose, a fonte de carbono que
apresentou maior atividade específica). O meio contendo Fusarium foi incubado a 30° e

18 | P á g i n a
submetido á agitação controlada por aproximadamente 48 horas (tempo necessário até o
final da fase exponencial de crescimento).

4.2) Obtenção de extrato proteico celular

Realizado como descrito no item 4.2, corrigindo-se os volumes para a atual massa
fúngica.

4.3) Medida da atividade especifica da enzima β-galactosidase

Realizado como descrito no item 4.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na quantificação de proteína pelo método de Lowry foi obtida a seguinte curva-padrão

de BSA:
0.4

0.35
f(x) = 0 x + 0.03
R² = 0.99
0.3

0.25

0.2 DO media
Linear (DO media)
0.15

0.1

0.05

0
0 50 100 150 200 250

Abs
média μg/mL mg/mL
Glicose 0,081 33.375 133.5 0,1335
sacarose 0,185 98,375 393.5 0,3935
lactose 0,137 68,375 273,5 0,2735

Na quantificação da atividade enzimática da β-galactosidase foi obtida a seguinte curva-

padrão de ONP:

19 | P á g i n a
 1.2

f(x) = 0 x + 0.01
1 R² = 1

0.8

0.6 DO média
Linear (DO média)
0.4

0.2

0
0 100 200 300 400 500 600

nM/min/m
Abs nM/min L
Glicose 0,061 21,27 2,127 10,635
Sacaros
e 0,0945 36,5 3,65 18,25
Lactose 0,245 104,9 10,49 52,45

Atividade enzimática específica (nM/min/mg):

Glicose 76,38
Sacaros
e 46,37
Lactose 191,77

A atividade enzimática específica foi obtida dividindo-se o valor da atividade

enzimática (nM de ONP gerados/min/ml) pela concentração de proteínas na solução
(mg/ml).

CONCLUSÃO

20 | P á g i n a
Através dos procedimentos realizados no módulo II, concluiu-se que a enzima β-
galactosidase é indusível na presença de lactose (sua expressão é aumentada na presença
deste nutriente). Pode-se concluir também que é possível obter resultados reprodutíveis
quando se passa de uma escala ‘’piloto’’ para grande escala, desde que os
procedimentos sejam realizados de forma padronizada. Esse procedimento, chamado de
scale-up é normalmente utilizado na indústria. Através dele é possível determinar os
parâmetros e condições necessárias para que os processos possam ser aplicados em
grande escala, fornecendo os resultados desejados.

MÓDULO III
21 | P á g i n a
 Purificação da enzima β-galactosidase de Fusarium
oxysporum

INTRODUÇÃO
No módulo II constatou-se que a enzima β-galactosidase é produzida em Fusarium
oxysporum somente quando este fungo cresce em meio contendo lactose como única
fonte de carbono, ou seja, essa enzima é induzível e seu indutor é a lactose.

Para que as enzimas microbianas produzidas industrialmente possam ser utilizadas

comercialmente, estas devem ser purificadas, ou seja, separadas de outras proteínas
presentes no extrato proteico total.

Alguns dos métodos de purificação mais utilizados são a cromatografia de troca iônica
e a cromatografia de filtração molecular. Essas técnicas cromatográficas de separação e
identificação de substancias orgânicas e inorgânicas têm em comum o principio de
funcionamento, no qual a fase móvel (p.e., uma solução de proteínas) passa através de
uma fase estacionaria ou fixa, que separa os componentes da fase móvel.

A troca iônica é um método que se baseia na adsorção das proteínas à superfície da

coluna contendo carga oposta, enquanto que as proteínas que possuem mesma carga são
eluídas primariamente. Neste método a fase móvel é uma solução de proteínas e a fase
estacionária é uma resina contendo cargas em sua superfície (separação por carga).
Resinas aniônicas possuem carga positiva e são capazes de reter ânions, enquanto
resinas catiônicas possuem carga negativa e capacidade para reter cátions.

Na cromatografia de filtração molecular são utilizadas resinas com tamanho de poros

variável na fase estacionária. Esse método se baseia no fato de que as proteínas menores
penetram e ficam retidas nos poros, enquanto que as proteínas maiores são eluídas
primeiro, esse método separa moléculas por tamanho.

Para se avaliar o grau de pureza da proteína realiza-se também a eletroforese em gel de

poliacrilamida (PAGE – polyacrilamide gel electrophoresis). Este gel é uma matriz
porosa que permite que as proteínas sejam separadas por tamanho. Quanto maior for a
proteína, maior é a dificuldade que ela apresenta em atravessar essa matriz, ao contrario,
quanto menor for a proteína, mais facilmente ela se move através do gel.

OBJETIVO
Pesquisar os principais bancos de dados da literatura científica.
Familiarização com protocolo de purificação de proteína por métodos cromatográficos
(troca iônica e filtração molecular)
Análise crítica das abordagens utilizadas para a purificação de proteínas.

DESENVOLVIMENTO
1)Cromatografia de troca iônica (coluna de DEAE celulose)

22 | P á g i n a
1.1) Recuperação da resina

Para a recuperação, a resina de Dietilaminoetil-celulose (DEAE-celulose) foi filtrada à

vácuo e passada para um béquer onde adicionou-se NaOH 0,2 M, foi filtrada novamente
e lavada duas vezes com água destilada.
Passou-se a coluna para um béquer e adicionou-se HCl 0,2 M, foi filtrada novamente e
lavada duas vezes com água destilada.
Lavou-se o material novamente com NaOH 0,2 M e depois duas vezes com água
destilada.
Por fim foi adicionado tampão fosfato 10 mM, pH 6,5, contendo 50 mM de NaCl,
agitado e filtrado, esse procedimento foi realizados várias vezes, até que o pH estivesse
em 6,5.

1.2) Montagem e preparação da resina

Após a recuperação, a resina diluída em tampão fosfato foi colocada na coluna.

Equilibrou-se a coluna com tampão fosfato, circulando este tampão na coluna (cerca de
100 ml).
A amostra foi dialisada em tampão fosfato pH 6,5, contendo 50 mM de NaCl e
adicionada à coluna.
Foram coletadas alíquotas do eluato de aproximadamente 5 ml cada.
Realizou-se a dosagem de proteínas (leitura a 280 e 420 nm no espectrofotômetro, com
cubeta de quartzo). Nas alíquotas que apresentaram maior absorbância, foi feito ensaio
da atividade enzimática.
A absorbância de cada alíquota e as atividades enzimáticas correspondentes foram
plotadas em gráficos.
Aplicou-se tampão fosfato com concentrações cada vez maiores de NaCl (de 50 mM até
500 mM) na coluna de troca iônica. Alíquotas foram coletadas e submetidas à dosagem
de proteínas e atividade enzimática.
Foram plotados em um gráfico os resultados de concentração de proteína e atividade
enzimática juntamente com as concentrações crescentes de NaCl.

Fração DO280nm DO 420nm [NaCl]

1 0,02 0,05
2 0,07
3 0,086
4 0,108
5 0,12 -0,032 0,05
6 0,153
7 0,17 -0,038
8 0,091
9 0,178 -0,025
10 0,324 0,05
11 0,398 0,241
12 0,292
13 0,195 0,026

23 | P á g i n a
14 0,147
15 0,059 -0,022 0,05
16 0,089
17 0,08 -0,002
18 0,065
19 0,054
20 0,055 0,05
21 0,049
22 0,045
23 0,042
24 0,038
25 0,035 0,05
26 0,034
27 0,034
28 0,035
29 0,029
30 0,03 0,05
31 0,133 0,133
32 0,44 0,284
33 0,075 0 0,05
34 0,057
35 0,059
36 0,059
37 0,077 0,026
38 0,185
39 0,315 0,117
40 0,261
41 0,245 0,235
42 0,274
43 0,314 0,244
44 0,346
45 0,349
46 0,381 0,093
47 0,292 0,042
48 0,399 0,07
49 0,354
50 0,34
51 0,337 0,029
52 0,306
53 0,273
54 0,229 0,021
55 0,23
56 0,186
57 0,193 0,017 0,5
58 0,18
59 0,286 0,015
60 0,255
61 0,146 0,5

24 | P á g i n a
 62 0,116 0,003
63 0,098
64 0,07 0,008 0,05

0.6

0.5
Troca iônica
0.4
DO 280nm
0.3 DO 420 nm
Moving average (DO 420 nm)
DO

0.2 50-500 mM NaCl

Moving average (50-500 mM NaCl)
0.1 Moving average (50-500 mM NaCl)
Moving average (50-500 mM NaCl)
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
-0.1
Fração

2)Cromatografia de filtração molecular (Coluna Sephadex G-100)

A coluna de filtração molecular foi montada e equilibrada com tampão fosfato pH 6,5,
contendo 50 mM de NaCl (mais ou menos 200 ml).
A amostra foi dialisada em água destilada e aplicada diluída na coluna. Foram coletadas
alíquotas do eluato de aproximadamente 5 ml cada. Após o final da aplicação da
amostra foi passado na coluna tampão fosfato pH 6,5, contendo 50 mM de NaCl e
continuou-se a coletar alíquotas de 5 ml cada;
Realizou-se a dosagem de proteínas (leitura a 280 e 420 nm no espectrofotômetro, com
cubeta de quartzo). Nas alíquotas que apresentarem maior absorbância, foi feito ensaio
da atividade enzimática.
A absorbância de cada alíquota e as atividades enzimáticas correspondentes foram
plotadas em gráficos.
Fração DO280nm DO 420nm
1 0,028
2 0,015
3 0,016
4 0,012
5 0,027 0,266
6 0,096 0,243
7 0,029 0,169
8 0,126 0,189
9 0,058 0,35
10 0,048 0,538
11 0,288 0,423

25 | P á g i n a
 12 0,153 0,254
13 0,546 0,158
14 0,286 0,067
16 0,078
18 0,021
20 0,008
22 0,011

Filtração molecular
0.6
0.5
0.4
0.3 DO280nm
DO

0.2 DO 420nm
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Fração

3)Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)

3.1) – Preparação do gel

Lavou-se as placas com água e sabão e depois com álcool etílico 70% e secou-se bem as
placas.

A solução do gel de separação foi preparada como mostrado na tabela abaixo:

Gel de separação (12%)

Reagente Volume (μL)
Água destilada 1295
Acrilamida 30% 2000
Tris 1,5 M; pH 8,8; SDS 0,4% 1650
Persulfato de amônio (PSA 10%) 50
TEMED 5
Total 5000

Montou-se as placas de vidro no suporte, adicionou o gel de separação ate ¾ do volume

total das placas e completou-se o volume com água destilada. Esperou-se
aproximadamente 10 minutos para polimerização do gel.

26 | P á g i n a
Preparou-se o gel de empilhamento conforme a tabela abaixo:

Gel de empilhamento (5%)

Reagente Volume (μL)
Água destilada 900
Acrilamida 30% 265
Tris 1,0 M; pH 6,8; SDS 0,4% 390
Persulfato de amônio (PSA 10%) 50
TEMED 5
Total 1610

Retirou-se a água entre as placas observando se o gel de separação estava totalmente

polimerizado. Adicionou-se o gel de empilhamento até completar o volume das placas.
Inseriu-se o pente com as canaletas com cuidado e aguardou cerca de 10 minutos para
polimerização.

3.2) Preparação da amostra e corrida

Colocaram-se alíquotas de 30 μL de amostra em tubos de 1,5 mL. Adicionou-se a cada

tubo 7 μL do tampão de amostra 3X (glicerol 30%; SDS 9,2%; azul de bromofenol 1%;
β-mercaptoetanol 20%; Tris-base 0,25 M, pH 6,8). Homogeneizou bem e aqueceu a
95ºC por 5 minutos.
As placas foram colocadas na cuba e eletroforese e encheu a cuba com tampão de
corrida 1X.
Solução 10X (Tris-base 0,25 M; 1,9 M de glicerina; EDTA 10 mM e SDS 35 mM)
Aplicou-se entre 10 e 20 μL de cada amostra nas canaletas do gel. Como referência foi
reservado uma canaleta para aplicar 7 μL de padrão de peso molecular já diluído em
tampão de amostra.

A cubeta foi ligada na fonte e a voltagem regulada pra 50 Volts (V) até que o corante
azul chegasse no limiar entre o gel de empilhamento e o gel de separação. A partir desse
momento a voltagem foi aumentada para 80 V.
Quando o corante azul estava próximo ao fim da placa, desligou-se a fonte e colocou o
gel na solução descorante por 20 minutos.
Retirou-se a solução fixadora e adicionou a solução corante (Coomassie-Blue G-250
0,1% [p/v]; ácido acético 9% [v/v] e metanol 45% [v/v]) por 4 a 12 horas (overnight).
Colocou-se o gel em solução descorante (ácido acético 7,5% e metanol 25%) até que as
bandas ficassem nítidas.

27 | P á g i n a
1 - Marcador de peso molecular (Biolabs®)
3 - Extrato Bruto Turma N°1
4 - Extrato Bruto Turma N°2
6 - Troca iônica Turma N°1
7 - Filtração Molecular Turma N°2
9 - Filtração Molecular Turma N°1
10 - Troca iônica Turma N°2

4) Tabela de purificação

28 | P á g i n a
CONCLUSÃO
Analisando o quadro geral de purificação observamos uma redução na concentração de
proteína já que a as demais proteínas que não a β-galactosidase estão sendo removidas.
Como consequência pode se observar uma redução da atividade enzimatica total e
aumento da atividade enzimatica específica.
Com a cromatografia de troca iônica foi possível aumentar a atividade específica em 4,4
vezes e após a filtração molecular este valor subiu para 13 vezes.
O uso de técinas cromatográficas combinadas (troca iônica e filtração molecular)
permitiu a purificação da enzima β-galactosidase de Fusarium oxysporum obtida no
módulo II.

MÓDULO IV
29 | P á g i n a
 Fermentação alcoólica: Produção de cerveja

INTRODUÇÃO
A cerveja por ser uma bebida socializante por excelência e tem estado presente em
muitas de nossas atividades como festas familiares, churrascos, rodas de samba, pagode,
sinuca, jogos de cartas,e entre outras, é convidada obrigatória da happy hour em
qualquer dia da semana.A cerveja é assim querida por trazer tradição, sabor e, desde que
não se abuse, provoca descontração e alegria. A cerveja está na raiz da cultura ocidental
e se mantém relevante até hoje como elemento integrador. A indústria cervejeira é um
dos maiores negócios do mundo e é parte importante da economia de vários países. O
volume anual de mais de 100 milhões de hectolitros consumidos coloca o Brasil entre os
quatro maiores mercados do mundo, me pé de igualdade com a Alemanha, que tem,
porém, menos da metade da população brasileira.Embora aparentemente simples, a
produção de cerveja requer muito conhecimento e prática, pois envolve várias e
complexas reações químicas e bioquímicas que devem ocorrer necessariamente sob
controle rigoroso de temperatura, tempo, pressão, pH etc. Obtêm-se a cerveja através da
fermentação do mosto obtido a partir de cereais. A fermentação é a oxidação de uma
fonte de carbono (glicose) para obtenção de energia, resultando em um composto
orgânico parcialmente oxidado (etanol, ácido lático, ácido acético) e gás carbônico
como subprodutos. Na fermentação alcoólica, os principais organismos responsáveis
são as leveduras, principalmente às pertencentes ao gênero Saccharomyces.São quatro
ingredientes básicos necessários para a elaboração da cerveja: malte, água, lúpulo e a
levedura. Estes são adicionados ao longo do processo que inlcui: brasagem, a
fermentação, a maturação e por último o envase/engarrafamento.

OBJETIVO
Reconhecer e fazer contagem de células leveduriformes sob microscópio óptico;
Familiarizar com conceitos da tecnologia de fermentações tais como cultura pura, graus
Brix, atenuação, floculação, ganho de biomassa versus produção etanol, dentre outros;
Elaborar cerveja artesanal em escala laboratorial (25L) avaliando as diferentes etapas do
processo de produção.

DESENVOLVIMENTO

30 | P á g i n a
1) Obtenção do fermento.
Colônias isoladas obtidas em meio *YPD ágar através da técnica de estria por
esgotamento foram utilizadas para inocular tubos contendo 4mL de YPD 2%.
Depois de incubar a 30°C over-night os inóculos foram transferidospara
erlenmeyers de 125mL contendo 50mL de YPD 2% e incubados a 30°C por 24-
48 hs. Finalmente as culturas foram transferidas a erlenmeyers de 4 L contendo
1,5L de PYD 2% e incubadas novamente a 30° por 48hs (precisa-se de 3L de
cultura para cada linhagem). As células foram coletadas por centrifugação a
3750 rpm por 10 min a 4°C e lavadas com água destilada. Previamente à
inoculação no mosto as células foram contadas em câmara de Neubauer (aprox.
108 UFC/ mL).
*YPD – 2% Peptona Bacteriológica
1% Estrato de levedura
2%Glicose
No preparo de YPD sólido adicionar 2% de ágar-ágar.
Esterilizou-se por autoclave (120°C por 15min),a fonte de glicose foi auto-
clavada separadamente, pois pode haver formação de compostos tóxicos para a
levedura (reação de Mailard – uma reação química entre um aminoácido ou
proteína e um carboidrato reduzido, obtendo-se produtos que dão sabor, odor, e
cor aos alimentos.)

Antes da incubação

31 | P á g i n a
 Após incubação.

2)Produção do mosto
 6Kg de Malte de cevada (2:1 proporção água:malte)
 14gr de Lúpulo (Humulus lupulus)
 Saccharomyces cerevisiae: 2,5x107 UFC/mL
2,5x107 x 12L = 108 x Y
Y = 3L

32 | P á g i n a
3)Maltagem
O início do processo da produção da cerveja começa a partir do momento quando se
escolhe o grão que será utilizado. O grão então passa por processos que fornecerão as
características desejadas para o mestre cervejeiro.
A maltagem é subdividida em três etapas: maceração, germinação e secagem.
A maceração consiste em fornecer oxigênio e água ao grão, despertando sua dormência,
preparando-o para a etapa seguinte.
Na germinação, a cevada sofre modificação física e química. Fisicamente, ocorre a
formação de radículas e da acrospira. Quimicamente, se dá a formação das enzimas que
irão quebrar o amido e as proteínas no ponto adequado para a produção da cerveja.
Na secagem, as radículas são eliminadas. É nessa etapa que ocorre a formação dos
aromas típicos do malte. Dependendo da intensidade da germinação e também dos graus
de secagem e torrefação, o malte adquire colorações e aromas que vão desde o neutro
até o café, passando pelo caramelo, o chocolate e o torrado. A secagem também tem
grande importância na conservação do malte, eliminando o risco de mofo e favorecendo
a estocagem.
Embora poucas cervejarias tenham seu próprio processo de maltagem, normalmente as
maltarias são indústrias separadas, e fornecedoras de matéria prima para as cervejarias.
Em escala laboratorial esse processo não foi realizado, a matéria prima foi adquirida
através dessas indústrias, mas o processo é muito importante para a produção da cerveja
da maneira desejada.

4)BRASSAGEM
33 | P á g i n a
 Malte moído

Água a 55° C

Sacarificação
52°C por 30 min – Peptidases e proteases.

63°C por 20 min – β-amilases: açucares fermentáveis.

68°C por 90 min – Açúcares não fermentáveis (dão ‘corpo’)

75°C por 5 min – Desnaturação de enzimas.

Água a 70°C

Filtragem

10°Brix

Mosto a 100°C

1ª LUPULAGEM – 0,375 g/L por 60 min (amargor )

2ª LUPULAGEM – 0,75g/L por 15 min (sabor)

12° Brix

A brasagem, ou fabricação do mosto, consiste em uma sequência de procedimentos

que transformam o amido e as proteínas contidas no malte em uma solução de
açúcares e outras substâncias chamada mosto. A brasagem é subdividida em três
subetapas: sacarificação, filtragem e lupulagem.

4.1)Sacarificação:

34 | P á g i n a
Primeiramente moeu-se o malte paraque esse liberasse o conteúdo dos grãos de
cevada (amido) que são, em seguida, foram suspensos em água e aquecidos a
diferentes temperaturas para que atuem as proteases, peptidases e amilases obtendo-
se assim açúcares fermentáveis que no caso do mosto são principalmente maltose,
glicose e maltrotriose.

Na primeira etapa da sacarificação o malte + água permaneceram a 52°C por 30min

para que as peptidases e proteases atuem liberando os aminoácidos para a
fermentação.Nesta faixa é possível regular a espuma e o brilho da cerveja. Como os
grãos estão envoltos por uma malha que contém proteínas, a ação das enzimas
proteolíticas pode favorecer um pouco mais a exposição do amido ao ataque das
enzimas da sacarificação.

Na segunda etapa da sacarificação o malte + água permaneceram a 63°C por 20 min,

para que as β-amilases convertam o amido em açúcares. Regulando a atuação da
enzima, o cervejeiro consegue determinar o corpo da cerveja. Neste ponto é feito um
teste com iodo, para determinar qual o momento em que toda o amido já foi
transformado em glicose. O teste baseia-se na propriedade que o iodo apresenta de
se ligar ao amido, apresentando uma coloração escura, quando a concentração de
amido diminui, perde-se a coloração. Quanto mais incolor a solução do malte + água
no teste, menos amido está presente, ou seja, mais amido foi convertido à glicose.

Na terceira etapa da sacarificação o malte + água permaneceram em 68°C por 90

min, Açúcares não fermentáveis, grandes tais como as dextrinas – sabor e corpo da
cerveja.

Na quarta etapa da sacarificação o malte + água permaneceram em 75°C por 5min

para que ocorresse a desnaturação das enzimas, para que essas cessem suas
atividades e estabilizem o resultado desejado, impedindo que continuem a atuar
durante a filtração do mosto.

35 | P á g i n a
 4.2) Filtragem:

Separação do mosto líquido do bagaço do malte. Utilizou-se um fundo falso, que

serve de sustentação para o verdadeiro elemento filtrante que consiste nas palhas do
malte. Para que esse processo seja válido, a moagem deve ser feita com moinhos de
rolo para que as cascas sejam preservadas.

Após a filtração, adicionou-se água ao bagaço, extraindo-se boa parte do mosto

embebido nas cascas. A temperatura dessa água não deve ser muito elevada, de
modo a evitar a extração excessiva de polifenóis, que podem prejudicar o sabor da
cerveja. A adição de água ocorreu até se atingir 10°Brix. (10g de açúcar em 100mL
de solução).Para medir o grau Brix utiliza-se refratômetros, ou sacarímetros.

4.3)Lupulagem

36 | P á g i n a
É durante esse processo onde acrescentou-se o lúpulo. Essa etapa foi realizada em duas
etapas durante a fervura.

1 -0,375 g/L por 60 min para conferir amargor.

2- 0,75 g/L por 15 min para conferir sabor e aroma.

Realiza-se a fervura com o objetivo de esterilizar o mosto e inativar as enzimas do

malte. Por outro lado, o lúpulo confere amargor e sabor à cerveja.

5)Fermentação

Assim que o mosto obtido foi resfriado, as células de levedura foram adicionadas. O
mosto então foi incubado à 18°C por aproximadamente uma semana, quando o valor de
atenuação atinge 4°Bx. A fermentação é resultado do metabolismo das leveduras que
são capazes de converter açúcares fermentáveis em dióxido de carbono e etanol. Além
destes, outros subprodutos metabólicos podem ser gerados durante a fermentação, os
quais, juntamente com aqueles provenientes do malte e do lúpulo, serão os responsáveis
por formar o flavour das cervejas.

6)Maturação

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Após a fermentação o produto que se obtém é chamado de cerveja verde, pois contém
componentes de sabor indesejável, tais como o Diacetil, que é uma substância considera
off flavour conferindo à cerveja um sabor amanteigado.A maturação inicia-se com a
retirada das leveduras e em geral ocorre em temperaturas menores que a fermentação.(0
e 4°C) Ao iniciar-se a maturação, a maior parte do açúcares já foi metabolizado e
transformada em álcool etílico, dióxido de carbono, glicerol, ácido acético, álcoois
superiores e ésteres. É nesta etapa que ocorre a carbonatação natural da bebida, como
efeito da contrapressão exercida no próprio tanque de maturação pelo gás carbônico
produzido na fermentação do extrato que ainda resta. A maturação também contribui
para a clarificação das cervejas pela sedimentação das células e de outros componentes
que causam turbidez à bebida, além da saturação de gás carbônico.

7)Envase/engarrafamento

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Após a maturação foram adicionados 6gr de sacarose para 1L de mosto. Para um
volume de 12L de mosto empregou-se 75gr de sacarose em 200mL de água antes do
engarrafamento. Este processo tem como objetivo o enriquecimento do perfil aromático,
aumento da carbonatação e o aumento do teor alcoólico das cervejas. Em grandes
indústrias esse processo é realizado através de injeção de gás carbônico log após a
filtração, ou nos tanques de armazenamento.

Conclusão
O processo de fermentação foi de fundamental importância pois através dele tivemos
acesso a todas as etapas da fabricação de cerveja, conhecendo as diferentes cepas e suas
vantagens, o que deve ou não fazer nos processos, as vantagens e desvantagens de cada
processo e a importância de cada etapa para se produzir a cerveja desejada.

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