Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 1

Colaboraram nesta edição:

Aline Oliboni de Azambuja

Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e
Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).
Andresa Patrícia Regert Lucho
Engenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).
Diouneia Lisiane Berlitz
Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e
Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).
Emerson Luís Nunes Costa
BIOTECNOLOGIA Engenheiro Agrônomo (UFRGS) e Mestre e Doutor em
Ciência & Desenvolvimento Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS)
KL3 Publicações Gabriela Cristina Alles
Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia:
Fundador Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).
Henrique da Silva Castro Jaime Vargas de Oliveira
Engenheiro Agrônomo (UFSM), Mestre em Fitotecnia –
Direção Geral e Edição Fitossanidade/Entomologia (UFPEL),
Ana Lúcia de Almeida Laura Massochin Nunes Pinto
Bióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda em Biologia:
Diretor de Arte Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).
Henrique Castro Fº Leila Lucia Fritz
Bióloga (UNISINOS) e Mestranda em Biologia: Diversidade e
Projeto Gráfico
Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).
Agência de Comunicação IRIS Lidia Mariana Fiúza
E-mail Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia –
biotecnologia@biotecnologia.com.br Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas
(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal
Portal (CIRAD-Montpellier).
www.biotecnologia.com.br Marcus Hübner
Biólogo (FURG) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo
Departamento Comercial, de Vida Silvestre (UNISINOS).
Maria Helena Ribeiro Reche
Redação e Edição:
Bióloga (UPF) e Mestre e Doutoranda em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).
Neiva Knaak
Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).
SHIN CA 01 - Lote A - Bloco A - Sala 223 Raquel Castilhos-Fortes
Shopping Deck Norte Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Microbiologia Agrícola e do
Lago Norte Ambiente (UFRGS)
Brasília - DF
Rogério Schünemann
CEP: 71503-502
Biólogo (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e
Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).
Vilmar Machado
Biólogo (UNISINOS) e Mestre e Doutor em Genética e
Biologia Molecular (UFRGS)
Os artigos assinados são de
inteira responsabilidade
de seus autores.
Nota: A Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, é
ISSN 1414-6347 indexada na AGROBASE ( base de dados da Agricultura Brasileira)
BINAGRI- Biblioteca Nacional de Agricultura- MAPA- Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento. no Agris ( International
Information System for the Agricultural Sciences and Technology)
da FAO e atende a obrigatoriedade do Depósito Legal na Biblioteca
Nacional do Rio de Janeiro - Fundação Biblioteca Nacional.

2 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

Conselho Científico
Dr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento Vegetal
Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia;
Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal;
Dra. Lidia Mariana Fiuza - Microbiologia e Entomologia Agrícola;
Dr. Maçao Tadano - Agricultura;
Dr. Naftale Katz - Saúde;
Dr. Pedro Jurberg - Ciências;
Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;
Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos;
Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.
Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi
Dr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia
Fundação Dalmo Catauli Giacometti
Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética;
Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico;
Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN
Dr. José Roberto Rogero
Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec
Dr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPA
Dr. Diógenes Santiago Santos - UFRGS
Dr. José Luiz Lima Filho - UFPE
Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ
Carta ao Leitor
EDIÇÃO 38 - 2009/2010
bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) tem o ca-
risma mundial dos microbiologistas e entomo-
logistas. Esse entomopatógeno ubíquo é ím-
par no potencial biotecnológico aplicado no
controle biológico nas áreas agrícolas, florestais, de
saúde animal e humana. Nessas áreas, o microrganis-
mo pode ser utilizado como biopesticida formulado,
registrado e comercializado ou seus genes podem ser
adaptados e incorporados no genoma das plantas por
meio da engenharia genética, atualmente denomina-
das plantas-Bt. Nos estudos dessa bactéria há coope-
rações multidisciplinares que permitem as análises da
biologia, toxicologia e ecologia microbiana, as quais
são tratadas nessa edição. O objetivo dessa publica-
ção é apresentar o estado da arte sobre o entomopa-
tógeno B. thuringiensis, com dados bibliográficos e
resultados de pesquisa obtidos pelo grupo de pesqui-
sa CNPq/UNISINOS: Manejo e Toxicologia em Agroe-
cossistemas, onde atuam estudantes de Graduação e
Pós-Graduação da Biologia da UNISINOS, além de pro-
fessores e pesquisadores colaboradores do IRGA, UFR-
GS, UFPEL, UFSM, UCS, FIOCRUZ, EMBRAPA, CIRAD-
Montpellier, Universidade de Otawa e Universidade
de Nebraska.
Dra. Lidia Mariana Fiuza

Edição Especial - Ecotoxicologia de Bacillus thuringiensis, organizada e coordenada pela Dra. Lídia
Mariana Fiuza, Professora Titular e Coordenadora Executiva do Programa de Pós-Graduação em
Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre da Universidade do Vale do Rio dos Sinos; Bolsista de
Produtividade em Pesquisa do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico,
Consultora Técnica do Instituto Rio Grandense do Arroz.
fiuza@unisinos.br lmfiuza@pesquisador.cnpq.br

PESQUISA
ARTRÓPODES E BACTÉRIAS ENTOMOPATOGÊNICOS 04
ECOLOGIA DE BACILLUS ENTOMOPATOGÊNICOS 14
TOXINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS 24
MECANISMO DE AÇÃO DE BACILLUS THURINGIENSIS 32
TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS ÀS PRAGAS AGRÍCOLAS 36
TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS AOS INSETOS SOCIAIS 40
TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS ÀS PRAGAS URBANAS E VETORES 44
INTERAÇÕES DE BACILLUS THURINGIENSIS E O CONTROLE DE FITOPATÓGENOS 48
TOXICIDADE DE BACILLUS THURINGIENSIS EM ORGANISMOS NÃO-ALVO 54
PRODUTOS DE BACILLUS THURINGIENSIS: REGISTRO E COMERCIALIZAÇÃO 58
PLANTAS TRANSGÊNICAS QUE SINTETIZAM TOXINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS E OUTRAS 62
EVOLUÇÃO E MANEJO DA RESISTÊNCIA DE INSETOS 68

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 3

 ARTRÓPODES E BACTÉRIAS
Pesquisa ENTOMOPATOGÊNICOS
Pesquisa

Emerson Luís Nunes Costa
Engenheiro Agrônomo (UFRGS) e
Mestre e Doutor em Fitotecnia –
Fitossanidade (UFRGS)
Andresa Patrícia Regert Lucho
Engenheira Agrônoma (UFRGS) e
Mestre em Biologia: Diversidade e
Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).
Leila Lucia Fritz
Bióloga (UNISINOS) e
Mestranda em Biologia:
Diversidade e Manejo de
Vida Silvestre (UNISINOS).
Lidia Mariana Fiuza
Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em
Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),
Doutora em Ciências Agronômicas
(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em
biotecnologia Vegetal (CIRAD-
Montpellier).

ntre os artrópodes, os insetos são a maio-
ria das espécies animais e têm importância
nas mais diversas áreas. Na agricultura,
podem ser úteis ou nocivos, atuando na
manutenção do equilíbrio das populações
como inimigos naturais, na polinização, na
decomposição da matéria orgânica do solo e como
pragas das culturas. Nesse trabalho são apresen-
tadas algumas informações sobre a classe Insec-
ta, destacando-se os insetos de importância agrí-
cola, com a caracterização de ordens e subordens
e exemplos de famílias e espécies de insetos-pra-
ga, vetores de fitopatógenos, predadores e para-
sitóides. Também constam dados sobre as bacté-
rias que atuam como agentes microbianos aplica-
dos no controle biológico de insetos.
1.1 A Classe Insecta
A classe Insecta, com 29 ordens, pertence à
superclasse Hexapoda e ao filo Arthropoda. En-
tre os aspectos que caracterizam a maioria dos
representantes da classe Insecta estão: corpo di-
vidido em três porções (cabeça, tórax e abdome),
cabeça com um par de antenas, olhos compos-
tos, peças bucais expostas (ectognatos), tórax com
três segmentos, três pares de pernas, nenhum,
um ou dois pares de asas, e abdome com 6 a 11
segmentos.
Durante o desenvolvimento, os insetos so-
frem metamorfose, por meio de muda do tegu-
mento (ecdise). Insetos hemimetábolos são aque-
les que sofrem metamorfose chamada incomple-
ta, passando pelas fases de ovo, ninfa e adulto.
Nesse caso os indivíduos jovens são muito seme-
lhantes aos adultos, mas apresentam o sistema
reprodutivo imaturo e, no caso de insetos alados,
nota-se o desenvolvimento das asas, observando-
se a presença de tecas alares. Insetos holometá-
bolos têm metamorfose completa, passando pe-
las fases de ovo, larva, pupa e adulto. Nesse caso,
os indivíduos jovens são bem diferentes dos adul-
tos, como ocorre com as borboletas e moscas,
onde inclusive há mudança no aparelho bucal.
Os besouros também têm metamorfose comple-
ta, com larvas morfologicamente diferentes dos
adultos, mas normalmente o tipo de aparelho
bucal se mantém.
A classe Insecta representa 70% das espécies
animais, e encontra-se distribuída nos mais dife-
rentes ambientes, onde os insetos, com aspectos
positivos ou negativos, destacam-se como orga-
nismos de importância, como na indústria têxtil
(o bicho da seda), na alimentação (o mel produ-
zido pela abelha), na saúde humana (moscas, mos-
quitos, percevejos e outros insetos transmissores
de agentes patogênicos), na veterinária (insetos
transmissores de moléstias em animais) e na agri-
cultura.
1.2 Importância dos
insetos na agricultura
Na agricultura, a ocorrência de insetos tam-
bém tem seus aspectos positivos e negativos.
Sob o aspecto negativo estão os insetos que
se alimentam de plantas e causam danos econô-
micos a diversas culturas agrícolas. Os insetos-
praga, pelo hábito de alimentarem-se de vege-
tais, são chamados de fitófagos. Dependendo da
estrutura vegetal da qual se alimentam, também
recebem denominações específicas. Assim, os que
se alimentam de frutos são os carpófagos; de ra-
ízes, rizófagos; de folhas, filófagos; de madeira,
xilófagos; sugadores de seiva são fitossucsívoros.
Além dos danos causados de forma direta,
pela alimentação, alguns insetos causam danos
indiretos às culturas, atuando como vetores de
fitopatógenos (Tabela 1). Também há insetos que
estão associados à ocorrência de moléstias, devi-
do a injúrias que causam nos tecidos vegetais pelos
hábitos alimentares ou de postura, favorecendo a
penetração de patógenos. Como exemplos po-
dem ser citados o minador-dos-citros (Phylloc-
nistis citrela), que favorece a ocorrência do can-
cro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas
axonopodis pv. citri, o tripes Thrips tabaci asso-
ciado à ocorrência do fungo Alternaria porri, cau-
sador da mancha púrpura em alho e cebola, e as
moscas-das-frutas, cujos hábitos de postura, ali-
mentação e desenvolvimento facilitam a ocorrên-
cia de patógenos causadores de podridões em
frutos, como o fungo Monilinia fructicola, causa-
dor da podridão parda em frutos de pêssego. In-
setos sugadores que excretam substâncias açuca-
radas estão associados à ocorrência de fumagina,
caracterizada pelas estruturas fuliginosas do fun-
go Capnodium sp.
Sob o aspecto positivo estão os insetos poli-
nizadores, muitos deles essenciais para a forma-
ção de frutos e conseqüentemente de sementes;
os insetos subterrâneos que atuam na decompo-
sição da matéria orgânica e em outras caracterís-
ticas desejáveis nos solos destinados à produção
agrícola e, ainda, os inimigos naturais, que se ali-
mentam de outros insetos, muitas vezes manten-
do as populações de pragas em níveis que não
causam dano econômico e sem necessidade de
adoção de outros métodos de controle.
Entre os inimigos naturais, na classe Insecta,
espécies predadoras ocorrem em 22 ordens, en-
quanto cinco ordens têm representantes parasí-
ticos (Berti Filho & Ciociola, 2002).
Os predadores, durante seu ciclo evolutivo,
podem consumir diversas presas. Normalmente
são mais generalistas, pois atacam diferentes es-
pécies, que podem pertencer a diferentes famíli-
as ou ordens, incluindo insetos-praga ou não.
Na Tabela 2 são apresentados alguns insetos pre-
dadores e suas presas.
Os parasitóides são em geral mais específi-
cos, ou seja, especializados a determinados hos-
pedeiros. Assim, normalmente são mais restritos
à espécie, família ou ordem. Tais inimigos natu-
rais dependem de apenas um hospedeiro para
completar seu ciclo de desenvolvimento, e dife-
renciam-se dos parasitas porque causam a mor-
te do hospedeiro e os adultos têm vida livre.
Atacam em geral as formas jovens dos insetos-
praga, inclusive ovos. Quando ocorrem em pos-
turas, controlam a praga antes dessa causar da-
nos às culturas. Na Tabela 3 são apresentados
alguns insetos parasitóides e seus hospedeiros.
De acordo com Berti Filho & Ciociola (2002),
o impacto de predadores é mais difícil de avaliar
do que o de parasitóides, pois estes podem ser
observados em seus hospedeiros, enquanto os
predadores dificilmente deixam sinais de ataque,
principalmente quando consomem toda a pre-
sa. Ao contrário dos predadores, os parasitóides
têm alta capacidade de encontrar seus hospe-
deiros, inclusive quando a densidade populaci-
onal de fitófagos é baixa (Shepard et al., 1987 e
1995).
1.3 Ordens, subordens e famílias
de insetos de importância agrícola
Dentre as 29 ordens da classe Insecta, nove
destacam-se pela importância agrícola de seus
representantes: Coleoptera, Diptera, Hemiptera,
Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Neuropte-
ra, Orthoptera e Thysanoptera. O Quadro 1 apre-
senta informações sobre características gerais,
famílias e espécies das principais ordens e su-
bordens de insetos de importância agrícola.
Nesse contexto, as plantas de arroz (Orysa
sativa L.) são hospedeiros para um grande nú-
mero de insetos-praga e a ação desses artrópo-
des é um dos principais fatores que afetam a
orizicultura, pois as perdas variam entre 10 e
35% da produção. No entanto, são poucos os
insetos que podem ser considerados pragas, pois
muitos deles são inimigos naturais que estão
associados ao controle biológico dos insetos-pra-

4 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

ga. Fritz et al. (2008) analisaram a abundância de in-
setos-praga e inimigos naturais presentes em áreas
de arroz irrigado em Cachoeirinha (RS). Foram quan-
tificados 1015 indivíduos subdivididos em 10 ordens
de insetos e 2 ordens de aracnídeos (Figura 1). Os
dípteros apresentaram maior abundância dentre os
insetos (51,92%), seguido de Hemiptera (14%), Hy-
menoptera (8,87%), Collembola (8,18%), Coleoptera
(3,05%), Orthoptera (2,56%), Odonata (1,28%), Pso-
coptera (0,98%), Lepidoptera (0,69%) e Dermaptera
(0,1%). Acredita-se que as larvas de mosquitos vêm
desenvolvendo resistência aos inseticidas que são uti-
lizados frequentemente em lavouras orizícolas, tor-
nando-se conseqüentemente abundantes nesses agro-
ecossistemas (Victor & Reuben, 2000).
Entre os insetos, Coleoptera é a ordem dos be-
souros ou cascudos. Há inúmeras espécies de cole-
ópteros fitófagos, sendo que em muitos casos, tanto
as larvas quanto os adultos alimentam-se de plantas.
Nessa ordem, há insetos-praga de diferentes hábitos:
filófagos, rizófagos, xilófagos, carpófagos, entre ou-
tros. Há também várias espécies que atacam produ-
tos armazenados. Entre as famílias, destaca-se Curcu-
lionidae, dos gorgulhos ou bicudos, que é a maior
família do mundo, com cerca de 50.000 espécies des-
critas, sendo a maioria das espécies fitófagas, e as
larvas geralmente desenvolvem-se no interior de par-
tes vegetais, como brocas.
Na ordem Coleoptera também há insetos que são
inimigos naturais, pois atuam no controle biológico
como predadores de outros insetos. Nesse caso des-
tacam-se as famílias Carabidae e Coccinellidae (joani-
nhas), onde a maioria das espécies, tanto na fase de
larva como de adulto, são predadoras de insetos-pra-
ga.
Em Diptera, a ordem das moscas e mosquitos,
também há insetos-praga e inimigos naturais. Entre
os insetos fitófagos destaca-se a família Tephritidae,
das moscas-das-frutas. Entre os inimigos naturais des-
tacam-se as famílias Syrphidae, com espécies cujas
larvas são predadoras, e Tachinidae, com espécies
que desenvolvem-se como parasitóides.
A ordem Hemiptera é composta por insetos de
hábito sugador. Anteriormente, Hemiptera era a or-
dem apenas dos percevejos. Atualmente, inclui tam-
bém cigarras, cigarrinhas, pulgões, cochonilhas, psilí-
deos e moscas-brancas, que pertenciam à ordem Ho-
moptera, atualmente não mais considerada como or-
dem em Insecta.
Além dos danos diretos causados pelos insetos
fitófagos da ordem Hemiptera, que sugam líquidos
de diferentes partes vegetais, também há os danos
indiretos, principalmente relacionados à transmissão
de fitopatógenos.
Em Hemiptera, inimigos naturais ocorrem ape-
nas na subordem dos percevejos (Heteroptera), onde
em algumas famílias há espécies predadoras de inse-
tos (sugam hemolinfa). No entanto, tais famílias não
são exclusivas de espécies entomófagas. Em Reduvii-
dae há também espécies hematófagas (os barbeiros)
e em outras, como Pentatomidae, há um grande nú-
mero de espécies fitófagas. Em Hymenoptera estão
as abelhas, vespas, vespinhas e formigas. Nessa or-
dem há diversas espécies que atuam como poliniza-
dores. Entre os fitófagos destaca-se a família Formici-
dae, que inclui as formigas-cortadeiras. Mas é no con-
trole biológico que a ordem Hymenoptera destaca-
se, pela grande quantidade de famílias e espécies de
parasitóides. Entre os predadores, destaca-se a famí-
lia Vespidae.
Na ordem Isoptera estão os cupins, com espécies
consideradas pragas de diversas culturas, como pas-
tagens, cana-de-açúcar e florestais.
Em Lepidoptera, a ordem das mariposas e bor-
boletas, estão espécies de insetos-praga com diferen-
tes hábitos alimentares, como filófagos, xilófagos, car-
Figura 1. Abundância de insetos e inimigos naturais em lavouras de arroz
irrigado, RS
pófagos, rizófagos, minadores de folhas, espécies
que atacam produtos armazenados, entre outras.
No entanto, os danos dos lepidópteros às cultu-
ras são causados quase que exclusivamente pelas
formas jovens, conhecidas como lagartas.
Entre as famílias de Lepidoptera destaca-se
Noctuidae, que inclui diversas espécies que cau-
sam danos a culturas de grande importância eco-
nômica. Em Noctuidae estão a lagarta-da-soja (An-
ticarsia gemmatalis) e Spodoptera frugiperda, uma
praga polífaga conhecida como lagarta-militar, la-
garta-do-cartucho-do-milho ou lagarta-da-folha-
do-arroz.
A ordem Neuroptera é composta por insetos
predadores, com destaque para a família Chryso-
pidae, cujas larvas são conhecidas como bicho-
lixeiro, pois carregam os restos mortais das pre-
sas aderidos ao corpo.
Em Orthoptera, ordem dos gafanhotos, gri-
los, esperanças e grilotalpas, as espécies de inse-
tos-praga são normalmente polífagas, com desta-
que para as famílias Acrididae, do gafanhoto-cri-
oulo e Gryllotalpidae, dos grilotalpas ou cachor-
rinhos-da-terra.
Na ordem Thysanoptera estão os insetos co-
nhecidos como tripes ou trips, sendo a maioria
das espécies fitófagas e algumas associadas à trans-
missão de viroses de plantas.
A ordem Araneae conta com mais de 38.834 es-
pécies, incluídas em 3.694 gêneros e 109 famílias
no mundo (Platnick, 2008). Elas estão distribuí-
das em agroecossistemas terrestres e são conside-
radas um dos mais abundantes grupos de inver-
tebrados predadores, além de possuírem a vanta-
gem de não danificar as plantas e controlarem
eventuais explosões populacionais de insetos, li-
mitando o canibalismo e territoriedade. No en-
tanto, os pesticidas não seletivos têm sido consi-
derados um risco para as espécies de aranhas
benéficas. Fritz et al. (2008) analisaram as popula-
ções de aranhas em lavouras orízicolas orgânicas
e convencionais (com aplicação de inseticida),
coletadas de 3 regiões produtoras de arroz irriga-
do do RS. Nesses agroecossistemas foram coleta-
das 1148 aranhas, entre jovens e adultos, haven-
do maior abundância em lavouras orgânicas (765)
que diferiram significativamente das lavouras com
aplicações de inseticidas (383). Das 12 famílias
registradas predominaram Araneidae e Tetragna-
thidae que foram fortemente afetadas pelos inse-
ticidas, reduzindo em até 80% da população (Fi-
gura 2).
1.4 Bactérias Entomopatogênicas
As toxinas bacterianas com atividade insetici-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
da potencialmente aplicadas no controle de inse-
tos-praga das plantas cultivadas e vetores de do-
enças animais e humanas foram casualmente des-
cobertas no final do século XIX, através das inves-
tigações das doenças que ocorriam nas criações
de abelhas melíferas (Apis mellifera) e do bicho-
da-seda (Bombyx mori).
A documentação da taxonomia geral bacteri-
ana efetuada por Breed et al. (1957) e o levanta-
mento de espécies de bactérias relacionadas com
insetos hospedeiros descrito por Steinhaus (1947),
podem ser considerados trabalhos pioneiros e fun-
damentais à taxonomia de bactérias que causam
doenças em insetos. A taxonomia bacteriana mo-
derna baseia-se em critérios morfológicos, fisioló-
gicos, sorológicos e genéticos.
Atualmente são conhecidas inúmeras espéci-
es de bactérias associadas a insetos, porém pou-
cas apresentam as características desejáveis à apli-
cação no controle biológico de pragas, sendo na
classificação das bactérias entomopatogênicas, os
critérios de Falcon (1971) os mais viáveis por agru-
parem as bactérias em apenas duas categorias: es-
porulantes e não-esporulantes. Entre essas cate-
gorias destacam-se com maior importância à pa-
tologia de insetos as espécies das famílias Bacilla-
ceae e Enterobacteriaceae.
As bactérias esporulantes apresentam uma ca-
racterística de persistência, as quais podem se man-
ter em condições ambientais adversas através de
estruturas de resistência denominadas endóspo-
ros. Esta característica dessa categoria de bactérias
vem sendo considerada um pré-requisito à pro-
dução de agentes microbianos em escala comer-
cial.
Como característica de bactérias entomopato-
gênicas potencialmente aplicadas no controle mi-
crobiano de insetos, destacam-se as espécies que
apresentam alta virulência, elevada capacidade in-
vasora e produção de toxinas, causando toxemias
nos insetos alvo. Com essas características, na ca-
tegoria de bactérias esporulantes destacam-se como
gêneros de maior importância: Bacillus e Clostri-
dium.
1.4.1. Gênero Bacillus
Bacillus spp., em geral aeróbicas ou facultati-
vamente anaeróbicas, encontram-se em substra-
tos variáveis devido ao complexo enzimático pro-
duzido pelas células em forma de bastonetes, po-
dendo essas se apresentarem individuais ou em
cadeias. Esse gênero apresenta uma grande varia-
ção entre as espécies, porém as características en-
tomopatogênicas associadas à formação de endós-
5
poros e a produção de toxinas e enzimas deter-
minam as seguintes espécies como promissoras
ao controle de insetos prejudiciais:
A. Bacillus thuringiensis
Este microrganismo foi descoberto em 1902
por Ishiwata no Japão, através da criação massal
de Bombix mori. Em 1911, B. thuringiensis foi
novamente isolado por Berliner a partir de larvas
de Ephestia kuehniella, na cidade de Thüringe,
na Alemanha, de onde é originário seu atual
nome. Os primeiros ensaios utilizando B. thurin-
giensis foram realizados na Europa entre os anos
de 1920 e 1930, no controle de Ostrinia nubila-
lis, lepidóptero da família Pyralidae. Nos Estados
Unidos e na Europa, entre os anos de 1930 e
1940, numerosos testes foram realizados contra
outras espécies de lepidópteros. Atualmente, no
caso do controle biológico, B. thuringiensis é o
microrganismo mais utilizado em nível mundial .
Para os microbiologistas, B. thuringiensis (Fi-
gura 3) é uma bactéria gram-positiva, esporulan-
te, aeróbica ou facultativamente anaeróbica, na-
turalmente encontrado no solo. As espécies thu-
ringiensis, cereus e anthracis do gênero Bacillus
apresentam um grau de parentesco tão elevado,
que muitas vezes dificulta, se não impossibilita,
diferenciá-las através de provas bioquímicas e bac-
teriológicas mais simples. Durante muito tempo,
as duas primeiras espécies foram consideradas
como sendo uma única. O principal critério utili-
zado para a distinção entre essas bactérias é a
produção de corpos de inclusões paraesporais
durante o processo de esporulação do B. thurin-
giensis.
No controle microbiano dos insetos, o ento-
mopatógeno Bacillus thuringiensis (Bt) oferece
as melhores alternativas como bioinseticida, mos-
trando-se também um bom candidato à obten-
ção de formulações comerciais, bem como à en-
genharia genética de plantas.
B. Bacillus cereus
B. cereus pode ser considerado como pató-
geno facultativo, devido ao seu hábito saprofíti-
co e à adaptação à vida parasítica das linhagens
entomopatogênicas, sendo atualmente ainda uti-
lizado como opcional no controle de alguns le-
pidópteros, coleópteros e himenópteros quando
o B. thuringiensis mostra-se ineficaz.
O ingrediente ativo responsável pela viru-
lência dessa bactéria corresponde a ação enzi-
mática da lecitinase, descrita por Heimpel (1954,
1955). Em 1989, Rahmet-Alla & Rowley descre-
veram que a fosfolipase C de B. cereus estaria
relacionada a sua atividade entomopatogênica.
Essa bactéria caracteriza-se por apresentar célu-
las em forma de bastonetes com esporos cen-
trais, não-cristalíferas e ausência de esporângio
estendido. Alguns autores mencionam que além
da lecitinase que levou certas linhagens a vida
parasítica, o endósporo dessa bactéria contém
proteína tóxica de baixa atividade específica, es-
truturalmente semelhante ao cristal de B. thurin-
giensis.
Diversos estudos do modo de ação B. cereus
mencionam que essa espécie não tolera meio al-
calino e a enzima para ser ativa exige um pH
entre 6,6 e 7,4, tornando essa bactéria específica
a insetos cujo conteúdo intestinal encontra-se na
faixa neutra, quando então são provocadas alte-
rações no epitélio do intestino médio das larvas
sensíveis, sendo os sintomas patológicos variá-
veis em função do modo de infecção por esse
patógeno.
C. Bacillus larvae
6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
Figura 2. Araneofauna em sistema de cultivo orgânico e convencional de
arroz irrigado, RS
Essa bactéria apresenta esporos centrais ou
terminais que variam de elípticos a cilíndricos num
esporângio distinto, sem corpo de inclusão para-
esporal (cristal). Quando os esporos de B. larvae
são ingeridos pelas larvas e pupas das abelhas,
causam a doença americana das abelhas ou pú-
trida dos berçários.
D. Bacillus alvei
Essa espécie caracteriza-se por apresentar es-
poros centrais ou sub-terminais que variam de
elípticos a cilíndricos. Essa espécie causa doença
européia das crias das abelhas.
E. Bacillus popilliae e Bacillus lentimorbus
Essas espécies são patógenos obrigatórios,
crescem pouco em meio de cultura, e têm como
características esporos elípticos a cilíndricos, em
esporângio nítido num bastonete. B. popilliae cau-
sa a doença leitosa do tipo A e B. lentimorbus
causa a doença leitosa tipo B, ambas em larvas
de escarabeídeos. As características de resistência
dos esporos ao calor, à dessecação e à radiação,
além da sua longevidade em larvas mortas e par-
tículas de solo, tornam essas bactérias agentes
promissores no controle de larvas de Popillia ja-
ponica e Amphimallon mojalis (na Europa e Aus-
trália), além de Eutheola humilis, Stenocrates spp.
e Migdolus morretesi (no Brasil).
O mecanismo de ação é semelhante em am-
bas às espécies, cujas bactérias atuam por inges-
tão, passando do trato digestivo à hemolinfa, mul-
tiplicando-se, esporulando, causando a septice-
mia e morte dos insetos.
F. Bacillus sphaericus
Trata-se de uma espécie que apresenta espo-
ros esféricos em posição terminal num esporân-
gio distendido. Certas cepas dessa espécie pro-
duzem inclusões cristalinas (ou cristais), compos-
tas por dois peptídeos de 42 e 51 kDa que repre-
sentam a toxina binária, com ação inseticida. Há
cepas que sintetizam proteínas inseticidas de
100kDa.
Essa bactéria é cosmopolita, tendo sido iso-
lada de solo, água e do seu hospedeiro natural
(pernilongos mortos). As cepas foram classifica-
das por sorotipos conforme o antígeno flagelar,
totalizando atualmente cerca de 50 sorotipos, en-
tre os quais 7 contêm cepas ativas contra larvas
de dípteros e as cepas mais tóxicas apresentam
como particularidade inclusões paraesporais crista-
linas. Existem mais de 300 cepas de B. sphaericus
catalogadas pelo Instituto Pasteur (Paris, França),
sendo 50% dessas tóxicas às larvas de dípteros.
1.4.2 Gênero Clostridium
O gênero Clostridium compreende cerca de 100
espécies distribuídas em 19 grupos de acordo com
a homologia de ARN16s. As células são em forma
de bastonetes, geralmente Gram-positivas, com en-
dósporos ovais ou esféricos que as deformam. As
espécies desse gênero são estritamente anaeróbias,
havendo algumas que toleram a presença de oxi-
gênio livre, porém não formam esporos. Essas bac-
térias são encontradas naturalmente no solo, sedi-
mentos marinhos, restos animais e vegetais, assim
como na flora intestinal de vertebrados e inverte-
brados, como os insetos.
Os efeitos entomopatogênicos de C. brevifas-
ciens e C. malacosomae foram observados em lar-
vas de Malacosoma pluviale, havendo a germina-
ção dos esporos na luz intestinal e o rápido cresci-
mento vegetativo, o qual causa a morte em poucos
dias, sem haver invasão na cavidade do corpo do
inseto. Alguns autores citam que C. bifermentans
malaysia sintetiza uma proteína tóxica às larvas de
Aedes aegypti, Culex pipiens e Anopheles stephensi,
a qual apresenta elevada similaridade as delta-en-
dotoxinas sintetizadas pelo entomopatógeno B. thu-
ringiensis.
Figura 3. Bacillus thuringiensis
em microscopia eletrônica de
transmissão
Quadro 1. Caracterização das principais ordens e subordens de insetos de importância agrícola, com
exemplos de famílias e espécies

ORDEM COLEOPTERA – besouros

Características gerais
• Asas anteriores do tipo élitros (consistência coriácea ou córnea) e posteriores membranosas;
• Aparelho bucal mastigador;
• Metamorfose completa : Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto);
• Mais de 300.000 espécies descritas.

Subordem Adephaga
Características gerais
• Porção ventral do segmento abdominal (urosternito) basal divido pelas cavidades coxais do terceiro par de
pernas;
• Em geral, predadores.
Principal família de importância agrícola
• Carabidae: adultos e larvas predadores (Ver Tabela 2)

Subordem Polyphaga
Características gerais
• Porção ventral do segmento abdominal (urosternito) basal não divido pelas cavidades coxais do terceiro
par de pernas;
• Maioria das famílias de Coleoptera.
Principais famílias de importância agrícola
• Anobiidae: Lasioderma serricorne – besouro-do-fumo
• Bostrichidae: Rhyzopertha dominica - besourinho-do-trigo
• Buprestidae: Colobogaster cyanitarsis – broca-da-figueira
• Bruchidae: Acanthoscelides obtectus – caruncho-do-feijão
• Cerambycidae: Oncideres impluviata - serrador-da-acácia-negra
• Chrysomelidae: Diabrotica speciosa – vaquinha ou brasileirinho
• Coccinellidae: joaninhas – larvas e adultos predadores (Ver Tabela 2)
Epilachna cacica – joaninha-das-cucurbitáceas (fitófaga)
• Curculionidae: Anthonomus grandis – bicudo-do-algodoeiro
Oryzophagus oryzae – gorgulho-aquático (adulto), bicheira-da-raiz-do-arroz (larva)
Sitophilus zeamais – gorgulho-do-milho
• Elateridae: Conoderus scalaris - larva-arame
• Meloidae: Epicauta atomaria – burrinho
• Scarabaeidae: Euetheola humilis – cascudo-preto-do-arroz
• Scolytidae: Hypothenemus hampei – broca-do-café
• Tenebrionidae: Tribolium castaneum - besouro-do-milho

Observação: As outras duas subordens (Archostemata e Myxophaga) têm pouco mais de 50 espécies descritas.

ORDEM DIPTERA – moscas e mosquitos

Características gerais
• Asas anteriores membranosas;
• Asas posteriores modificadas em halteres ou balancins;
• Aparelho bucal sugador labial;
• Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto).

Subordem Nematocera – mosquitos, pernilongos e borrachudos

Característica geral
• Antenas mais longas que o tórax.
Principal família de importância agrícola
• Cecidomyiidae: Jatrophobia brasiliensis – mosca-das-galhas-da-folha-da-mandioca
Stenodiplosis sorghicola – mosca-do-sorgo

Subordem Brachycera – moscas

Característica geral
• Antenas curtas, com arista ou estilo no último segmento.
Principais famílias de importância agrícola
• Agromyzidae: Liriomyza trifolii - mosca-minadora
• Syrphidae: larvas predadoras (Ver Tabela 2)

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 7

 • Tachinidae: parasitóides (Ver Tabela 3)
• Tephritidae: moscas-das-frutas - Ceratitis capitata – mosca-do-mediterrâneo
Anastrepha fraterculus – mosca-sul-americana
Anastrepha grandis - mosca-das-cucurbitáceas

ORDEM HEMIPTERA - percevejos, cigarras, cigarrinhas, pulgões, cochonilhas, psilídeos e moscas-brancas

Características gerais
• aparelho bucal sugador labial (rostro);
• ápteros ou com dois pares de asas, membranosas ou com o anterior total ou parcialmente mais resistente que
o posterior;
• metamorfose incompleta: Hemimetábolos (ovo, ninfa, adulto ou ovo, ninfa, “pupário”, adulto)

Subordem Sternorrhyncha - cochonilhas, pulgões, moscas brancas e psilídeos

Características gerais
• rostro emergindo entre as pernas anteriores;
• antenas longas ou curtas;
• ápteros ou alados (membranosas ou anteriores tégminas);
• ninfas e/ou adultos podem viver aderidos às plantas.
Principais famílias de importância agrícola
• Aleyrodidae: moscas-brancas - Aleurothrixus floccosus
Bemisia tabaci
• Aphididae: Aphis gossypii – pulgão-do-algodoeiro
Myzus persicae - pulgão-verde
Toxoptera citricida - pulgão-preto-dos-citros
• Phylloxeridae: Daktulosphaira vitifoliae - filoxera-da-videira
• Psyllidae: Diaphorina citri - psilídeo-dos-citros
• Coccidae: Coccus viridis - cochonilha-verde
Saissetia coffeae - cochonilha-parda
• Diaspididae: Chrysomphalus ficus – cabeça-de-prego
Lepidosaphis beckii - escama-vírgula
Pinnaspis aspidistrae - escama-farinha
• Margarodidae: Eurhizococcus brasiliensis – pérola-da-terra
Icerya purchasi – cochonilha-australiana
• Pseudococcidae: Planococcus citri – cochonilha-branca
Pseudococcus maritimus - cochonilha-branca

Subordem Auchenorrhyncha – cigarras e cigarrinhas

Características gerais
• rostro emergindo da parte inferior da cabeça;
• antenas setáceas curtas;
• asas membranosas ou anteriores tégminas;
• ninfas e adultos de vida livre.
Principais famílias de importância agrícola
• Cicadidae: Quesada gigas – cigarra-do-cafeeiro
• Cercopidae: Deois flavopicta - cigarrinha-das-pastagens
Mahanarva fimbriolata – cigarrinha-da-raiz-da-cana-de-açúcar
Mahanarva posticata – cigarrinha-da-folha-da-cana-de-açúcar
Notozulia entreriana - cigarrinha-das-pastagens
• Cicadellidae: Dalbulus maidis – cigarrinha-do-milho
Empoasca kraemeri - cigarrinha-verde-do-feijoeiro

Subordem Heteroptera – percevejos

Características gerais
• rostro articulado;
• asas anteriores do tipo hemiélitro.
Principais famílias de importância agrícola
• Cydnidae: Scaptocoris castanea - percevejo-castanho
• Coreidae: Diactor bilineatus - percevejo-do-maracujá
Phthia picta – percevejo-do-tomate
• Pentatomidae: Nezara viridula – percevejo-verde-da-soja
Oebalus poecilus - percevejo-do-grão-do-arroz
Tibraca limbativentris – percevejo-do-colmo-do-arroz
• Reduviidae : predadores (Ver Tabela 2)

8 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

ORDEM HYMENOPTERA – abelhas, formigas, vespas, vespinhas
Características gerais
• Asas membranosas;
• Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto)

Subordem Apocrita – abelhas, formigas, marimbondos, vespinhas

Característica geral
• Abdome livre ou pedunculado
Principais famílias de importância agrícola
• Apidae: abelhas - Trigona spinipes - abelha-irapuá (fitófaga)
• Formicidae: Atta spp. - saúvas
Acromyrmex spp. - quenquéns
• Vespidae: predadores (ver Tabela 2)
Observação: Famílias de hymenópteros parasitóides (ver Tabela 3)

Subordem Symphita Característica geral

• Abdome séssil
Família de importância agrícola
• Siricidae: Sirex noctilio - vespa-da-madeira

ORDEM ISOPTERA – cupins

Características gerais
• Aparelho bucal mastigador;
• Antenas moniliformes;
• Asas presentes nas formas reprodutivas, membranosas, ambos os pares iguais;
• Asas com sutura basal, que se rompe após a revoada, destacando as asas do corpo;
• Metamorfose completa: holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto);
• Espécies sociais, formando castas: sexuados alados (formam novos cupinzeiros), sexuados ápteros (rei e
rainha) e estéreis (operários e soldados);
• Fontanela: onde localiza-se glândula com função de defesa dos cupins superiores.
Principal família de importância agrícola
• Termitidae: Cornitermes cumulans
Nasutitermes globiceps

ORDEM LEPIDOPTERA – borboletas e mariposas

Características gerais
• Asas membranosas cobertas por escamas
• Aparelho bucal sugador maxilar (espiritromba ou probóscida)
• Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva (=lagarta), pupa (=crisálida), adulto)

Subordem Glossata
Característica geral
• Espiritromba formada pelas gáleas maxilares
Principais famílias de importância agrícola
• Crambidae: Azochis gripusalis – broca-da-figueira
Diatraea saccharalis - broca-da-cana-de-açúcar
• Gelechiidae: Phthorimaea operculella – traça-da-batata
Sitotroga cerealella - traça-dos-cereais
• Noctuidae: Agrotis ipsilon – lagarta-rosca
Alabama argillacea - curuquerê-do-algodoeiro
Anticarsia gemmatalis – lagarta-da-soja
Helicoverpa zea - lagarta-da-espiga-do-milho
Mocis latipes – lagarta-dos-capinzais
Spodoptera frugiperda – lagarta-do-cartucho-do-milho, lagarta-da-folha-do-arroz
Pseudaletia sequax – lagarta-do-trigo
• Pieridae: Ascia monuste orseis - curuquerê-da-couve
• Pyralidae: Elasmopalpus lignosellus – lagarta-elasmo
Plodia interpunctella – traça-indiana
• Sphingidae: Erinnyis ello – mandarová-da-mandioca
Manduca sexta - mandarová-do-fumo
• Tortricidae: Cydia pomonella – traça-da-maçã
Grapholita molesta – mariposa-oriental
Observação: Cada uma das outras três subordens (Aglossata, Heterobathmiina e Zeugloptera) tem apenas uma
família. Como característica geral dessas subordens, as gáleas maxilares não formam espiritromba (probóscida).

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 9

 ORDEM NEUROPTERA
Características gerais
• Asas membranosas com sistema variado de nervuras ;
• Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto);
• Larvas predadoras.
Principal família de importância agrícola
• Chrysopidae – predadores (ver Tabela 2)

ORDEM ORTHOPTERA – gafanhotos, grilos, esperanças e grilotalpas

Características gerais
• Terceiro par de pernas saltatorial;
• Antenas filiformes ou setáceas;
• Aparelho bucal mastigador;
• Asas com par anterior do tipo tégmina e posterior membranosa;
• Metamorfose incompleta: Hemimetábolos (ovo, ninfa, adulto).

Subordem Caelifera - gafanhotos

Características gerais
• Antenas curtas;
• Tímpanos, quando presentes, localizados no primeiro segmento do abdome.
Principal família de importância agrícola
• Acrididae: Rhammatocerus schistocercoides – gafanhoto-crioulo

Subordem Ensifera - esperanças, grilos e grilotalpas

Características gerais
• Antenas longas;
• Tímpanos, quando presentes, localizados nas tíbias anteriores.
Principal família de importância agrícola
• Gryllotalpidae – Neocurtilla hexadactyla – grilotalpa ou cachorrinho-da-terra

ORDEM THYSANOPTERA - tripes ou trips

Características gerais
• Aparelho bucal sugador labial triqueta (raspador-sugador);
• Antenas filiformes ou moniliformes;
• Asas franjadas;
• Metamorfose incompleta: Hemimetábolos (ovo-ninfa-ninfa imóvel-adulto).

Subordem Tubulifera Característica geral

• Último segmento abdominal em forma de tubo.

Subordem Terebrantia Característica geral

• Último segmento abdominal arredondado ou cônico.
Principal família de importância agrícola
• Thripidae: Frankliniella schultzei
Thrips palmi
Thrips tabaci

Croft, 1990; Heinrichs, 1994; Gallo et al., 2002; Heinrichs & Barrion, 2004; Lucho, 2004.

10 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

Tabela 1: Alguns insetos vetores de fitopatógenos
INSETOS VETORES PATÓGENOS DOENÇAS CULTURAS

Acrogonia citrina (Hem.:
Cicadellidae)
Aphis gossypii (Hem.:
Aphididae)
Bactéria - Xylella fastidiosa Clorose variegada dos citros (CVC) Citros
Cucumber mosaic virus (CMV) Mosaico da bananeira Bananeira
Papaya ringspot virus – type P (PRSV-P) Mosaico do mamoeiro Mamoeiro
Passion fruit woodiness virus (PWV) Endurecimento dos frutos Maracujazeiro

Bemisia tabaci (Hem.:
Aleyrodidae)
Cerotoma arcuata(Col.:
Chrysomelidae)
Dalbulus maidis(Hem.:
Cicadellidae)
Diabrotica speciosa (Col.:
Chrysomelidae)
Diaphorina citri (Hem.:
Psyllidae)
Dilobopterus costalimai(Hem.:
Cicadellidae)
Frankliniella
occidentalis(Thy.: Thripidae)
Frankliniella schultzei(Thy.:
Thripidae)
Hypocryphalus mangiferae
(Col.: Scolytidae)
Myzus persicae (Hem.:
Aphididae)
Myndus crudus(Hem.:
Cixiidae)
Oncometopia facialis (Hem.:
Cicadellidae)
Planococcus ficus (Hem.:
Pseudococcidae)
Pseudococcus
longispinus(Hem.:
Pseudococcidae)
Rhopalosiphum maidis(Hem.:
Aphididae)
Bean golden mosaic virus (BGMV) Mosaico dourado do feijoeiro Feijoeiro
Bean rugose mosaic virus (BRMV) Mosaico rugoso da soja Feijoeiro e soja
Fitoplasma Enfezamento vermelho do milho Milho
Maize rayado fino virus (MRFV) Risca do milho Milho
Spiroplasma kunkelii Enfezamento pálido Milho
Bean rugose mosaic virus (BRMV) Mosaico rugoso da soja Feijoeiro e soja
Bactéria - Candidatus liberibacter spp. Greening ou Huanglongbing (HLB) Citros
Bactéria - Xylella fastidiosa Clorose variegada dos citros (CVC) Citros
Tospovírus Vira-cabeça Fumo, tomate e outras solanáceas
Tospovírus Vira-cabeça Fumo, tomate e outras solanáceas
Fungo: Ceratocystis fimbriata Seca da mangueira Mangueira
Papaya ringspot virus – type P (PRSV-P) Mosaico do mamoeiro Mamoeiro
Passion fruit woodiness virus (PWV) Endurecimento dos frutos Maracujazeiro
Potato leafroll virus (PLRV) Enrolamento da folha da batateira Batata
Potato virus Y (PVY) Mosaico do pimentão Solanáceas
Soybean mosaic virus (SMV) Mosaico comum da soja Soja
Phytoplasma palmae Amarelecimento letal Coqueiro
Bactéria - Xylella fastidiosa Clorose variegada dos citros (CVC) Citros
Grapevine leafroll-associated virus Enrolamento da folha Videira
(GLRaV)
Grapevine leafroll-associated virus Enrolamento da folha Videira
(GLRaV)
Soybean mosaic virus (SMV) Mosaico comum da soja Soja
Sugarcane mosaic virus (SCMV) Mosaico comum Milho, sorgo, cana-de-açúcar

Thrips palmi(Thy.: Thripidae) Tospovírus Vira-cabeça Fumo, tomate e outras solanáceas

Toxoptera citricidus(Hem.: Citrus tristeza virus (CTV) Tristeza dos citros Citros
Aphididae) Papaya ringspot virus – type P (PRSV-P) Mosaico do mamoeiro Mamoeiro
Passion fruit woodiness virus (PWV) Endurecimento dos frutos Maracujazeiro
Kimati et al., 1997; Gallo et al., 2002; Oliveira et al., 2003.
Tabela 2: Alguns insetos predadores e suas presas
ORDENS E FAMÍLIAS PREDADORES PRESAS
Coleoptera
Carabidae Callida scutellaris lagartas
Calosoma granulatum lagartas
Lebia concina lagartas
Coccinellidae (joaninhas) Azya luteipes cochonilhas
Eriopis connexa pulgões
Cycloneda sanguinea pulgões
Pentilia egena cochonilhas
Rodolia cardinalis cochonilhas
Dermaptera
Forficulidae (tesourinhas) Doru luteipes lagartas e ovos
Diptera
Syrphidae Pseudodoros clavatus pulgões
Salpingogaster nigra ninfas de cigarrinhas
Hemiptera
Anthocoridae Orius insidiosus lagartas, ovos, tripes, pulgões
Lygaeidae Geocoris sp. lagartas e ovos
Nabidae Nabis sp. lagartas e ovos
Pentatomidae Podisus nigrispinus lagartas e ovos
Reduviidae Zelus sp. lagartas, coleópteros
Hymenoptera
Vespidae Polistes sp. lagartas
Polybia sp. lagartas
Neuroptera
Chrysopidae Chrysopa sp. pulgões, cochonilhas, moscas-brancas
Chrysoperla sp. pulgões, cochonilhas, moscas-brancas
Gallo et al., 2002; Silva et al., 2002; De Bortoli et al., 2008.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 11
 Tabela 3: Alguns insetos parasitóides e seus respectivos hospedeiros
ORDENS E FAMÍLIAS PARASITÓIDES HOSPEDEIROS CULTURAS

Hymenoptera
Aphelinidae Aphelinus mali Pulgão-lanígero Eriosoma Macieira e outras rosáceas
lanigerum(Hem.: Aphididae)
Encarsia (Prospaltella) berlesei Cochonilha-branca Pseudaulacaspis Pessegueiro, amoreira e outras
pentagona (Hem.: Diaspididae) frutíferas
Bethylidae Vespa-de-uganda Prorops nasuta Broca-do-café Hypothenemus hampei Cafeeiro
(Col.: Scolytidae)
Braconidae Apanteles sp. Mandarová-do-fumo Manduca sexta Fumo
(Lep.: Sphingidae)
Aphidius sp. Pulgão-verdeMyzus persicae (Hem.: Diversas culturas, como as
Aphididae) solanáceas
Pulgão-do-algodoeiroAphis gossypii(Hem.: Diversas culturas, como algodão,
Aphididae) solanáceas e cucurbitáceas
Pulgão-da-espigaSitobion avenae(Hem.: Diversas culturas, como trigo,
Aphididae) aveia, cevada
Apanteles subandinus Traça-da-batataPhthorimaea Batata
operculella(Lep.: Gelechiidae)
Chelonus insularis Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodoptera Diversas culturas, como milho,
frugiperda(Lep.: Noctuidae) arroz, algodoeiro
Colastes letifer Bicho-mineiro Leucoptera coffeella(Lep.: Cafeeiro
Lyonetiidae)
Cotesia flavipes Broca-da-cana Diatraea saccharalis(Lep.: Cana-de-açúcar, milho e outras
Crambidae) Poaceae (gramíneas)
Diachasmimorpha longicaudata Mosca-do-mediterrâneo Ceratitis capitata Frutíferas diversas
(Dip.: Tephritidae)
Hypomicrogaster hypsipylae Broca-do-cedroHypsipyla grandella(Lep.: Cedro, mogno e outras espécies
Pyralidae) florestais
Chalcididae Brachymeria pseudoovata Traça-dos-cachos Cryptoblabes Videira
gnidiella(Lep.: Pyralidae)
Encyrtidae Ageniaspis citricola Minador-dos-citros Phyllocnistis Citros
citrella(Lep.: Gracillariidae)
Eulophidae Proacrias coffeae Bicho-mineiro Leucoptera coffeella(Lep.: Cafeeiro
Lyonetiidae)
Tetrastichus giffardianus Mosca-do-mediterrâneo Ceratitis Frutíferas diversas
capitata(Dip.: Tephritidae)
Ibaliidae Ibalia leucospoides Vespa-da-madeira Sirex noctilio(Hym.: Pinus
Siricidae)
Ichneumonidae Campoletis flavicincta Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodoptera Diversas culturas, como milho,
frugiperda(Lep.: Noctuidae) arroz, algodoeiro
Coccygomimus tomyris Lagarta-cachorrinho Eupseudosoma Eucalipto
aberrans (Lep.: Arctiidae)
Lagarta-mede-palmo Sabulodes caberata Eucalipto
caberata (Lep.: Geometridae)
Microcharops bimaculata Lagarta-da-soja Anticarsia Soja e outras Fabaceae
gemmatalis(Lep.: Noctuidae) (leguminosas)
Scelionidae Telenomus podisi Percevejo-marrom Euschistus heros(Hem.: Soja
Pentatomidae)
Percevejo-do-colmoTibraca Arroz
limbativentris(Hem.: Pentatomidae)
Trissolcus basalis Percevejo-verde-da-soja Nezara viridula Diversas culturas, como soja e
(Hem.: Pentatomidae) mamoeiro
Trissolcus urichi Percevejo-do-colmoTibraca Arroz
limbativentris(Hem.: Pentatomidae)
Trichogrammatidae Trichogramma galloi Broca-da-cana Diatraea saccharalis(Lep.: Cana-de-açúcar, milho e outras
Crambidae) Poaceae (gramíneas)
Trichogramma pretiosum Broca-pequena-do-fruto Neoleucinodes Tomateiro e outras solanáceas
elegantalis(Lep.: Crambidae)
Lagarta-da-espiga-do-milho Helicoverpa Milho, sorgo e outras Poaceae
zea(Lep.: Noctuidae) (gramíneas)
Diptera
Tachinidae Archytas incertus Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodoptera Diversas culturas, como milho,
frugiperda(Lep.: Noctuidae) arroz, algodoeiro
Archytas lopesi Lagarta-das-folhas Rolepa unimoda(Lep.: Ipê
Lymantriidae)
Archytas pseudodaemon Lagarta-cachorrinho Eupseudosoma Eucalipto
aberrans (Lep.: Arctiidae
Mariposa-violácea Sarsina violascens(Lep.: Eucalipto
Lymantriidae)
Hemisturmia sp. Lagarta urticante Lonomia Cafeeiro
circumstans(Lep.: Saturniidae)
Lespesia affinis Lagarta-cachorrinho Eupseudosoma Eucalipto
aberrans (Lep.: Arctiidae)
Trichopoda nitens Percevejo-verde-da-soja Nezara viridula Diversas culturas, como soja e
(Hem.: Pentatomidae) mamoeiro
Xanthozona melanopyga Lagarta-das-palmeiras Brassolis Coqueiro, dendezeiro e outras
sophorae(Lep.: Nymphalidae) palmeiras
Sampaio et al., 2001; Gallo et al., 2002; Rodrigues et al., 2004; Pratissoli et al., 2005; Carvalho, 2005; Maciel et al., 2007.

12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

1.5 Referências
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13
 ECOLOGIA DE BACILLUS
Pesquisa ENTOMOPATOGÊNICOS
Pesquisa

1.1 Biologia e ecologia

de Bacillus spp.

Atualmente são conhecidas inúmeras espécies de bactérias associadas a

insetos. Porém poucas apresentam as características desejáveis à aplicação do
controle biológico de insetos-praga das plantas cultivadas (Fiuza, 2001). No
entanto, o crescente interesse pela utilização de
bioinseticidas para o controle de populações de in-
studos ecológicos visando à conservação de Bacillus spp. setos prejudiciais, levou o homem a pesquisar mais
em ecossistemas aquáticos e terrestres justificam-se pela profundamente as bactérias (Habib & Andrade,
aplicação de algumas espécies no controle biológico de 1998). Entre as bactérias entomopatogênicas, o gê-
insetos. Apesar desses microrganismos apresentarem nero Bacillus apresenta especial importância no
semelhanças quanto à biologia e modo de ação, eles
controle biológico de pragas, destacando-se o Ba-
diferem entre si por características particulares de cada espécie.
cillus sphaericus e o Bacillus thuringiensis (Priest,
Os aspectos relacionados à distribuição geográfica, habitat
preferencial, interações com a microbiota local, fatores que
1992, 2000; Rabinovitch, 2000; Brighenti et al., 2005;
afetam crescimento, esporulação e atividade inseticida dos Capalbo et al., 2005; Crickmore et al., 2008; De Melo,
entomopatógenos servem como parâmetros às análises de 2008).
impacto ambiental, especialmente em agroecossistemas Embora seja reconhecido que B. thuringiensis é
orizícolas. Esse conjunto de elementos fornece subsídios que um patógeno de insetos, a ecologia dessa bactéria
auxiliam na seleção de isolados com potencial inseticida e ainda é pouco conhecida (Jensen et al., 2003). Ele
ampliam a escassa literatura sobre o papel ecológico desses é um microrganismo ubíquo do solo, mas é tam-
microrganismos no ambiente. bém encontrado nos demais ambientes terrestres,
aquáticos e também em insetos mortos, produtos
armazenados, plantas e detritos (Meadows et al.,
Aline Oliboni de Azambuja
1992; Meadows, 1993; Bernhard et al., 1997, Hossain et al., 1997; Forsyth &
Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre Logan, 2000; Hongyu et al., 2000; Maeda et al., 2000; Sneath, 2001; Martinez &
(UNISINOS). Caballero, 2002; Silva et al., 2002; Uribe et al., 2003; Wang et al., 2003). De
toda forma, ele habita mais comumente o solo e a superfície das folhas (For-
Gabriela Cristina Alles
Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda syth & Logan, 2000). No solo, o número de células varia de 102 a 104 Unida-
em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida des Formadoras de Colônias (UFC) por grama de solo, enquanto em plantas,
Silvestre (UNISINOS). esse número varia de 0 a 100 UFC cm-2 (Damgaard, 2000).
Leila Lucia Fritz
De acordo com Meadows (1993) existem quatro possíveis explicações para
Bióloga (UNISINOS) e Mestranda em Biologia: a presença de B. thuringiensis no solo: a primeira considera que B. thuringi-
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre ensis raramente desenvolve-se no solo, mas é depositado nesse substrato por
(UNISINOS). folhas, insetos, entre outros. A segunda hipótese assume que esse microrga-
Maria Helena Ribeiro Reche nismo pode ser patógeno de insetos do solo que apresentem reduzida impor-
Bióloga (UPF) e Mestre e Doutoranda em tância econômica, com os quais poucos estudos foram realizados. A terceira
Biologia: Diversidade e Manejo de Vida hipótese pressupõe que B. thuringiensis pode desenvolver-se no solo quando
Silvestre (UNISINOS).
existem nutrientes suficientes, obtidos de resíduos orgânicos em decomposi-
Lidia Mariana Fiuza ção. Enquanto a última teoria afirma a existência de afinidade de B. thuringi-
Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em ensis e Bacillus cereus, com o qual B. thuringiensis pode trocar material gené-
Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutora tico, possibilitando sua permanência no ambiente.
em Ciências Agronômicas (ENSAM-
Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Além de B. thuringiensis e B. cereus, existem as espécies: B. mycoides, B.
Vegetal (CIRAD-Montpellier). pseudomycoides, B. anthracis e B. weihenstephanensis (Hansen, et al., 2003;

14 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38


Figura 1. Bactérias esporulantes
provenientes de amostras de solo
em regiões produtoras de arroz
irrigado do RS
Hu et al., 2004). As espécies, B. ce-
reus e B. thuringiensis são fenotipi-
camente e geneticamente muito simi-
lares entre si, havendo dificuldade na
distinção entre as duas espécies (Le-
cadet et al., 1999; Shisa et al., 2002).
No entanto, B. cereus é considerado
patógeno facultativo devido ao seu
hábito saprofítico no solo e parasita
de linhagens de insetos, possuindo
uma proteína tóxica de baixa ativida-
de específica (Habib & Andrade,
1998). Esta espécie não produz inclu-
sões paraesporais inseticidas atuando
através de ação enzimática (Guttmann
& Ellar, 2000; Shisa et al., 2002). Mui-
tas cepas de B. cereus são considera-
das patógenas oportunistas de mamí-
Figura 2. Freqüência de Bacillus spp. nos diferentes sistemas de cultivo e fases da cultura do arroz irrigado no RS; (C)
pousio, (SCC) sistema de cultivo convencional, (SCG) sistema de cultivo pré-germinado, (SCD) sistema de cultivo direto
feros, causando intoxicações alimen-
tares seguidas de vômitos e diarréias,
dificultando o seu emprego no con-
trole de insetos-praga (Hansen & Hen-
driksen, 2001).
As informações sobre o destino
das toxinas de B. thuringiensis no solo
são limitadas, embora alguns traba-
lhos mostrem que elas unem-se a áci-
dos húmicos e suplementos orgâni-
cos ou partículas do solo, que as pro-
tegem da degradação sem perder sua
atividade inseticida (Polanczyk & Al-
ves, 2003). De modo geral, as bacté-
rias entomopatogênicas permanecem
no solo por meses ou anos após a
sua liberação. B. thuringiensis é ca-
paz de permanecer viável por mais
de três anos após liberado (Fuxa,
1992). A sensibilidade dos esporos
desse entomopatógeno à radiação
solar e à dessecação está associada
com os plasmídeos, ocorrendo trocas
na composição química da cobertura
dos esporos, reduzindo sua tolerân-
cia aos fatores físicos do ambiente.
Nas folhas, a limitação dos esporos
pode ocorrer pelo tipo de folha e seus
exudados, os quais contém inibido-
res da germinação de esporos (Yá-
nez & Cabriales, 2000).
Considerando a hipótese de que
os esporos do B. thuringiensis encon-
tram-se no ambiente como resultado
da morte do inseto alvo, espera-se que
a distribuição dessa bactéria ocorra
aleatoriamente, e que os isolados de
um mesmo lugar sejam similares (Fiu-
za, 2001). No entanto, os isolados de
B. thuringiensis têm sido encontrados
em todos os tipos de solos e regiões
do mundo, incluindo tundra ártica, es-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
tepe, regiões temperadas e tropicais,
savanas e desertos quentes. Sua abran-
gência foi relatada em áreas da Es-
candinávia a Nova Zelândia e da Is-
lândia a Cadeias Montanhosas. No en-
tanto, ele é raramente encontrado em
areias de praias e camadas de solo
abaixo de 10 cm de profundidade
(Landén et al., 1994; Chilcott & Ellar,
1998).
B. thuringiensis tem sido freqüen-
temente isolado de florestas, áreas ur-
banas, campos e principalmente de
lavouras agrícolas (Martin, 1994; Fiu-
za, 2001).
Em um levantamento do Banco de
Bactérias Entomopotagonênicas da
Microbiologia da UNISINOS (BBE-
MU), foram analisadas 278 amostras
de solo, oriundas de 29 municípios,
de cinco regiões produtoras de arroz
irrigado do RS. Foram isoladas 674
amostras de bactérias esporulantes, a
maioria pertencente ao Litoral Norte
(41%), seguido do Litoral Sul (21%),
da Campanha (14,4%), da Depressão
Central (14%) e da Fronteira Oeste
(10%) (Figura 1).
Dessas, 31,1% correspondem a B.
thuringiensis; 6% a B. cereus; 4% a B.
sphaericus e 58,9% equivalem a ou-
tras espécies de Bacillus (Fritz et al.,
2007). Outras pesquisas em solos de
áreas de arroz irrigado revelam a
ampla ocorrência de Bacillus no RS.
Em 2006, Azambuja estudou a fre-
qüência de isolados de Bacillus spp.
durante o período que compreende
o ciclo do cultivo do arroz irrigado
no sistema convencional e obteve 245
colônias de bactérias esporulantes,
onde 143 pertenciam ao gênero Ba-
15
 Figura 3. Abundância de Bacillus thuringiensis em relação aos distintos tratamentos fitossanitários e período de irriga-
ção do arroz no RS; (C) área controle, (H) área somente com herbicidas, (H+I) área com herbicidas e inseticida, (H+F)
área com herbicidas e fungicida
cillus, entre as quais foram identifica-
das 26,6% como B. thuringiensis; 4,2%
como B. sphaericus e 69,2% foram
agrupadas como outras espécies de
Bacillus.
Silva et al. (2002) reforçam a pre-
dominância de B. thuringiensis (9,1%)
em solos de todas as regiões brasilei-
ras se comparado a B. sphaericus
(5,1%), com exceção da região Sul do
país que B. sphaericus (10,1%) foi
mais freqüente que B. thuringiensis
(4,6%). No entanto, em solos agríco-
las de diferentes áreas da Argentina a
freqüência de B. sphaericus foi maior
(2,1%) em relação à de B. thuringi-
ensis (1,6%) conforme os dados de
Dias et al. (1999).
Como foi verificada nas diversas
pesquisas, a freqüência de B. thurin-
giensis em vários locais e as diferen-
ças encontradas podem ser atribuídas
a inúmeros fatores, incluindo varia-
ções geográficas, climáticas, ativida-
de agrícola, tipo de solo e método de
isolamento. Contudo, Martin (1984)
discute que B. thuringiensis não pos-
sui um habitat natural bem definido,
pois esse entomopatógeno é caracte-
rizado como um microrganismo sa-
profítico, sem exigências nutricionais
restritas, podendo adaptar-se a dife-
rentes condições ambientais.
Diante disso, ainda que os ento-
mopatógenos apresentados possuam
semelhanças quanto à biologia e
modo de ação, eles diferem entre si
por características particulares de cada
espécie. Estudos ecológicos facilitam
16 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
a compreensão dessas bactérias no
ambiente, suas relações patógeno/
hospedeiro e a estrutura de popula-
ções, permitindo conhecer o compor-
tamento de microrganismos naturais
e novos isolados, sejam eles modifi-
cados geneticamente ou introduzidos
através de programa de controle mi-
crobiano (Sosa-Gómez et al., 1998).
Ainda assim, as bactérias entomopa-
togênicas do gênero Bacillus são
matéria-prima à industrialização de
inseticidas bacterianos. Seus efeitos
sobre as larvas são tão pronunciados
que as indústrias de inseticidas con-
vencionais buscam ampliar suas utili-
zações com o objetivo de controlar
as pragas da agricultura e vetores de
agentes etiológicos de doenças huma-
nas e vegetais.
1.2 Bacillus spp. em amostras
de solos de agroecossistemas
O crescente aumento de áreas agrí-
colas vem causando diversos efeitos
ambientais, como a mudança micro-
biana do solo que é mediada por di-
versos processos e funções (Motavalli
et al., 2004). Em agroecossistemas, as
mudanças significativas e perceptíveis
na comunidade microbiana do solo
estão relacionadas com as condições
ambientais, sendo conseqüência prin-
cipalmente do uso das práticas de
manejo desse ambiente (Atlas et al.,
1991). Práticas agrícolas, tais como
tipo de manejo do solo, rotação de
culturas, aplicação de agrotóxicos e
uso de maquinários interferem na
microbiota terrestre, afetando a qua-
lidade do solo, modificando as pro-
priedades físicas, químicas e biológi-
cas (Valarini et al., 2002; Andréa &
Hollweg, 2004). Dessa forma, ocor-
rem variações no número de indiví-
duos ou na dinâmica bioquímica na-
tural da comunidade de microrganis-
mos. Porém, pouco é conhecido so-
bre a distribuição desses microrganis-
mos terrestres e a maneira com que
eles respondem as mudanças de ma-
nejo na terra (Buckley & Schmidt,
2003).
Diversas populações de bactérias
formadoras de endósporos ocorrem
em áreas agrícolas e podem contri-
buir diretamente ou indiretamente na
produtividade das culturas (Gardener,
2004). As bactérias gram-positivas for-
mam uma parte importante da micro-
biota de solo, o qual constitui o prin-
cipal ambiente natural que abriga
bactérias do gênero Bacillus (Ibarra
et al., 2003; Mohamed et al., 2007).
Muitas espécies desse gênero são con-
sideradas de importância prática (Cac-
camo et al., 2001), já que espécies de
Bacillus são utilizadas para a síntese
de uma grande variedade de produ-
tos médicos, agrícolas, farmacêuticos
entre outros (Mohamed et al., 2007).
No entanto, as transformações mi-
crobianas ocorrem devido às diferen-
tes populações que habitam o solo, e
as suas distintas reações químicas po-
dem ser alteradas sempre que o ecos-
sistema sofrer algum tipo de interfe-

Figura 4. Freqüencia de Bacillus spp. em amostras de água do Canal de
Irrigação das 5 regiões produtoras de arroz do RS: Litoral Norte-LN, Campa-
nha-CA, Fronteira Oeste-FO, Depressão Central- DC e Litoral Sul- LS
rência. Assim, na aplicação de diver-
sos tipos de manejo, podem existir
diferentes disponibilidades de subs-
tratos que determinarão o favoreci-
mento ou a inibição do estabeleci-
mento dos diferentes grupos micro-
bianos (Castro & Prado, 1993).
Fritz (2007) analisou a abundân-
cia de bactérias entomopatogênicas
pertencentes ao gênero Bacillus ob-
tidas de 36 amostras de solo coleta-
das de diferentes sistemas de cultivo
de arroz irrigado: sistema de cultivo
convencional (SCC), sistema de culti-
vo pré-germinado (SCG) e sistema de
cultivo direto (SCD) e de uma área
de pousio (sem cultivo) por aproxi-
madamente 12 anos (C). Foram sele-
cionadas 336 colônias pertencentes ao
gênero Bacillus spp., onde foram
identificadas, 35,42% como B. thurin-
giensis, 16,96% como B. cereus, 9,52%
Figura 5. Freqüencia de Bacillus spp. Isolados em amostras de água das
Parcelas de cultivo de arroz, das 5 regiões produtora do RS: Litoral Norte-LN,
Campanha-CA, Fronteira Oeste-FO, Depressão Central- DC e Litoral Sul- LS
como B. sphaericus e 38,10% como
Bacillus sp. Todavia, não houve di-
ferença significativa na freqüência
de Bacillus spp. entre os sistemas
de plantio (p>0,05), embora as fa-
ses da cultura tenham influencia-
do a abundância das espécies
(P<0,01). A irrigação revelou-se
capaz de favorecer a variação na
abundância de Bacillus spp., prin-
cipalmente no caso de B. sphaeri-
cus, uma vez que representou
71,4% do total de isolados encon-
trados durante a referida etapa da
cultura (Figura 2).
O fato dos solos agrícolas so-
frerem mudanças nas suas propri-
edades físicas e químicas pela in-
trodução da cultura contribui para
a diversidade de bactérias em fun-
ção da aeração, profundidade e
melhor distribuição ao longo das
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
camadas (Kennedy, 1999).
Pfüller et al. (2000) analisaram a
freqüência de microrganismos utili-
zando diferentes sistemas de plan-
tio, e em seus estudos a população
microbiana não diferiu significativa-
mente, embora tenha ocorrido uma
maior variação no SCC. No entanto,
Garbeva et al. (2003) compararam a
diversidade de Bacillus em solos
agrícolas, e observaram maior nú-
mero de esporos em solos que apre-
sentavam cultivos, em tempo redu-
zido em comparação aos cultivados
em longo prazo.
De acordo com Buckley & Tho-
mas (2003), uma possível explica-
ção para que as comunidades mi-
crobianas em campos abandonados
de cultivo continuem a apresentar
freqüências semelhantes com cam-
pos atualmente cultivados, se deve
ao fato de que as comunidades mi-
crobianas do solo respondem às ca-
racterísticas do ambiente, que reque-
rem longos períodos de tempo para
recuperação dos efeitos antrópicos.
Em geral, os microrganismos res-
pondem de diversas formas à apli-
cação de pesticidas em seu hábitat,
podendo ocorrer principalmente se-
leção de populações resistentes. Essa
seleção pode ser em função de suas
características fisiológicas e morfo-
lógicas. Com o passar do tempo, a
diversidade microbiana entra em
equilíbrio, porém passa a ser com-
posta por um menor número de es-
pécies, mantendo-se por meses ou
anos, atingindo o clímax a semelhan-
ça da fase original (Borges et al.,
2004). Por outro lado, alguns auto-
res relatam que a diminuição das
bactérias pode estar relacionada com
a sensibilidade aos herbicidas, re-
sultando na eliminação de algumas
espécies. (Wardle & Parkinson,
1990).
Nesse sentido, Azambuja (2006)
avaliou a influencia do cultivo con-
vencional de arroz irrigado sobre a
abundância de bacilos entomopato-
gênicos, em quatro áreas tratadas
com distintos produtos fitossanitári-
os e a fase de irrigação da cultura,
concluindo que não houve diferen-
ça significativa entre os parâmetros
avaliados separadamente sobre a
abundância de B. thuringiensis e B.
sphaericus. No entanto, a interação
entre os fatores apresentou signifi-
17

Figura 6. Ocorrência de espécies de Bacillus isoladas de amostras de água
durante o ciclo da cultura 2001/02 de arroz irrigado do Rio Grande do Sul
cativa diferença para B. thuringien-
sis. Antes da irrigação, o microrganis-
mo foi mais freqüente na área tratada
somente com os herbicidas, contudo
quando o arroz foi inundado a abun-
dância foi mais pronunciada nesse
período de irrigação e no tratamento
com herbicidas/fungicida (Figura 3).
Os solos de arroz irrigado são pre-
dominantemente ácidos, quando
ocorre à inundação, o pH é elevado
naturalmente, próximo à neutralida-
de pelo processo de redução. Em fun-
ção dessa nova condição, a disponi-
bilidade de nutrientes atinge níveis
estáveis durante um período de 4 a 6
semanas após a inundação (IRGA,
2005).
As mudanças climáticas interferem
de diferentes formas numa série de
organismos, que conseqüentemente,
afetam outros e o conjunto destas mu-
danças pode prejudicar o meio ambi-
ente físico. Sendo assim, os micror-
ganismos estão entre os seres mais
sensíveis as variações ambientais, pois
formam grandes populações, possu-
em crescimento rápido, facilidade de
dispersão e reduzido tempo de gera-
ções, constituindo-se em potenciais
indicadores biológicos para o estudo
de impactos das mudanças climáticas
globais (Ghini, 2008).
A influência de fatores climáticos
na ocorrência de B. thuringiensis e
B. sphaericus, em solos de orizicultu-
ra irrigada, foi avaliada por Azambu-
ja (2006) e a autora sugere que a pre-
dominância dos entomopatógenos foi
mais acentuada no período de verão
com valores médios de temperatura
do ar de 26 oC, umidade relativa de
66 % e temperatura do solo de 24,7
18 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
o
C, contudo, essas diferenças não fo-
ram submetidas à análise estatística.
Todavia, a temperatura é um impor-
tante fator de influência alterando a
eficiência de bioinseticidas a base de
Bacillus entomopatogênicos. Baixas
e altas temperaturas reduzem a ativi-
dade larvicida, indicando a necessi-
dade de estudos potenciais devido ao
grande número de insetos vetores em
climas tropicais (Consoli et al., 1995).
Em agroecossistemas, a variação da
diversidade microbiana ao longo das
estações do ano ainda não é bem
compreendida, já que em cada esta-
ção parece ocorrer uma comunidade
microbiana dominante acompanhada
de outras pouco abundantes. Essas va-
riações estão diretamente ligadas ao
regime hídrico, ao clima da região, a
estrutura e manejo do solo e ao teor
e a qualidade dos resíduos vegetais
aportados (Torsvisk & Ovreas, 2002).
Os solos representam um ecossis-
tema complexo e as variações nos ní-
veis de pH, compostos inorgânicos e
matéria orgânica podem representar
um fator limitante na colonização, es-
tabelecimento e esporulação de mi-
crorganismos residentes (Melo & Aze-
vedo, 1998). Diante desse fato, mui-
tas pesquisas procuram elucidar quais
os componentes minerais são mais fa-
voráveis ou limitantes do crescimen-
to microbiano no solo. Além disso,
determinadas concentrações de um
dado elemento podem apresentar
efeitos adversos para um mesmo mi-
crorganismo. Alguns autores descre-
vem que a presença de cálcio favore-
ce o crescimento, esporulação e a
produção da delta-endotoxina de B.
thuringiensis no solo, mas em eleva-
das concentrações inibe os três pro-
cessos (Sikdar et al., 1991; Içgen et
al., 2002; Polanczyk, 2004). Por
outro lado, há divergências quanto
à presença de magnésio, sendo im-
portante na biossíntese do cristal
protéico ou limitante do crescimen-
to (Içgen et al., 2002; Polanczyk
2004) . Também há relatos na lite-
ratura de que a adição de fosfato
orgânico (3 a 100 mM) não influ-
encia na biossíntese do cristal, ape-
sar de reduzir o crescimento de
células e esporos (Içgen et al.,
2002), porém Azambuja (2006) ob-
servou que B. thuringiensis foi fa-
vorecido pelas quantidades de po-
tássio no solo.
Em relação ao pH, alguns auto-
res mencionam que a acidez do solo
favorece a adsorção da toxina de
B. thuringiensis pela fração argilo-
sa do mesmo protegendo da bio-
degradação por microrganismos
competidores que têm sua ativida-
de inibida nessa condição. Os va-
lores acima de 5,2 favorecem o cres-
cimento da bactéria, mas quando o
pH não é controlado próximo à
neutralidade ocorre à baixa produ-
ção da toxina (West et al., 1985; Si-
kdar et al., 1991; Tapp & Stotzky,
1998). Sabe-se que a disponibilida-
de de nutrientes minerais, pH neu-
tro e umidade dos solos favorecem
a germinação de B. thuringiensis
representando importantes fatores
nos níveis de crescimento do mi-
crorganismo (West et al., 1985).
Contudo, os níveis ótimos de me-
tais para o crescimento de B. thu-
ringiensis e produção da delta-en-
dotoxina são variáveis e ainda não
foram claramente demonstrados,
conforme discutem alguns autores
(Sikdar et al., 1991; Içgen et al.,
2002).
B. sphaericus, tem ação mosqui-
tocida, especialmente para larvas de
Culex pipiens, sendo potencializa-
da após crescimento em meio de
cultura com os elementos minerais
KH2PO4, MgSO4, MnSO4, Fe2(SO4)3,
ZnSO4, CaCl2 e pH 7,2 conforme
estudos realizados por Kaflon et al.,
(1983). Nos estudos de Azambuja
(2006), o índice de B. sphaericus
não foi afetado pelas propriedades
físico-químicas dos solos avaliados
de arroz irrigado. Os resultados
anteriores dos referidos autores
podem possivelmente ser explica-
das por Silva et al. (1999) e Alles
(2008) que relacionam às diferen-
tes origens do entomopatógeno,
como solos e águas, a utilização de
algumas cepas em estudos ecológi-
cos pela resistência a diferentes con-
dições de estresse.
Na tentativa de caracterizar ce-
pas com atividade inseticida e veri-
ficar a influência do cultivo conven-
cional sobre os Bacillus entomopa-
togênicos, Azambuja (2006) obteve
a distribuição de isolados de B. thu-
ringiensis com genes cry4, (ativida-
de inseticida a dípteros) em cepas
provenientes de solos de todos os
tratamentos fitossanitários, exceto
da área tratada com herbicidas/in-
seticida, sendo igualmente distribu-
ídas entre os períodos de irrigação.
Como justificativa deste dado pode-
se ressaltar que as áreas inundadas
de cultivo de arroz são habitats fa-
voráveis à criação de mosquitos, de-
vido à presença de elevada matéria
orgânica e resíduos poluentes pro-
venientes das fontes utilizadas (Ba-
tista-Filho et al., 1998).
1.3 Bacillus spp. em
ecossistemas aquáticos
Entre as bactérias melhor adap-
tadas à vida no solo e na água, es-
tão àquelas pertencentes ao gênero
Bacillus. O gênero Bacillus é feno-
tipicamente heterogêneo, com
membros exibindo um amplo con-
junto de requerimentos nutricionais,
condições de crescimento, diversi-
dade metabólica e na composição
base do DNA. O conhecimento da
ecologia de espécies de Bacillus no
solo e na água ainda não é comple-
to (Vilain et al., 2006).
Espécies de Bacillus foram refe-
ridas por sua capacidade metabóli-
ca distinta (Fernandes et al., 2007;
Fu et al., 2007; Fisher & Hollibaugh,
2008), no Mono Lake, um lago hi-
persalino, alcalino do leste da Cali-
fórnia, onde existem processos de
oxidação e redução de selênio e ar-
sênio em presença de fontes de car-
bono dissolvido. Em lavouras de ar-
roz no Rio Grande do Sul, (RS),
Mattos et al. (2007), avaliaram o im-
pacto do uso do inseticida carbo-
sulfano sobre os microrganismos do
solo, o risco de contaminação do
solo, da água e do sedimento, e a
degradação microbiana. Os resulta-
dos apontaram espécies do gênero
Bacillus entre os grupos Gram-po-
sitivos dos consórcios de bactérias,
com maior capacidade metabólica
em degradar o carbosulfano.
Relacionando diferentes ambien-
tes aquáticos, com a viabilidade dos
esporos de B. sphaericus, Yousten
et al. (1995) destacam que na água
doce a fração de esporos viáveis é
maior do que no mar. Pouco se sabe
sobre quais fatores ambientais são
mais importantes para a perda de
viabilidade dos esporos dessa bac-
téria. Fatores como a temperatura
de crescimento, pH, aeração, pre-
sença de minerais e certos compos-
tos carbonados e nitrogenados afe-
tam a formação dos endósporos
(Sneath, 2001). Nesse sentido, Alles
(2008) avaliou o crescimento de
cepas de B. sphaericus, frente a pes-
ticidas químicos, compostos orgâ-
nicos e metais pesados, obtendo
uma expressiva heterogeneidade
entre as estirpes e uma resistência
ao metal Cádmio, considerando tais
características fenotípicas importan-
tes para o controle e manejo bioló-
gico, dependendo do local onde o
agente de biocontrole será aplica-
do.
Contudo, sabe-se que as formu-
lações comerciais de B. sphaericus
são mais resistentes a habitats po-
luídos e a sua reciclagem é favore-
cida em certas condições, mas com
estreito número de hospedeiros em
relação à B. thuringiensis israelen-
sis (Singh e Gill, 1988; Thanabalu et
al., 1991 e 1993; Nielsen-Leroux e
Charles, 1992; Nicolas et al., 1993;
Consoli et al, 1995; Charles et al.,
1996; Silva-Filho e Regis, 2003;
Schwartz et al., 2001; Silva-Filho e
Peixoto, 1997).
Em estudos de diversidade bac-
teriana em orizicultura no RS, Re-
che & Fiuza (2005) e Fritz et al.
(2007) isolaram e identificaram es-
pécies de Bacillus em águas de irri-
gação e em amostras de águas de
áreas orizícolas do RS. Nessas pes-
quisas, B. thuringiensis, B. sphaeri-
cus, B. cereus e Bacillus sp. foram
identificados em amostras de água
coletadas nos Canais de Irrigação e
nos Canais de Drenagem das lavou-
ras orizícolas do RS. As coletas fo-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
ram realizadas durante o ciclo da
cultura do arroz, 2001/02, em 5 re-
giões produtoras de arroz do RS: De-
pressão Central- DC, Fronteira Oes-
te- FO, Campanha- CA, Litoral Nor-
te- LN e Litoral Sul- LS (Figuras 4 e
5).
Os resultados apresentados nas
Figuras 4 e 5, referem-se à abun-
dância de Bacillus spp. nas regiões
orizícolas estudadas e nos dois tra-
tamentos, Canal de Irrigação e Par-
celas de cultivo de Arroz. Caracte-
rísticas adaptativas a vários ambien-
tes e sob condições adversas de tem-
peratura, pH e salinidade, lhes são
conferidas por sua capacidade de
permanecer em latência devido a
formação de esporos. As variações
de temperatura entre as regiões e a
disponibilidade de recursos, podem
influenciar as diferenças de abun-
dância na distribuição das espécies
(Ricackanov, 2003).
As parcelas de cultivo apresen-
taram maior abundância de colôni-
as bacterianas (Figura 5) quando
comparadas com as águas de irri-
gação da lavoura (Figura 4). Águas
de lavoura de arroz recebem trata-
mentos fitossanitários e Bacillus
parecem ter afinidade com ambien-
tes que receberam agroquímicos,
transformando-os em fontes de car-
bono para a sua produção de ener-
gia. Além disso, o ambiente de la-
voura alterna inundação e drena-
gem, o que favorece o desenvolvi-
mento de bactérias esporulantes (Li-
esack, 2001).
Os resultados de pesquisa quan-
to aos isolados de Bacillus em águas
de lavouras orizícolas durante o ci-
clo da cultura, expressaram a pre-
sença de B. thuringiensis em 39,7%
das amostras de água analisadas. Em
segundo lugar, Bacillus sp., 35,8%,
seguidos de B. cereus, 14,6% e B.
sphaericus, 9,9% (Figura 6).
B. thuringiensis foi encontrado
em maior freqüência nas águas de
cultivo de arroz (Figura 6). A pre-
sença de Bacillus sp. é mencionada
por Martiny et al. (2005), como um
dos grupo bacterianos mais comuns
em sistemas de distribuição de água
potável. Em estudos após desinfec-
ção com cloro, em sistemas de água
potável, Szabo et al. (2007), encon-
traram esporos de bactérias do gê-
nero Bacillus, aderidos nas depres-
19
 sões da tubulação de ferro corroído.
Os autores concluíram que esses es-
poros são capazes de persistir por
longos períodos de tempo em pre-
sença de altos níveis de cloro. Esse
microrganismo pode desenvolver-se
em águas ricas em nutrientes libera-
dos pela decomposição de resíduos
orgânicos, assim como foi citado para
o solo, por Polanczyk & Alves (2003).
Esses autores também levantaram a
hipótese dessa bactéria ter algum tipo
de relação simbiótica com plantas, o
que explicaria a produção de toxinas
tão específicas e eficientes.
B. sphaericus é muito comum e
de distribuição cosmopolita, sendo
principalmente isolada do solo em sis-
temas aquáticos ou mesmo de larvas
de pernilongos mortos, seu hospedei-
ro natural (Singer, 1981; Priest et al.,
1997; Alves, 1998; Wirth et al., 2001;
Partridge e Berry, 2002; Wei et al.,
2006).
B. cereus, de acordo Vilain et al.
(2006), é uma bactéria de solo que
pode ocorrer na rizosfera das plantas
e algumas estirpes produzem antibi-
óticos capazes de inibir o desenvol-
vimento de doenças fúngicas na ri-
zosfera; Galvão et al. (2006), em aná-
lises microbiológicas de água de cul-
tivo de mexilhões, detectaram B. ce-
reus em 6,7% das amostras. Rowan et
al. (2003) referem-se a B. cereus,
como um grupo heterogêneo de bac-
térias Gram-positivas, que devido a
sua habilidade em formar esporos, to-
lera melhor ambientes hostis do que
outros entomopatógenos bacterianos
não esporulantes. B. cereus é um pa-
tógeno humano oportunista, que está
presente no solo e na água, podendo
proliferar em uma gama de ambien-
tes incluindo matérias-primas e ali-
mentos processados (From et al.,
2005; Tourasse et al., 2006).
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129.
23
 TOXINAS DE BACILLUS
Pesquisa THURINGIENSIS
Pesquisa
Laura Massochin Nunes Pinto
Bióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda
em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida
Silvestre (UNISINOS).
Diouneia Lisiane Berlitz
Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).
Raquel Castilhos-Fortes
Bióloga (UNISINOS) e Mestre em
Microbiologia Agrícola e do Ambiente
(UFRGS)
Lidia Mariana Fiuza
Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em
Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),
Doutora em Ciências Agronômicas
(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em
biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).
24 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
toxicidade de B. thuringi-
ensis está relacionada à sín-
tese das proteínas Cry que
atuam especificamente no
intestino médio dos insetos,
as quais são codificadas por
genes cry. Essas proteínas têm atividade
inseticida a diferentes ordens de insetos-
praga, de acordo com a presença dos ge-
nes cry, nas cepas bacterianas. Além des-
sas proteínas, o entomopatógeno produz
outros tipos de toxinas, como exotoxinas,
proteínas Vip, endotoxinas, entre outras.
Sendo assim, esse artigo apresenta a atual
classificação dos genes cry, as ordens de
insetos-alvo das proteínas Cry e outros fa-
tores de toxicidade da bactéria.
1.1 Proteínas Cry
Juntamente com a esporulação, B. thu-
ringiensis libera inclusões cristalinas para-
esporais que podem conter uma ou mais
proteínas inseticidas, denominadas Cry, as
quais são codificadas por genes também
denominados cry. Estas proteínas apresen-
tam peso molecular entre 40 e 140kDa e
tornam-se tóxicas a insetos, após sua in-
gestão e solubilização, no intestino médio
das larvas (Bravo, 1997).
Estudos sobre a seleção de B. thurin-
giensis têm identificado diferentes cepas
desta bactéria, as quais mostram ação so-
bre diversas ordens de insetos, como Lepi-
doptera, Coleoptera, Diptera, Hymenopte-
ra, Homoptera, Hemiptera, Isoptera, Or-
thoptera, Siphonaptera, Thisanoptera e
Mallophaga (Feitelson et al., 1992; Maagd
et al., 2001; Cavados et al., 2001; Castilhos-
Fortes et al., 2002; Pinto et al., 2003; Ma-
agd et al., 2003), além de nematóides (Mar-
roquim et al., 2000).
Assim, sabe-se que diversos grupos de
insetos são suscetíveis aos cristais tóxicos
de B. thuringiensis e que uma espécie de
inseto pode ser afetada por mais de uma
cepa da bactéria, pois estas freqüentemen-
te produzem diferentes proteínas insetici-
das. Isso significa que um cristal protéico
pode ser tóxico a uma grande variedade
de insetos, principalmente lepidópteros.
Além disso, as proteínas Cry de B. thurin-
giensis podem ter seu efeito alterado de
acordo com a radiação solar, temperatura
e pH (Nishiitsutsuji-Uwo et al., 1977; Ro-
sas-García et al., 2008).
A busca por novos genes cry, que sin-
tetizem novas proteínas Cry, com diferen-
tes efeitos inseticidas tem sido uma das
grandes metas na pesquisa com B. thurin-
giensis, desde os primeiros trabalhos pu-
blicados sobre a manipulação genética de
B. thuringiensis (Schnepf & Whiteley, 1981).
As toxinas Cry têm sido classificadas de
acordo com sua homologia na seqüência
de aminoácidos (Figura 1), na qual a de-
nominação “Cry” apresenta quatro ranques
hierárquicos de números e letras (maiús-
culas e minúsculas), como por exemplo,
Cry3Aa2. As proteínas Cry (Tabela 1) com
cerca de 45% de homologia em sua seqüên-
cia são colocadas no primeiro ranque e
quando apresentam 78 e 95% de identida-
de, constituem o segundo e terceiro ran-
que, respectivamente.
Cinco blocos de seqüências são comuns
a maioria das proteínas Cry. Quando se
analisa o tamanho destas proteínas também
fica evidente sua diversidade entre as dife-
rentes protoxinas. A extensão C-terminal,
encontrada nas proteínas mais longas, não
faz parte da toxina ativa, pois é digerida
pelas proteases no intestino dos insetos,
mas pode ter ação na formação do cristal
(Schnepf et al., 1998).
A estrutura tridimensional das formas
ativas das toxinas Cry1 (Grochulski et al.,
1995), Cry2 e Cry3 (Li et al.,1991), quando
analisadas em cristalografia de raio X, mos-
traram-se muito similares, cada uma apre-
sentando três domínios. As inclusões cris-
talíferas ingeridas por larvas susceptíveis
dissolvem-se no intestino dos insetos e as
protoxinas inativas são solubilizadas e cli-
vadas na longa região C-terminal, por pro-
teases intestinais, originando fragmentos re-
sistentes a proteases com cerca de 60 kDa
(Maagd et al., 2003).
O domínio I, N-terminal, consiste em sete
alfa-hélices e participa na inserção da mem-
brana intestinal e formação do poro. O do-
mínio II, ou beta-prisma, apresenta três
folhas dobradas simétricas, formando as
beta-folha. O domínio III C-terminal con-
siste em duas beta-folha antiparalelas. Es-
tes dois domínios estão envolvidos no re-
conhecimento dos receptores e ligação,
além do domínio III também ter sido asso-
ciado à formação de poros (Maagd et al.,
2001).
Figura 1. Dendograma de proteínas Cry
de Bacillus thuringiensis (Fonte http://
www.lifesci.susx.ac.uk/home/
Neil_Crickmore/Bt. Acesso em 19/11/
2008).

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 25

 Tabela 1. Classificação e caracterização das proteínas Cry de Bacillus thuringiensis.

26 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

L- Lepidoptera; C- Coleoptera; D- Diptera; H- Hymenoptera; N- Nematoda; Le- leucócitos cancerosos humanos.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 27

Figura 2. Dendograma das proteínas Vip sintetizadas por Bacillus thuringiensis
(Fonte: http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt)
Atualmente, existem 428 proteínas Cry
descritas, que estão classificadas em 55 clas-
ses Cry (Tabela 1). O autor Crickmore man-
tém um site na internet, o qual reúne as
informações sobre todas as toxinas Cry já
publicadas, além de permitir o acesso às
características moleculares de cada uma.
Estes dados são atualizados periodicamen-
te e podem ser acessados no endereço:
http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/
Neil_Crickmore/Bt.
Este número tem crescido regularmen-
te, pois a descoberta de novos genes im-
plica na obtenção de novas toxinas que
possam ter maior especificidade ou toxici-
dade. Dentre os grupos de genes cry mais
estudados, destacam-se cry1, cry2, e cry9,
os quais já foram descritos com amplo es-
28 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
pectro inseticida aos lepidópteros.
Dentre estes grupos, os genes cry1 são
os mais freqüentes na natureza, represen-
tando mais de 43% dos genes cry caracteri-
zados e freqüentemente as bactérias que
possuem genes deste grupo codificam pro-
toxinas entre 130 e 140kDa, que são arma-
zenados em cristais bipiramidais (Hofte &
Whiteley, 1989; Rosas-García et al., 2008;
Thammasittirong & Tipvadee, 2008).
O dendograma da Figura 1 mostra os
grupos de proteínas Cry, que são classifi-
cados de acordo com a similaridade entre
a seqüência de genes que codificam as re-
feridas toxinas bacterianas.
De acordo com Crickmore et al. (1998),
o primeiro domínio apresenta em torno de
45% de similaridade entre si, ao passo que
o segundo domínio mostra-se entre 45 e 75%
similares e o terceiro domínio a partir de 75%
de similaridade, quando se trata da seqüência
de aminoácidos.
Carlson et al. (1994) relatam que B. thu-
ringiensis apresenta em seu genoma de 2,4 a
5,7 milhões de pares de bases, e a maioria dos
isolados apresentam elementos extra cromos-
sômicos lineares ou circulares. Os genes cry
estão localizados em plasmídios e muitos iso-
lados de B. thuringiensis possuem diversos ge-
nes cry responsáveis pela síntese de diferen-
tes proteínas inseticidas (Lereclus et al., 1993).
Durante seu desenvolvimento, B. thuringien-
sis passa por duas fases, a fase vegetativa e a
estacionária, semelhantes ao desenvolvimento
de Bacillus subtilis.
A primeira fase caracteriza-se pelo cresci-
mento exponencial das células de B. thuringi-
ensis, momento em que há grande disponibili-
dade de nutrientes no meio. A fase estacioná-
ria ocorre quando o meio se torna hostil e a
bactéria adapta-se à diminuição de nutrientes
através de mecanismos genéticos. A expres-
são dos genes cry de B. thuringiensis geral-
mente ocorre na fase estacionária da célula,
acumulando seu produto na célula mãe, na
forma de uma inclusão cristalífera, a qual é
liberada no meio ao final da esporulação (Le-
reclus et al., 2000). Esta inclusão pode repre-
sentar cerca de 25% do peso seco de células já
esporuladas (Agaisse & Lereclus, 1995). Esses
autores relatam que apesar da expressão dos
genes cry estarem estreitamente relacionada
ao evento da esporulação, existem genes cry
que são expressos independentemente da es-
porulação.
A quantidade de proteína produzida por
uma célula de B. thuringiensis não está direta-
mente relacionada com o número de cópias
de genes cry, pois a capacidade de produção
de proteína pela célula, mesmo com apenas
uma cópia de um determinado gene cry, pode
ser elevada. Por exemplo, a cepa B. thuringi-
ensis kurstaki HD73, possui apenas uma cópia
de gene cry1, mas sintetiza cristais bipirami-
dais em quantidades semelhantes àquelas pro-
duzidas por cepas que apresentam três ou qua-
tro diferentes genes cry1. Desta forma, a sínte-
se protéica atinge um limite máximo, com cer-
to número de cópias de genes cry na célula e
acima deste não há acréscimo na produção de
toxinas (Agaisse & Lereclus, 1995).
As toxinas Cry são as mais proeminentes
de uma série de fatores que permitem o desen-
volvimento de sua virulência à morte ou enfra-
quecimento dos insetos. Esses dados sugerem
que muitas estirpes de B. thuringiensis podem
ser consideradas como patógenos oportunistas
de insetos. Seria de grande importância uma
compreensão mais profunda das verdadeiras
funções ecológicas de B. thuringiensis, tanto
para melhorar a confiabilidade da avaliação dos
riscos e para o desenvolvimento de métodos
eficientes de isolamento de estirpes de B. thu-
ringiensis, contendo genes cry ativos.
1.2 Proteínas Vip
As proteínas VIP foram descritas por Estru-
Tabela 2. Proteínas Vip com efeito tóxico a diferentes insetos
ch et al. (1996) e recebem essa denomina-
ção por serem produzidas na fase vegetati-
va de crescimento de B. thuringiensis. Sua
concentração também permanece alta an-
tes e depois da fase de esporulação.
Vários estudos foram realizados após
sua descoberta visando a caracterização,
identificação de novos tipos, ação insetici-
da e também produção de plantas com ca-
pacidade de expressá-las. Estes estudos, po-
rém, são incipientes quando comparados
com as endotoxinas.
A localização dos genes responsáveis
por sua produção ainda não foi determina-
da, embora existam vários conjuntos de
primers que podem ser utilizados para iden-
tificá-las como vip1 e vip2 (Rice, 1999; Fang
et al., 2007; Selvapandiyan et al., 2001 )
vip3A (Rice, 1999), vip3Aa (Seifinejad et al.,
2008), vip5 e vip6 (Loguercio et al., 2002).
A Figura 2 apresenta um dendograma
com as proteínas Vip, já identificadas e ca-
talogadas, no site: http://
www.lifesci.susx.ac.uk/home/
Neil_Crickmore/Bt. Esse dendograma mos-
tra primeiramente dois grandes agrupamen-
tos de proteínas onde são encontradas se-
qüências genéticas semelhantes entre si,
subdivididos em cinco grupos menores, de
acordo com essa seqüência genética. Per-
cebe-se, claramente que esses cinco gru-
pos similares são formados por proteínas
da mesma classe, ou seja, Vip1, Vip2 e Vip
3. A diferença entre a seqüência de genes
que codificam essas proteínas é que define
sua classificação, como Vip1Aa, Vip1Ab, en-
tre outras.
De acordo com Rang et al. (2005), as
proteínas Vip2 exibem entre 21 e 22% de
similaridade com a proteína Vip3Ba1, en-
quanto as proteínas da classe Vip1 são en-
tre 8 e 22% similares à Vip3Ba1.
Segundo Fang (2007) estas proteínas
representam uma das maiores descobertas
de toxinas com capacidade inseticida, sen-
do extremamente relevante a ausência de
similaridade nas seqüências de aminoáci-
dos destas proteínas com as seqüências de
aminoácidos das endotoxinas, especialmen-
te, em termos de manejo e evolução da
resistência.
De acordo com o dendograma da Fi-
gura 2, estas proteínas são classificadas em
três subfamílias diferentes (Crickmore et al.,
2005), sendo que ocorrem em torno de 15%
das cepas de B. thuringiensis avaliadas por
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
Estruch (1996) e 23% das cepas avaliadas
por Rice (1999). As subfamílias Vip1 e Vip2
(Tabela 2) são componentes de uma pro-
teína binária com atividade inseticida con-
tra Diabrotica virgifera e D. longicornis
(Han et al., 1999; Warren, 1997). As prote-
ínas Vip 3 são ativas contra lepidópteros
(Tabela 2), como Spodoptera frugiperda e
Helicoverpa zea. Seu modo de ação está
relacionado à formação de poros na mem-
brana do epitélio do intestino médio (Yu
et al., 1997; Loguercio et al., 2002; Lee et
al., 2003). Ao mesmo tempo que a Vip 3
apresentou toxicidade sobre lepidópteros
e não mostrou efeitos sobre insetos não-
alvo (Whitehouse, 2007).
Devido a sua atividade inseticida rela-
cionada a Heliothis zea, as proteínas Vip
3A estão sendo expressas em plantas de
algodão, conferindo resistência ao inseto.
Nesse sentido, Bommireddy et al. (2007),
avaliaram plantas de algodão modificadas
somente com a proteína Vip 3A, ou com a
combinação de Vip 3A e Cry 1Ab (Vip Cot)
nos lepidópteros H. zea e H. virescens. Con-
siderando o comportamento das lagartas,
os resultados desses autores mostram que
houve maior índice de infestação em plan-
tas não modificadas em relação às demais
(Vip 3A e Vip Cot).
O conjunto desses dados demonstra
que às proteínas Vip são promissoras no
controle de insetos-praga, uma vez que pos-
suem diferenças estruturais em relação às
demais proteínas de B. thuringiensis, o que
pode retardar o processo de resistência nas
populações de insetos.
1.3 Demais fatores de virulência
de B. thuringiensis
Além das proteínas Cry e Vip, os isola-
dos de B. thuringiensis podem sintetizar
proteínas denominadas Cyt, que possuem
atividade citolítica in vitro e especificidade
in vivo aos dípteros (Höfte & Whitheley,
1989; De Maagd et al., 2003). De acordo
com esses autores fazem parte desse gru-
po as proteínas Cyt1Ca e Cyt2Aa e seu
modo de ação também pode estar relacio-
nado a um sinergismo com outras toxinas
produzidas pelos isolados.
O entomopatógeno também produz
outros fatores de virulência, como as β-
exotoxinas, α-exotoxinas, hemolisinas, en-
terotoxinas, quitinases e fosfolipases (Höf-
te & Whiteley, 1989; De Maagd et al., 2001).
Esses autores declaram desconhecida a
exata contribuição de cada fator na viru-
lência da bactéria, sendo uma dificuldade
determinar o espectro tóxico de um isola-
do que sintetiza mais de uma proteína. Isso
porque, quando os fragmentos tóxicos vão
se ligar aos receptores da membrana do
intestino médio do inseto, ocorre uma com-
petição pelos sítios de ligação, que pode
interferir na toxicidade do isolado.
Guttmann & Ellar (2000) identificaram
isolados de B. thuringiensis com a presen-
ça de hemolisinas, quitinases e lecitinases,
29

Tabela 3. Subespécies de Bacillus thuringiensis produtores da β-exotoxina da em seus ensaios de toxicidade. Porém, de-
sendo eles: Bt kurstaki, Bt israelensis, Bt
fukuokaensis Bt kyushuensis, Bt darmasta-
diensis, Bt thompsoni, Bt tolworthii e Bt os-
trinae. Já as subespécies Bt galleriae, Bt ai-
zawai e Bt wuhanensis apresentaram so-
mente hemolisina e quitinase.
Os mesmos autores também relatam a
presença do gene que codifica a enteroto-
xina, uma toxina produzida por diferentes
cepas de B. thuringiensis, com peso mole-
cular em torno de 45kDa, e que pode ser
tóxica a vertebrados, uma vez que é análo-
ga à toxina produzida por B. cereus. Con-
siderando a análise de 13 isolados de B.
thuringiensis avaliados, 9 foram positivos
para o gene entS que codifica a enterotoxi-
na. No mesmo sentido, Rivera et al. (2000)
avaliaram 74 isolados do entomopatógeno,
em relação a presença dos genes bce, hbl e
nhe para a enterotoxina. Os seus resulta-
dos mostram que o gene nhe foi o mais
freqüente, seguido de hbl e bce mostrando
assim, uma pequena diferença na distribui-
ção desses genes entre B. thuringiensis e
B .cereus.
Outros dados de pesquisa sobre ente-
rotoxina (Ngamwongsatit et al., 2008), re-
velaram a presença dos genes hbl, nhe, cytK
e entFM em 205 isolados de B. thuringien-
sis e 411 isolados de B. cereus. Os dados
desses autores mostram que, em 149 isola-
dos de B. thuringiensis todos os genes ocor-
reram simultaneamente, sendo os genes nhe
e entFM aqueles de menor freqüência. Es-
ses autores relatam a importância desse
conhecimento uma vez que a enterotoxina
30 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
pode causar intoxicação alimentar, quan-
do relacionada ao patógeno B. cereus.
Em relação à β-exotoxina, também cha-
mada thuringiensina, é uma proteína com
peso molecular de 0,7 kDa (Gohar & Per-
chat 2001), insespecífica, termoestável,
identificada por inibir a síntese de rRNA
(Mackedonski & Hadjilov, 1972) e prejudi-
car a formação do fuso mitótico, dentre
outros efeitos observados em ensaios in vi-
tro com Alium cepa (Sharma & Sahu, 1977).
Por ser inespecífica e tóxica a vertebrados,
a thuringiensina é avaliada em testes labo-
ratoriais, utilizando roedores como cobai-
as.
Os dados de Ohba et al. (1981) mos-
tram que, de 740 isolados de B. thuringi-
ensis avaliados quanto a presença da β-exo-
toxina, 28 produziram essa toxina. Além
desses, dois isolados da espécie B. subtilis,
um isolado de B. natto e dois isolados da
espécie B. megaterium também foram pro-
dutores da thuringiensina.
Nesse sentido, Hernandéz et al. (2003)
revelam que 79% dos isolados de B. thu-
ringiensis thuringiensis são produtores des-
sa toxina, seguidos de 20% para B. thurin-
giensis kenyae, 13% para B. thuringiensis
kurstaki, contrastando com 0% de produ-
ção para B. thuringiensis aizawai.
Na Tabela 3 constam dados sobre a pro-
dução da β-exotoxina pelas diferentes su-
bespécies de B. thuringiensis.
A thuringiensina também apresenta ati-
vidade inseticida a diferentes espécies de
insetos-praga, como demonstra o trabalho
de Barreto et al. (1999) utilizando S. frugiper-
vido as suas propriedades não específicas aos
insetos, ou seja, pode também afetar organis-
mos não-alvo, os isolados bacterianos que são
produtores dessa toxina não podem ser co-
mercializados para serem utilizados na agri-
cultura visando o controle de insetos-praga.
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31
 MECANISMO DE AÇÃO
Pesquisa DE BACILLUS THURINGIENSIS
Pesquisa
Lidia Mariana Fiuza
Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),
Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em
biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).
estudo do modo de ação das
proteínas Cry de B. thuringi-
ensis será abordado revelan-
do a especificidade dessas to-
xinas através da detecção de receptores
presentes no sistema digestivo dos in-
setos-alvo. O tema trata do modo de
ação completo de B. thuringiensis, des-
de a ingestão do entomopatógeno até a
morte do inseto. O processo de análise
de receptores nos tecidos dos insetos é
descrito detalhadamente, envolvendo
diferentes abordagens metodológicas de
detecção de sítios de ligação das prote-
ínas inseticidas e uma discussão com
dados de diversos autores que desen-
volvem pesquisas nessa área.
1.1 Modo de ação das proteínas
Cry de B. thuringiensis
As análises do modo de ação das
proteínas Cry de B. thuringiensis visam
esclarecer os mecanismos pelos quais
estas proteínas exercem seu efeito en-
tomopatogênico e elucidar a especifici-
dade das diferentes toxinas (Endo e
Nishiitsutsuji-Uwo, 1980; Höfte e Whi-
teley, 1989; Gill et at., 1992; Schnepf et
al., 1998; Fiuza, 2004). Considerando o
conjunto de informações atualmente dis-
poníveis sobre as fases entre a ingestão
dos cristais e a morte das larvas dos in-
setos suscetíveis às proteínas Cry de B.
thuringiensis, descreve-se como fases do
mecanismo de ação:
32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
(i) Inicia pela solubilização dos cris-
tais em pH alcalino no intestino
médio dos insetos, liberando as
protoxinas de 130-140 kDa para
Cry1 e 70 kDa para Cry2. Essa
etapa é determinante à especifi-
cidade do isolado de B. thurin-
giensis à espécie alvo, tanto pela
alcalinidade do sistema digesti-
vo quanto pela composição dos
cristais de B. thuringiensis.
(ii) Protoxinas são ativadas pelas
enzimas digestivas, formando
fragmentos tóxicos de 60-65 kDa.
Nessa etapa tanto a composição
proteolítica quanto a estrutura
protéica do cristal são importan-
tes.
(iii) Toxinas reconhecem receptores
específicos às microvilosidades
das células epiteliais do intesti-
no médio das larvas suscetíveis
às quais elas se ligam. Os estu-
dos realizados com BBMV (Brush
Border Membrane Vesicles) iso-
ladas de larvas de lepidópteros
mostram que a ligação de forte
afinidade entre a toxina e o re-
ceptor é reconhecido como um
fator importante na determinação
do espectro inseticida das prote-
ínas Cry (Fiuza et al., 1996). Da-
dos de pesquisa mostram que há
uma correlação positiva entre a
ligação, in vitro, da toxina no
receptor intestinal e a toxicida-
de, in vivo. Por outro lado, ou-
tros estudos descrevem que o
reconhecimento do receptor é
necessário, mas não é suficiente
para provocar a toxicidade, su-
gerindo a existência de outros
fatores relacionados ao modo de
ação das proteínas Cry. Em 1994,
Knight et al., isolaram de BBMV
de larvas de Manduca sexta
 (Lep., Sphingidae) uma amino-
peptidase N implicada na inte-
ração da toxina Cry1Ac. Os mo-
delos de receptores atualmen-
te descritos mostram que um
inseto pode apresentar, em
quantidade variável, diversas
classes de receptores que po-
dem ser reconhecidos por di-
ferentes toxinas. Dados de pes-
quisa revelam que estes mode-
los podem explicar a especifi-
cidade das toxinas de B. thu-
ringiensis.
(iv) Após o reconhecimento do re-
ceptor, a toxina induz a forma-
ção de poros na membrana ce-
lular do epitélio intestinal. A
formação dos poros na mem-
brana celular provoca o dese-
quilíbrio iônico entre o cito-
plasma e a o meio externo à
célula. As análises histopatoló-
gicas realizadas após a intoxi-
cação dos insetos mostram a
destruição das microvilosida-
des, hipertrofia das células epi-
teliais, vacuolização do cito-
plasma e lyse celular, levando
o inseto a paralisia e morte.
Na seleção das proteínas insetici-
das, sintetizadas por essa bactéria, as
análises in vitro dos receptores mem-
branares podem viabilizar uma rápida
determinação do espectro de ação das
proteínas Cry contra as espécies alvo,
sendo em seguida efetuada a avalia-
ção da toxicidade in vivo, apenas para
os isolados pré-selecionados como ati-
vos in vitro. Sendo assim, o presente
trabalho trata de diferentes métodos
de análise de receptores de proteínas
de B. thuringiensis em formas imatu-
ras de lepidópteros.
1.2 Análise de receptores em
cortes histológicos de insetos
1.2.1 Tecidos dos insetos
As larvas de insetos podem ser
obtidas de coletas a campo, as quais
devem passar por um período de qua-
renta em condições controladas, ou
oriundas de criação massal de insetos
mantida em laboratório, em condições
controladas de temperatura, umidade
relativa e fotofase, as quais podem
variar de acordo com a espécie do in-
seto. Os tubos digestivos dos insetos
são dissecados e fixados 24 h, em Bou-
in Hollande Sublimé a 10%, lavados
por 12 h em água destilada e desidra-
tados em séries crescentes de etanol,
70 a 100% (Brandtzaeg, 1982). Em se-
guida os tecidos são impregnados em
Figura 1. Receptores de proteínas Cry biotiniladas, revelados nos tecidos de
larvas de lepidópteros, com fosfatase alcalina e peroxidase (Fiuza, 1995)
banhos mistos (etanol/tolueno/pa-
raplasto) e incluídos em paraplasto
100% a 58oC. Os cortes longitudi-
nais ou transversais, de 7 a 10 µm
de espessura, preparados com mi-
crótomo LKB, são montados em lâ-
minas de vidro, tanadas com poly-
l-lysina a 10%, e conservadas a 4oC
para posterior análise de recepto-
res em cortes histológicos.
1.2.2 Proteínas Cry
As cepas de B. thuringiensis po-
dem ser cultivadas em meio usual
glicosado por aproximadamente 5
dias, conforme o método de Mahi-
llon & Delcour (1984). Após a lise
bacteriana devem ser centrifugadas
e lavadas com tampão fosfato, pH
6. Os cristais são separados dos es-
poros e das células bacterianas em
gradiente de renografina ou saca-
rose por ultra centrifugação, con-
forme metodologia descrita por
Sharpe et al. (1975). As bandas, con-
tendo os cristais puros, são lavadas
e diluídas em água milli-Q esterili-
zada, contendo phenylmethylsul-
fonyl (PMSF).
As proteínas Cry são solubiliza-
das em tampão fosfato, pH 10. Esse
pH deve ser ajustado a 8,6 por diá-
lise contra o tampão 20 mM Tris e
as proteínas Cry são ativadas por
bovine pancreatic trypsin (Type I),
sendo a reação inativada com tryp-
sin inhibitor (Type II). A pureza e
a integridade das proteínas pode ser
avaliada por eletroforese em gel de
poliacrilamida a 10%, SDS-PAGE
(Laemmli, 1970). A concentração
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
pode ser determinada pelo método Bra-
dford (1976), usando a bovine serum al-
bumin (BSA) como proteína padrão.
1.2.3 Proteínas biotiniladas
As proteínas Cry podem ser biotini-
ladas, conforme o método descrito por
Bayer & Wilcheck (1990), onde a incor-
poração da biotina na parte N-terminal
da proteína é feita usando o BNHS (bi-
otinyl-N-hydroxysuccinimide) em tam-
pão de bicarbonato de sódio, pH 9. O
produto da reação deve ser purificado
em sephadex G-25 (Sigma) e as frações
biotiniladas identificadas por dot-blot,
onde se utiliza membrana de nitrocelu-
lose, o conjugado de estreptavidina-fos-
fatase-alcalina diluída no tampão TST
(Tris-Saline-Triton, pH 7;6) e o substra-
to de revelação (BCIP e NBT em tam-
pão Tris; pH 9,5). A concentração das
proteínas Cry biotiniladas pode ser de-
terminada pelo método Bradford (1976),
usando a BSA como proteína padrão. A
pureza e a integridade das proteínas
marcadas pode ser avaliada em western-
blot, usando membrana de nitrocelulo-
se (Sigma) e o tampão Towbin, pH 8,3
com 10% etanol. As membranas podem
ser reveladas usando a mesma técnica
descrita no dot-blot.
1.2.4 Anticorpos
As proteínas Cry são preparadas,
conforme descrito anteriormente na
purificação, e depois são utilizadas na
obtenção de anticorpos em pequenos
animais como: coelhos, ratos e camun-
dongos, entre outros. O soro coletado
dos animais é utilizado na obtenção das
imunoglobulinas (IgGs), as quais podem
33

Figura 2. Receptores de proteínas Cry biotiniladas, detectados nos
tecidos de larvas de lepidópteros com fluoresceína e observados em
microscopia de varredura laser (Fiúza, 1995)
ser separadas em colunas de sepharose
protein-A e as frações purificadas por
afinidade incubando os IgGs e as mem-
branas de nitrocelulose, contendo os
antígenos previamente transferidos por
western-blot conforme descrito por
Burke et al. (1982). A especificidade e
sensibilidade dos anticorpos policlonais
é determinada pelo método de dot-blot
e ELISA - Enzyme-linked immunosor-
bent assay.
1.2.5 Detecção in vitro de recepto-
res
As análises in vitro dos receptores
de proteínas Cry de B. thuringiensis são
realizada com cortes histológicos do sis-
tema digestivo das larvas dos insetos em
estudo. A detecção propriamente dita
corresponde a incubação dos tecidos
com as proteínas, previamente despa-
rafinados e reidratados.
Nas análises com proteínas Cry bio-
tiniladas, os cortes histológicos são in-
cubados à temperatura ambiente, duran-
te 1h, com as proteínas biotiniladas. As
proteínas não ligadas aos sítios recep-
tores são removidas com TST, pH 7,6.
Na etapa posterior, os tecidos são
tratados com estreptavidina conjugada
a uma enzima (peroxidase ou fosfatase
alcalina) ou fluorocromo (fluoresceína
ou ficoeritrina), diluídos em tampão TST.
O complexo da reação “proteína-recep-
tor”, usando o conjugado com enzimas
pode ser revelado com substrato DAB
para peroxidase e BCIP/NBT para fos-
fatase alcalina (Figura 1), sendo as sec-
ções montadas com Pertex, entre lâmi-
34 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
na e lamínula de vidro.
Nas revelações com fluorocromos,
com a fluoresceína (Figura 2), os cortes
histológicos são montados com Mowiol
e conservados a 4°C para análise em
microscopia óptica - MO ou microsco-
pia de varredura Laser – MVL.
Nas análises imunohistoquímicas,
com proteínas não marcadas (proteínas
nativas), os receptores são revelados
com o complexo anticorpo primário
(AC , específico contra a proteína Cry)
1
e anticorpo secundário (AC , dirigido
2
contra o AC ) conjugado a uma enzima
1
ou fluorocromo, os quais são revelados
e montados de acordo com o método
descrito anteriormente. As testemunhas
são preparadas pela omissão alternada
de cada etapa da reação, a fim de elimi-
nar a hipótese de reações falso-positi-
vas. As amostras reveladas com enzimas,
tipo peroxidase e fosfatase alcalina,
podem ser avaliadas em microscopia
óptica. Para as análises onde são utili-
zados os fluorocromos pode ser utiliza-
da a microscopia de fluorescência con-
vencional ou de varredura laser.
1.3 Considerações
As marcagens detectadas na região
das microvilosidades das células do epi-
télio intestinal revelam a presença de
receptores membranares às proteínas
Cry, nas microvilosidades das células
epiteliais do intestino médio das larvas
dos insetos (Figuras 1 e 2).
No caso dos tecidos tratados como
controle, representantes da omissão al-
ternada dos diferentes componentes da
reação, pode-se observar a ausência de
coloração nas microvilosidades das cé-
lulas do epitélio intestinal dos insetos
em estudo.
As imunodetecções e as detecções
de proteínas Cry biotiniladas foram uti-
lizadas por diversos autores, para reve-
lação de receptores membranares intes-
tinais, em larvas de diferentes espécies
de lepidópteros (Bravo et al., 1992a;
Denolf et al., 1993a; Estada e Ferre, 1994;
Fiuza, 1995), de dípteros (Ravoahangi-
malala et al., 1993) e de coleópteros
(Bravo et al. 1992b; Denolf et al., 1993b;
Boets et al., 1994). Esses autores com-
provaram que as ligações das proteínas
Cry nas microvilosidades do intestino
médio das larvas de insetos correspon-
dem à existência de um receptor espe-
cífico à referida proteína no inseto-alvo.
Considerando, os estudos dos recep-
tores in vitro e as análises da toxicidade
in vivo, pode-se inferir que os métodos
de detecção de receptores membrana-
res podem ser aplicados na seleção das
proteínas ativas contra insetos, haven-
do uma correlação positiva entre as aná-
lises in vitro e in vivo. Porém, para de-
terminar a Concentração Letal Média
(CL50) de uma proteína Cry faz-se ne-
cessário o bioensaio uma vez que as li-
gações das proteínas aos receptores
podem variar em concentração e afini-
dade, como já descrito por diversos au-
tores, para diferentes espécies de inse-
tos (Denolf et al., 1993a; Van Rie et al.,
1990; Fiuza et al., 1996; Lee et al., 1996;
Hua et al., 2001). Também há estudos
demonstrando que as proteínas Cry tó-
xicas aos insetos correspondem àque-
las que se ligam de forma irreversível
aos receptores das células epiteliais dos
insetos alvo (Liang et al., 1995).
No controle biológico de insetos, a
espécie Bacillus thuringiensis oferece
as melhores alternativas à produção de
biopesticidas e à engenharia genética de
plantas. Sendo assim, é fundamental
avaliar o espectro de ação e a especifi-
cidade das proteínas potencialmente
inseticidas e, nesse contexto, Fiuza
(2004) menciona que a análise in vitro
dos receptores membranas pode ser
considerada uma ferramenta indispen-
sável face ao grande número de isola-
dos, cepas e proteínas de B. thuringi-
ensis já identificados, que representam
um potencial no manejo de insetos-pra-
ga.
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35
 TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS
Pesquisa ÀS PRAGAS AGRÍCOLAS
Pesquisa
Diouneia Lisiane Berlitz
Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).
Aline Oliboni de Azambuja
Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).
Andresa Patrícia Regert Lucho
Engenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em
Biologia: Diversidade e Manejo de Vida
Silvestre (UNISINOS).
Neiva Knaak
Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda
em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida
Silvestre (UNISINOS).
Rogério Schünemann
Biólogo (UNISINOS) e Mestre em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).
Jaime Vargas de Oliveira
Engenheiro Agrônomo (UFSM), Mestre em
Fitotecnia – Fitossanidade/Entomologia
(UFPEL),
Lidia Mariana Fiuza
Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em
Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutora
em Ciências Agronômicas (ENSAM-
Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia
Vegetal (CIRAD-Montpellier).
36 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
controle microbiano de inse-
tos tem sido considerado um
método de controle seguro
aos humanos e ao meio am-
biente, sendo assim nesse tra-
balho são apresentados dados de toxi-
cidade de B. thuringiensis a insetos-
praga, especialmente aos lepidópteros
e coleópteros pragas de importância
agrícola. Os trabalhos de pesquisa en-
fatizam os métodos de ensaios toxico-
lógicos em laboratório e campo, utili-
zando o entomopatógeno B. thuringi-
ensis e as formas imaturas das espéci-
es-alvo.
1.1 Os insetos-praga
Entre os insetos-praga para os quais
têm sido desenvolvidos estudos e apli-
cações de controle com B. thuringien-
sis estão os lepidópteros, Spodoptera
frugiperda e Anticarsia gemmatalis, e
o coleóptero Oryzophagus oryzae, os
quais serão apresentados como mode-
lo de estudos de toxicidade com B. thu-
ringiensis.
A lagarta militar, S. frugiperda, ata-
ca e causa danos a várias culturas de
importância econômica, como: sorgo,
milho, arroz, alfafa, cana-de-açúcar e al-
godoeiro (Cruz et al., 1999; Gallo et al.,
2002), ao passo que, a lagarta da soja A.
gemmatalis é praga-chave para essa cul-
tura e também tem importância para
culturas como amendoim, feijão e alfa-
fa (Gallo et al., 2002). Já o gorgulho aqu-
ático, O. oryzae, cujas larvas são conhe-
cidas como bicheira-da-raiz-do-arroz, é
o principal inseto-praga da cultura do
arroz irrigado no sul do Brasil (Martins
et al., 2004) e, por isso, é também um
dos mais estudados pelas instituições de
pesquisa dessa região (Costa, 2003).
As lagartas de S. frugiperda e A. gem-
matalis podem ser criadas em laborató-
rio, desde que respeitados determina-
dos padrões de temperatura, umidade
relativa e fotoperíodo (28ºC, 70%U.R.,
12h de fotoperíodo). O ciclo evolutivo
desses insetos, em laboratório, ocorre
em torno de 30 dias, desde a fase de
ovo até a emergência do adulto. Os adul-
tos são mantidos em gaiolas de acrílico
com alimentação a base de glicose aquo-
sa (10%), onde acasalam e realizam a
postura. Os ovos são retirados diaria-
mente e acondicionados junto à dieta
artificial, sendo dieta de Poitout para S.
frugiperda e dieta de Greene para A.
gemmatalis. As lagartas desenvolvem-
se nessa dieta até a formação da pupa,
que então são separadas em macho ou
fêmea até emergir o adulto, finalizando
o ciclo.
No caso de O. oryzae, por se tratar
de uma larva aquática, que se alimenta
das raízes das plantas de arroz, não é
descrito nenhum método de criação efi-
ciente desse inseto, em laboratório. Por-
tanto, quando realizados os bioensaios,
esses insetos são coletados diretamente
de áreas de plantio de arroz infestadas,
trazidos ao laboratório para então se-
 Figura 1. Bioensaios com lagartas de Spodoptera frugiperda (A) ou Anticarsia gemmatalis e larvas de
Oryzophagus oryzae (B)
rem utilizados nos ensaios biológicos.
1.2 Bioensaios
de B. thuringiensis
com os insetos-praga
Para determinar a atividade insetici-
da de isolados bacterianos, os bioensai-
os podem ser classificados como preli-
minares ou seletivos. A utilização de
suspensão de células e esporos bacteri-
anos é uma forma de identificar isola-
dos ativos cujas propriedades mostram
eficiência no controle de insetos-praga.
Bioensaios também são utilizados
para determinar a Concentração Letal
Média (CL50), ou seja, a quantidade de
entomopatógeno que deve ser utilizada
para controlar a metade da população
do inseto. Para esses, são usados os iso-
lados que causaram um eficiente índice
de mortalidade nos testes preliminares.
Nesta análise são utilizadas suspensões
contendo células e esporos ou a prote-
ína purificada, dosados em diferentes
concentrações. Os ensaios de toxicida-
de são importantes também, pois reve-
lam injurias e detrimento morfológico,
além de determinar em quanto tempo
ocorre a morte do inseto, Tempo Letal
Médio (TL50). Esses dados são então ana-
lisados para que, quando aplicado em
lavouras, o bioinseticida seja eficiente
no controle dos insetos-alvo.
Os ensaios utilizando as lagartas de
S. frugiperda e A. gemmatalis podem
ser realizados em mini-placas de acríli-
co, contendo dieta artificial, onde é apli-
cada a quantidade de inóculo pré-de-
terminada para uma lagarta por placa
(Figura 1A). A quantidade de insetos
pode variar entre 20 e 50 e o número de
repetições entre três e cinco. No caso
do coleóptero O. oryzae, os testes podem
ser realizados em tubos de ensaio con-
tendo uma planta de arroz, água e a sus-
pensão bacteriana, com 5 larvas do inse-
to por tubo (Figura 1B). Todos os bioen-
saios utilizam placas ou tubos controle,
contendo os insetos e sem adição dos tra-
tamentos. Os ensaios são acondicionados
em câmaras climatizadas nas mesmas con-
dições de criação ou manutenção dos in-
setos em laboratório, descritas anterior-
mente. Os experimentos são avaliados até
o 7º dia após a aplicação dos tratamentos
e os dados são utilizados para o cálculo
da mortalidade corrigida pela fórmula de
Abbott (1970).
1.3 Controle de S. frugiperda
com B. thuringiensis
Apesar de inúmeras pesquisas envol-
vendo esse lepidóptero e seu controle, há
dificuldade em encontrar um isolado bac-
teriano patogênico a essa espécie. Essa
afirmação é comprovada no trabalho de
Polanczyky et al. (2003) que, utilizando
58 subespécies de B. thuringiensis em S.
frugiperda demonstraram que apenas B.
thuringiensis morrisoni apresentou 80%
de mortalidade das lagartas. Também Sil-
va et al. (2004), testaram 77 isolados sen-
do que somente 4 foram ativos a espécie-
alvo.
Recentemente, Berlitz & Fiúza (dados
não publicados) testaram 132 isolados
onde apenas um apresentou alta toxici-
dade ao inseto, com 100% de mortalida-
de, quando utilizada a suspensão de cé-
lulas e esporos bacterianos. Em outro tra-
balho, Berlitz et al. (2003) testaram 24 iso-
lados de B. thuringiensis provenientes de
diversas regiões orizícolas do RS e obteve
as maiores mortalidades entre 31,6 e 100%
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
com apenas cinco isolados, sendo que a
cepa com maior potencial inseticida foi
analisada quanto ao perfil protéico con-
firmando a presença de proteínas ativas
contra lepidópteros. As reduzidas taxas de
mortalidade podem estar relacionadas a
diferentes fatores, como por exemplo, o
modo de ação das proteínas bacterianas
no intestino do inseto, ou modificações
no sítio de ligação dessas toxinas na mem-
brana intestinal. Além disso, cada isolado
tem uma característica genética particu-
lar, ou seja, essas toxinas são codificadas
por genes e esses têm uma determinada
especificidade.
Em outro trabalho, Berlitz & Fiuza
(2004) testaram B. thuringiensis aizawai
proveniente do produto formulado Xen-
tari® mostrando que a suspensão celular
apresentou CL50 de 1,9x108 UFC/mL (Uni-
dade Formadora de Colônia/mL) reduzin-
do em 56,7% o consumo alimentar das
lagartas. Isso indica que a bactéria inibe a
alimentação do inseto-praga, o que tam-
bém está relacionado com a mortalidade
das lagartas.
Entretanto o fato de um isolado cau-
sar mortalidade às lagartas não implica
que, quando purificadas as proteínas tó-
xicas, essas serão ativas ao inseto. É o que
ocorreu na pesquisa de Berlitz (2006), que,
quando utilizada a suspensão de células
e esporos bacterianos obtiveram 100% de
mortalidade, entretanto quando purifica-
das as proteínas do isolado, essas causa-
ram baixa mortalidade às lagartas apre-
sentando CL10 de 268µg/mL. Esse fato pode
estar relacionado ao conjunto de fatores
de virulência presentes na bactéria, ou
então a presença de outras toxinas como,
por exemplo, proteína Vip, exotoxinas, he-
molisinas, quitinases, entre outras, que
estão presentes na suspensão bacteriana.
37
 A CL50 de proteínas Cry de B. thu-
ringiensis aizawai para lagartas de 3º
ínstar de S. frugiperda foi determina-
da por Lucho (2004). As proteínas Cry
foram obtidas a partir de bioinsetici-
da comercial (Xentari®), purificadas
em gradiente de sacarose, solubiliza-
das em tampão fosfato (pH 10) e ava-
liadas em SDS-PAGE. Nos bioensaios
foram avaliadas seis concentrações de
proteínas Cry (0,27 a 8,80 µg/mL) e
testemunha (água destilada e esterili-
zada), sendo aplicados 10 µL sobre a
superfície de folhas de milho acondi-
cionadas em mini-placas de acrílico,
contendo um inseto. Cada tratamen-
to foi constituído de 30 lagartas e 3
repetições, totalizando 630 insetos.
Os resultados obtidos por Lucho
(2004) apontaram CL50 de 2,22; 0,41 e
0,18 µg/mL para 2, 3 e 4 dias após a
aplicação dos tratamentos, respecti-
vamente, e revelaram que as proteí-
nas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C e Cry1D
sintetizadas por B. thuringiensis ai-
zawai são altamente tóxicas à S. fru-
giperda.
Para a mesma espécie, S. frugi-
perda, os dados de Knaak et al. (2006)
mostram que a toxicidade das prote-
ínas Cry1Ab e Cry1Ac, sintetizadas por
B.thuringiensis thuringiensis 407 (pH
408) e B.thuringiensis kurstaki HD-
73, respectivamente, revelaram uma
CL50 de 9,29 e 1,79 µg/cm2 às lagartas
de 1º instar.
Nesse sentido, os dados de Lam-
bert et al. (1996) revelam que a pro-
teína Cry1Ac é muito tóxica para He-
liothis virescens, mas não mostra ne-
nhuma atividade contra Helicoverpa
armigera. Os mesmos autores rela-
tam que Cry1Ca exibe uma atividade
forte contra S. exigua e S. littoralis,
mas não contra S. frugiperda. Peyron-
net et al. (1997) utilizaram Cry1Aa em
Lymantria dispar causando uma des-
polarização rápida e irreversível da
membrana intestinal, mas Cry1Ab e
Cry1Ac eram inativas. Estes resulta-
dos estão de acordo com Van Franke-
nhyzen et al. (1991) que demonstra-
ram um nível alto de toxicidade para
Cry1Aa, mas nenhuma atividade às
outras duas toxinas, confirmando as-
sim a especificidade das proteínas Cry
de B. thuringiensis aos lepidópteros.
Considerando os isolados brasi-
leiros, Praça et al. (2004) selecionan-
do cepas de B. thuringiensis efetivas
contra lagartas de 2º ínstar de S. fru-
giperda, compararam novas cepas ao
B. thuringiensis kurstaki HD-1 (CL50
de 0,285 µg/cm2), obtendo CL50 de
0,09 e 0,52 µg /cm2, para S234 e S997,
respectivamente, que revelou a nova
cepa S234 como a mais tóxica à S.
38 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
frugiperda. Já nos estudos com proteí-
nas Cry, Aranda et al. (1996) determina-
ram que a CL50 para S. frugiperda das
proteínas Cry1Ab e Cry1Ac foram supe-
riores a 2 µg/cm2.
1.4 Controle de A. gemmatalis
com B. thuringiensis
As análises de mortalidade de isola-
dos de B. thuringiensis às lagartas de A.
gemmatalis, realizados por Schünemann
(2006), mostraram que entre os 158 iso-
lados testados, 138 foram ativos e 20
inativos. Entre os isolados patogênicos,
39 deles causaram até 29% de mortali-
dade, 93 entre 30 e 69% e 6 entre 70 e
100%. Análises similares foram encon-
trados por Bobrowski et al. (2001) com
o mesmo banco de bactérias.
Azambuja & Fiuza (2003) obtiveram
37 e 50% de mortalidade corrigida con-
tra a lagarta-da-soja utilizando dois iso-
lados naturais de B. thuringiensis pro-
venientes de regiões orizícolas do RS.
Nas avaliações de patogenicidade reali-
zados com isolados primitivos, Souza et
al. (1999) e Silva et al. (2004), revelam
grandes índices de isolados patogêni-
cos a mesma ordem de inseto. Por ou-
tro lado, a ocorrência de isolados inati-
vos a lepidópteros é bastante freqüen-
te. As variações entre as concentrações
de proteínas inseticidas presentes em
cada suspensão bacteriana pode ser a
causa dessas diferenças entre a ativida-
de inseticida dos isolados.
A ausência de patogenicidade de iso-
lados de B. thuringiensis pode estar re-
lacionada à classe de proteínas sinteti-
zadas pelo mesmo, a qual não apresen-
ta especificidade ao inseto praga-alvo.
Porém, Fiuza (2003) e Praça et al. (2004)
destacam que o mesmo isolado bacteri-
ano pode ter atividade inseticida sobre
espécies da mesma ordem, ou até mes-
mo a outras ordens de insetos.
Em muitos casos a diferença de to-
xicidade das cepas de B. thuringiensis
pode estar relaciona ao próprio inseto,
onde, por exemplo, a extensão da vari-
ação genética de A. gemmatalis pode
estar relacionada a transferência de ge-
nes entre populações geográficas e o
tempo em que essas populações encon-
tram-se separadas, onde o mecanismo
de isolamento reprodutivo se torna uma
barreira efetiva (Sosa-Gómez, 2004).
Sendo assim, os dados da suscetibilida-
de de A. gemmatalis aos diferentes iso-
lados de B. thuringiensis são importan-
tes para um manejo local ou regional
desse inseto-praga, pois em m trabalhos
envolvendo cepas de B. thuringiensis
kurstaki, por exemplo, Mascarenhas et
al. (1998) e Dias et al. (1999) encontra-
ram diferentes índices de mortalidade
da mesma espécie.
1.5 Controle de O. oryzae
com B. thuringiensis
Para O. oryzae são relacionados pou-
cos dados na literatura a respeito da ação
de proteínas de B. thuringiensis. Por se
tratar de uma larva que se alimenta das
raízes da planta de arroz, portanto fica
submersa, é difícil o acesso de bioinseti-
cidas ao local. Os atuais métodos de con-
trole dessa praga restringem-se aos inseti-
cidas químicos que são utilizados basica-
mente no tratamento de semente ou dis-
tribuídos em cobertura na água de irriga-
ção.
Na busca de métodos alternativos de
controle desse inseto, o entomopatógeno
B. thuringiensis mostra-se promissor na
obtenção de plantas transgênicas resisten-
tes à praga-alvo. Nesse sentido, Pinto et
al. (2003), selecionaram 6 isolados de B.
thuringiensis com a presença de genes
da classe cry 3 ou cry 7, que sintetizam as
proteínas inseticidas à ordem dos coleóp-
teros, e avaliaram sua atividade inseticida
à O. oryzae. Dentre os isolados testados
pelos autores, dois causaram mortalidade
corrigida de 100%, três entre 59 e 67% e
um em torno de 50%.
Esses dados foram utilizados por Ber-
litz (2006) que selecionou um isolado com
a presença do gene cry3 que causou 53%
de mortalidade com a suspensão de célu-
las e esporos bacterianos, onde as prote-
ínas inseticidas foram purificadas, dosa-
das e aplicadas nos bioensaios com os
insetos (Figura 1B). Os resultados dessa
pesquisa podem ser aplicados na utiliza-
ção de genes cry, uma vez que causou a
mortalidade das larvas do coleóptero,
quando utilizadas às proteínas purificadas,
obtendo uma CL50 de 5,4µg/mL. Em estu-
dos preliminares com essa espécie-alvo,
Steffens et al. (2000) obtiveram 53,41% de
mortalidade às larvas do gorgulho aquáti-
co com um isolado de B. thuringiensis
contendo genes cry 3, específicos a cole-
ópteros. Considerando os dados mencio-
nados, os resultados obtidos pelos dife-
rentes autores confirmaram a predição da
atividade inseticida de B. thuringiensis
possivelmente devido à presença dos ge-
nes cry3 e cry7, os quais codificam toxi-
nas específicas a coleópteros (Ben-Dov et
al., 1997).
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39
 TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS
Pesquisa AOS INSETOS SOCIAIS
Pesquisa

as interações com as plan- insetos sociais do mundo.

tas, as formigas e os cupins
podem se tornar pragas e
nesse caso faz-se necessário
o controle, onde os entomo-
patógenos assumem um pa-
pel importante no controle biológico.
Nesse contexto, alguns dados de pes-
quisa sobre os ensaios de toxicidade
de B. thuringiensis às formigas corta-
deiras e aos cupins de montículo são
apresentados nesse artigo.
1.1 Os insetos sociais
Nas sociedades de insetos, o siste-
ma de castas possibilita uma divisão
do trabalho, permitindo a execução de
múltiplas tarefas, nas quais indivíduos
estéreis são responsáveis pela manu-
tenção da colônia (obtenção de alimen-
to, defesa e cuidados com a prole), e
os reprodutores limitam-se a reprodu-
ção. O Brasil está entre os países que
contemplam a maior diversidade de
As formigas estão entre os orga-
nismos mais abundantes do planeta,
somando, em conjunto, mais de 10%
da massa de todos os organismos ter-
restres, incluindo mamíferos de gran-
de porte (Hölldobler e Wilson, 1990).
De acordo com estes autores, em um
hectare da Floresta Amazônica vivem
mais de oito milhões de formigas.
As formigas cortadeiras são os
principais herbívoros dos Neotrópi-
cos. Abundantes nas suas numero-
sas colônias desfolham a vegetação,
sendo consideradas importantes pra-
gas agrícolas no Brasil, com prejuí-
zos estimados em milhões de reais.
O gênero Acromyrmex representa
uma ameaça às plantas cultivadas.
Esses insetos também se destacam
por atacarem uma ampla variedade
de vegetais, incluindo plantas orna-
mentais, reflorestamento e pastagens.
As diferentes espécies deste gênero
apresentam ampla distribuição geo-

Raquel de Castilhos-Fortes
Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Microbiologia
Agrícola e do Ambiente (UFRGS)

Aline Oliboni de Azambuja

Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).

Laura Massochin Nunes Pinto

Bióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda em
Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).

Lidia Mariana Fiuza

Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em
Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutora em
Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e
Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD- Figura 1. Bioensaios com cepas de Bacillus thuringiensis e Nasutitermes
Montpellier). ehrhardti, em laboratório

40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38


Figura 2. Representação esquemática dos bioensaios com Acromyrmex
lundi e Bacillus thuringiensis
gráfica no Rio Grande do Sul, eviden-
ciando hábitos de forrageamento bas-
tante diversos (Gusmão e Loeck, 1999).
Os cupins estão presentes pratica-
mente em todos os ambientes terres-
tres ou que sofreram alguma pertur-
bação antrópica, alimentando-se basi-
camente de celulose, obtida através
desta capacidade de ajustar-se a di-
versos ecossistemas. Muitas espécies
desempenham um papel ecológico
significativo, reciclando nutrientes
minerais no solo e participando na re-
generação de ambientes devastados.
Porém, várias outras espécies se des-
tacam como os organismos mais da-
ninhos à cultura agrícola e florestal
(Berti-Filho, 1993). No Brasil, além de
dificultarem seriamente os tratos cul-
turais, os cupins de montículo são con-
siderados importantes pragas de pas-
tagens e culturas de arroz, milho, cana-
de-açúcar, amendoim e eucalipto. As
principais espécies responsáveis por
estes danos pertencem aos gêneros
Cornitermes, Syntermes, Heterotermes,
Nasutitermes, entre outros.
O controle desses insetos vem sen-
Figura 3. Patogenicidade de Bacillus thuringiensis à Nasutitermes ehrhardti, em ensaios de laboratório; B. thuringiensis
sooncheos (Bts); B.thuringiensis roskildiensis (Btr); B. thuringiensis yunnanensis (Bty); B. thuringiensis huazhongensis (Bth);
B. thuringiensis braliliensis (Btb); B. thuringiensis colmeri (Btc) e B. thuringiensis kurstaki (Btk)
do realizado basicamente com a apli-
cação de inseticidas químicos, sendo
um método alternativo as bactérias en-
tomopatogênicas que podem ser iso-
ladas naturalmente do corpo desses
insetos, representando mais uma fer-
ramenta de combate ao inseto-praga,
sem prejudicar o meio ambiente.
1.2 B. thuringiensis
isolados de insetos-sociais
Na análise da patogenicidade de
B. thuringiensis sobre um determina-
do inseto, o primeiro passo a ser ado-
tado é a correlação da atividade das
proteínas Cry no inseto-alvo já descri-
ta. Caso este efeito ainda não tenha
sido avaliado, uma das alternativas
poderá ser por meio do isolamento do
microrganismo de indivíduos da es-
pécie de inseto-alvo. Diversos traba-
lhos são publicados anualmente des-
crevendo o isolamento de novas ce-
pas de B. thuringiensis de diferentes
substratos, inclusive dos próprios in-
setos (Borm et al., 2002). Nesse senti-
do, Azambuja et al. (2001) obtiveram,
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
a partir de 80 indivíduos de Acromyr-
mex sp., 35 isolados do gênero Baci-
llus, entre os quais 14 foram identifica-
dos como B. thuringiesis. Através des-
te estudo pode-se constatar a elevada
ocorrência de B. thuringiensis associa-
do a formigas cortadeiras.
Para tanto, os insetos devem ser co-
letados com pinça e acondicionados em
frascos esterilizados a -18ºC até o mo-
mento de sua utilização. O isolamento
é realizado através da maceração de
10 insetos em solução salina, sendo que
1mL desta suspensão é submetida a
pasteurização, em seguida a inocula-
ção em Ágar Nutriente e incubação
durante 24h a 30°C.
As colônias obtidas devem ser en-
tão inoculadas em meio seletivo (Peni-
cilina G) e mantidas a 30°C e 180rpm
durante 24 horas. As amostras positi-
vas devem ser avaliadas em microsco-
pia de contraste de fase para identifi-
cação das inclusões paraesporais, ca-
racterísticas de B. thuringiensis.
Os isolados de B. thuringiensis,
oriundos de A. lundi, que causaram
mortalidade ao referido inseto foram
avaliados por PCR quanto a sua consti-
tuição de genes cry conforme descrito
por Pinto et al. (2003). Os autores iden-
tificaram que sete dos nove isolados
que apresentaram toxicidade a A. lun-
di amplificaram fragmentos de DNA
correspondentes a pelo menos uma das
classes de genes cry avaliadas, sendo
elas cry1 e/ou cry9. Os genes cry2,
cry3, cry7 e cry8, os quais também
foram avaliados na pesquisa, não fo-
ram detectados nas amostras testadas.
Além disso, 22% dos isolados obtidos
de A. lundi não amplificaram com ne-
nhum dos primers avaliados, podendo
41
 Figura 4. Isolados de Bacillus thuringiensis a partir da maceração de Nasutitermes ehrhardti infectados;
A- Bacillus thuringiensis soocheon; B- Bacillus thuringiensis roskildiensis
representar novos genes cry.
1.3 Bioensaios de B. thuringiensis
com insetos-sociais
Cupins e formigas sofrem ação de di-
versos tipos de patógenos como: vírus,
bactérias, fungos e nematóides, sendo a
defesa contra os mesmos pouco conheci-
da. A complexidade do comportamento e
a biologia dificultam o controle destes in-
setos (Leonardo, 1989; Diehl-Fleig, 1993).
Portanto, técnicas de bioensaios eviden-
ciando o efeito desses entomopatóge-
nos sobre os insetos sociais, considera-
dos pragas, são escassos. Nessa linha de
pesquisa, Castilhos-Fortes et al. (2002)
avaliaram a patogenicidade de diferen-
tes cepas de B. thuringiensis, sobre Na-
sutitermes ehrhardti, onde foram utili-
zadas suspensões contendo uma mistura
de células vegetativas, esporos e cristais.
Porções de celulose (1cm2), utilizadas
como substrato alimentar, foram mergu-
lhadas nas suspensões de B. thuringien-
sis, as quais foram colocadas em placas
de acrílico com seis compartimentos de
5,5 cm de diâmetro. Em cada comparti-
mento, contendo 1cm2 de celulose trata-
da, foram colocados dez insetos (Figura
1).
O acondicionamento dos ensaios foi
feito em estufa incubadora tipo B.O.D., a
28O C, 70% de umidade relativa, no escu-
ro. A mortalidade dos insetos foi avaliada
diariamente até o 7° dia após a instalação
dos bioensaios, observando-se os cupins
mortos com sintomas característicos de
intoxicação por B. thuringiensis.
Em 2003, Pinto et al. testaram o efei-
to de B. thuringiensis em formigas cor-
tadeiras, cujo método de bioensaio foi
desenvolvido objetivando a sobrevivên-
cia dos indivíduos por no mínimo sete
dias, tempo suficiente para a avaliação
de bioensaios. Esse método foi constitu-
42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
ído de uma dieta líquida composta de
peptona bacteriológica, glicose e extra-
to de levedura, com substituição perió-
dica de 48 horas, previamente acondici-
onada em pequenos frascos de polipro-
pileno, acrescida de cinco indivíduos de
Acromyrmex lundi (Figura 2).
Utilizando o referido método de bi-
oensaio de B. thuringiensis com
Acromyrmex lundi, pode-se obter 100%
de sobrevivência das formigas por 180
horas (7,5 dias), tempo suficiente para a
avaliação dos bioensaios com o ento-
mopatógeno.
1.4 Toxicidade de B. thuringiensis
aos cupins e formigas cortadeiras
As referências de B. thuringiensis
contra isópteros são restritas, havendo
poucos dados disponíveis, como os de
Cowie et al. (1989), que citam algumas
cepas de B. thuringiensis tóxicas a vári-
as espécies de térmitas em condições
laboratoriais. Khan et al. (1985), também
ressaltam a carência de trabalhos desen-
volvidos visando testar B. thuringiensis
em térmitas, embora tenham citado os
trabalhos de Smythe & Coppel (1965),
os quais constataram que a solução com
B. thuringiensis mostrou-se tóxica a três
espécies de Reticulitermes, bem como a
Zootermopsis angusticollis. Khan et al.
(1977) isolaram B. thuringiensis a partir
de ninfas do isoptero Bifiditermes bee-
soni infectadas, encontradas em campo.
Nos testes de toxicidade contra Micro-
cerotermes champion, a suspensão de
bactérias testada causou alta mortalida-
de em condições laboratoriais.
Considerando a patogenicidade de
B. thuringiensis para N. ehrhardti, Cas-
tilhos-Fortes el al. (2002) testaram 57
cepas desta bactéria, sendo que sete
mostraram-se mais efetivas: B. thuringi-
ensis sooncheon (Bts) e B. thuringiensis
roskildiensis (Btr) com uma mortalidade
de 100%; seguidos dos isolados B. thu-
ringiensis yunnanensis (Bty) com 71,4%;
B. thuringiensis huazhongensis (Bth)
com 57,1%; B. thuringiensis brasiliensis
(Btb) com 52,3%; B. thuringiensis col-
meri (Btc) com 42,85% e B. thuringien-
sis kurstaki (Btk) com 28,57% de morta-
lidade ao 7o dia após a aplicação dos tra-
tamentos, conforme resultados apresen-
tados na Figura 3.
Para a determinação da CL50 de B.
thuringiensis os referidos autores utili-
zaram os isolados B. thuringiensis soon-
cheon e B. thuringiensis roskildiensis os
quais causaram 100% de mortalidade nos
ensaios pré-seletivos. As CL50 de B. thu-
ringiensis sooncheon observadas foram
46,98x108, 66,19x106 e 5,14x105 esporos/
ml, aos três, cinco e sete dias após os
tratamentos, respectivamente. Para B.
thuringiensis r oskildiensis foram
30,78x105, 48,40x106 e 16,80x104 espo-
ros/ml aos três, cinco e sete dias, res-
pectivamente.
A toxicidade de B. thuringiensis para
N. ehrhardti foi confirmada pelos auto-
res através de observações microscópi-
cas de cupins macerados aos três, cinco
e sete dias após a aplicação dos trata-
mentos. As estruturas de B. thuringien-
sis formadas por células em forma de
bastonete, cadeias, esporos e inclusões
paraesporais podem ser observadas na
Figura 4A para B. thuringiensis soon-
cheon e na Figura 4B para B. thuringi-
ensis roskildiensis.
A patogenicidade e o desenvolvimen-
to de B. thuringiensis foram estudados
por Khan et al. (1985) nos isópteros Mi-
crotermes championi e Bifiditermes be-
esoni, que se mostraram suscetíveis à
infecção causada pela bactéria após a
aplicação do formulado Thuricide-HP.
De acordo com a análise histopatológi-
ca, foi constatado que a ação de B. thu-
ringiensis é mais rápida em M. champio-
ni quando comparado a B. beesoni, sen-
do o intestino médio do inseto invadido
pela bactéria seis horas após a ingestão,
a qual penetra a cavidade corporal, o te-
cido adiposo e células hipodérmicas 20 a
24 horas após a infecção. Em B. beesoni,
a bactéria instalou-se próximo à membra-
na peritrófica depois de 24 horas, atacou
o epitélio e células regenerativas após 48
horas e alcançou a membrana basal do
intestino médio 72 horas após a infec-
ção.
Nos estudos do efeito patogênico de
B. thuringiensis contra A. lundi foram
identificados isolados ativos contra esta
formiga cortadeira, sendo que o isolado
Bt HA48 atingiu 100% de mortalidade (Pin-
to et al., 2003).
1.5 Perspectivas
Em insetos sociais, aspectos como
hábitos comportamentais devem ser con-
siderados, uma vez que a eliminação de
uma porção da colônia não é suficiente
para a extinção. Os fragmentos restantes
têm capacidade de recuperação e nova
infestação, portanto há necessidade de
eliminação da rainha das colônias (Mar-
tins, 1998).
O uso de organoclorados é o método
mais utilizado para controlar populações
de cupins e formigas e embora, com
menos freqüência, outros métodos podem
ser citados como o controle cultural, ação
de predadores e aplicação de extratos
vegetais (Wilcken e Raetano, 1995).
O controle biológico é uma alternati-
va ao controle químico e vem ganhando
destaque em pesquisas de manejo de
populações de pragas. Os principais or-
ganismos utilizados para o controle de
formigas e cupins são microrganismos
patogênicos, em especial fungos e nema-
tóides, e até o momento poucas pesqui-
sas foram realizadas em laboratório com
B. thuringiensis.
As pesquisas têm publicado resulta-
dos satisfatórios no controle de formigas
utilizando os fungos Beauveria bassiana,
Metarhizium anisopliae e Paecilomyces
farinosus (Loureiro e Monteiro, 2005),
além do microsporídeo Thelohania sole-
nopsae (Williams e Deshazo, 2004). O
mesmo ocorre com cupins avaliados fren-
te a fungos entomopatogênicos, como B.
bassiana (Bao & Yendol, 1971) e M. aniso-
pliae (Kramm & West 1981; Hänel 1981 e
1982).
Diferentes estudos visam determinar
quais os organismos patogênicos como fun-
gos ou nematóides, que poderiam ser utili-
zados contra os térmitas. Os resultados,
geralmente, têm sido discrepantes. Outras
linhagens ou espécies de patógenos deve-
riam ser testadas contra os térmitas subter-
râneos, mas os testes de campo devem ser
precedidos de estudos de laboratório para
determinação da patogenicidade dos dife-
rentes patógenos e linhagens. Isto pode aju-
dar a avaliar o potencial do agente patogê-
nico e fornecer a base para estimar as con-
centrações requeridas em campo.
Fernandes (1994) relatou que os princi-
pais problemas enfrentados na pesquisa
sobre controle biológico de cupins são a
carência de conhecimentos biológicos, o
pequeno número de taxonomistas que tra-
balha com isópteros e a falta de outros gru-
pos trabalhando em conjunto neste assun-
to.
Contudo, bactérias entomopatogênicas
podem ser consideradas agentes de contro-
le biológico com potencial de patogenici-
dade e surgem como uma alternativa efici-
ente, ecológica e econômica para a solução
dos danos causados por cupins e formigas.
1.6 Referências
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43
 TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS
Pesquisa ÀS PRAGAS URBANAS E VETORES
Pesquisa

Gabriela Cristina Alles Marcus Hübner Lidia Mariana Fiuza

Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Biólogo (FURG) e Mestre em Biologia: Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia – Fitossanidade
Doutoranda em Biologia: Diversidade e Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e
Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). (UNISINOS). Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).

utilização de bactérias en-
tomopatogênicas do gêne-
ro Bacillus, como agente de
controle populacional de
pragas urbanas e vetores de
agentes patogênicos, tem
relevância nas pesquisas nacionais e inter-
nacionais. Sendo assim, esse trabalho trata
do controle desses insetos, utilizando as es-
pécies B. thuringiensis e B. sphaericus,
onde se destacam as características das es-
pécies do grupo Bacillus, sua ocorrência e
alguns dados de autores que realizaram pes-
quisas na área da saúde pública.
1.1 Bacillus spp. no controle de
vetores de doenças
1.1.1 Insetos vetores de doenças
Algumas espécies dos gêneros Anophe-
les, Aedes, Culex e Mansonia podem ser
importantes vetores de patógenos huma-
nos responsáveis por enfermidades como
malária, febre amarela, encefalite, dengue
e filariose. Estas doenças atingem um nú-
mero significativo de pessoas em diversos
países da Ásia, África e Américas. O Culex
quinquefasciatus é responsável pela trans-
missão da Wuchereria bancrofti, agente eti-
ológico da filariose bancroftiana no Brasil,
além de ser um potencial vetor para o Ví-
rus do Oeste do Nilo (VNO), originado na
África, onde as aves são os hospedeiros e
reservatórios naturais, podendo acometer
o homem, cavalos e outras espécies, cau-
sando desde febre, dor de cabeça e mialgi-
as até encefalite severa e meningite. Desde
1999 ocorrem epidemias da doença nos
EUA e, até o momento, já foram registra-
dos mais de 19 mil casos de infectados com
mais de 750 óbitos (Centers for Disease
Control and Prevention, 2006). Recente-
mente, o vírus passou a circular no Caribe
e já foi isolado na Colômbia e em cavalos
mortos na Argentina (Berrocal, 2006; Mo-
rales, 2006). O Brasil tem um plano de vi-
gilância para detectar a introdução do VNO
no país, visto que o Cx. quinquefasciatus,
potencial vetor, é abundante, além de um
contingente considerável de aves migrató-
rias que ocorre no país por ser originário
de rotas das Américas e de países vizinhos,
onde ocorre a circulação do vírus (Luna et
al., 2003).
É importante ressaltar que há uma gran-
de dificuldade do controle populacional
destes mosquitos devido a suas caracterís-
ticas biológicas como curto ciclo de vida,
alta capacidade reprodutiva e de adapta-
ção ao ambiente. O controle, através do
uso de inseticidas químicos tem apresenta-
do problemas devido ao seu modo de ação
não específico, além da possibilidade de
rápida seleção de resistência de insetos a
estes compostos. Por estas razões, a pro-
cura por agentes mais seletivos aumentou
e, com isso, a adoção de métodos de con-
trole biológico cresceu (Centers for Disea-
se Control and Prevention, 2006).
1.1.2 Bactérias entomopatogênicas
A microflora bacteriana dos insetos,
confinada no intestino, é rica, diversa e
compreende bactérias Gram-positivas e
negativas. Entre as bactérias Gram-positi-
vas, algumas auxiliam na digestão dos ali-
mentos, porém outras são patogênicas e
recebem grande atenção dos pesquisado-
res devido ao seu potencial para o contro-
le de pragas (Priest, 2000; Fiuza, 2001). Entre
estes patógenos destacam-se as bactérias
do gênero Bacillus, com potencial biopes-
ticida que representam cerca de 90% do
mercado mundial (Schnepf et al., 1998), sen-
do amplamente utilizados como uma alter-
nativa aos inseticidas químicos em termos
de segurança a organismos não-alvo e
quando ocorre o desenvolvimento de re-
sistência a inseticidas químicos (Rodrigo-
Simón et al., 2006).
Duas espécies de bactérias entomopa-
togênicas se destacam no controle biológi-
co dos insetos vetores: B. sphaericus e B.
thuringiensis israelensis. Estes microrganis-
mos estão sendo comercializados há mais
de uma década, pois produzem proteínas
inseticidas que, ao serem ingeridas, são le-
tais para as larvas dos mosquitos devido a
sua ação no trato digestivo. O Bti tem ativi-
dade decrescente para os gêneros Aedes,
Simulium, Culex e Mansonia, já o B. spha-
ericus é particularmente eficiente para o
controle de larvas de Cx. quinquefasciatus
e produtos comerciais à base desta bacté-
ria estão disponíveis no Brasil.
O principal fator tóxico do B. sphaeri-
cus para larvas de Cx. quinquefasciatus é a
toxina binária (Bin) contida em um cristal
protéico produzido durante a fase de es-
porulação da bactéria. Após a ingestão deste
cristal pelas larvas, ocorre a sua solubiliza-
ção em pH intestinal alcalino e a protoxina
liberada no lúmen é clivada por serinopro-
teases para atingir a forma de toxina ativa.
A toxina Bin ativa interage com receptores
específicos presentes na membrana apical
das células do epitélio intestinal das larvas,
principalmente nas regiões do ceco gástri-
co e intestino posterior.
O B. sphaericus apresenta uma grande
vantagem em relação ao Bti: a ótima per-
sistência em criadouros ricos em matéria
orgânica, típicos de larvas de Culex, além
de seus esporos sofrerem reciclagem nos
cadáveres das larvas, o que pode ampliar
seu período de persistência nos criadouros
(Nicolas et al., 1987; Skovmand & Baudu-
in, 1997).
Populações de larvas de Culex podem
apresentar resistência ao B. sphaericus após

44 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

 Tabela 1. Mortalidade corrigida de Blatella germanica e
Periplaneta americana, submetidas aos tratamentos com
sorovares de Bacillus thuringiensis
Mortalidade Corrigida (%)
Tratamentos B. germanica
B.t. sorovar colmeri 6,65
B.t. sorovar yunnanensis 14,85
B.t. sorovar huazhangiensis 15,00
B.t. sorovar roskildiensis 16,65
B.t. sorovar sooncheon 30,00
serem submetidas à forte pressão de sele-
ção, sob condições de laboratório (Amo-
rim, 2007; Georghiou, 1992; Pei, 2002; Rod-
charoen & Mulla, 1994) ou de campo
(Mulla, 2003). Estes resultados apontam
para a necessidade de racionalizar o uso
do B. sphaericus, a fim de evitar a seleção
de populações resistentes.
A primeira população resistente obtida
sob condições de laboratório, foi submeti-
da à forte pressão de seleção e atingiu um
nível de resistência da ordem de 100.000
vezes, em relação à colônia susceptível
(Georghiou, 1992). Em outro estudo reali-
zado em laboratório, foram selecionadas
duas colônias de Cx. quinquefasciatus, no
Brasil e na China, que atingiram um alto
nível de resistência (>100.000) (Pei, 2002).
Também foi demonstrado que é possível
selecionar a resistência ao B. sphaericus
cepa IAB59, sob condições de laboratório,
embora, esta seleção tenha ocorrido de
forma mais lenta em relação ao B. sphaeri-
cus 2362. O nível de resistência chegou a
mais de 40.000 vezes (Amorim, 2007). Em
campo, já foram detectadas populações com
níveis de resistência variáveis na França
(Chevillon, 2001), Índia (Rao, 1995), China
(Yuan, 2000), Tunísia (Nielsen-Leroux,
2002) e na Tailândia (Mulla, 2003). O pro-
cesso de seleção da resistência em popula-
ções de campo é modulado por diversos
fatores que incluem o background genéti-
co da população, bem como fatores ecoló-
gicos e ambientais.
1.1.3 Controle integrado de vetores
O conceito do Manejo Integrado de
Vetores (MIV) surgiu como resultado de
uma mudança de paradigma após o uso
intensivo de inseticidas químicos nas dé-
cadas de 1940-60. Em outras palavras, o
MIV é definido como uma combinação ra-
cional de diversos métodos de controle
disponíveis, objetivando manter a popula-
ção de vetores em níveis aceitáveis e da
maneira mais efetiva, econômica e segura,
incluindo componentes biológicos, quími-
cos, físicos e ambientais, visando interferir
o mínimo possível no ecossistema. No MIV,
várias ações são empregadas na tentativa
P. americana
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
de englobar todas as causas do problema.
No âmbito do controle de mosquitos, estas
ações podem incluir a melhoria da rede de
esgoto e distribuição de água, eliminação
física de criadouros, uso de barreiras físi-
cas nas habitações, medidas de proteção
individual, uso de larvicidas específicos em
criadouros que não podem ser eliminados,
além da conscientização e participação da
comunidade. Dentre estas ações, o uso de
biolarvicidas apresenta vantagens, como a
especificidade para o inseto alvo e segu-
rança para o meio ambiente (Georghiou et
al., 1992).
O principal objetivo de estratégias de
controle integrado de vetores é reduzir a
densidade populacional de mosquitos para
níveis em que a atividade é minimizada ou
a transmissão de doenças reduzidas ou in-
terrompida com o mínimo de efeitos ambi-
entais.
Idealmente, programas de controle in-
tegrado devem incluir intervenções mais
eficazes e ambientalmente compatíveis.
Devido à sua eficácia e aparente especifi-
cidade, tanto Bt israelensis quanto B. spha-
ericus podem ser ideais para o programa
integrado de controle de pragas. (Lacey &
Orr, 1994). A combinação de Bt israelensis
com outros agentes de controle biológico
resultou em um excelente controle e, em
alguns casos, a supressão prolongada de
larvas de mosquitos.
Mulligan & Schaefer (1982) relataram
um controle inicial de larvas de Cx. tarsa-
lis em uma das zonas úmidas em que o
tratamento com Bt israelensis foi seguido
por abatimento em longo prazo com lar-
vas de insetos predadores. Do mesmo
modo, Mulla et al. (1993) observaram que
as populações de Cx. quinquefasciatus, Cx.
stigmatosoma e Cx. tarsalis não se recupe-
raram após o tratamento com Bt israelensis
devido a subsequentes predações de lar-
vas por macroinvertebrados aquáticos e
uma redução na oviposição atrativa da pe-
cuária local.
Regis & Nielsen-Leroux (2000) revisan-
do estratégias de manejo de resistência B.
sphaericus recomendaram o acompanha-
mento da susceptibilidade das espécies-alvo
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
de B. sphaericus antes e durante o trata-
mento, alternando o uso de B. sphaericus
com Bt israelensis. Zahiri et al. (2004) de-
monstraram que utilizando suspensões de
misturas contendo formulações comerciais
de Bt israelensis e B. sphaericus, não resul-
tou em resistência em colônias de Cx. quin-
quefasciatus, enquanto que somente sus-
pensões de B. sphaericus gerou resistên-
cia.
1.2 B. thuringiensis
no controle de baratas
Segundo Wilson (1972), estudos com-
parativos realizados entre famílias primiti-
vas de térmitas e baratas revelaram a exis-
tência de múltiplas características em co-
mum que, segundo o autor, poderiam con-
siderar os térmitas como baratas sociais,
cujos diagramas de filogenia, não só refor-
çam este parentesco, como também, rela-
cionam a evolução da flora microbiana in-
testinal entre as ordens Isoptera e Blatto-
dea.
Nesse contexto, a partir do trabalho de
Castilhos-Fortes et al. (2002), Hübner (2004)
testou cinco isolados de B. thuringiensis
em Blatella germanica e Periplaneta ame-
ricana: B. thuringiensis yunnanensis, B.
thuringiensis colmeri, B. thuringiensis hua-
zhangiensis, B. thuringiensis sooncheon e
B. thuringiensis roskildiensis, oriundos do
Instituto Pasteur, Paris.
Para o estudo, adultos e ootecas de B.
germanica e P. americana foram coleta-
dos em estabelecimentos comerciais e re-
sidenciais, no município de Gramado, Rio
Grande do Sul. Ambas as espécies perma-
neceram em caixas de plástico (564 x 385
x 371 mm e 400 x 270 x 362 mm), com as
bordas superiores preenchidas com uma
mistura de água e talco neutro, para evitar
a fuga dos insetos. A umidade foi mantida
através de algodão umedecido, trocado a
cada 48 horas. Substratos de papelão cor-
rugado foram utilizados para mimetizar seu
hábitat natural. Na alimentação foi utiliza-
da 0,5 g de ração animal moída Whiskas,
sendo os insetos mantidos em condições
controladas (30ºC, 70% de U.R., 12h foto-
fase).
Nos bioensaios, baratas adultas de am-
bas as espécies foram agrupadas em caixas
plásticas (262 x 177 x 85 mm), contendo
placas de Petri com algodão umedecido em
água destilada e outra contendo 0,5g de
ração animal moída e 1000µL das suspen-
sões bacterianas a 1.1010 células/mL. Nas
testemunhas, os isolados foram substituí-
dos por água destilada esterilizada. Para
cada isolado bacteriano e cada espécie fo-
ram utilizados 30 insetos. A mortalidade foi
analisada durante 7 dias após a aplicação
dos tratamentos e corrigida pela fórmula
de Abbott (Alves, 1998).
Os dados de patogenicidade, utilizan-
do os cinco isolados de Bacillus thuringi-
ensis, demonstraram uma baixa ação tóxi-
ca sobre B. germanica (6,65% a 30% de
mortalidade), e uma inatividade (0% de
45
mortalidade) à P. americana, levando-se em
consideração que os índices de mortalidade
corrigida apresentados na Tabela 1.
Apesar de Wilson (1972) ter descrito um
parentesco evolutivo entre as famílias primiti-
vas de térmitas e baratas, inclusive quanto a
sua flora bacteriana, o presente estudo de-
monstra que não há uma correlação da ação
de B. thuringiensis sobre B. germanica e P.
americana, pertencentes às famílias mais evo-
luídas.
Cavados (2003) cita que o controle bioló-
gico com bactérias entomopatogênicas tem
como principal vantagem a especificidade.
Dependendo da composição de proteínas Cry
no cristal bacteriano, os isolados podem apre-
sentar um espectro de ação limitado às or-
dens de insetos (Fiuza, 2001). Assim, os da-
dos obtidos sugerem que as delta-endotoxi-
nas produzidas pelos cinco isolados de B. thu-
ringiensis testados não apresentam proteínas
Cry com ação tóxica para a ordem Blattodea,
uma vez que causaram uma menor ação so-
bre os insetos-alvo do trabalho de Hübner
(2004).
Lambiase et al. (1996) mencionam uma
diferenciação na localização dos sítios bacte-
rianos em B. germanica e P. americana, o
que poderia justificar o fato de ter-se obtido
uma ação inseticida para a primeira espécie e
uma ausência de efeito para a segunda.
Também forma realizados ensaios de to-
xicidade in vivo para verificar a ação de B.
thuringiensis oswaldocruzi (H-38) e B. thu-
ringiensis brasiliensis (H-39) contra Peripla-
neta americana e Blatella germanica. Porém,
nesses ensaios não houve ação patogênica das
cepas avaliadas às duas espécies de baratas
utilizadas nos bioensaios (Hübner, 2004).
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429.
 INTERAÇÕES DE BACILLUS THURINGIENSIS
Pesquisa E O CONTROLE DE FITOPATÓGENOS
Neiva Knaak
Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em
Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).
Aline Oliboni de Azambuja
Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).
Andresa Patrícia Regert Lucho
Engenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em
Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).
Diouneia Lisiane Berlitz
Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).
Lidia Mariana Fiuza
Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em
Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutora em
Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e
Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-
Montpellier).
48 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
s tratamentos fitossanitários
constituem uma rotina nos
cultivos agrícolas, os quais
visam o controle de plantas
daninhas, insetos e fitopató-
genos. Como agentes do ma-
nejo integrado das culturas, os pesquisa-
dores têm priorizado a aplicação de inimi-
gos naturais (parasitóides e predadores),
extratos vegetais e microrganismos. Nesse
contexto, dados referentes às interações
desses agentes de controle são apresenta-
dos, com ênfase nas bactérias entomopa-
togênicas da espécie B. thuringiensis. Con-
siderando o controle biológico de fitopa-
tógenos, a doença não é só a interação entre
patógeno e hospedeiro, mas o resultado
da interação entre patógeno, hospedeiro e
uma série de microrganismos não patogê-
nicos que também repousam no sítio de
infecção. Esses agentes não patogênicos po-
dem limitar ou aumentar a atividade do pa-
tógeno, ou a resistência do hospedeiro. O
sucesso do biocontrole depende das pro-
priedades antagonistas e dos mecanismos
de ação do hiperparasita. Desse modo,
nesse trabalho são apresentadas várias pes-
quisas que relatam o efeito antagônico de
B. thuringiensis aos fungos fitopatogênicos.
1.1 Interações de métodos
de controle de insetos
O interesse por obter produtos agríco-
las em sistemas sustentáveis estimula o es-
tudo e o uso de estratégias do Manejo In-
tegrado de Pragas (MIP) e do Manejo Eco-
lógico de Pragas (MEP). Sendo assim, ex-
tratos vegetais apropriadamente seleciona-
dos e em concentrações adequadas podem
ser usados em associação com entomopa-
tógenos obtendo-se efeitos aditivos ou si-
nergéticos no controle (Saito & Luchini,
1998).
Segundo os autores, o efeito estressor
desses extratos sobre a praga pode deter-
minar uma ação mais rápida do entomopa-
tógeno e/ou um maior índice de mortali-
dade. Assim essa associação pode ser posi-
tiva ou benéfica quando o inseto-alvo tem
mecanismos comportamentais de defesa
contra entomopatógenos, quando as con-
dições ambientais não são favoráveis ou as
quantidades de inóculo necessárias são ele-
vadas.
Nesse sentido, Lucho (2004) estudou a
interação entre B. thuringiensis aizawai e
extrato de folhas de Melia azedarach (ci-
namomo) para o controle de lagartas de
Spodoptera frugiperda, em laboratório. Na
pesquisa foram avaliados quatro tratamen-
tos: extrato de folhas de M. azedarach; B.
thuringiensis aizawai; mistura de B. thu-
ringiensis aizawai e extrato de M. azeda-
rach; controle (água destilada) sendo a
mortalidade das lagartas observada diaria-
mente, até o sétimo dia após aplicação dos
tratamentos (DAT). O uso de B. thuringi-
ensis, isoladamente ou em associação com
o extrato de M. azedarach mostrou-se letal
no 1º DAT. Nas lagartas submetidas somente
ao extrato, a mortalidade iniciou aos 2 DAT
e ao final do bioensaio, a mortalidade acu-
mulada foi maior na associação do biopes-
ticida e do inseticida botânico. Os percen-
tuais de mortalidade de S. frugiperda ob-
servados aos 7 DAT foram de 55, 70 e 90%
para os tratamentos com extrato, B. thu-
ringiensis aizawai e a associação de B. thu-
ringiensis aizawai com extrato de M. aze-
Tabela 1. Aplicações simultâneas de entomopatógenos e extratos vegetias no controle de pragas de grãos
armazenados (adaptada de Sabbour, 2003)
Plantas
Folhas de T. distichum
Óleo volátil de T. distichum
Óleo volátil de B. carterri
darach, respectivamente. Assim, foi obser-
vado um efeito sinérgico dos ingredientes
ativos de B. thuringiensis aizawai e extra-
to de M. azedarach contra S. frugiperda,
pois o resultado da associação foi superior
ao uso dos bioinseticidas isoladamente.
Apesar disso, a interação de métodos
de controle nem sempre apresenta o efeito
desejado sobre o inseto. Isso foi demons-
trado por Berlitz (2006) que utilizou B. thu-
ringiensis simultaneamente com o cinamo-
mo, M. azedarach. As concentrações utili-
zadas nesse trabalho não demonstraram
eficiência, pois a mortalidade do lepidóp-
tero S. frugiperda foi de, apenas 6% e para
larvas do coleóptero Oryzophagus oryzae
foi de 11%. Esse fato pode estar associado
a um possível efeito inibitório da bactéria
sobre o extrato vegetal ou vice-versa.
Em relação ao uso simultâneo de bio-
inseticidas, Sabbour (2003) realizou ensai-
os com extrato das folhas e óleo volátil de
Taxodium distichum (L. Rich) e Boswella
carterri, em combinação com a bactéria B.
thuringiensis e o fungo Beauveria bassia-
na (Vuillemin, 1912), em pragas de produ-
tos armazenados. Em seus resultados a com-
binação dos entomopatógenos com as plan-
tas, reduziu significativamente o valor da
Concentração Letal Média (CL50), conforme
mostra a Tabela 1.
De acordo com Novan, (1992) a utili-
zação de extratos vegetais reduz a alimen-
tação do inseto através de seus aleloquími-
cos, o que otimiza a atividade inseticida do
microrganismo, resultando em um maior
índice de mortalidade.
Já os autores Zhang et al. (2000) utili-
zaram B. thuringiensis kurstaki em diferen-
tes concentrações e suplementado com trip-
sina de soja mostrando uma inibição no
crescimento larval de H. armigera (P<0,05).
Em ensaios in vitro e in vivo, os autores
comentam que a degradação das toxinas
de B. thuringiensis pode ser inibida pela
tripsina da soja. Os dados sugerem que o
tempo de retenção das toxinas no intesti-
no médio das larvas foi estendido, ocor-
rendo também um sinergismo entre os cris-
tais inseticidas da bactéria e os inibidores
de tripsina da soja.
No caso do uso interativo de B. thu-
ringiensis com nematóides entomopatogê-
nicos, Koppenhöfer e Kaya (1997) utiliza-
Redução da CL50 (%)
Insetos B. thuringiensis
Plodia interpeculata
Ephesia cautella
Ephesia küehniella
Plodia interpeculata
Ephesia cautella
Ephesia küehniella
Plodia interpeculata
Ephesia cautella
Ephesia küehniella
ram B. thuringiensis japonensis e nematói-
des em larvas de Cyclocephala hirta e C.
pasadenae (Coleoptera: Scarabaeidae) mos-
trando que essa interação apresentou mai-
or mortalidade que os tratamentos indivi-
duais, viabiliando assim o uso integrado
desses organismos.
B. thuringiensis também pode ser utili-
zado em combinação com outros micror-
ganismos para o controle de insetos-praga.
Nesse sentido, Broderick et al. (2000), iden-
tificaram um aumento de 35% da mortali-
dade do lepidóptero Lymantria dispar (L.)
quando usado B. thuringiensis e zitermici-
na A de B. cereus, sendo que a zitermicina
é responsável pelo efeito sinergético dos
microrganismos. Primeiramente porque
essa substância acumula-se em grandes
quantidades nas culturas de B. cereus, se-
gundo porque quando utilizada individu-
almente não causa efeito sobre o inseto,
somente em combinação com B. thuringi-
ensis, aumentando a mortalidade de L. dis-
par.
Os resultados de Wraight & Ramos
(2005) também demonstram sinergismo de
35,2; 33,8; e 21,1% quando utilizado simul-
taneamente um produto comercial a base
de B. thuringiensis e do fungo B. bassiana
em Leptinotarsa decemlineata. Esses auto-
res revelam que a interação pode ter sido
ocasionada pela intoxicação causada pelo
entomopatógeno, inibindo a alimentação
do inseto, ocasionando uma situação de
estresse, e efeitos fisiológicos, o que facili-
tou a penetração do fungo no inseto. Efei-
tos semelhantes também foram observados
por Ma et al. (2008), quando utilizada a
proteína Cry 1Ac de B. thuringiensis com
B. bassiana. Esses autores observaram efei-
tos deletérios na mortalidade das larvas de
Ostrinia furnacalis (Lepidoptera: Crambi-
dae), além de diminuição na formação de
pupas e na emergência dos insetos adul-
tos.
Os autores Brousseau et al., (1998) tam-
bém encontraram efeitos sinergéticos quan-
do avaliada a combinação de B. thuringi-
ensis kurstaki com destruxinas do fungo M.
anisopliae para combater larvas de Choris-
toneura fumiferana (Clemens, 1865) (Le-
pidoptera: Tortricidae).
Outra forma de controle integrado foi
avaliada por Petry et al. (2004) utilizando
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
B. bassiana
71 45
63 35
69 20
67 43
63 43
74 34
67 30
72 46
79 38
B. thuringiensis e controle mecânico de es-
pécies de Simulium, revelando 88,83% de ín-
dice reducional médio de larvas dos mos-
quitos. Já Andrade & Modolo (1991) testa-
ram B. thuringiensis israelensis em mistura
com o pesticida temephos contra A. aegypti
causando 91 e 98% de mortalidade corrigida,
diminuindo o tempo letal médio. O modo
de ação das proteínas de B. thuringiensis is-
raelensis foi avaliada por Gómez et al. (2007)
demonstrando que a presença da proteína
Cyt1Aa aumenta a capacidade de ligação, na
membrana intestinal do inseto, da proteína
Cry11A. Isso porque a proteína Cyt depois
de solubilizada expõe regiões específicas na
membrana, promovendo a ligação da prote-
ína Cry e aumentando assim, sua atividade
inseticida.
Essas informações indicam que se torna
cada vez mais importante as pesquisas nessa
área, uma vez que a aplicação de inseticidas
químicos resulta em grandes impactos nos
agroecossistemas, pois atingem não somente
os inimigos naturais dos insetos, mas tam-
bém contaminam o solo e os lençóis de água
subterrâneos.
1.2 Interações tri-tróficas
Para um melhor entendimento dos agro-
ecossistemas, é importante estudar as rela-
ções existentes entre as espécies e suas teias
alimentares, que constituem um complexo de
interações tróficas onde há interesse em in-
terações tri-tróficas visando a utilização de
patógenos, parasitóides e predadores, junta-
mente com a planta hospedeira/inseticida.
Essas relações podem ser devidamente utili-
zadas nas práticas de manejo de insetos-pra-
ga, uma vez que se torna importante a pre-
servação de inimigos naturais dos insetos, que
são também os controladores das populações
da praga.
As interações tri-tróficas podem ser re-
sultantes de dois efeitos: efeito direto da plan-
ta sobre a biologia e o comportamento do
inimigo natural, devido às substâncias quí-
micas ou caracteres morfológicos da planta;
ou efeito da planta sobre a praga alterando
seu comportamento, desenvolvimento, tama-
nho, o que afeta também seu inimigo natu-
ral. Essas interações são mais complexas
quando há mais de uma espécie de inimigo
natural envolvida. Nesse tipo de interação,
49
 as plantas são importantes “meios de co-
municação”, pois ao serem atacadas por um
herbívoro, liberam substâncias voláteis pe-
las folhas, as quais orientam as fêmeas dos
parasitóides a encontrarem as lagartas e de-
positar seus ovos. Sendo assim, os odores
têm papel fundamental na organização dos
indivíduos nos agroecossistemas (Vendra-
min, 2002; Vilela &Palini, 2002).
As interações tri-tróficas podem ser
exemplificadas nas culturas da soja e do
milho. A cultura é atacada pela largarta-da-
soja, A. gemmatalis que é combatida atra-
vés da aplicação de vírus, o Baculovirus
anticarsia, e predada por Geocoris sp. No
caso do milho, as lagartas de S. frugiperda
podem ser parasitadas por Trichogramma
sp. e controladas através do entomopató-
geno B. thuringiensis.
De acordo com Ferry et al. (2004), os
insetos são causadores de perdas mundiais
entre 10 e 20% da produção agrícola. Com
isso as pesquisas na área biotecnológica
estudam diferentes formas de induzir a re-
sistência de uma planta a seu predador.
Apesar disso as técnicas convencionais de
controle químico ainda são largamente uti-
lizadas, sendo que o controle biológico en-
contra algumas resistências, principalmen-
te devido aos elevados custos aos produ-
tores agrícolas.
Agrawal (2000) relata que as plantas
podem ser atrativas ou benéficas a alguns
inimigos naturais de herbívoros, mas tam-
bém podem ser tóxicas ou prejudiciais a
esses. Assim, as interações tri-tróficas po-
dem identificar esses mecanismos de modo
a poder manipulá-los, o que irá ampliar o
controle e reduzir o uso de inseticidas.
Os autores Ferry et al. (2004) identifi-
caram diferentes estratégias de defesa das
plantas a seus predadores. Dentre essas,
pode-se citar mecanismos de defesa endó-
genos e moleculares, sinalização das plan-
tas e a produção de substâncias voláteis.
Em resposta, os insetos também desenvol-
veram estratégias de defesa a esses com-
postos, principalmente através da produ-
ção de proteinases e de mecanismos espe-
ciais de desintoxicação utilizando, por
exemplo, citrocomo P450, monoxigenases
e glutatione S-transferases.
Entretanto, a complexidade química das
plantas pode manipular seus fenótipos e,
conseqüentemente de seus inimigos natu-
rais (Wittstock e Gerhenzon, 2002). Ven-
zon et al. (2001) relatam que, quando inse-
rido uma quantidade de inimigos naturais
ou removendo-se determinadas espécies de
um agroecossistema, uma grande quanti-
dade de interações indiretas pode ser es-
perada. Essas interações podem ser positi-
vas ou negativas ao controle biológico, de-
vendo-se dar importância aos níveis de in-
terações entre as espécies.
As interações tri-tróficas também podem
ser exemplificadas através do trabalho de
Dequech et al. (2005) que avaliaram lagar-
tas de S. frugiperda parasitadas por Cam-
poletis flavicincta e infectadas por B. thu-
50 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
ringiensis aizawai. Em seus resultados o
uso conjunto dos componentes biológicos
citados, aumentou a mortalidade do inse-
to-praga e diminuiu seu consumo de ali-
mento.
Resultados semelhantes foram encon-
trados por Moraes et al. (2004) que identi-
ficaram a influência de silício em plantas
de trigo, no pulgão-verde (Schizaphis gra-
minum) e seus inimigos naturais. Os da-
dos desses autores mostram que a aplica-
ção de silício na cultura aumentou a resis-
tência das plantas de trigo diminuindo a
preferência alimentar do pulgão-verde, não
afetando seus inimigos naturais.
Através desses trabalhos nota-se a im-
portância de novas pesquisas visando iden-
tificar relações tri-tróficas benéficas e efici-
entes que podem ser utilizadas junto às
práticas de Manejo Integrado de Pragas.
1.3 Compatibilidade de
produtos fitossanitários com Bacillus
entomopatogênicos
O controle biológico ocorre natural-
mente no ambiente através da ação de ini-
migos naturais, mantendo em níveis relati-
vamente baixos as populações de inúme-
ras pragas (Lacey et al. 2001). As bactérias
Bacillus thuringiensis e B. sphaericus são
entomopatógenos que desempenham o
papel de agentes de controle microbiano
de pragas de importância agrícola e veto-
res de agentes etiológicos de doenças hu-
manas (De Maagd et al., 2003). Diante dis-
so, a utilização e conservação desses mi-
crorganismos, dentro de agroecossistemas,
é uma das estratégias utilizadas no Manejo
integrado de Pragas, já que são encontra-
das naturalmente nesses ambientes. Assim,
torna-se importante conhecer a ação dos
produtos fitossanitários, determinando a sua
seletividade e compatibilidade sobre os en-
tomopatógenos, com o objetivo de mini-
mizar os impactos tanto no ambiente quanto
na microbiota residente (Batista-Filho et al.,
2001).
A excessiva aplicação de defensivos
agrícolas vem ocasionando uma série de
desequilíbrios ambientais, especialmente
nas populações de entomopatogênos, ve-
rificadas atráves da inibição do crescimen-
to, esporulação, mutações genéticas, redu-
ção da toxicidade a determinada praga,
influenciando diretamente no estabeleci-
mento e sobrevivência (Alves et al., 1998).
No entanto, a ação dos agroquímicos so-
bre os microrganismos pode variar em fun-
ção da espécie e linhagem do microrganis-
mo, como também da formulação química
e dosagens dos produtos (Batista-Filho et
al., 2001). Contudo, alguns produtos apre-
sentam seletividade aos entomopatógenos,
podendo potencializar o seu efeito e con-
tribuir para o controle do inseto-alvo (Benz,
1971; Chen et al., 1974). Assim, a associa-
ção de inseticidas químicos e biológicos
contribuem para minimizar os efeitos ne-
gativos sobre os agroecossistemas (Chen
et al., 1974; Batista-Filho et al., 2001).
Grande parte das reações dos pesticidas,
atualmente utilizadas no controle de pragas,
é desconhecida devido à carência de infor-
mações a respeito da compatibilidade desses
produtos sobre entomopatógenos (Morris,
1977). Para B. thuringiensis, majoritariamen-
te os trabalhos realizados sobre interação são
proveniente da década de 70, como reflexo
da demasiada aplicação de inseticidas sintéti-
cos orgânicos como hidrocarbonetos clorina-
dos, oganofosforados, metilcarbamatos e pi-
retróides (Casida e Quistad, 1998). Para B.
sphaericus, quase a totalidade dos trabalhos
se referem à toxicidade às larvas de dípteros,
ressaltando a importância de estudos que vi-
sam à proteção desse inimigo natural, através
da compatibilidade com os pesticidas quími-
cos.
Ainda na década de 70, Doughert et al.
(1971) obtiveram respostas variadas na sensi-
bilidade de B. thuringiensis thuringiensis em
função dos diversos solventes utilizados para
os mesmos pesticidas. A presença de emulsi-
ficantes e outros aditivos concentrados, utili-
zados nas preparações, podem gerar proble-
mas de compatibilidade com entomopatóge-
nos devendo ser considerado na elaboração
de novas formulações comerciais (Morris,
1977). O mesmo autor testou a compatibili-
dade de 27 pesticidas sobre a germinação e
replicação de B. thuringiensis kurstaki, con-
cluindo que o grupo dos carbamatos foram
os mais compatíveis, as piretrinas altamente
bacteriostáticas e os produtos acefato, triclor-
fon, metomil, carbaril, mexacarbato e PH 60-
40 (derivado da uréia) podem ser utilizados
em conjunto com a bactéria.
Os trabalhos mais atuais nessa linha de
pesquisa avaliaram o efeito de diferentes con-
centrações de defensivos agrícolas sobre mi-
crorganismos entomopatogênicos. Especial-
mente para B. thuringiensis, os dados mos-
tram que tiametoxam, carbosulfan, diafentiu-
ron, imidacloprid, acefato, utilizados nas con-
centrações máximas, não apresentaram dife-
rença significativa nas unidades formadoras
da colônia - UFC (Batista-Filho et al., 2001;
Batista-Filho et al., 2003; Almeida et al., 2003).
Por outro lado, essas pesquisas revelam que
endosulfan, monocrotofós, deltametrina e ci-
proconazole + tiametoxam inibiram a forma-
ção das colônias. Já, na concentração míni-
ma, o diafentiuron foi sinérgico e o tiameto-
xam e ciproconazole + tiametoxam não afe-
taram B. thuringiensis. Utilizando ambas as
concentrações, o endosulfan, deltametrina e
profenofós + lufenuron inibiram as colônias
da bactéria e tiametoxam + cipermetrina fo-
ram compatíveis.
Há poucas pesquisas que avaliam a com-
patibilidade de bactérias entomopatogênicas
com os pesticidas mais utilizados em diver-
sas culturas, como por exemplo, o arroz irri-
gado. No caso, Azambuja (2006) testou seis
produtos fitossanitários, comumente utiliza-
dos na orizicultura irrigada, sobre as bactéri-
as B. thuringiensis e B. sphaericus, em con-
dições laboratoriais e observou que os herbi-
cidas glifosato e propanil foram significativa-
mente antagônicos ao desenvolvimento de B.
thuringiensis, e os mesmos produtos, inclu-
indo o fungicida azoxistrobina, reduziram o
crescimento de B. sphaericus, afetando esse
microrganismo com mais intensidade. Entre-
tanto, relatou uma provável compatibilidade
dos herbicidas quincloraque e pirazosulfuron-
etil e o inseticida fipronil para ambos ento-
mopatógenos naturais do solo, propondo a
sua utilização em Programas de MIP.
Complementando os dados anteriores,
Batista-Filho et al. (2001) verificaram que o
inseticida fipronil apresentou um efeito sinér-
gico aumentando a UFC de B. thuringiensis
(Dipel®) quando utilizado na concentração mí-
nima, mas não teve influência quando utili-
zado na concentração máxima. Entretanto,
Rohr (2005) mostrou que azoxistrobina, quin-
cloraque e fipronil não apresentaram intera-
ções significativas sobre os bioinseticida de
B. thuringiensis kurstaki (Dipel®) e B. thu-
ringiensis aizawai (Xentari®).
Os dados dos ensaios realizados in vitro
expõem ao máximo os microrganismos a ação
dos produtos fitossanitários, podendo diferir
das condições de campo, onde outros fato-
res interferem, diminuindo a intensidade das
reações. Nesse sentido, Alves et al. (1998) sa-
lientam que a seletividade de um produto
testado in vitro pode ser confirmado em cam-
po, mas o antagonismo apresentado em la-
boratório nem sempre pode ser verificado no
campo.
Os dados referentes às interações entre
entomopatógenos e pesticidas em condições
de campo são ainda mais reduzidos (Alves et
al., 1998). Nesse enfoque, Azambuja (2006),
em laboratório, concluiu que os agroquími-
cos: fipronil, azoxistrobina, quincloraque, gli-
fosato, propanil e pirazosulfuron-etil não in-
terferiram na abundância de B. thuringiensis
nem de B. sphaericus. Ressaltando esse pa-
drão, Batista-Filho et al. (2001) estudaram a
compatibilidade do tiametoxam e B. thurin-
giensis (Dipel®), aplicados em lavouras de
feijão, revelando que o inseticida não inter-
feriu no potencial de inóculo do entomopa-
tógeno, assim como in vitro, recomendando
a utilização do produto em conjunto com a
bactéria. Conforme foi verificado, no ambi-
ente natural, os diversos fatores bióticos e
abióticos atuam minimizando os possíveis
impactos sobre os Bacillus spp. da ação dire-
ta dos produtos fitossanitários (Alves et al.,
1998).
Em outro trabalho, Das et al. (2003) veri-
ficaram a influência de dois inseticidas em
diversos microrganismos presentes nos solos
de cultivo de arroz. Esses autores mencio-
nam que forato e carborufam estimularam o
crescimento das populações de bactérias e as
proporções de Bacillus sp. No entanto, o efei-
to sinérgico de carbofuram foi mais pronun-
ciado. Esse fato está relacionado à capacida-
de de alguns microrganismos desse gênero
utilizarem o inseticida e degradarem seus pro-
dutos para o seu próprio desenvolvimento
no solo.
Como já mencionado, na literatura a res-
peito de interações de microrganismos ento-
mopatogênicos e agroquímicos, em condi-
ções de campo, é muito restrita e quase a
totalidade dos trabalhos realizados dessa
natureza se referem aos fungos entomopa-
togênicos avaliados in vitro. A falta de pa-
dronização na realização dos testes é um
dos problemas desse tipo de estudo que,
em muitos casos, não permite uma compa-
ração efetiva entre os produtos (Alves et
al., 1998).
Diante disso, os microrganismos ento-
mopatogênicos que habitam naturalmente
os agroecossistemas devem ser preserva-
dos através de técnicas culturais e princi-
palmente na utilização de pesticidas com-
patíveis não comprometendo o MIP (Almei-
da et al., 2003).
1.4 Controle microbiano
de Fitopatógenos
1.4.1 Fungos Fitopatogênicos:
Os fungos constituem um grupo de
organismos que se caracteriza por nunca
apresentarem tecido verdadeiro, por serem
eucarióticos e aclorofilados. A maioria das
espécies fúngicas é saprofítica, mas algu-
mas desenvolveram a capacidade de para-
sitar plantas, causando a morte ou um re-
tardamento do desenvolvimento do hos-
pedeiro. Devido aos sistemas intensivos de
produção agrícola, o índice e a prevalên-
cia de doenças têm aumentado significati-
vamente, podendo, em alguns casos, cau-
sar perda total da produção. Esse aumento
de doenças em áreas agrícolas se deve prin-
cipalmente ao desequilíbrio entre as dife-
rentes populações microbianas do solo, do
rizoplano, do fitoplano e endofíticas que
interagem com plantas, permitindo o esta-
belecimento e o desenvolvimento dos fun-
gos patogênicos (Esposito & Azevedo,
2004).
Os autores relatam que para o fungo
patogênico colonizar a planta hospedeira,
inicialmente ele precisa quebrar o seu sis-
tema de defesa. Para isso, produz enzimas
hidrolíticas (cutinases, celulases, ligninases
e outras) que quebram a cutícula e a pare-
de da celular hospedeira; toxinas que re-
duzem ou inibem completamente a ativi-
dade das células da planta a ser parasitada
e/ou produzem substâncias específicas de
plantas (hormônios) que quebram o equi-
líbrio fisiológico da célula vegetal, causan-
do distúrbios no crescimento e na diferen-
ciação das células da planta (Esposito e Aze-
vedo, 2004).
Em geral, os fungos patogênicos apre-
sentam três estágios de colonização da plan-
ta hospedeira. Esses estágios são caracteri-
zados pela germinação do esporo na su-
perfície dos tecidos da planta hospedeira,
pelo reconhecimento da superfície, pela
formação de apressório e pela penetração
nos tecidos vegetais. Estando no interior
da planta, o fungo pode colonizar os espa-
ços intercelulares e/ou intracelulares de
forma parasítica e, posteriormente, produ-
zir estruturas reprodutivas que permitam a
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
sua disseminação (Esposito e Azevedo, 2004).
1.4.2 Efeitos de B. thuringiensis
em fitopatógenos:
Alguns microrganismos, como bactérias,
fungos e actinomicetos, produzem metabó-
litos capazes de inibir o crescimento de ou-
tros microrganismos. Estas substâncias são
diferentes na sua estrutura e distribuição, se
restringindo aos poucos compostos e estan-
do presentes em apenas alguns microrganis-
mos (Kennedy, 1999). Os produtos do meta-
bolismo secundário microbiano são alvos de
pesquisas cada vez mais intensas na busca
de substâncias bioativas, para atuação em di-
versas áreas como a agricultura, veterinária
e farmácia (Woodruff, 1980).
Grande parte dos microrganismos envol-
vidos no controle biológico atua através de
antibiose, onde ocorre a interação entre or-
ganismos, um metabólito produzido por um
deles tem um efeito prejudicial sobre o ou-
tro. A produção de metabólitos pode resul-
tar na completa lise e dissolução da estrutu-
ra celular e independe do contato físico en-
tre os microrganismos (Bettiol & Ghini, 1995),
dessa forma, a busca por microrganismos
antagônicos a fungos fitopatogênicos tem
aumentado (Benitez et al., 2004). Diversas
espécies de Bacillus são citadas como pro-
dutoras de antibióticos, podendo secretar me-
tabólitos comercialmente importantes, como
enzimas aminolíticas e enzimas proteolíticas
(Bettiol & Ghini, 1995).
Bettiol (1988), em trabalho de seleção
de microrganismo antagônico a Pyricularia
oryzae, verificou que B. subtilis foi o mais
eficiente em inibir o crescimento micelial do
patógeno, e constatando também que o an-
tagonista apresenta boas características para
uso como agente de controle biológico, pois,
além de rápido desenvolvimento, tanto em
meio de cultura como na natureza, produ-
zem endósporo e antibióticos, crescem em
larga faixa de temperatura e adaptam-se a
várias condições ambientais.
O processo para que ocorra o antago-
nismo exige a degradação da parede celular
fúngica por hidrolases secretada por micror-
ganismos. Como quitina e beta-1,3-glucana
são os principais componentes estruturais da
parede celular fúngica, quitinases e glucana-
ses podem ser importantes no controle bio-
lógico desses microrganismos (Kulminskaya
et al., 2001). Knaak et al. (2007) testaram as
cepas e proteínas Cry1Ab e Cry1Ac sintetiza-
das por Bacillus thuringiensis thuringiensis
407 (pH 408) e B. thuringiensis kurstaki HD-
73, respectivamente, sobre os fungos fitopa-
togênicos Pyricularia grisea, Rhizoctonia so-
lani, Fusarium oxysporum e F. solani. Veri-
ficaram que as cepas B. thuringiensis, que
sintetizam as proteínas Cry1Ab e Cry1Ac, re-
duziram o crescimento micelial dos fungos
R. solani, P. grisea, F. oxysporum e F. solani
durante o período avaliado, quando compa-
rado aos controles. As duas cepas inibiram o
crescimento dos fitopatógenos testados até
sete dias após a incubação, onde houve di-
ferença significativa (P<0,05) entre os trata-
51
 mentos bacterianos e os grupos controle.
Na avaliação da ação das proteínas Cry1Ab
e Cry1Ac, sobre R. solani, P. grisea, F. oxys-
porum e F. solani, não foi observada a for-
mação do halo de inibição de crescimento.
Nos resultados obtidos para germina-
ção dos conídios também não houve dife-
rença significativa (P<0,05) entre o contro-
le e os tratamentos com as proteínas Cry1Ab
e Cry1Ac sobre os fungos citados anterior-
mente. Batista-Junior et al. (2002) testaram
duas cepas: B. thuringiensis kurstaki HD1,
produtor do cristal com atividade insetici-
da e B. thuringiensis 407, mutante não pro-
dutor do cristal protéico, contra os fitopa-
tógenos F. solani, F. oxysporum e Colleto-
trichum sp., concluindo que a ausência dos
genes produtores do cristal protéico não
interferiram no poder de degradação do
micélio pelos isolados de B. thuringiensis
estudados.
O efeito inibitório das cepas de B. thu-
ringiensis nas estirpes dos fungos fitopato-
gênicos pode estar relacionado com a pro-
dução de enzimas que podem ter ação con-
tra a parede celular fúngica, já que algu-
mas bactérias antagonistas de fungos fito-
patogênicos produzem quitinases (Asaka e
Shoda, 1996; Mavingui e Heulin, 1994).
Nesse contexto, Barboza-Corona et al.
(1999) selecionaram e caracterizaram enzi-
mas (quitinases) de B. thuringiensis nati-
vos do México, concluindo que a ação si-
nérgica entre quitinases e proteínas Cry
podem ser aplicadas no controle biológico
de fitopatógenos.
Diferentes tipos de fungos e bactérias
produzem uma grande variedade de enzi-
mas degradantes (Mauch et al., 1988). Sen-
do assim, B. thuringiensis é uma bactéria
que secreta quitinases em meios de cultura
quando cultivada em meio com sais e qui-
tina (Barboza-Corona et al., 2003). Alguns
estudos sugerem que as quitinases de B.
thuringiensis possuem potencial biotecno-
lógico contra fungos fitopatogênicos (Es-
cudero-Abarca et al., 2001; Reyes-Ramírez
et al., 2004).
La Vega et al. (2006) testaram à enzima
quitinase, purificada de B. thuringiensis
aizawai, a qual produz 66 kDa quitinase
extracelular, nos fungos Fusarium sp. e S.
rolfsii. Os fitopatógenos foram incubados
com a enzima purificada por 120h, demons-
trando que os valores de inibição do cres-
cimento de S. rolfsii e Fusarium sp. foram
superiores e estatisticamente diferentes do
controle (11 e 24%, respectivamente). Os
mesmos autores não encontraram diferen-
ças significativas no crescimento com a
enzima purificada, em comparação com o
extrato bruto enzimático. Melent’ev et al.
(2001) testaram o extrato bruto e purifica-
do de quitinase de Bacillus sp. e descobri-
ram que a enzima purificada perdeu a sua
capacidade de inibir o crescimento de Fu-
sarium oxysporum e Helminthosporium
sativum. No entanto, há relatos de que al-
gumas cepas bacterianas apresentam uma
relação direta entre as suas habilidades para
52 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
reprimir o crescimento de fungos fitopato-
gênicos e para produzir quitinases (Inbar e
Chet, 1991).
Resmuska e Pria (2007) avaliaram o efei-
to dos agentes antagonistas B. thuringien-
sis e Trichoderma sp. no crescimento mi-
celial, sobre os fungos fitopatogênicos: Scle-
rotium rolfsii, Diaporthe phaseolorum,
Pythium aphanidermatum., Monilinia
fructicola, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoc-
tonia solani. Verificaram que a bactéria B.
thuringiensis mostrou-se eficiente no con-
trole de M. fructicola, S. sclerotiorum, F.
solani. e S. rolfsii, impedindo que o fungo
S. sclerotiorum formasse escleródios. O fun-
go Trichoderma sp., exerceu efeito no cres-
cimento micelial do fungo S. rolfsii. B. thu-
ringiensis mostrou-se mais eficiente que
Trichoderma sp. no controle biológico dos
fitopatógenos D. phaseolorum, P. aphani-
dermatum, M. fructicola, S. sclerotiorum,
R. solani e F. solani.
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53
 TOXICIDADE DE BACILLUS THURINGIENSIS
Pesquisa EM ORGANISMOS NÃO-ALVO
Andresa Patrícia Regert Lucho Emerson Luiz Nunes Costa
Engenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em Engenheiro Agrônomo (UFRGS) e Mestre e Doutor em
Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS)
(UNISINOS). nidae, Ichneumonidae e Tachinidae ocor-
Lidia Mariana Fiuza reu em lagartas recapturadas em plantas não
Diouneia Lisiane Berlitz Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia –
tratadas, mantidas em condições de telado.
Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em Das lagartas coletadas em áreas tratadas com
(UNISINOS). biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier). o bioinseticida, tanto em telado quanto a
campo, não foi observada emergência de
parasitóides.
Já Costa (2007), durante dois anos agrí-
colas, avaliou o efeito de inseticidas sobre
entomopatógeno B. thuringi- lógico. No caso do parasitóide, não foram os inimigos naturais de insetos-praga, por
ensis tem elevada especifici- verificadas alterações nas características bi- meio da quantificação de grupos taxonô-
dade, porém para uma utili- ológicas dos seus descendentes emergidos micos de inimigos naturais presentes antes
zação segura são necessários de lagartas infectadas com B. thuringiensis. e após a aplicação de produtos químicos e
ensaios toxicológicos com di- Segundo Stevenson & Walters (1983), biológicos em lavoura de arroz irrigado.
ferentes organismos não-alvo, embora a toxicidade de inseticidas possa Nesse estudo foram avaliados seis tratamen-
sendo nesse trabalho apresentados dados ser avaliada em condições de laboratório, tos (quatro inseticidas químicos sintéticos,
referentes à toxicidade aos inimigos natu- só é possível medir o efeito real do pestici- um inseticida à base de B. thuringiensis ai-
rais, especialmente aos parasitóides e pre- da em condições de campo, onde ocorrem zawai e testemunha sem inseticidas) e cin-
dadores de insetos, assim como às aves e as situações naturais de abrigo, proteção, co épocas de amostragem realizadas com
aos mamíferos. alternativas de escape, alimentação e sobre- rede de varredura do florescimento ao en-
vivência das espécies. Esses autores tam- chimento de grãos (prévia e aos 2, 7, 14 e
1.1 Efeitos de B. thuringiensis sobre bém destacam que as condições meteoro- 21 dias após a aplicação dos tratamentos -
predadores e parasitóides lógicas, o comportamento e o ciclo de vida DAT). Entre os inimigos naturais coletados
de cada espécie e a dose aplicada são fato- foram considerados oito subgrupos: ara-
Os inimigos naturais dos insetos são res que influenciam a toxicidade dos inse- nhas, micro-himenópteros, coleópteros,
de suma importância, pois, além de de- ticidas. odonatos, dermápteros, neurópteros, díp-
senvolverem seu papel ecológico de pre- Lucho (2004) avaliou a emergência de teros e hemípteros. No primeiro ano do
dação ou parasitismo, podem ser associa- parasitóides em lagartas de S. frugiperda estudo não foram observados efeitos signi-
dos aos métodos alternativos de controle recapturadas em arroz irrigado com e sem ficativos dos inseticidas sobre os inimigos
de pragas-alvo, através de criação massal tratamento de B. thuringiensis aizawai em naturais. No segundo ano, o inseticida lam-
em laboratórios (Gallo et al., 2002). O uso condições de telado e a campo. A emer- bdacialotrina reduziu o total de inimigos na-
de inseticidas pode causar danos diretos e gência de parasitóides das famílias Braco- turais coletados aos 2DAT. O número de
indiretos ao controle biológico natural, ao
causar a mortalidade de insetos benéficos
ou reduzir sua fonte alimentar pela morta-
lidade de insetos-praga (Shepard et al.,
1987; Wick & Freier, 2000; Berti Filho &
Ciociola, 2002). Por isso, o uso de bioinse-
ticidas que controlam as pragas com baixo
impacto sobre organismos benéficos deve
ser incentivado (Fragoso et al., 2001; De-
grande et al., 2002).
Nesse sentido, Dequech et al. (2005)
estudaram a interação entre o parasitóide
Campoletis flavicincta e B. thuringiensis
aizawai em lagartas de Spodoptera frugi-
perda em condições de laboratório. Os
autores avaliaram o consumo alimentar e
a mortalidade de lagartas parasitadas, in-
fectadas pela bactéria, e parasitadas e in-
fectadas, além da biologia dos parasitói-
des emergidos a partir de lagartas infecta-
das e não infectadas pela bactéria. O me-
nor consumo foliar e a maior taxa de mor-
talidade foram observados em lagartas afe-
tadas pelos dois agentes de controle bio-

54 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38


Figura 1. Mortalidade de camundongos CF1 submetidos aos tratamentos
intraperitoneais com Bacillus thuringiensis, ( Susp. = suspensão contendo células
e esporos; Sob. = sobrenadante da cultura; Prot. = proteína purificada; Test. =
testemunha tratada somente com água; Número total de indivíduos = 15 por
tratamento)
coleópteros predadores, representados em
sua maioria por Coccinellidade (“joani-
nhas”), foi reduzido significativamente aos
2DAT por lambdacialotrina, carbaril, mala-
tiona e imidacloprido. Nos dois anos do
estudo não foi observado efeito significati-
vo de B. thuringiensis sobre o número de
inimigos naturais coletados após a aplica-
ção do bioinseticida.
Em outra pesquisa, Nascimento et al.
(1998) avaliaram o efeito de B. thuringien-
sis kurstaki sobre o predador de lagartas de
lepidópteros, Podisus nigrispinus, em labo-
ratório. Em seus resultados, não foi obser-
vada a presença de esporos ou células ve-
getativas do entomopatógeno na hemolin-
fa do predador, apenas no intestino médio
e nas fezes. Os autores relatam que, em la-
boratório, são utilizadas altas dosagens de
biopesticida e oferecido apenas uma alter-
nativa alimentar e que, em campo, o pre-
dador tem alternativas de alimentação, não
dependendo somente de uma presa infec-
tada.
Além dos produtos formulados a base
de B. thuringiensis, atualmente as pesqui-
sas na área biotecnológica visam a transfor-
mação genética de plantas com os genes
cry de B. thuringiensis para conferir a re-
sistência dessas plantas aos insetos-praga.
Plantas de milho, algodão e batata transgê-
nicos têm sido comercializados (Shelton et
al. 2002), porém, os dados de O’Callaghan
et al. (2005) revelam que não foram detec-
tados efeitos dessas plantas em insetos be-
néficos, como polinizadores e inimigos na-
turais.
Nesse contexto, Romeis et al. (2008)
relatam que dados como a descrição da
cultivar, as características moleculares dos
elementos genéticos inseridos na planta, a
natureza e a estabilidade da expressão pro-
téica, o espectro de ação das proteínas, a
composição de macro e micronutrientes e
as características morfológicas e agronômi-
cas da planta, são exigidos pelas autorida-
des para a regulamentação dessas plantas.
Os autores mostram que o milho modifica-
do com o gene expressando a proteína Cry
1Ab de B. thurigniensis, ativa a insetos da
ordem Lepidoptera, não afeta insetos de
outras ordens. Ou seja, as proteínas de B.
thuringiensis são altamente específicas, não
atingindo artrópodes não alvos.
Na revisão de Fontes et al.(2002) são
discutidos princípios e questões ecológicas,
impacto ambiental e efeitos de plantas ge-
neticamente modificadas no ambiente. Em
relação aos inimigos naturais, os autores
relatam a existência de fatores importantes
em relação às plantas, como o ciclo de vida
(anual ou perene) que difere na composi-
ção das comunidades de artrópodes asso-
ciados a essas plantas. Dos 41 trabalhos ava-
liados pelos autores, 20 foram conduzidos
em laboratório e desses, 14 não mostraram
efeito sobre inimigos naturais, quando uti-
lizadas plantas modificadas e não modifi-
cadas. No restante (6 trabalhos) não foram
observados efeitos em alguns inimigos na-
turais. E em 14 de 21 trabalhos avaliados
em campo, os autores não mostraram dife-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
rença na densidade de inimigos naturais
entre áreas com plantas-Bt e plantas não
transgênicas. Porém, nos 7 casos restantes
ocorreu um decréscimo nessa densidade.
No trabalho de Chen et al. (2008) fo-
ram avaliados os efeitos diretos e indire-
tos da proteína Cry1Ac de B. thuringiensis
que está presente em plantas transgênicas
de milho e algodão, sobre o parasitóide
da lagarta Plutella xilostella, Diadegma
insulare. Os autores utilizaram a planta
transgênica e a proteína proveniente de
uma formulação líquida comercial (MC),
em três tratamentos: a proteína purificada,
o produto comercial e a planta transgêni-
ca. Também avaliaram o efeito de insetici-
das a base de spinosad, indoxacarb, lamb-
da-cialotrina e cipermetrina. Em seus re-
sultados, observaram que, mais de 90% das
lagartas foram parasitadas após a ingestão
dos tratamentos, indicando que esses não
influenciam o parasitismo. Porém, o nú-
mero de D. insulare emergidos das lagar-
tas, diferiu entre o controle e o grupo tra-
tado com a formulação comercial, mas não
diferiu entre o controle e as lagartas trata-
das com a planta expressando a proteína
Cry 1Ac ou somente com a proteína puri-
ficada.
Os autores citados também demons-
traram que o parasitóide D. isulare foi al-
tamente suscetível aos inseticidas comu-
mente utilizados para o controle das la-
gartas de P. xylostella, ocorrendo a morte
dos mesmos após duas horas de contato.
Sendo assim, os inseticidas usados afetam
as populações do parasitóide e, conse-
qüentemente aumentam as populações do
inseto praga-alvo, no caso, P. xylostella.
Estudo semelhante foi realizado por
Torres & Ruberson (2008) com a mesma
proteína expressa em plantas de algodão.
Os resultados desse estudo mostraram que
a proteína foi detectada em três níveis tró-
ficos avaliados, porém, os insetos preda-
dores e parasitas das lagartas de S. exigua
não foram afetados quando as lagartas for-
ma alimentadas com algodão transgênico.
Um caso bem polêmico entre a comu-
nidade científica, foi o trabalho de Losley
et al. (1999) que mostrou que o milho ge-
neticamente modificado com a proteína
Cry1Ab de B. thuringiensis, afetou severa-
mente a população da borboleta monar-
ca, Danaus plexippus. Em seu trabalho foi
comparado a alimentação, o crescimento
e a mortalidade de lagartas que se alimen-
tavam de plantas com pólen Bt, com pó-
len de milho não modificado e plantas sem
pólen. O resultado apresentou sobrevivên-
cia de 56% com milho-Bt e 100% de so-
brevivência com pólen normal e sem pó-
len.
Entretanto novas pesquisas foram rea-
lizadas posteriormente como Stanley-Horn,
et al. (2001) que avaliou 6 híbridos de B.
thuringiensis em quatro cidades diferen-
tes (EUA) divididos em duas etapas (na
borda e na parte interna das lavouras) fren-
te à D. plexippus. As conclusões dos auto-
55
 res fornecem evidências de que a quanti-
dade de pólen e a expressão de Cry1Ab no
pólen predizem um impacto na alimenta-
ção das lagartas da monarca, porém isso
ocorre em lagartas do 1º instar, sendo que
não ocorrem diferenças significativas da so-
brevivência da monarca nas regiões com
milho-Bt e milho não transgênico. Além
disso, os autores identificaram a mortalida-
de de lagartas poucas horas após a alimen-
tação em áreas com milho não transgênico
pulverizados com λ-cialotrina. A sobrevivên-
cia e o crescimento foram afetados também
em áreas próximas ao local. Entretanto pes-
quisas devem continuar sendo realizadas
para entender o impacto do milho não trans-
gênico sendo que é relativamente de baixa
toxicidade a borboletas monarca.
Apesar desses dados o conhecimento a
respeito da influência de novas tecnologias
seja para a produção de biopesticidas ou
para a transgenia, ainda são carentes de
informação. Entretanto, os estudos realiza-
dos até então indicam que efeitos nocivos
em organismos não-alvo verificados em la-
boratório são raramente detectados no am-
biente, provavelmente porque a quantida-
de de produto utilizada em laboratório é
superior àquela utilizada e recomendada em
campo.
1.2 Efeitos de
B. thuringiensis sobre aves
Um grupo de predadores de lagartas,
os pássaros, também deve ser avaliado em
relação ao uso de biopesticidas ou plantas
geneticamente modificadas. Porém existem
poucos dados na literatura a respeito desse
assunto. Os autores Sopuck et al. (2002)
relatam a utilização do produto comercial
Foray 48B a base de B. thuringiensis. kurs-
taki, para o controle de Lymantria dispar e
avaliaram a resposta de pássaros associa-
dos ao sul da Ilha de Vancouver, no Cana-
dá. Em seus resultados não observaram di-
ferença na abundância relativa de pássaros
nas áreas tratadas e não tratadas com o bi-
opesticida, entre os anos de 1999 e 2000,
indicando que o tratamento não influencia
na presença dos mesmos.
Já Norton et al. (2001) avaliaram o efei-
to secundário da mesma subespécie de B.
thuringiensis citada acima porém proveni-
ente do produto Thuricide, em aves da es-
pécie Dendragapus canadensis. Os auto-
res citam essa ave como um herbívoro pri-
mário, porém os pintos, em suas primeiras
duas semanas de vida, são essencialmente
insetívoros. Lattner (1982) descreve a ali-
mentação dessa ave como sendo cerca de
64% de lagartas, seguido de gafanhotos
(10%), formigas (7%) e outras variedades
de invertebrados e partes de plantas. O tra-
balho de Norton et al. (2001) teve como
objetivo avaliar os itens da dieta e o cresci-
mento de D. canadensis em áreas tratadas
e não tratadas com B. thuringiensis kurs-
taki. Os resultados indicam que o cresci-
mento dos pintos foi afetado em relação às
56 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
duas áreas, ocorrendo uma redução de 30%
no tamanho desses na área tratada com a
bactéria. Porém esses dados podem estar
relacionado ao fato de que, com a morte
das lagartas devido à ingestão do patóge-
no, os pintos passaram a se alimentar prin-
cipalmente de formigas e estas tem um bai-
xo índice de proteínas em comparação com
às lagartas. Isso pode ser determinante para
o decréscimo no tamanho dos pintos, uma
vez que a dieta alimentar teve seu teor de
proteínas também reduzido.
1.3 Efeitos de B. thuringiensis
sobre mamíferos
Pequenos mamíferos, como ratos e ca-
mundongos, também estão associados às
áreas agrícolas uma vez que esses animais
podem se alimentar dos grãos das culturas.
Então também existem pesquisas que ava-
liam o possível efeito do entomopatógeno
nesses mamíferos, sendo que a bactéria tam-
bém pode produzir toxinas ativas a esses
animais.
Na área da saúde, os trabalhos de Pra-
sad & Shethna (1975) sugerem que as pro-
teínas de B. thuringiensis têm atividade
antitumoral em sarcoma Yoshida em ratos,
além de acentuarem a resposta imune de
ovelhas. Yamashita et al. (2000), também
demonstram efeito citocida em células de
leucemia, em ensaios in vitro.
Em relação a humanos, a revisão de Si-
egel (2001) apresenta dados em que o pro-
duto Thuricide (B. thuringiensis thuringi-
ensis) foi ingerido (100mg) e inalado
(100mg) por 18 pessoas, durante 5 dias, e
esses não apresentaram nenhuma reação
decorrente do microrganismo. Além dessa
reportagem, o trabalho apresenta alguns
dados sobre isolados de B. thuringiensis que
foram re-isolados de queimaduras ou feri-
das de pessoas, entretanto foi averiguado
que a água utilizada para a limpeza desses
ferimentos estava contaminada. Além dis-
so, o autor relata que o isolado pode se
desenvolver nesses locais feridos quando o
sistema imune não está respondendo de
forma adequada ao ferimento, mas não cau-
sa nenhuma reação.
Betz et al. (2000) relatam que B. thu-
ringiensis kurstaki foi administrado em hu-
manos voluntários durante 3 dias, na quan-
tidade de 1000mg/pessoa ou 1x1010 espo-
ros/mL, e não apresentaram sintomas de
toxicidade, nem culturas de células bacteri-
anas nas amostras de sangue avaliadas. Os
autores relatam a presença das proteínas Cry
1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry 2Aa no isolado
testado.
Diferentes autores relatam os resultados
de suas pesquisas com ratos tratados com
B. thuringiensis. No caso de Bishop et al.
(1999), a aplicação oral de 5.1010 esporos/
dia de B. thuringiensis thuringiensis e B.
thuringiensis israelensis, em ratos não mos-
trou diferença significativa no peso corpo-
ral dos animais tratados e não tratados. Nos
dados de Siegel (2001), ratos foram trata-
dos via oral com 109 esporos/dia, por 730
dias, também não apresentaram nenhuma
reação.
Também em ensaios toxicológicos, Ber-
litz et al. (2006) avaliaram o efeito da sus-
pensão de células e esporos de B. thuringi-
ensis aizawai proveniente do produto co-
mercial Xentari e B. thuringiensis thuringi-
ensis (H1), em ratos Wistar. Os autores ava-
liaram o conteúdo estomacal e as fezes em
SDS-PAGE, onde os resultados sugerem que
as proteínas são degradadas no estômago
dos animais. Os estômagos foram avaliados
em estereomicroscópio (40x) não apresen-
tando modificações superficiais, como pi-
pocas vermelhas ou raias hemorrágicas, em
relação ao grupo controle. Os autores con-
cluíram que as proteínas de B. thuringien-
sis não afetam os ratos quando administra-
das oralmente.
Em outra pesquisa, Berlitz (2006) ava-
liou a suspensão e as proteínas purificadas
de dois novos isolados bacterianos, em ca-
mundongos CF1, via oral e intraperitoneal,
divididos em grupos de 5 animais e três re-
petições. Os dados dos tratamentos, via oral,
não causaram mortalidade dos camundon-
gos, porém nas administrações intraperito-
neais os camundongos morreram a partir
de 6horas após a aplicação dos tratamen-
tos, quando aplicada a suspensão bacteria-
na contendo células e esporos (Figura 1).
Apesar desses resultados, deve-se sali-
entar que injeções intraperitoneais não são
uma via de acesso natural do entomopató-
geno nos mamíferos. Essa mortalidade tam-
bém não deve estar associada à thuringien-
sina, uma proteína tóxica a vertebrados que
é produzida pelo entomopatógeno, pois
essa toxina está presente no sobrenadante
da cultura, e esse tratamento não causou a
mortalidade dos animais.
O tratamento via oral, não causou rea-
ções nos camundongos. Nesse sentido, Betz
et al. (2000) revelam que as proteínas Cry1,
Cry2 e Cry3 são degradadas em 30 segun-
dos após a ingestão, em ensaios in vitro,
resultando em proteínas de 2 kDa. Também,
os dados de Vasquez-Padrón et al. (2000) e
Moreno-Fierros et al. (2000) revelaram que
camundongos Balb/c apresentaram eleva-
da produção de anticorpos IgA, seguidos
de IgG e IgM, após a administração oral,
retal e intraperitoneal da proteína Cry1Ac,
mostrando uma eficiente resposta imune
desses animais.
Como já comentado anteriormente, as
preocupações têm sido em torno dos efei-
tos das plantas geneticamente modificadas
com genes de B. thuringiensis em seus con-
sumidores. Porém, Azevedo & Araújo (2003)
mostram a ausência de efeitos tóxicos, mu-
tagênicos, teratogênicos ou clastogênicos
dessas plantas. Betz et al. (2000) também
relatam que as proteínas Cry de B. thurin-
giensis não são tóxicas em contato direto,
sendo que a exposição de animais não-alvo
é extremamente baixa e a presença dessas
proteínas nos tecidos vegetais também ocor-
re em baixas concentrações. Romeis et al.
(2008) também comentam que os testes la-
boratoriais utilizando essas plantas, são con-
duzidos com elevadas concentrações da
proteína purificada, muito acima daquelas
concentrações encontradas nos tecidos das
plantas.
Apesar desses dados, periodicamente
estão sendo lançados produtos comerciais
à base de B. thuringiensis e que, para che-
garem ao mercado devem passar por dife-
rentes análises para confirmar a não toxici-
dade em organismos não-alvo. O mesmo
ocorre com as plantas geneticamente mo-
dificadas que são testadas em diferentes
organismos para garantir a sua segurança.
Nesse sentido, a Lei de Biossegurança nº
11.105, estabelece as normas de segurança
e os mecanismos de fiscalização de ativida-
des que envolvam organismos geneticamen-
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57
 PRODUTOS DE BACILLUS THURINGIENSIS:
Pesquisa REGISTRO E COMERCIALIZAÇÃO
Lidia Mariana Fiúza
Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre
em Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),
Doutora em Ciências Agronômicas
(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em
biotecnologia Vegetal (CIRAD-
Montpellier).
Diounéia Liziane Berlitz
Bióloga (UNISINOS) e Mestre em
Biologia: Diversidade e Manejo de Vida
Silvestre (UNISINOS).
58 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
onsiderando os biopestici-
das, aqui serão apresenta-
dos aspectos básicos rela-
cionados às avaliações to-
xicológicas dos produtos
formulados à base de B. thuringien-
sis, assim como os procedimentos re-
lacionados ao registro desses produ-
tos comerciais, os quais seguem a lei
base dos agrotóxicos.
Atualmente aproximadamente 98%
dos biopesticidas, utilizados na agri-
cultura e na saúde, correspondem às
formulações de B. thuringiensis (Sch-
nepf et al., 1998; Polanczyk, 2003).
No início desse milênio as vendas
desses produtos foram de aproxima-
damente US$ 2 milhões. Em alguns
países, como no Brasil, o acesso a es-
ses produtos ainda é limitado, pois os
custos das formulações são elevados
e as multinacionais que os comerci-
alizam não mantém uma distribuição
regular nas diferentes regiões do país.
Além desses problemas soma-se a
baixa persistência de alguns produ-
tos e a falta de informações dos pro-
dutores sobre o potencial e as vanta-
gens dos biopesticidas.
No Brasil, a prospecção de ento-
mopatógenos bacterianos é realizada
em laboratórios de pesquisa ligados à
agricultura e saúde pública, como:
Embrapa, Fiocruz, Universidades Pú-
blicas e Privadas. Essas mesmas insti-
tuições têm desenvolvido os produ-
tos ou efetuado convênio com Em-
presas Particulares. Os registros dos
produtos à base de B. thuringiensis
seguem basicamente as mesmas re-
gras dos químicos sintéticos, cujos
órgãos federais responsáveis pela ava-
liação e registro são Ministério da Agri-
cultura, Pecuária e Abastecimento
(MAPA), Agência Nacional de Vigilân-
cia Sanitária (ANVISA) e Instituto Bra-
sileiro do Meio Ambiente e dos Re-
cursos Naturais Renováveis (IBAMA),
os quais prometem no atual contexto
priorizar os biopesticidas em relação
aos agrotóxicos convencionais, facili-
tando assim o registro dos produtos
comprovadamente menos agressivos
aos organismos não-alvo e ao ambi-
ente.
1.1 Legislação e Registro
de produtos
A utilização de biopesticidas, as-
sim como dos demais agrotóxicos ba-
seia-se na relação “riscos x benefíci-
os” que requer ensaios, os quais reve-
lam a segurança ao homem e ao meio
ambiente. Sendo assim, a legislação
deve assegurar a sociedade que o bi-
opesticida autorizado para comercia-
lização e aplicação no controle bioló-
gico foi adequadamente avaliado
quanto aos parâmetros agronômicos,
saúde pública e meio ambiente (Mea-
dows, 1993; Alves, 1998; Gallo et al.,
2002).
O registro de produtos à base de
B. thuringiensis segue a “Lei dos Agro-
tóxicos”, cuja legislação básica é a Lei
n. 7.802 de 11 de julho de 1989, onde
os produtos são avaliados pelo Minis-
tério da Agricultura e Ministério da
Saúde quanto aos seguintes aspectos:
 Tabela 1. Produtos comerciais de Bacillus thuringiensis para controle de pragas agrícolas

Produtos Empresas B. thuringiensis (Bt) Insetos-alvo

Dipel Abbott Bt kurstaki lepidópteros
Thuricide Sandoz Bt kurstaki lepidópteros
Agree Mitsui Bt aizawai lepidopteros
Bactur Milenia Agrociências Bt kurstaki lepidópteros
Ecotech Pro Bayer Bt kurstaki lepidópteros
Bactospeine Solvay Bt kurstaki lepidópteros
Javelin Sandoz Bt kurstaki lepidópteros
Foray Novo-Nordisk Bt kurstaki lepidópteros
Biobit Novo-Nodisk Bt kurstaki lepidópteros
Foil/Condor Ecogen Bt kurstaki lepidópteros
Delfin Sandoz Bt kurstaki lepidópteros
Cutlass Ecogen Bt kurstaki lepidópteros
Larvo Bt Fermone Bt kurstaki lepidópteros
Nubilacid Radonja Bt kurstaki lepidópteros
MVP Mycogen Bt kurstaki lepidópteros
Bac-control Agricontrol Bt kurstaki lepidópteros
XenTari Abbott Bt aizawai lepidópteros
M-One Mycogen Bt san diego Bt tenebrionis coleópteros
Di-Terra Abbott Bt san diego Bt tenebrionis coleópteros
Trident Sandoz Bt san diego Bt tenebrionis coleópteros
Novodor Novo Nordisk Bt san diego Bt tenebrionis coleópteros
M-One Plus Mycogen Bt san diego Bt tenebrionis (empacotadas) coleópteros
Foil Ecogen Bt (recombinante) coleópteros

pesquisas; experimentação; produção;
embalagem e rotulagem; transporte; ar-
mazenamento; comercialização; propa-
ganda comercial; utilização; importação;
exportação; destino final de resíduos e
embalagens; registro; classificação; con-
trole; inspeção e fiscalização de produ-
tos.
A “Lei dos Agrotóxicos” foi regula-
mentada pelos Decretos n. 98.816, de
11 de janeiro de 1990 e Dec. 4.074 de
04 de janeiro de 2002, sendo que atual-
mente para registro de um biopesticida
no Brasil estão envolvidos os seguintes
ministérios:
• MAPA: avaliação dos aspectos
agronômicos.
• ANVISA: avaliação da toxicolo-
gia ao homem, incluindo as aná-
lises de resíduos em alimentos.
• IBAMA: avaliação das interações
dos agrotóxicos com o meio am-
biente e seus componentes bióti-
cos.
Ao Ministério da Agricultura com-
petem basicamente as determinações
sobre as pragas a serem controladas,
assim como as dosagens e o número
de aplicações dos produtos, cujos da-
dos podem ser consultados no Compên-
dio de Defensivos Agrícolas (Andrei,
1999) e o seu complemento editado em
2003.
O Ministério da Saúde baseia-se 26
ensaios de exposição aguda em animais
de laboratório, cujos dados são extra-
polados para o homem, estabelecendo
assim 4 Classes Toxicológicas aos agro-
tóxicos:
• Classe I - Extremamente tóxi-
cos - rotulagem vermelha
• Classe II – Altamente tóxico -
rotulagem amarela
• Classe III – Moderadamente tó-
xico – rotulagem azul - Bt
• Classe IV – Pouco tóxico – ro-
tulagem verde - Bt
No caso das formulações de B. thu-
ringiensis, essas se encontram predo-
minantemente distribuídas entre as clas-
ses III e IV, as quais se classificam como
moderadamente ou pouco tóxicas. Es-
sas classes toxicológicas referem-se sem-
pre a manipulação dos produtos pelos
fabricantes, transportadores, aplicado-
res e outros.
Também compete a ANVISA o esta-
belecimento de “tolerância” que se re-
fere aos limites máximos dos resíduos,
os quais são avaliados em estudos de
exposição subcrônica e crônica e da-
dos desses resíduos nos produtos agrí-
colas. Junto ao MAPA são determina-
dos os “períodos de carência” dos pro-
dutos, que fazem referência ao interva-
lo de segurança.
O Ministério do Meio Ambiente re-
quer 20 ensaios ecotoxicológicos, 36
estudos de características físico-quími-
cas, 4 testes de metabolismo e degra-
dação. Em seguida o produto é classifi-
cado quanto ao seu potencial de peri-
culosidade no meio ambiente:
• Classe I – Produto altamente
perigoso
• Classe II – Produto muito peri-
goso
• Classe III – Produto perigoso -
Bt
• Classe IV – Produto pouco pe-
rigoso - Bt
Como anteriormente, nesse caso os
produtos de B. thuringiensis se enqua-
dram como perigosos ou pouco peri-
gosos ao meio ambiente. Os dados que
competem ao IBAMA envolvem os as-
pectos: físico-químicos que revelam a
identidade da molécula do biopestici-
da; ecotoxicológicos que englobam es-
tudos com organismos não alvos (abe-
lhas, minhocas, microcrustáceos, peixes,
aves, microrganismos do solo e outros);
comportamento no meio ambiente que

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 59

 avalia a lixiviação, mobilidade no
solo e bioconcentração nas cadeias
tróficas, entre outros.
Nos estudos toxicológicos dos bi-
opesticidas podem ser avaliados so-
mente o ingrediente ativo ou a for-
mulação que se deseja registrar, po-
dendo ambas as formas serem avali-
adas simultaneamente. Após as aná-
lises requeridas pela ANVISA e IBA-
MA, é o MAPA quem registra a for-
mulação do produto, publicando a
decisão no Diário Oficial da União,
com validade nacional e tempo in-
determinado (Gallo et al.,2002).
1.2 Produtos comerciais
à base de B. thuringiensis
Entre os biopesticidas, a base de
B. thuringiensis (Entwistle et al, 1993;
Schnepf et al., 1998), apresentados
na Tabela 1, alguns se destacam no
controle biológico de pragas agríco-
las por serem utilizados há várias
décadas, levando atualmente esse
entomopatógeno a quase totalidade
do mercado dos pesticidas microbia-
nos.
B. thuringiensis é um importante
agente de controle de insetos-praga,
principalmente para lepidópteros e
coleópteros, porque seu ingrediente
ativo tóxico, representado por pro-
teínas Cry, pode ser considerado ató-
xico aos vertebrados e aos insetos
não-alvo (Siegel, 2001). Por outro
lado, as formulações comerciais de
B. thuringiensis apresentam uma es-
tabilidade limitada a campo, além de
apresentarem um período de aplica-
ção crítico devido à redução da sus-
cetibilidade com o desenvolvimento
larval dos insetos.
Para complementar e manter atu-
alizadas essas informações recomen-
da-se a revisão de alguns sites que
indicados a seguir:
- www.andef.com.br (Associação
Nacional de Defesa)
- www.epa.gov (EPA – Environ-
mental Protection Agency)
- www.anvisa.gov.br
- www.ibama.gov.br
- www.agricultura.gov.br
- http: www. pesticide.net
- http://pesticideinfo.org
- http://foodchemicalnews.com
- http://www.cnpma.embrapa.br
Quanto às formulações de B. thu-
ringiensis israelensis e comercializa-
60 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
ção em escala mundial contra dípteros,
especialmente os vetores de doenças
humanas como Aedes aegypti, destacam-
se os seguintes produtos (Thomas e
Ellar, 1983; Armstrong et al., 1985; Thi-
ery et al., 1996; Andrade, 2008):
• Vectobac, Skeetal, Bactimos
(Abbot)
• Teknar (Sandoz)
• Aquabac (Becker Microbials)
• LarvX SG (Meridian Precision
Realease Technologies)
• Biotouch (Zohar Dalia)
• Culinex (Culinex Gmbh)
• Bacticide( Biotech International
Ltd)
• Bactivec (Labiofam)
• Bt Horus SC (Bthek) (http://
www.bthek.com.br)
Os mesmos autores também menci-
onam algumas formulações comerciais
de B. sphaericus para o controle de lar-
vas de Culex pipiens, como:
• Spherimos e Vectolex (Abbot)
• Sphericide (Biotech Internatio-
nal Ltda)
• Spicbiomoss (Turicorin Alkali
Chemicals and Fertilisers Ltda).
Apesar de haver um número signifi-
cativo de produtos à base de B. thurin-
giensis, ainda há um longo percurso
para que sejam atingidas a maioria das
ordens de insetos-praga de importân-
cia agrícola e vetores de doenças hu-
manas. Enquanto mais pesquisas vêm
sendo desenvolvidas nessa área, devem
ser priorizados os biopesticidas já re-
gistrados e comercializados para o con-
trole de insetos a fim de reduzir a con-
taminação ambiental causada pelos in-
seticidas químicos.
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 PLANTAS TRANSGÊNICAS QUE SINTETIZAM
PLANTAS
Pesquisa
TOXINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS E OUTRAS

Lidia Mariana Fiúza Laura Massochin Nunes Pinto

Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia – Bióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda em
Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia (UNISINOS).
Vegetal (CIRAD-Montpellier).

o contexto das aplicações
biotecnológicas do ento-
mopatógeno B. thuringi-
ensis, aqui se encontram
dados bibliográficos sobre
a transformação genética
de plantas, com genes de
B. thuringiensis e outros, que conferem
resistência ou tolerância das plantas hos-
pedeiras aos insetos-praga. As espécies ve-
getais apresentam naturalmente uma re-
sistência aos insetos fitófagos, diferenci-
ando assim os grupos de pragas em fun-
ção das plantas hospedeiras. A resistên-
cia vegetal está baseada em vários meca-
nismos de defesa, incluindo uma gama
de metabólitos secundários nocivos pro-
duzidos pelas plantas. A biotecnologia ve-
getal, através do desenvolvimento de téc-
nicas de biologia celular e molecular de
vegetais superiores oferece novas possi-
bilidades ao melhoramento de plantas cul-
tivadas, facilitando a obtenção de plantas
resistentes ao ataque dos insetos. A trans-
formação genética e a regeneração in vi-
tro de plantas, somadas à disponibiliza-
ção de genes de interesse agronômico,
destinados a introdução em plantas, têm
permitido a geração de plantas transgêni-
cas com características específicas, sem o
rompimento de combinações genéticas já
selecionadas pelos programas convenci-
onais de melhoramento genético de plan-
tas cultivadas. A transformação de plan-
tas com genes de origem microbiana, ve-
getal e animal, os quais codificam especi-
ficamente toxinas com efeito inseticida,
62 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
vem sendo considerada uma alternativa re-
levante junto aos métodos de controle de
insetos-praga das plantas de interesse eco-
nômico, onde se destacam as plantas-Bt
resistentes a diversas ordens de insetos,
principalmente aos lepidópteros e coleóp-
teros.
1.1 Genes de
B. thuringiensis em plantas
B. thuringiensis apresenta um geno-
ma de 2,4 a 5,7 milhões de pares de ba-
ses, com elementos extracromossômicos
lineares ou circulares (Carlson et al., 1994).
Os genes cry estão localizados em plas-
mídios, sendo esses responsáveis pela sín-
tese de diferentes proteínas inseticidas,
cuja clonagem e caracterização desses
genes em 1981 (Schnepf & Whiteley, 1981)
revelou novas perspectivas de aplicação
do entomopatógeno. Entre essas se encon-
tra a transgenia que permite introduzir os
genes de B. thuringiensis codificadores das
toxinas nos genomas dos vegetais, permi-
tindo a expressão contínua das proteínas
em todos os tecidos da planta e atingin-
do, assim, apenas os insetos-praga que se
alimentam dos tecidos (de Maagd et al.,
1999). A primeira geração de plantas trans-
gênicas resistentes a insetos foi desenvol-
vida com o uso de genes codificadores de
proteínas inseticidas de B. thuringiensis
(Fischhoff, 1987; Vaeck et al., 1987).
Os genes cry de B. thuringiensis são
talvez os exemplos mais conhecidos de
genes exógenos para os quais tem sido
difícil obter um nível satis-
fatório de expressão em
plantas transgênicas (Diehn
et al.,1996). A baixa expres-
são dos genes de B. thurin-
giensis em plantas tem sido
associada à instabilidade
das moléculas de mRNA,
uma característica ampla-
mente observada da expres-
são destes genes em plan-
tas é o pouco ou nenhum
acúmulo de mRNA mesmo
quando sob controle de
promotores fortes. Para tan-
to várias modificações têm sido testadas
para aumentar a eficiência de expressão
destes genes, como adaptar os códons pre-
ferenciais de bactérias para códons prefe-
renciais de plantas e/ou aumentar o con-
teúdo de G/C nas seqüências codificantes
(Perlak et al., 1991), retirada de sítios de
splicing, modificações dos sinais de poli-
adenilação dentro da região codificante
(Koziel et al., 1993), inserção de íntrons
na região 5’ da seqüência não traduzida
(Jouanin et al., 1998) bem como a inser-
ção de genes nativos em cloroplastos ini-
cialmente restrita a tabaco (McBride et al.,
1995).
Genes parcialmente ou totalmente sin-
téticos têm sido construídos, nestes genes
a seqüência de nucleotídeo é modificada
sem a troca da seqüência de aminoácido,
a expressão destes genes em plantas au-
mentou significativamente (de menos de
0,001% de proteína solúvel na folha para
até 1%), sendo os genes totalmente sinté-
ticos os mais eficientes em testes de cam-
po (Jouanin et al., 1998).
Os estudos iniciais se basearam em
plantas como tabaco e tomate (Barton et
al., 1987; Fischhoff et al., 1987; Vaeck et
al., 1987) devido às facilidades de trans-
formação, cultivo em casa de vegetação e
crescimento rápido. Vários genes quimé-
ricos contendo um gene promotor de ori-
gem vegetal; a seqüência completa do gene
cry e uma região de poliadenilação foram
introduzidos em tabaco e tomate, porém
nenhuma expressão foi detectada em ta-
baco e níveis muito baixos foram obser-
vados em tomate (Perlak et al., 2001).
A truncagem da seqüência codificadora
do gene cry por eliminação da metade 3’
desta seqüência aumentou a expressão
para níveis detectáveis de proteína e mRNA
(Estruch et al., 1997). Os primeiros testes
de campo com versões truncadas do gene
cry foram eficientes no controle de Heli-
coverpa zea no caso do tomate (Perlak &
Fischhoff, 1993), porém não no controle
de Heliothis virescens no caso do algodão
(Jenkins et al., 1991). Os resultados mais
efetivos foram obtidos utilizando genes sin-
téticos (Perlak et al., 1990; Perlak et al.,
1991; Van der Salm et al., 1994).
Tabela 1. Genes de B. thuringiensis utilizados na engenharia genética de plantas

Plantas Genes Insetos-Alvo Referências

Álamo cry1Aa Lymantria dispar (L.) McCown et al. (1991)

cry3Aa Chrysomela tremulae F. Cornu et al. (1996)
Alfafa cry1Ca Spodoptera litoralis (Boiusduval) Sthrizhov et al. (1996)
Algodão cry1Ab Heliothis virescens, Helicoverpa zea Perlak et al. (1990)
cry1Ac e cry2Ab Spodoptera exigua, Pseudoplusia includens (Walker) Adamczyk et al. (2001)
cry1F e cry1Ac Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Pectinophora gossypiella, Estigmene EPA (2008)
acrea, Bucculatrix thurberiella, Pseudoplusia includens, Spodoptera
exigua, Spodoptera frugiperda, Spodoptera ornithogalli, Ostrinia
nubilalis
cry1Ab e Vip3Aa - EPA (2008)
cry1Ac lepidópteros USDA (2008)
Amendoim cry1Ac Elasmopalpus lignosellus Singsit et al. (1997)
Arroz cry1Aa Chilo suppressalis Breitler et al. (2004)
cry1Ab Cnaphalocrocis medinalis, Chilo suppressalis, Scirpophaga Shu et al. (2000), Ye et al. (2003), Wunn et al.
incertulas,Cnaphalocrocis medinalis, Herpitogramma licarisalis; (1996), Datta et al. (1998), Ghareyazie et al.
Sesamia inferens, Naranga anescens, Mycalesis gotama, Parnara (1997), Alam et al. (1998), Wu et al. (1997),
guttata. Husnain et al. (2002)
cry1Ac Chilo suppressalis, Nilaparrata lugens, Scirpophaga incertulas Loc et al. (2002), Khanna e Raina (2002),
Nayak et al. (1997), Han et al. (2007)
cry1Ab e cry1Ac Chilo suppressalis, Scirpophaga incertulas, Ostrinia nubilialis, Cheng et al. (1998), Ahmad et
Cnaphalocrocis medinalis al. (2002), Tu et al. (2000)
cry1B Chilo suppressalis Breitler et al. (2000 e 2001)
cry1C Scirpophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis Tang et al. (2006)
cry2A Scirpophaga incertulas,Cnaphalocrocis medinalis Maqbool et al. (1998), Chen et al. (2005)
Batata cry1Ab Phthorimaea operculella (Zeller) Peferoen et al. (1992), Rico et al. (1998)
cry1Ab Heliothis armigera (Hübner) Chakrabarti et al. (2000)
cry3Aa Leptinotarsa decemlineata Adang et al. (1993), Perlak et al. (1993),
Coombs et al. (2002)
Berinjela cry1Ab Leucinodes orbonalis Guenée Kumar et al. (1998)
cry3A Leptinotarsa decemlineata (Say) Jelenkovic et al. (1998)
cry3B Leptinotarsa decemlineata Iannacone et al. (1997)
Brócolis cry1C Plutella xylostella (L.) Zhao et al. (2001)
Canola cry1Ac Thrichoplusia ni (Hübner), Spodoptera exigua (Hübner), Heliothis Stewart et al. (1996b)
virescens (Fabr.), Helicoverpa zea (Boddie)
cry1Ac Plutella xylostella Halfhill et al. (2001)
Fumo cry1Aa Manduca sexta (L.) Barton et al. (1987)
cry1Ab Manduca sexta Vaeck et al. (1987)
cry1Ab e cpTI Manduca sexta Perlak et al. (1991)
cry1Ab Manduca sexta Williams et al. (1993)
cry1Ac Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Spodoptera littoralis McBride et al. (1995)
cry1C Spodoptera littoralis Strizhov et al. (1996)
cry2A Helicoverpa armigera, Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Spodoptera Selvapandiyan et al. (1998);
exigua Kota et al. (1999)
Milho cry1Ab Ostrinia nubilalis (Hübner) Koziel et al. (1993)
cry9c Ostrinia nubilalis Jansem et al. (1997)
cry1F Diatraea grandilosella, Ostrinia nubilalis EPA (2008)
cry1Ac Ostrinia nubilalis EPA (2008)
cry3Bb1 Diabrotica virgifera, Diabrotica barberi EPA (2008)
cry34Ab1 e cry35Ab1 Diabrotica virgifera EPA (2008)
cry1Ab1 e cry3Bb1 Ostrinia nubilalis, Diatraea grandiosella, Diatraea crambidoides, EPA (2008)
Diatraea saccharalis, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda,
Elasmopalpus lignosellus, Diabrotica virgifera, Diabrotica barberi
cry1F + cry34Ab1 e Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodoptera EPA (2008)
cry35Ab1 frugiperda, Elasmopalpus lignosellus, Diabrotica virgifera, Diabrotica
barberi, Diatraea crambidoides, Diatraea grandiosella, Diatraea
saccharalis, Striacosta albicosta
cry3A e cry1Ab Diabrotica virgifera, Diabrotica barberi EPA (2008)
cry1A e cry2Ab2 - EPA (2008)
cry1A + cry2Ab2 e - EPA (2008)
cry3Bb1
cry1Ac Ostrinia nubilalis USDA (2008)
cry3A Diabrotica virgifera, Diabrotica barberi USDA (2008)
Repolho cry1Ab Plutella xylostella Bhattacharya et al. (2002)
Soja cry1Ac Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Pseudoplusia includens Stewart et al. (1996a)
Tomate cry1Ab Heliothis virescens Fischolff et al. (1987)
cry1Ac Helicoverpa armigera Mandaokar et al. (2000)

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 63

 Genes de B. thuringiensis codificado-
res de proteínas Cry foram isolados e in-
troduzidos em plantas agronomicamente
importantes utilizando diferentes métodos
de transformação genética como aqueles
que empregam Agrobacterium, transfor-
mação direta de protoplastos e bombar-
deamento de partículas ou biobalística.
No início dos anos 80, o primeiro gene
cry foi clonado e expresso em Escheri-
chia coli (Schnepf & Whitley, 1981), sen-
do no final dessa década produzida a pri-
meira planta de tomate com genes de B.
thuringiensis (Fischhoff, 1987). O milho
Maximizer™ da Novartis, o algodão Boll-
gard™ e a batata Newleaf™ da Monsanto
foram introduzidas no mercado norte-
americano em 1995, sendo genericamen-
te conhecidas como plantas-Bt (Jouanin
et al.,1998). Atualmente, o milho-Bt é a
planta transgênica mais cultivada no mun-
do, ocupando 15% da área global cultiva-
da com transgênicos em países como
EUA, Canadá, Argentina, África do Sul,
Espanha e França. O algodão-Bt ocupa o
segundo lugar em áreas plantadas, repre-
sentando aproximadamente 7% da área
cultivada com transgênicos (James, 2000).
Além do milho, da batata, do tomate e do
algodão, outras plantas cultivadas expres-
sam uma ou várias proteínas Cry para o
controle de lepidópteros e coleópteros
(Tabela 1) e outras plantas-Bt de espéci-
es cultivadas estão em fase de desenvol-
vimento em laboratórios ou em testes de
campo (Oecd, 2001).
Atualmente estão registradas mais de
300 seqüências de genes cry, indicando
que a próxima geração de plantas-Bt de-
verá apresentar múltiplos genes cry, ofe-
recendo aos produtores um maior espec-
tro de proteção contra diferentes insetos-
praga e reduzindo a probabilidade dos
mesmos desenvolverem resistência.
As pesquisas também estão voltadas
para o incremento da expressão dos ge-
nes de B. thuringiensis em plantas, na
seleção de novas variantes de B. thurin-
giensis mais ativas e/ou na modificação
das seqüências dos genes cry de maneira
a aumentar a produção de toxinas no in-
terior das plantas. Nesse sentido, Schuler
et al. (1998) relata que uma estratégia para
a maior efetividade tóxica das plantas-Bt
contra insetos seria a introdução de ge-
nes nativos de B. thringiensis no genoma
dos cloroplastos, o que resulta num ele-
vado nível de expressão. A natureza pro-
cariótica dos plastídios vegetais permite
a transcrição dos genes de B. thringiensis
e a tradução e processamento dos mR-
NAs de forma mais eficiente. Nesse caso,
alguns autores mencionam que o entrave
estaria associado à transformação de clo-
roplastos a qual se restringe apenas a al-
gumas plantas-modelo, como por exem-
plo tabaco e tomate (Jouanin et al., 1998;
Kota et al., 1999).
64 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
1.2 Outros genes em plantas
Considerando outros genes de interes-
se à engenharia genética de plantas, os
inibidores de proteinases vegetais são po-
lipeptídios ou proteínas que se encontram
naturalmente nas plantas e fazem parte
do sistema de defesa das mesmas contra
herbívoros. Nos insetos as proteinases são
classificadas em diferentes grupos, vari-
ando conforme a ordem ou espécie, sen-
do estas responsáveis pela digestão dos
alimentos de onde são assimilados nutri-
entes essenciais ao crescimento e ao de-
senvolvimento dos mesmos.
Os inibidores de proteinases serínicas
e cisteínicas vêm sendo mencionados
como inibidores do crescimento e do de-
senvolvimento de alguns insetos das or-
dens lepidóptera e coleóptera, respecti-
vamente. A atividade antimetabólica dos
inibidores não foi bem elucidada, poden-
do estes: inibirem as enzimas digestivas
diretamente; provocarem a hipersecreção
de enzimas no intestino provocando o es-
gotamento dos aminoácidos essenciais;
afetarem o balanço hídrico, as trocas e a
regulação enzimática dos insetos (Schu-
ler et al., 1998).
Inibidores de alfa-amilases podem ser
considerados um segundo inibidor de en-
zimas, também utilizados na transforma-
ção de plantas (Tabela 2). Ensaios reali-
zados com Callosobruchus sp. e Bruchus
sp. mostram que esses inibidores, como
alfa-AI-Pv oriundo do feijão comum (Pha-
seolus vulgaris), são glicoproteínas termo-
estáveis que inibem alfa-amilases no in-
testino médio desses coleópteros pragas
de grãos armazenados, bloqueando assim
o seu desenvolvimento larval (Schuler et
al.,1998).
As lectinas são proteínas naturalmen-
te produzidas por plantas, principalmen-
te pelas leguminosas, como Glycine max
e Canavalia ensiformes, respectivamen-
te. O modo de ação destas proteínas ve-
getais não foi bem elucidado, mas alguns
resultados de pesquisa sugerem que estas
se ligam às células epiteliais do intestino
dos insetos (Carlini & Grossi-de-Sá, 2002).
Dados de pesquisa mostram que vári-
as lectinas identificadas têm efeito inseti-
cida contra diversas ordens de insetos,
principalmente coleópteros, hemípteros e
homópteros, porém algumas apresentam
efeito tóxico para mamíferos, enfatizando
assim a necessidade de maiores investi-
gações nessa área (Carlini & Grossi-de-
Sá, 2002).
Alguns genes de quitinases, peroxida-
ses e triptofano-descarboxilases vêm sen-
do introduzidos em plantas visando prin-
cipalmente à resistência a insetos da or-
dem Homoptera (Schuler et al., 1998). Por
outro lado, os conhecimentos sobre os
mecanismos de ação desses produtos são
restritos devido à elevada complexidade
do sistema.
No controle de pragas de importância
agrícola, observa-se que, a possibilidade
de obtenção de plantas que sintetizam to-
xinas letais aos insetos através da trans-
formação vegetal com genes oriundos de
outras plantas, microrganismos e animais,
abriu novas perspectivas ao Manejo Inte-
grado de Pragas. Outro aspecto importante
são as novas alternativas de controle de
insetos de difícil acesso através dos méto-
dos convencionais, seja pelo modo de vida
subterrâneo ou endofítico da praga alvo.
A utilização de plantas transgênicas
resistentes permite o acúmulo do produ-
to (toxina) entomotóxico nos tecidos ve-
getais, afetando diretamente a espécie alvo
quando a mesma se alimenta do tecido
transgênico, sem causar danos às espéci-
es não alvo, representando assim um mé-
todo alternativo para o controle de pra-
gas das plantas cultivadas associado à pre-
servação do meio ambiente.
1.3 Segurança das
plantas transgênicas
A liberação comercial das plantas ge-
neticamente modificadas com genes cry
de B. thuringiensis, relatada na publica-
ção de Dunwell (1999), revela que os pro-
dutores norte-americanos têm adotado as
plantas transgênicas como um elemento
chave no aumento da produção vegetal.
Esse marco histórico só chegou ao Brasil
em 2005, através da regulamentação e li-
beração do cultivo e comercialização das
plantas transgênicas. Para maior detalha-
mento sobre esse assunto consultar os se-
guintes sites:
- www.ctnbio.gov.br (Comissão Técni-
ca Nacional de Biossegurança)
- www.anbio.org.br (Associação Naci-
onal de Biossegurança)
Os dados de revisão de Fontes et al.
(2002) relatam a segurança, riscos ambi-
entais e eficiência no controle de pragas
através do emprego das plantas-Bt. Tam-
bém os trabalhos de revisão de Bobro-
wski et al. (2003) e Polanczyk et al. (2003)
citam alguns benefícios do uso dessa tec-
nologia, como:
• Diminuição dos efeitos ambientais
sobre as toxinas;
• Segurança na utilização;
• Redução do uso de inseticidas quími-
cos;
• Eficiência no controle das pragas;
• Proteção vegetal;
• Preservação dos inimigos naturais;
• Redução de doenças fúngicas.
1.4 Considerações e perspectivas
Os dados de pesquisa têm revelado
que certas espécies de insetos, principal-
Tabela 2. Outros genes utilizados na obtenção de plantas transgênicas resistentes aos insetos (adaptado de Schuler et al., 1998)
GENES / PRODUTOS
CMe (cevada); CMTI (abóbora); MTI-2 (mostarda);
PI-IV (soja); KTi3 e SKTI (soja); inibidor de
proteinase I e II (tomate); SI (animal);
α1AT(animal)
Pot PI-I e Pot PT-II (batata); BPTI (pâncreas
bovino);
C-II (soja); CpTI (cowpea)
OC-1 (arroz)
anti-quimiotripsina (Manduca sexta), anti-elastase
(M. sexta), anti-tripsina (M. sexta)
Inibidores de alfa-amilase
WMAI-1 (cereais)
αAI-Pv (feijão)
Lectinas
GNA (anêmona), p-lec (ervilha)
WGA (trigo), lectina (arroz), jacalin
Outros
BCH – quitinase (feijão)
Quitinase (Manduca sexta)
Quitinase(tomate), Peroxidase(fumo)
TDC (crisântemo)
14K-CL (bifuncional) *
* bifuncional: inibidor de proteinases serínicas e de alfa-amilases
mente lepidópteros, têm adquirido resis-
tência às proteínas Cry de B. thuringien-
sis, reforçando assim o compromisso das
futuras pesquisas na identificação de no-
vas toxinas inseticidas. Também são con-
siderados importantes os estudos sobre
expressão gênica, espectro de ação e es-
pecificidade das proteínas inseticidas, per-
mitindo a disponibilização freqüente de
novas versões gênicas mais eficazes, mais
específicas e com vantagens ainda maio-
res sobre as práticas convencionais de
controle de pragas. Ainda para evitar ou
retardar o surgimento de resistência de
insetos às plantas transgênicas, recomen-
da-se a adoção de técnicas de manejo ade-
quadas, sendo algumas já relatadas por
Peferoen (1997) há mais de uma década.
A aplicação integrada das plantas
transgênicas na agricultura convencional,
já ultrapassou a aceitação pública da tec-
nologia dos transgênicos e atualmente re-
presenta uma realidade no incremento da
produção de alimentos de origem vege-
tal, com baixo custo e impacto ambiental.
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Lepidoptera
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Lepidoptera, Coleoptera
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tomate
petúnia, fumo, bétula, alface, arroz, batata,
trevo branco
colza, álamo, batata, fumo, maçã, alface, arroz,
morango, girassol, batata-doce, tomate
colza, álamo, fumo
algodão, fumo, alfafa
fumo
feijão, ervilha, fumo
uva, colza, batata, arroz, batata-doce, cana-
de-açúcar, girassol, fumo, tomate
milho
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67
 EVOLUÇÃO E MANEJO
Pesquisa DA RESISTÊNCIA DE INSETOS
“O conhecimento nos permite contornar muitos problemas, mas muitas
vezes, apenas nos possibilita adiar o inevitável, transferindo para algum ponto futuro
os acontecimentos que buscamos com todo empenho evitar – Vilmar Machado”
Vilmar Machado
Biólogo (UNISINOS) e Mestre e Doutor em
Genética e Biologia Molecular (UFRGS)
Lidia Mariana Fiúza
Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em
Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),
Doutora em Ciências Agronômicas
(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em
biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).
68 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
ste artigo apresenta alguns aspec-
tos relacionados à evolução e ao
manejo da resistência do ponto
de vista da biologia evolutiva.
Aqui são abordados os mecanis-
mos biológicos envolvidos no
processo de adaptação dos insetos-pra-
ga aos agentes de controle e, também,
como o conhecimento destes se reflete
nas estratégias utilizadas para reduzir a
velocidade de evolução da resistência
às plantas transgênicas.
1.1 Introdução
A resistência aos inseticidas é um
fenômeno mundial e as estimativas atu-
ais indicam que mais de 500 espécies
de artrópodes desenvolveram resistên-
cia a um ou mais pesticidas (Georghiou
& Lagunes-Tejeda, 1991). A resistência
também foi observada para uma varie-
dade de produtos naturais e regulado-
res do crescimento de insetos. Dentre
o que aprendemos com a utilização de
inseticidas químicos foi que a capaci-
dade de resposta adaptativa dos inse-
tos é quase inevitável e ocorre relativa-
mente rápido. Para muitos esse fenô-
meno parece ser surpreendente, mas
não devemos esquecer que uma das ca-
racterísticas mais relevantes dos orga-
nismos vivos é sua capacidade de evo-
luir continuamente.
O processo de evolução ocorre de
forma “automática” - sem a influência
de forças externas ou de um agente di-
recionador para compreender como as
mudanças evolutivas acontecem, pre-
cisamos analisar aspectos básicos da bi-
ologia dos seres vivos os quais influen-
ciam a evolução da diversidade bioló-
gica possibilitando a adaptação aos di-
ferentes ambientes e também respostas
específicas a pressões seletivas mais di-
retas, como a predadores, parasitas ou
a agentes de controle desenvolvidos
pela espécie humana, como antibióti-
cos ou inseticidas químicos.
Nossa relação com insetos-praga,
bactérias e vírus, mesmo que pareça es-
tranha para alguns, pode ser analisada
como um processo de co-evolução.
Nossas respostas, nesse processo, são
frutos da aplicação do conhecimento ci-
entífico enquanto o que observamos,
através da evolução da resistência, não
é. Indiferentes aos nossos esforços, po-
pulações de insetos se reproduzem pas-
sando de uma geração para outra as
informações genéticas. Esse processo de
reprodução não é aleatório: em cada
geração alguns indivíduos deixarão mais
descendentes que outros; o sucesso na
passagem dos genes para as próximas
gerações está associado à presença de
características genéticas que contribu-
em para a reprodução e a sobrevivên-
cia às condições ambientais vigentes.
A descrição acima pode ser simples,
mas nos possibilita ter uma idéia geral
do processo de evolução da resistência
aos antibióticos e inseticidas químicos.
Para uma compreensão mais apurada
do processo podemos fazer, no míni-
mo, duas perguntas relevantes. Quais
as características importantes do mate-
rial genético passado de uma geração
para outra no processo de evolução?
Porque a sobrevivência e a reprodução
não são aleatórias?
As respostas para estas perguntas
nos permitirão compreender, em linhas
gerais, a evolução da resistência aos in-
seticidas e antibióticos, e também ana-
lisar as possibilidades de evolução da
resistência às plantas geneticamente mo-
dificadas com genes de B. thuringien-
sis, denominadas plantas-Bt. Além dis-
so, ajudarão a compreender os proce-
dimentos utilizados nas estratégias de
manejo da evolução da resistência.
1.2 Diversidade genética nas
populações e evolução da resistência
A evolução de respostas adaptati-
vas ocorre pelo efeito de seleção natu-
ral sobre a variação genética existente
nas populações. A aplicação repetida
de inseticidas do mesmo grupo quími-
co e modelo de ação favoreceram vari-
antes genéticas específicas nas popula-
ções alvos levando à substituição dos
indivíduos susceptíveis pelos indivídu-
os resistentes. O gene para resistência
que aumenta em freqüência numa po-
pulação pode se espalhar para outras
populações através do fluxo gênico.
As diferenças genéticas entre os in-
divíduos de uma população são consi-
deradas a matéria prima da evolução,
existindo uma relação entre valor adap-
tativo médio de uma população e os
níveis de variabilidade que ela apresen-
ta. Segundo o teorema fundamental de
Fisher (1930), a taxa de mudança evo-
lutiva é proporcional à diversidade ge-
nética existente nas populações.
A diversidade genética é a base para
respostas às mudanças ambientais. A
importância do estudo da variabilidade
pode ser compreendida pela quantida-
de de trabalhos sobre o tema, em espe-
cial procurando identificar os fatores
envolvidos na sua manutenção. Nos tra-
balhos com populações naturais, a pre-
ocupação com a existência da diversi-
dade genética aparece de formas varia-
das. Para programas de conservação e
manejo da vida silvestre, um dos temas
centrais é a manutenção da variabilida-
de genética em ambientes fragmenta-
dos, pois é consenso que a persistência
futura das populações pode depender
da preservação de componentes espe-
cíficos da diversidade genética (Gilpin
& Sóule, 1986; Meffe & Carrol, 1997).
Em programas de manejo e controle de
pragas e vetores, essa preocupação está
associada, por um lado, à busca por li-
nhagens de agentes de controle que
sejam específicas a uma determinada
praga (Potting et al. 1997; Vink et al.,
2003) e por outro, à identificação de
variantes resistentes aos agentes de con-
trole nas espécies consideradas pragas
ou vetores de doenças (Ofuya & Cre-
dland, 1995; Winder et al. 1997; Guirao
et al. 1997; Nicol et al. 1998; Szalanski
et al. 1999; 2000; Oliveira et al. 2001;
Birungi & Munstermann, 2002). A im-
portância e as implicações de existên-
cia de variação genética nas populações
naturais de pragas e vetores foram sali-
entadas por Diehl & Bush (1984) em
seu trabalho sobre “biotypes”. Segun-
do os autores, o não reconhecimento
desse fator pode frustrar ou dificultar
programas de manejo e controle bioló-
gico de pragas. Para Newman et al.
(1998), a diversidade genética nas po-
pulações é um dos elementos que con-
tribuem para reduzir a eficiência de pro-
gramas de controle químico e/ou bio-
lógico. Essa também é uma preocupa-
ção considerada por programas envol-
vidos no desenvolvimento de varieda-
des de plantas resistentes a insetos-pra-
ga (Sardesai, 2000; Heinrichs, 2001).
A importância da variabilidade ge-
nética para programas de manejo e con-
trole de pragas tem sido discutida por
décadas, mas seu estudo tornou-se pos-
sível apenas com o desenvolvimento de
marcadores baseados na análise de
DNA. A aplicação desses marcadores
tornou-se uma ferramenta importante
para o estudo da dinâmica e dos fato-
res que influenciam populações natu-
rais (Edwards, 1993; Smith & Wayne,
1996; Schierwater & Desale, 1998). Es-
tudos detalhados sobre a importância
da variabilidade genética em insetos-
praga ou vetores são recentes e entre
eles destacam-se: Winder et al. (1997);
Guirao et al. (1997); Nicol et al. (1998);
Szalanski et al. (1999); Downie (2000);
Geurgas et al. (2000; 2002); Appleby &
Credland (2003).
Estudos recentes têm registrado va-
riação intra-específica na susceptibilida-
de a agentes de controle químico e/ou
biológico em várias espécies, como por
exemplo, Microctonus aethiopoides,
Schizaphis graminium e Spodoptera
frugiperda. Em Microctonus aethiopoi-
des (Hymenoptera: Braconidae), um pa-
rasitóide utilizado em programas de
controle de biológico de pragas, foram
identificadas linhagens (biotipos) adap-
tadas a hospedeiros diferentes, analisan-
do-se a variação intra-específica no gene
para Citocromo Oxidase I (Vink et al.,
2003). Uma das dificuldades no contro-
le de Schizaphis graminium (Hemipte-
ra: Aphididae), uma das mais importan-
tes pragas de cereais do mundo, é a
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
existência de linhagens diferentes ao
longo da sua área de distribuição. Para
esse inseto estão sendo realizados es-
tudos visando selecionar marcadores
moleculares específicos para identificar
as diferentes linhagens e, desta forma,
melhorar as condições de controle uti-
lizando agentes específicos para cada
uma (Aikhionbare & Mayo, 2000; Lo-
pes da Silva et al., 2004). Em Spodopte-
ra frugiperda (Lepidoptera: Noctuide),
uma praga de várias culturas importan-
tes, lagartas coletadas em hospedeiros
diferentes apresentaram diferenças sig-
nificativas na susceptibilidade a deter-
minados inseticidas e a endotoxinas de
B. thruringiensis (Adamczyk, et al.,
1997).
Exemplos mais interessantes da di-
versidade genética em insetos-praga
ocorre em Bemisia tabaci, considerada
por muitos a principal praga agrícola
do mundo, tendo sido registrada sua
ocorrência em mais de 600 espécies de
plantas e, até o momento, são conheci-
dos mais de 20 biotipos (Oliveira et al.,
2001; Omondi el al., 2005; Carabali et
al., 2005). No Brasil, esse inseto é co-
nhecido como mosca-branca e os pre-
juízos caudados decorrem da atividade
de sucção de seiva, injeção de toxinas
e pela transmissão de vírus de plantas.
A variabilidade genética intra-específi-
ca e a diversidade de hospedeiros es-
tão entre os grandes desafios para o
controle desse inseto (Perring, 2001).
Os parágrafos acima reforçam a idéia
de que é preciso levar em conta a di-
versidade genética existentes nas po-
pulações dos insetos-alvo em progra-
mas de manejo e controle. Vários estu-
dos demonstram que essa variabilidade
também está presente nos mecanismos
biológicos que possibilitam a ação das
toxinas de B. thuringiensis.
A resistência às toxinas de B. thu-
ringiensis pode envolver: a não ativa-
ção da toxina, a imobilização da toxina
na membrana peritrófica, sua incapaci-
dade de ligar-se aos receptores da mem-
brana, sua incapacidade de criar poros
na membrana do epitélio e sua baixa
eficiência pelo rápido reparo dos da-
nos causados por ela às células afeta-
das (Ferre & Van Rie, 2002; Griffitts &
Aroian, 2005; Baxter et al. 2008).
O mecanismo mais comum envol-
vendo a resistência às toxinas de B. thu-
ringiensis é a redução na capacidade
de ligação aos receptores nas microvi-
losidades do intestino médio dos inse-
tos (Ferre et al., 1991; 2003; Pigott &
Ellar, 2007; Wang et al., 2007; Rodrigo-
69
 Simón et al., 2008). Modificações nos
genes que codificam os receptores para
as proteínas Cry foram encontradas em
várias espécies. Mutações nos recepto-
res para proteína Cry1A estão envolvi-
das na resistência em Heliothis virescens
(Gahan et al., 2001), Pectinophora gos-
sypiella (Morin et al., 2003), Helicover-
pa armigera (Xu et al., 2005; Luo et al,
2006) e P. xylostella (Ballester et al.,
1999). Em C. elegans foram identifica-
dos quatro genes diferentes para resis-
tência à toxina (Griffitts et al., 2005).
Além disso, foram descritos mecanismos
de resistência a B. thuringiensis envol-
vendo genes diferentes em H. virescens,
P. xylostella (Jurat-Fuentes & Adang,
2006) e P. interpunctella (Herrero et al.,
2001). Em H. virescens em cada 1000
insetos 1,5 é portador do gene para re-
sistência a B. thuringiensis (Gould et
al., 1995; 1997).
As informações acima demonstram
claramente a presença de genes para
resistência às toxinas de B. thuringien-
sis em populações de várias espécies
mesmo que em baixa freqüência. É pre-
ciso destacar que até o momento não
foi registrada nenhuma população na-
tural resistente a essas toxinas. O que é
necessário para que estes genes aumen-
tem em freqüência nas populações na-
turais? A resposta simples é: que as apli-
cações das toxinas B. thuringiensis tor-
nem-se numa pressão de seleção cons-
tante e intensa.
1.3 Fluxo gênico
Estudos sobre a estrutura genética
de populações têm demonstrado, ao
longo do tempo, que as espécies rara-
mente são constituídas por populações
únicas e panmíticas; pelo contrário, di-
ferenças genéticas são encontradas en-
tre as populações. Essas diferenças são
componentes importantes da diversida-
de genética da espécie. Em geral, a tro-
ca de genes ocorre com maior probabi-
lidade entre populações próximas geo-
graficamente do que entre populações
mais distantes, sendo influenciada pela
estrutura geográfica e espacial das po-
pulações. Portanto, o estudo da estru-
tura genética das populações é um com-
ponente importante de programas de
manejo e controle de pragas, pois po-
dem fornecer informações sobre níveis
de variabilidade genética, graus de di-
ferenciação entre as populações e pa-
drões de fluxo gênico. Além disso, pode
possibilitar o monitoramento das mu-
70 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
danças na freqüência de genes es-
pecíficos.
A caracterização genética das es-
pécies alvo, ao longo de sua área de
distribuição, é um dos fatores que
podem contribuir para o sucesso de
programas de controle biológico
(Hoelmer & Kirk, 2005). O fluxo
gênico é um componente importan-
te para as estratégias de manejo da
evolução da resistência e seus efei-
tos podem ter reflexos em pequena
e grande escala.
Em pequena escala (populações
locais) espera-se que ele contribua
para diluição da resistência levando
ao cruzamento entre insetos resis-
tentes e não resistentes. Sua intensi-
dade tem efeitos na taxa de aumen-
to da freqüência dos genes para re-
sistência. A capacidade de dispersão
de um inseto praga é relevante para
definição do tamanho e distribuição
das áreas de refúgio, uma vez que
estas são os locais para manutenção
de indivíduos susceptíveis possibili-
tando o fluxo de genes não-resisten-
tes para grupos de indivíduos resis-
tentes nas áreas de plantas-Bt (Va-
cher et al., 2006).
Em grande escala, o fluxo gêni-
co pode determinar a possibilidade
dos genes para resistência se espa-
lharem ao longo da área de distri-
buição geográfica da espécie. Esse
fenômeno influencia a velocidade
em que uma adaptação que surge
numa população local pode se es-
palhar.
Os possíveis impactos do fluxo
gênico na evolução da resistência
torna fundamental dispor de estudos
precisos sobre a estrutura genética
das populações de insetos-praga vi-
sando estimar seu impacto em po-
pulações locais e também em lon-
gas distâncias. Especialmente no
caso de pragas com ampla área de
distribuição que atacam culturas di-
ferentes.
Estudos de estrutura genética têm
potencial para responder questões
relevantes para o manejo destas es-
pécies, como por exemplo: os inse-
tos que atacam plantas diferentes for-
mam linhagens distintas? Qual o grau
de diferenciação genética entre as
linhagens? Quando as linhagens
ocorrem na mesma área, os cruza-
mentos são aleatórios ou não? Qual
a capacidade de dispersão a longas
distâncias? A reprodução ocorre an-
tes ou depois da dispersão dos insetos?
1.4 Efeito de seleção e
evolução da resistência
A seleção natural pode ser definida
como diferenças na taxa de reprodu-
ção e/ou sobrevivência entre indivídu-
os com características distintas. De uma
maneira mais simples, os indivíduos
com as melhores respostas aos proble-
mas de sobrevivência e reprodução
deixam mais genes para as próximas
gerações. O efeito da seleção natural
sobre as populações aumenta a freqüên-
cia dos alelos com resposta “positiva”,
gerando uma mudança adaptativa. De
acordo com a hipótese da rainha ver-
melha (Van Valen, 1973) é preciso evo-
luir (adaptar-se) continuamente para
não ser “superado” pelos seus compe-
tidores.
A capacidade de evoluir é uma ca-
racterística dos organismos vivos, mes-
mo que no processo ocorram extinções
de muitas linhagens, mas a “vida” no
planeta Terra tem mantido sua capaci-
dade de encontrar novos caminhos,
reinventando a si mesma de diferentes
maneiras.
Nossa relação com os insetos-praga
é apenas parte do processo e, por mai-
or que seja nosso empenho, não con-
seguimos superá-las; até hoje apenas
nos esforçamos para reduzir seu impac-
to sobre nossa existência. Essa relação
iniciou quando inventamos a agricultu-
ra e desde então estamos envolvidos
numa corrida ao armamento. Nossas
armas envolvem os diferentes métodos
de controle, com destaque para a apli-
cação em massa de produtos químicos
sintéticos após a segunda guerra mun-
dial e, mais recentemente, o desenvol-
vimento das plantas-Bt.
A crescente utilização de B. thurin-
giensis como biopesticidas e a amplia-
ção das áreas de plantio com plantas-
Bt certamente aumentam a pressão de
seleção desse agente sobre as popula-
ções alvo.
O primeiro formulado comercial de
B. thuringiensis surgiu na França, em
1938 e sua introdução nos Estados Uni-
dos ocorreu em 1950. Desde então essa
bactéria vem sendo utilizada amplamen-
te para controle de pragas (Sayyed e
Wright, 2002). Em 1996, foram comer-
cializados e plantados algodão-Bt e
milho-Bt em milhares de hectares nos
Estados Unidos (Gould, 1998). A partir
de então, foram produzidas outras plan-
tas com genes B. thuringiensis, e a área
plantada foi ampliada, estendendo-se
para outros continentes. Em 2002 fo-
ram plantados, no mundo, 14 milhões
de hectares apenas de algodão-Bt e mi-
lho-Bt (James, 2002; Bourguet et al.,
2005).
A expressão das toxinas de B. thu-
ringiensis nas plantas transgênicas é
considerada um dos maiores avanços
no uso de biopesticidas. Segundo Ja-
mes (2007), as lavouras de plantas-Bt
aumentaram anualmente, atingindo
114,3 milhões de hectares no mundo,
em 2007.
As informações disponíveis indicam
claramente que as condições para evo-
lução da resistência contra as toxinas
de B. thuringiensis existem, ou seja, as
populações apresentam genes para re-
sistência (mesmo que em freqüência
baixa) e a pressão de seleção aumenta
anualmente.
Cientes desta situação os profissio-
nais da área de manejo e controle de
pragas colocaram em prática o que cha-
mamos de manejo da resistência, isto
é, um conjunto de procedimentos que
tem por objetivo retardar ao máximo o
surgimento de populações resistentes
em campo.
1.5 Manejo da Evolução
da Resistência
Uma população se torna resistente
quando a maioria dos insetos susceptí-
veis ao método de controle utilizado foi
removida. A maior taxa de cruzamen-
tos entre insetos portadores do gene
para resistência tornará o controle mais
difícil a cada geração.
No intuito de eliminar ou retardar o
aumento na freqüência dos genes para
resistência às toxinas de B. thuringien-
sis em populações de insetos-alvo, fo-
ram desenvolvidas várias estratégias de
manejo da evolução da resistência. A
finalidade destas estratégias é reduzir a
pressão de seleção, diminuindo a velo-
cidade de crescimento da população de
insetos resistentes.
A estratégia mais utilizada no ma-
nejo da resistência é denominada de
altas doses/refúgio estruturado e fun-
damenta-se em modelos teóricos e tes-
tes experimentais realizados em peque-
na escala (Georghiou & Taylor, 1977;
1999; Gould, 1998; Peck et al., 1999;
Caprio, 2001, Onstad et al., 2002; Liu &
Tabashnik, 1997; Shelton et al., 2000;
Wenes et al., 2006).
As premissas dessa estratégia são:
(i) o gene para resistência ocorre em
freqüência baixa nas populações;
(ii) as quantidades de toxinas de B.
thuringiensis produzidas pelas plantas
são altas o suficiente para eliminação
da população os insetos homozigotos
não resistentes e os heterozigotos re-
sistentes;
(iii) os indivíduos resistentes (homo-
zigotos) que nascem nas áreas com
plantas-Bt cruzam aleatoriamente com
os indivíduos não resistentes que nas-
cem nas áreas dos refúgios.
No manejo da resistência, o refúgio
é a área na qual não são cultivadas plan-
tas-Bt e sua finalidade é manter na po-
pulação indivíduos susceptíveis às to-
xinas de B. thuringiensis, ou seja, aque-
les que não possuem genes para a re-
sistência. Sua contribuição é a produ-
ção de insetos adultos susceptíveis às
toxinas de B. thuringiensis para cruza-
rem com insetos homozigotos resisten-
tes, “diluindo”, dessa forma, a resistên-
cia na população. A dispersão para fora
das áreas dos refúgios é necessária para
que os cruzamentos aconteçam.
As dimensões e a distribuição das
áreas de refúgio são definidas com base
em estudos teóricos e experimentos de
campo podendo variar de acordo com
a cultura ou praga em questão. A área
dos refúgios para milho-Bt varia entre
20 e 50%; simulações de computador
indicam que áreas menores podem ace-
lerar a evolução da resistência. Para al-
godão-Bt, por outro lado, recomenda-
se que 5 a 20% da área de plantio seja
destinada ao refúgio (Technology Use
Guide, 2007-2008).
São fatores relevantes na definição
da área de refúgio: a capacidade de dis-
persão da praga, sua biologia reprodu-
tiva e seus hábitos alimentares. A distri-
buição dos refúgios também procura
reduzir a possibilidade de cruzamentos
entre indivíduos homozigotos para o
gene da resistência (Peck et al., 1999;
Caprio, 2001; Ives & Andow, 2002; Va-
cher et al., 2006; Tyutyunov et al., 2007;
2008; Hanur, 2008).
A expressão “doses altas” significa
que as plantas vão produzir quantida-
des das toxinas de B. thuringiensis su-
ficientes para eliminar da população os
indivíduos que possuem uma única có-
pia do gene para resistência, ou seja,
os heterozigotos. Por definição, “dose
alta”, é aquela suficiente para matar mais
do que 95% dos insetos heterozigotos
(Georghious & Taylor, 1977; Roush,
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38
1994; Gould, 1998).
Essa estratégia torna a resistên-
cia uma característica funcionalmen-
te recessiva, uma vez que apenas os
portadores de duas cópias do gene
sobrevivem às doses de toxina pro-
duzida pelas plantas-Bt (Tabashnik
& Croft, 1982). Nas áreas com plan-
tas-Bt sobreviverão apenas os raros
portadores de duas cópias do gene
para resistência, ou seja, os homo-
zigotos recessivos. Os cruzamentos
aleatórios entre os raros indivíduos
resistentes nas áreas com plantas-
Bt e os indivíduos não resistentes
dos refúgios, produziria indivíduos
susceptíveis que seriam eliminados
quando se alimentassem de plantas-
Bt (Gould, 1998; Vacher et al., 2006).
Na teoria, a estratégia “altas do-
ses/refúgios estruturados” funciona
muito bem, ou seja, dentro das pre-
missas ela realmente reduz a veloci-
dade de aumento na freqüência do
gene para a resistência nas popula-
ções aumentando, com isso, o tem-
po de uso das plantas-Bt. O mundo
real, porém, tem diversas maneiras
de se desviar das aceitações do mo-
delo.
Estudos sobre o padrão de he-
rança da resistência indicam que
outros mecanismos genéticos podem
ocorrer, como por exemplo, domi-
nância e herança poligênica (Heckel
et al., 2007). Além disso, os cruza-
mentos podem não ocorrer aleato-
riamente; para isso, basta que exis-
tam diferenças na velocidade de de-
senvolvimento entre indivíduos re-
sistentes e susceptíveis. A assincro-
nia no desenvolvimento pode de-
terminar uma freqüência maior de
cruzamentos entre indivíduos resis-
tentes, o que pode acelerar a evolu-
ção da resistência (LIU et al., 2000;
Medvinsky et al., 2007).
1.6 Considerações
A espécie humana, não tem mui-
tas respostas para explicar como a
vida surgiu no planeta Terra, mas
ao longo do tempo fez muitas des-
cobertas sobre as forças envolvidas
no processo de evolução da biodi-
versidade e nas mudanças adaptati-
vas nas diferentes linhagens de or-
ganismos.
A evolução é um processo com-
plexo, influenciado pela mutação,
seleção natural, fluxo gênico, deri-
71
 va genética e sistema de cruzamen-
tos. As interações entre estes fatores
são complexas e de difícil compre-
ensão. A construção de modelos para
simular o efeito destes fatores permi-
te analisar parcialmente estas intera-
ções. Atualmente em muitos casos
temos respostas relativamente preci-
sas de como as coisas aconteceram,
por exemplo, sobre a evolução da re-
sistência aos inseticidas e/ou antibió-
ticos.
Podemos fazer muitas previsões,
porém estas estão envolvidas num
mundo de incertezas, determinadas
pela presença do acaso ou das inte-
rações que nossos modelos não po-
dem estimar, pois são uma simplifi-
cação do mundo real.
Muitos pesquisadores acreditam
que o surgimento de linhagens resis-
tentes a agentes de controle químico
e/ou biológico em populações natu-
rais não é uma questão de “se” vai
acontecer, mas sim, “quando” irá
ocorrer. Estas preocupações são váli-
das também para as plantas-Bt (Wri-
ght et al., 1997; Gould, 1998; Tabash-
nik & Carriére, 2004, Tabashnik et al.,
2004 e 2008; Bourguet et al., 2005).
Quando analisamos um fenôme-
no biológico do ponto de vista da te-
oria da evolução, as unidades de tem-
po devem ser pensadas em perspec-
tivas diferentes; estas envolvem ge-
rações que se sucedem ao longo do
tempo. As unidades de tempo envol-
vem períodos maiores do que aque-
les que usamos para datar a história
da civilização, ou seja, 50 ou mesmo
100 anos, podem ser pouco relevan-
tes.
As constantes pesquisas por no-
vas toxinas e/ou a produção de plan-
tas com capacidade de expressar mais
do que uma toxina é um indicativo
de nossa consciência de que as plan-
tas-Bt cultivadas atualmente podem
ser sucessos temporários.
No momento, nossa melhor alter-
nativa é continuar aplicando as es-
tratégias de manejo da evolução da
resistência e aprimorar as pesquisas
por novos métodos para reduzir os
impactos das pragas sobre a produ-
ção de alimentos.
Devemos ter em mente, porém,
que essa relação evolutiva só poderá
terminar com a extinção de um dos
envolvidos, mas dada à dinâmica do
processo evolutivo, podemos afirmar
que novas relações irão surgir.
1.7 Referências
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