Universitatea ``Vasile Alecsandri``Bacau

Facultatea de Inginerie
Specializarea Inginerie Biochimica

PROIECT LA DISCIPLINA:
,,BIOREACTOARE’’

Student:
Coordonator: Pascu Alina
Prof.dr.ing. Nistor Ileana-Denisa Grupa 1141 A
Prep.drd.ing. Muntianu Gabriela

2010

1
 TEMA PROIECTLUI:
„PROIECTAREA UNUI BIOREACTOR UTILIZAT
LA OBŢINEREA PREPARATELOR ENZIMATICE
DESTINATE MATURĂRII BRÂNZETURILOR”

2
 Cuprins

TEMA DE PROIECTARE.................................................................pag. 2
INTRODUCERE.................................................................................pag. 4
Capitolul 1. Elemente de inginerie tehnologică.....................................pag. 6
1.1. Caracteristicile materiilor prime şi auxiliare..........................................pag. 6
1.1.2. Tipuri de bacterii starter...............................................................................pag. 10
1.1.2. Aspergillus Niger.........................................................................................pag. 12
1.2. Caracteristicile produselor finite.............................................................pag. 14
1.2.1.Generalităţi despre produsele finite...............................................................pag. 14
1.2.2.Preparate enzimatice folosite la maturarea brânzeturilor..............................pag. 17
1.2.3. Acţiunea principalelor proteinaze în timpul maturării brânzei......................pag. 18
1.2.4.Alte enzime din lapte......................................................................................pag. 20
1.2.5 Maturarea brânzeturilor..................................................................................pag. 23
1.2.6.Condiţii de maturare a brânzeturilor şi tratarea acestora în timpul maturării..pag 25
1.2.7. Accelerarea maturării brânzeturilor...............................................................pag. 26
1.2.8. Enzime incapsulate........................................................................................pag. 26
1.3. Variante tehnologice de obţinere a produsului finit...................................pag. 28
1.4. Descrierea etapelor tehnologice....................................................................pag. 31

Capitolul 2. Bilanţul de materiale..........................................................pag. 35

Capitolul 4. Bilanţul termic....................................................................pag. 38
Capitolul 4. Alegerea şi dimensionarea bioreactorului........................pag. 40
4.1. Utilajul principal-descriere..............................................................................pag. 40
4.2. Dimensionarea bioreactorului.........................................................................pag. 43

Concluzii......................................................................................pag. 45
Bibliografie..................................................................................pag. 46

3
 Introducere

Enzimele reprezintă catalizatori organici de natură proteică cu structură

macromoleculară, elaborate de celula vie. Ele manifestă acţiune strict specifică şi au rol
primordial în metabolismul celular. Specificitatea enzimelor este determinată de structura
centrilor activi formaţi de anumite grupe funcţionale ale aminoacizilor şi alte grupe chimice.
Cataliza enzimatică ocupă un loc important în biotehnologiile moderne. Utilizarea lor
în diferite domenii permite perfecţionarea proceselor tehnologice, a metodelor de analiză,
asigură indici superiori şi randamente crescute în industrie, agricultură, facilitând progresul
tehnic.
Abilităţile catalitice ale enzimelor mult mai sporite faţă de catalizatorii chimici,
realizarea proceselor în condiţii moderate de pH, temperatură şi presiune, precum şi
specificitatea de substrat înaltă, fără echivalent în cataliza neenzimatică au influenţat
considerabil lărgirea sferei de aplicare a preparatelor enzimatice - diverse procese
tehnologice, cercetări ştiinţifice, medicină, etc. Pe larg se utilizează astăzi enzimele în ţările
cu biotehnologii avansate - Statele Unite ale Americii, Japonia, Germania, Federaţia Rusă.
Marea majoritate a enzimelor utilizate în diferite ramuri industriale este reprezentată de
hidrolaze care sunt în marea majoritate enzime exocelulare, uşor solubile în apă. Dintre
acestea largi aplicări are grupa enzimelor proteolitice datorită rolului cheie în diversitatea
transformărilor substanţelor proteice. Se utilizează proteaze de origine animală (pepsina,
tripsina, renina - cheagul), vegetală (papaina, ficina, bromelaina) şi microbiană (proteaze
produse de bacterii şi fungi microscopici).
Potenţialul genetic bogat al micromicetelor permite obţinerea unei diversităţi
surprinzătoare de metaboliţi cu structură chimică complexă şi însuşiri biologice specifice. Prin
frecvenţa înaltă de biosinteză a enzimelor hidrolitice extracelulare se evidenţiază

4
reprezentanţii genurilor Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Rhizopus, Mucor, Alternaria,
Sclerotinia, Botrytis, Chaetomium, Trichoderma. Performanţele fungilor faţă de alte
microorganisme în calitate de producători de hidrolaze este capacitatea de a metaboliza o
gamă largă de diverse substraturi ieftine şi accesibile şi de a secreta metaboliţii în mediul de
cultură cea ce reduce preţul de cost a produsului final, simplifică procesul tehnologic.
Rolul principal al proteazelor constă în hidroliza substanţelor polipeptidice cu structura
complexă pînă la fragmente cu masa moleculară joasă, ceea ce determină gama largă de
aplicare în industria alimentară, în procesele de fabricare a prafului de supe, a brânzeturilor, a
unor produse de carne, băuturilor proteinizate, în panificaţie.
Preparatele enzimatice cu acţiune de coagulare a laptelui sunt denumite uzual „cheag
microbian”.
Lipsa tot mai accentuată a cheagului de origină animală a dus la sporirea preocupărilor
pentru a găsi modalitatea de rezolvare a situaţiei în condiţiile în care producţia de brânzeturi
are tendinţe de creştere. La scară industrială se produc cheaguri microbiene, prin biosinteză cu
diferite micete.

5
1. Elemente de inginerie tehnologica

1.1 Caracteristicile materiilor prime şi auxiliare

Culturile starter sunt definite ca acele culturi care se obţin plecând de la o cultură pură
stoc şi care prin trecerea prin culturi intermediare (pasaje) devin apte de a fi folosite pentru
producerea unor alimente fermentate. Culturile starter pot fi formate numai dintr-un singur
microorganism sau din mai multe microorganisme.
La folosirea culturilor starter în industria alimentară trebuie să se ţină seama de
următoarele caracteristici:
-sa conţină un anumit număr de microorganisme viabile/g sau ml şi un numar cât mai
redus de germeni nedoriţi;
-produşii metabolici să nu prezinte pericol pentru sănătatea omului;
-să nu conţină şi să nu producă antibiotice care se utilizează în scop terapeutic la om;
-să aibă anumite activităti specifice: de producere a acidului lactic, de reducere a
azotului etc;
-microorganismele existente în cultură să fie declarate cu numele stiinţific întreg;

Un mediu de cultură este un amestec de substanţe care asigură toate componentele

necesare pentru metabolismul celulei, şi anume:
- Surse de carbon;
- Azot;
- Substante minerale;
- Factori de creştere;
Mediile se folosesc pentru izolarea, multiplicarea şi conservarea microorganismelor
sau pentru obţinerea prin cultivare a produselor de biosinteză microbiană. Mediile pot fi
procurate de la firme producătoare sau pot fi preparate în laborator.
Cultura microorganismelor este utilizată pentru a creşte numărul de celule care se
doresc a fi studiate. Microorganismele sunt adăugate în mediul de cultură ce conţine nutrienţi
pentru creştere.
Cultura este incubată una sau mai multe zile, la temperatura optimă a fiecărui
microorganism. În multe cazuri microorganismele sunt crescute pe plăci cu agar.
Microorganismele se multiplică formând colonii. O colonie creşte în locul în care o singură

6
celulă a fost inoculată. O colonie este ca o clonă; ea poate fi pură daca nu exista în jurul ei alte
tipuri de microorganisme în colonii ce o pot contamina.
Mediile de cultură selective sunt medii definite sau complexe, cu o compoziţie
chimică bine definită, care permit dezvoltarea unui număr restrâns de microorganisme sau
chiar a unei specii. . Aceste medii conţin pe lângă substanţe nutritive şi inhibitori ai altor
microorganisme insoţitoare din microbiota din care se face izolarea culturii care se doreşte a fi
selecţionată.
Microorganismele adăugate la fabricarea brânzeturilor pot fi împartite în 2 mari grupe:
microorganisme starter şi microfloră secundară. Pe lângă acestea în timpul fabricaţiei se mai
pot dezvolta în brânză şi microorganisme non-starter provenite din lapte sau din contaminări
în timpul prelucrării.
Microflora starter este formată cu precădere din bacterii ce produc fermentaţia lactică,
proces anaerob de metabolizare a glucidelor sub acţiunea echipamentului enzimatic al
microorganismelor, având ca produs principal acidul lactic.
Microorganismele din cultura secundară nu contribuie la formarea acidului lactic, dar
în general joacă un rol important în timpul maturării.
Bacteriile lactice întâlnite frecvent în culturile starter sunt: Lactoccocus lactis,
Streptoccocus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, utilizate fie
individual, fie în combinaţii în funcţie de sortimentul de brânză.
O serie de microorganisme cunoscute sub denumirea de microfloră secundară, pot fi
adăugate alături de cultura starter. Din această categorie fac parte propionobacterii,
brevibacterii şi specii de mucegaiuri(Penicillium). Aceste microorganisme sunt utilizate
împreună cu bacteriile lactice şi sunt specifice unui anumit sortiment de brânzeturi.
Producerea de acid lactic de către microflora starter în timpul fabricării brânzeturilor
determină o reducere a Ph-ului laptelui care combinată cu un tratament termic şi amestecare
promovează sinereza prin expulzarea zerului din caş, contribuind semnificativ la unul din
procesele de baza ale fabricării brânzeturilor.
Maturarea brânzeturilor este un proces complex ce implica un număr de reacţii
biochimice la care iau parte şi concentraţii mari de microorganisme prezente în brânza. Atât
conţinutul de acid lactic cât şi procentul de transformare a lactozei în acid lactic reprezintă doi
indicatori foarte importanţi pentru evaluarea calităţii brânzeturilor. În timpul maturării,
culturile de bacterii suferă procesul de autoliză, eliberând enzime intracelulare în reţeaua de
brânza, iar aceste enzime vor continua să acţioneze asupra componenţilor caşului, dezvoltând
aroma şi producând modificările dorite de textură în timpul maturării.
• Bacteriile lactice
Caractere morfologice:bacteriile lactice prezinta heterogenitate morfologică.
Principalele forme sunt derivate de la forma coccus şi se găsesc sub forma de streptococi(g.
Streptococcus si Lactococcus), de diplococi(g. Leuconostoc), de tetrade( g. Pediococcus), iar
numeroase bacterii lactice se prezinta sub formă de bastonaşe.
Caractere fiziologice:bacteriile lactice folosesc ca sursă de carbon şi energie
pentozele,hexozele şi diglucidele. Dintre acizi, acidul malic poate fi transformat în acid
lactic,iar acidul citric în acetona şi diacetil.

7
 Numeroşi lactobacili au fost identificaţi în timpul maturării brânzeturilor.
Lactobacilii ocupă o nişă specifică în maturarea brânzeturilor. Lactobacilii au fost izolaţi din
brânzeturi şi supuşi identificării, iar cele mai raspândite sunt subspeciile găsite( Lactobacillus
casei, Lb. Fermentum, Lb. Brevis).

8
 Prezenţa microorganismelor heterofermentative- Lb. Fermentum, Lb.brevis a
determinat defecte de textură la brânza Cheddar. Adăugarea lactobacililor heterofermentativi
determină îmbunătăţirea calităţii brânzeturilor, în special prin accelerarea proceselor de
maturare.
• Cultura secundară
Propionibacterium- bacterii G(+), catalazo-pozitive, anaerobe/facultativ aerobe,
nesporulate.Patru specii sunt asociate cu brânza Elveţiana: Propionibacterium freundenreichii,
P. Thoenii, P. Jensenii si P. Acidopropionici. Fermentarea conduce la producerea de acid
propionic,acid acetic si dioxid de carbon.
• Culturi starter
Culturile starter contribuie la maturarea brânzeturilor,unde enzimele sunt implicate
în proteoliza şi în transformarea aminoacizilor în compuşi de aromă.
Se utilizează:
-culturi starter mezofile: pentru brânza Cheddar, Gouda, Edam, Brie şi Camembert;
- culturi starter termofile(50-55º C)- pentru brânzeturile tratate termic, brânzeturile
cu pastă tare.
• Microflora non-starter
Microflora non-starter reprezintă culturi mezofile de lactococi şi pediococi, care
reprezintă o parte importantă a florei microbiene în majoritatea brânzeturilor în timpul
maturării. Ele nu fac parte din microflora normală starter şi de regulă cresc în bune condiţii în
lapte şi nu contribuie la producerea acidului în vanele de coagulare.
Microorganismele implicate în producerea brânzei şi maturarea brânzei pot fi împărţite
în două grupe majore:
1) Microorganisme (placa) care se adaugă în brânză după ce au fost selectate cu atenţie
2) Bacterii lactice acide non-starter (NSLAB).
Primul grup poate fi subîmpărţit în două grupe:culturi starter primare şi secundare.
Bacteriile acide lactice sunt implicate în producţia de acid pe parcursul procesului de
fabricaţie şi contribuie la procesul de maturare. Microorganismele secundare nu contribuie la
producţia de acid şi constau în :
(a) bacterii lactice acide non-starter (NSLAB)
(b) alte bacterii, drojdii şi / sau mucegaiuri.
Microorganismele şi funcţia lor în producţia de brânzeturi sunt rezumate în tabelul 1.1.

9
 Tabelul 2. Microorganismele din brânză şi funcţia lor

Genul sau specia Functie cea mai importanta

Bacterii starter
Lactococcus Lactis Productia de acid si de aroma in timpul
maturarii
Leuconoctoc spp. Metabolismul citratului
Lactobacillus delbrueckii Productia de acid; formarea aromei in timpul
maturarii
Streptococcus thermophilus Productia de acid; formarea aromei in timpul
maturarii
Enterococcus spp. Formarea aromei in timpul maturarii
Bacterii lactice non-starter
Lactobacillus casei Formarea aromei in timpul maturarii
Pediococcus spp. Formarea aromei in timpul maturarii
Flora secundara
Corynebacterium spp.
Brevibacterium linens
Penicillium camemberti proteoliza
Penicillium roqueforti proteoliza
Yeasts Conversia lactatului in dioxid de C si apa

1.1.1. Tipuri de bacterii starter

Două tipuri de bacterii starter sunt utilizate în procesul de producere a brânzei:

termofile cu temperaturi optime de 42 ° C şi mezofile cu temperaturi optime de 30 ° C.
Criteriile de selecţie pentru tipul- 0 (un anumit tip starter) de culturi starter mezofile în
brânzeturile Cheddar sunt după cum urmează :

· Productia de acid la 21 şi 30-40 ° C

· Toleranta la sare
· Activitatea proteinazei si peptidazei

Bacteriile starter sunt bacteriile acidului lactic (LAB) şi funcţia lor este de a produce
acid în timpul procesului de fermentare, acidifierea laptelui pentru brânză la un nivel
corespunzător şi de asemenea, să contribuie la proteoliza în timpul coacerii. Ele prevăd, de
asemenea un mediu adecvat cu privire la potenţialul redox, pH, umiditate şi conţinutul de sare
pentru a permite activitatea enzimei din chimozina (cheag) şi culturi starter să procedeze
favorabil în brânză.
În afară de plasmina din lapte şi cheag, bacteriile acidului lactic(LAB) reprezintă
principala sursă de enzime proteolitice (proteinaze şi peptidaze) în brânzeturi. Ele transformă
cazeina în peptide mici şi aminoacizi liberi, care contribuie la aromă şi pot servi ca precursori
de aromă.

10
 Bacteriile starter cresc rapid în lapte pentru brânză şi caş în timpul producţiei,
ajungând la 108-109 ufc g-1, dar ulterior scad la aproximativ 1% din numărul maxim în
termen de o luna de maturare datorită pH-ului scăzut, epuizării de lactoză şi concentraţia
înalta de sare în caş. Moartea şi liza celulelor starter sunt importante deoarece enzimele
proteolitice intracelulare sunt eliberate în brânză unde degradează oligopeptidele la peptide
mici şi aminoacizi. Enzimele lor sunt implicate în transformarea proteinelor în aminoacizi şi
acizi graşi de la care compuşii de aroma sunt produşi .
Bacteriile starter sunt membri din genurile Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus,
Leuconostoc şi Enterococcus. De asemenea, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus
delbrueckii şi helveticus Lactobacillus sunt considerate ca bacterii starter .
Culturile starter sunt îngheţate în volume (200-1000 litri) sau congelate-uscate care
pot fi apoi adăugate direct la laptele pentru brânză. Inocularea laptelui minimizează riscul de
contaminare şi formatorii de aromă ce contribuie la aroma de dezvoltare sunt cunoscuţi a fi
prezenţi.
Culturile secundare pot fi definite ca acelea adăugate la brânză în alte scopuri decât
producţia de acid şi în esenţă, pot servi ca o sursă suplimentară de enzime.
Culturile secundare NSLAB necesită două caracteristici importante. Prima este că
tulpinile trebuie să ofere un echilibru de reacţii de maturare benefice în brânză. Adjuncţii sunt
selectaţi pe baza de lipsă de defecte specifice. Al doilea este că tulpinile adjuncţilor trebuie să
fie competitive împotriva NSLAB accidental în brânză Cheddar şi rămâne dominant în
timpul coacerii pentru a nu afecta aroma. În multe cazuri, această caracteristică este obţinută
prin selectarea NSLAB izolate de bună calitate.
Studiile au arătat că lactobacilii, folosiţi ca adjuvanţi, pot afecta dezvoltarea aromei în
brânză Cheddar. Cele mai multe rapoarte ale cercetătorilor consolideaza proteoliza şi
imbunătatirea intensitatii aromei . Astfel, selectarea tulpinii adjuvantului este crucială, pentru
că îmbunătăţirea tulpinii de Lactococcus casei produc brânza Cheddar de înaltă calitate, în
timp ce alte tulpini ale acestor specii a dus la brânză cu gust amar şi defecte. De obicei,
includerea de tulpini adjuncte de culturi non-starter de lactobacili îmbunătăţesc intensitatea
aromei, cresc aroma şi accelerează maturarea.
Culturile secundare implicate includ bacterii lactice acide nonstarter (NSLAB), care
cresc pe plan intern, în cele mai multe soiuri de brânză, bacterii (Micrococcus,
Corynebacterium), bacterii acid propionice (PAB), drojdii (Debaryomyces hansenii), matriţe
(Penicillum camemberti) şi lactobacili heterofermentativi(tabelul 1.1). Cele mai multe dintre
culturile secundare cresc în principal pe suprafaţa brânzei. Acestea sunt fie:
(a) contaminanţi accidentali
(b) în mod deliberat adăugate (drojdii).
Pentru anumite brânzeturi (Emmental) se utilizează şi Propionibacterium shermanii,
care fermentează acidul lactic cu producere de acid propionic, acid acetic şi dioxid de carbon,
care provoacă ``desenul`` brânzei(ochiuri mari). Pentru brânzeturile de tip Lamburger se
utilizează Brevibacterium linens, care contribuie la maturarea de suprafată a brânzei şi
formează colonii roşii-orange.
Sporii mucegaiului Penicillium roqueforti se utilizează la fabricarea brânzeturilor cu
mucegai în pastă, iar sporii de Penicillium Camemberti se utilizează pentru maturarea de
suprafată a brânzeturilor de tip Camembert, Brie etc.
Microflora variază numeric în timp. Astfel,dacă în brânza iniţiala se găsesc între
10000000 si 100000000 celule formatoare de colonii/g, pe măsura ce maturarea progresează ,
numărul de bacterii lactice se reduce, în funcţie de brânză şi în principal în dependenţă de
gradul de eliminare al lactozei, de nivelul de NaCl din brînza şi/sau gradul de autoliză al
bacteriilor lactice. Activitatea bacteriilor lactice este inhibată când micelul de NaCl în apa
conţinută de brânză este mai mare de 5%.

11
 Cultura starter de bacterii lactice se foloseşte după o prealabilă păstrare la frig(<10ºC)
de cel puţin 5-6 h, în intervalul maxim de 48h de la preparare.

1.1.2. Aspergillus niger

Este o ciupercă filamentoasă ce apartine clasei Ascomycete. Prezintă o repartiţie

mondială, dezvoltându-se pe materiile organice în descompunere în sol, în compost, cereale.
Prezente în micromediul uman pe plante, fructe, în aer. Sporii sunt vehiculaţi în aer şi datorită
dimensiunilor mici sunt inhalaţi intraalveolar. Sunt inofensivi pentru majoritatea populaţiei,
fiind eliminaţi prin apărarea specifică. Se estimează ca se găsesc între 1-20 spori/metru cub şi
inhalăm între 10-30 spori/zi. Un număr mic de specii sunt capabile să se dezvolte la 37°C
(temperatura corpului uman) şi provoaca boli (aspergiloza). Există numeroase forme de
aspergiloză, de la alergii la infecţii generalizate grave, adesea mortale. Severitatea
aspergilozei depinde de numeroşi factori, printre care sistemul imunitar al persoanei joacă rol
primordial.Sunt utilizate în industria agroalimentara şi în biotehnologii pentru fermentaţie,
producţia de enzime, producţia de acizi organici şi antimicrobiană.
Aspergillus este sursa de acizi organici, enzime şi fermentaţie. Folosirea
microorganismelor ca principală sursă de enzime se datorează faptului că se pot obţine
cantităţi mari de biomasă în timp relativ scurt şi în condiţii bine controlate, cât şi faptului că
se pot realiza nivele enzimatice crescute prin intervenţii asupra mediului de cultura şi a
parametrilor de bioproces sau asupra materialului genetic al microorganismului în procesele
fermentative fie în sistem submers, fie pe substraturi solide.
Tulpina Aspergillus niger CNMN FD 01 pe acest mediu formează intens
colonii abundente cu diametrul de 5-6 cm, sporulente, netede, miceliul aerian lipseşte, iar cel
de substrat este de culoare galbenă. Conidioforii sunt numeroşi, rotunzi, cafenii cu nuanţă
neagră.
Particularităţile fiziologice – biochimice.Creşte în limitele de
temperatură +5... +42 oC. Limitele valorilor pH-ului pentru dezvoltarea tulpinii 7,0 - 8,0.
Sursele de carbon. Asimilează activ: zaharoza, maltoza, lactoza, arabinoza si sorbita.
Nu asimilează: dulcita, D-dextroza si glucoza.
Sursele de azot. Asimilează azotul amoniacal, nitraţii şi nitriţii de azot, bulionul
peptonat.
Posedă capacitatea de a sintetiza enzime extracelulare: lipaze, amilaze, proteaze. Se
păstrează pe medii agarizate de malţ sau Czapec înclinate, la temperatura de +3...+5oC.
Termenul de reînsemânţare – 2 luni, reproducerea se realizează pe mediul de păstrare.
Temperatura de creştere +28...+30oC, durata – 12 zile.

Surse de carbon
Majoritatea microorganismelor utilizate în producerea de enzime sunt chemo-
organotrofe, ceea ce înseamnă că îşî procură energia şi carbonul din substanţe de natură
organică. Doar o cantitate redusă de carbon poate fi asimilată de microorganisme sub formă
de CO2 acesta fiind fixat de enzimele anaplerotice, cum sunt carboxikinaza si piruvat
carboxilaza.
Sursele de carbon de natura organică includ biopolimeri ( amidon, pectina,
celuloza ), monoglucide de tipul hexozelor ( glucoza ) si pentozelor ( xiloza ), diglucide,
triglucide, oligiglucide, alcooli, polioli, acizi organici, acizi grasi, aminoacizi, peptide si
polipeptide. Toti compuşii organici obţinuţi prin biosinteză sunt substraturi potentiale, dar
microorganismele, în funcţie de genul şi specia cărora aparţin, preferă să utilizeze doar
anumiţi compuşi.

12
 Principala sursă de carbon pentru microorganisme o reprezintă glucidele. Glucoza,
fructoza, galactoza sunt foarte uşor asimilate de către microorganisme. Maltoza , zaharoza,
lactoza sunt asimilate doar dacă microorganismele posedă enzime capabile să le transforme în
monoglucide. Deşi glucoza este utilizată des drept unică sursa de energie şi carbon în mediile
de laborator, ea rareori se găseşte libera în mediile fermentative industriale.
Surse de azot
Azotul din mediile în care se cultivă microorganismele are un rol anabolic, el
participând la biosinteza proteinelor structurale, a enzimelor funcţionale şi a acizilor nucleici.
Microorganismele utilizate în procesele de obţinere a enzimelor nu sunt diazotrofe, deci nu
sunt capabile de a fixa azotul atmosferic, motiv pentru care necesită prezenţa în mediul de
cultură surse de azot organic sau anorganic.
Surse de ioni anorganici
Circa 8% din substanţa uscată a celulelor microbiene este reprezentată de ioni
anorganici. Macronutrienţii ( N, P,S,Mg, K ) sunt necesari în cantităţi de ordinul
concentraţiilor milimolare. Micronutrienţii (Na, Ca, Fe, Co, Zn, Cu, Mn ) sunt necesari în
concentraţii micromolare sau chiar mai mici şi joacă roluri metabolice specifice. Caţiva ioni
metalici ( Ag, As, Ba, Ce, Cd, Hg, Li, Pb ) pot fi toxici pentru microorganisme la concentraţii
de circa 100 μmoli-l-1. Cele mai multe dintre mediile fermentative industriale şi apa folosită
pentru diluarea lor conţine ioni anorganici în proporţii adecvate creşterii microorganismelor,
încât suplimentarea acestora cu minerale nu este necesară. Mediile fermentative conţin
70.....90% apă, care acţionează ca solvent pentru nutrienţii conţinuţi de medii şi furnizează
elementele necesare a fi prezente în concentraţii foarte mici.

13
 1.2. Caracteristicile produselor finite

1.2.1. Generalităţi despre preparatele enzimatice

Industria alimentară este în fapt o biotehnologie. Materiile prime agroalimentare sunt

produse biologice şi implicit conservarea lor până la procesare sau până la consum implică
controlul şi monitorizarea riguroasă a activităţii enzimelor proprii ţesuturilor vegetale şi
animale, sau a activităţii enzimelor elaborate de microflora specifică.
Biotehnologia este un domeniu de o vastă interdisciplinaritate, situându-se la
interferenţa dintre biologie, microbiologie, biochimie şi inginerie genetică.
Enzimele proprii ţesuturilor vegetale şi animale sunt esenţiale în transformările pe care
materiile prime folosite în industria alimentară le parcurg până la produsul finit(ex: maturarea
fructelor şi legumelor, germinarea seminţelor folosite ca materii prime în industria panificaţiei
sau a berii, maturarea brânzeturilor şi a preparatelor din carne, maturarea vinurilor şi a
băuturilor distilate aromate).
Enzimele pot avea şi un rol deteriorativ cu implicaţii în modificarea caracterelor
senzoriale şi implicit cu pierderea valorii nutritive şi tehnologice a materiilor prime
agroalimentare.
Alături de enzimele existente în ţesuturile vegetale şi animale netratate termic un rol
important îl joacă şi microorganismele. Unele microorganisme fac parte din culturi
selecţionate, se adaugă într-un mediu de cultură în mod intenţionat, iar activitatea lor este
exploatată şi direcţionată către obţinerea unui produs alimentar cu valoare biologică ridicată
(produse lactate acide, vin, bere, oţet, alcool etilic, brânzeturi, preparate din carne, produse
farmaceutice, etc).
Altă categorie de microorganisme pot determina alterarea materiilor prime sau a
produselor alimentare. Acest motiv stă la baza impunerii unor norme de igienă foarte
riguroase.
În ultima perioadă, rolul biotehnologiilor a fost foarte bine conturat de tendinţe
moderne aplicate sub formă de preparate enzimatice mixte ca adaosuri exogene în industria
brânzeturilor, preparatelor din carne, etc. În egală măsură, şi nu mai puţin importante, în
conturarea tendinţelor moderne sunt mocroorganismele. Ele se folosesc sub formă de culturi
starter, singulare sau mixte, în industria laptelui, cărnii, etc.
Activitatea catalitica a enzimelor ,extrem de importantă din punct de vedere
fiziologic,prezintă şi o deosebită importanţă practică. O serie de industrii care prelucrează
materii prime de origine vegetală sau animală au de-a face în procesele lor tehnologice cu
reacţii catalizate de enzime care sunt proprii acestor materii prime sau sunt elaborate de
microorganismele ce se dezvoltă în/pe ele.

14
 Alte domenii; 6
Morarit,
panificatie; 5
Sucuri, vinuri; 10 Amidon; 30

Bere; 4

Distilate; 5
Produse lactate;
5 Detergenti; 35

Figura 2.Ponderea utilizării preparatelor enzimatice

Glucozizomeraze;
Alte enzime; 4
Pectinaze; 10 14

Amilaze fungice;
Proteaze fungice; 18
4

Amilaze bcteriene;
10

Proteaze Proteaze de
bacteriene; 35 coagulare; 5

Figura 3. Principalele tipuri de preparate enzimatice.

Reacţii enzimatice similare pot avea loc însă şi cu enzime izolate sau cu sisteme
enzimatice extrase din diverse surse bogate în enzime şi introduse apoi în procesele
tehnologice în scopul realizării unor transformări dorite. Aceste enzime sau sisteme
enzimatice izolate din mediile în care au fost elaborate se numesc preparate enzimatice. Ele se
caracterizează printr-o puritate mai mică sau mai mare în funcţie de cantitatea şi tipul
compuşilor proveniţi din sursa enzimatică ce le însoţesc. Cu alte cuvinte, preparatele
enzimatice pot fi mai mult sau mai puţin pure.
Preparatele enzimatice ca atare se obţin din următoarele materii prime:
• Ţesuturi animale: ficat, pancreas, mucoasă stomacală, inimă, rinichi;
• Ţesuturi vegetale: seminţe, cereale germinate şi negerminate, rădăcini, sevă,
latexuri, frunze;
• Microorganisme: bacterii, drojdii, mucegaiuri;
Cea mai importantă sursă de enzime o constituie microorganismele deoarece:
- se pot obţine în cantităţi mari(biomasa) prin cultivarea în instalaţii speciale
pe medii de cultură ieftine(tărâţă de grâu, extract de porumb, melasă, şroturi
de soia sau floarea soarelui);

15
 - ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt faţă de cel al
plantelor sau animalelor;
- producţia de enzime de către microorganisme poate fi mărită prin selectare şi
utilizarea de tulpini mutante, înalt performante(productive) şi prin stabilirea
condiţiilor optime fizice şi chimice pentru producerea de enzime;
- preparatele enzimatice obţinute pot avea activităţi diferite, cu predominanţa
unei activităţi.
Sursele de enzime de origine animală şi vegetală prezinta urmatoarele
avantaje/dezavantaje:
- sunt sigure din punct de vedere al inocuităţii preparatelor enzimatice care se
obţin;
- asigură obţinerea cu preponderenţă a unui anumit tip de enzimă;
- sunt limitate cantitativ;
- preparatele enzimatice obţinute sunt mai termosensibile;
Pentru selectarea unui microorganism care să producă enzima sau sistemul
enzimatic dorit, trebuie mai intâi să se testeze dacă microorganismele luate în lucru pot să
metabolizeze substanţa şi dacă printre reacţiile de metabolism se află şi reacţiile ce produc
transformarea dorită a substanţei. În cazul când un microorganism îndeplineşte aceste
condiţii, poate fi luat în lucru mai departe, selectarea efectuându-se după următoarele criterii:
- microorganismul să nu fie patogen;
- să nu elaboreze endo-, exo-, micotoxine;
- să nu posede activitate antibiotică sau potenţial alergen;
- să producă cu precădere şi în cantităţi mari enzima sau complexul enzimatic
dorit; se preferă mutantele constitutive nerepresibile prin produs final;
- să se dezvolte autoprotejat pe medii de cultură ieftine;
- să elaboreze enzima sau enzimele intracelular sau extracelular conform
utilizării celei mai eficiente a preparatului enzimatic;
- procesul de dezvoltare şi biosinteza a enzimelor să dureze cât mai puţin;
- să se preteze prelucrării tehnologice uşoare a mediului de cultură după
biosinteza , încât separarea biomasei de faza lichidă să se efectueze cât mai
simplu;
Preparatele enzimatice de origine microbiană trebuie să îndeplinească condiţiile:
- să fie libere de microorganisme patogene( bacterii din genul Salmonella
absente în 25 g probă,coliformi maximum 30 germeni în 10 g proba ) si
toxine microbiene;
- să fie lipsite de activitate antibiotică, factori alergeni sau alţi metaboliţi;
- să nu fie impurificate cu metale grele (As maximum 3 mg/kg, Pb maximum
10 mg/kg) ;
La producţia de preparate enzimatice de origine microbiană interesează ;
- sursa de microorganism folosită, care trebuie selecţionată după anumite
criterii;
- inocuitatea microorganismului producător de enzime(acesta trebuie să fie
recunoscut ca sigur din punct de vedere al inocuitaţii). Printre speciile de
microorganisme ce se folosesc menţionăm Aspergillus Niger, Aspergillus
oryzae,Mucor miehei, Saccharomyces cerevisiae etc.
- productivitatea sursei,care trebuie să fie maximă în condiţiile de fermentaţie
industrială ;
- stabilitatea genetică, în sensul păstrării caracteristicilor iniţiale în timpul
conservării şi preparării culturilor de producţie ;

16
 În vederea obţinerii preparatelor enzimatice trebuie ales un material biologic bogat în
enzime cu o înalta activitate catalitică; materialul trebuie să fie ieftin, uşor accesibil şi să se
prelucreze uşor.
Numărul preparatelor enzimatice utilizate în scopuri practice a crescut în ultimul timp
datorită marilor avantaje pe care le prezintă transformarea diferitelor substanţe.
Enzimele se mai numesc şi biocatalizatori de natură proteică, solubili, coloidali, sensibili la
acţiunea căldurii şi puternic dependenţi de condiţiile de mediu. Enzimele sunt sintetizate de
celule vii.
Într-un metabolism desfăşurarea secvenţială a fiecărei etape este posibilă numai sub
acţiunea biocatalizatorilor. Enzimele pot fi de natură vegetală, animală sau microbiană
(fungică sau bacteriană).

1.2.2. Preparate enzimatice folosite la maturarea brânzeturilor

1. Hidrolazele

Făcând excepţie de importanţa lor fiziologică, importanţa lor tehnologică constă în:
- hidroliza controlată a lipidelor din unele alimente în curs de finisare
(maturare), cum ar fi brânzeturile,salamurile crude, în care acizii graşi
eliberaţi pot participa la aroma produsului respectiv, sau se vor constitui ca
substraturi pentru formarea altor compuşi de aromă ;
- degradarea necontrolată a lipidelor;
O serie de preparate enzimatice se folosesc, în principal, la maturarea unor brânzeturi.
Aceste preparate enzimatice pot fi:
- lipaza pancreatică de vacă;
- lipaza gastrică;
-esterazele pregastrice;
-esteraza microbiană din Mucor miehei, Penicillium caseicolum, Pseudomonas
fluorescens, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae.
În ceea ce priveşte modul de acţiune al diferitelor enzime lipolitice, se menţionează
următoarele aspecte:
- lipazele acţionează în principal asupra trigliceridelor , având afinitate pentru
acizii graşi cu lanţ lung din structura trigliceridelor. Lipazele, având în
structura lor o parte hidrofilă şi una lipofilă, pot acţiona şi la interfaţa
ulei/apa, deci asupra emulsiilor de tip U/A care se formează în tractul
intestinal sau în vitro;
- esterazele acţionează în principal asupra gliceridelor care au acizi graşi cu
lanţ scurt în structura lor;

2. Proteinaze şi peptidaze

Proteoliza în brânză în timpul maturării este catalizată de enzimele din:

a)coagulant (chimozină, pepsină)
b)proteinaze din lapte (plasmină)
c) bacterii starter
d) culturi non-starter,adjuvanţi accidentali

17
 e) inocul secundar (în unele soiuri), de exemplu, Penicilium (P.) roqueforti,
camemberti P., linii Brevibacterium (Br.), Lactobacillus spp. (O dezvoltare recentă în
Cheddar)
f) proteinaze exogene şi / sau peptidaze sau celule bacteriene atenuate au fost
investigate recent ca un mijloc de accelerare a maturării sau accentuarea aromei .
Progresele de proteoliză în cele mai multe brânzeturi maturate pot fi rezumate după
cum urmează: hidroliza iniţială a cazeinei este catalizată în principal de coagulantul rezidual
şi într-o măsură mai mică, de plasmină şi catepsine D, probabil şi alte celule somatice
proteinaze. Acestea rezultă în formarea de peptidaze mari şi mijlocii, care sunt ulterior
degradate de coagulante şi de enzimele din culturile starter si non-starter. Peptidele mici şi
aminoacizii liberi sunt produse de acţiunea de proteinaze bacteriene şi peptidaze.
Proteoliza este evenimentul cel mai important şi cel mai complex . Proteoliza este
foarte importantă pentru textura brânzei prin hidrolizarea para-cazeinei matrice care dă
brânzei structura sa. O corelaţie înaltă există între intensitatea aromei brânzei Cheddar şi
concentraţia de aminoacizi liberi. Datorită caracteristicilor, cum ar fi înalta activitate
proteolitică şi lipolitică, unele specii de drojdii joacă un rol important în formarea de
precursori de aromă, cum ar fi aminoacizi, acizi graşi şi esteri.
Aminoacizii principali în brânză Cheddar sunt glicina,leucina,serina,
arginina,metionina. Aminoacizii contribuie direct la aroma brânzei cum unii aminoacizi au
gust dulce (de exemplu, glicina,serina,metionina,alanina), acru (de exemplu, aspartanul), sau
amar (de exemplu, valina,leucina) .

1.2.3. Acţiunea principalelor proteinaze în timpul maturării brânzei

Rata, amploarea şi natura proteolizei în timpul maturării brânzei, precum şi cantitatea

şi natura produselor de degradare, variază în funcţie de enzimele implicate, tipul de brânză,
precum şi condiţiile mediului de maturare. Proteoliza primară în brânză poate fi definită ca
degradarea individuală a diferitelor proteine care constituie matricea brânzei, ce reprezinta
schimbările β-, γ-, α-cazeinelor în peptide şi alte trupe minore care pot fi detectate de
electroforeze de poliacrilamidă.
Chimozina / Cheag
Chimozina a fost folosită ca enzima coagulantă a laptelui pentru producţia industrială
de brânză. Chimozina, enzima principală folosită la coagularea laptelui, hidrolizează iniţial
legătura Phe105-Met106 de к-NC, ceea ce duce la eliberarea de fragmente negative C-
terminal(CMP), astfel iniţiază coagularea laptelui .
Coagulantul contribuie indirect la dezvoltarea de aromă a brânzei Cheddar prin
producerea de peptide mari şi mijlocii care acţionează ca substraturi pentru culturile starter
(şi, eventual, non starter) proteinaze şi peptidaze care produc peptide mici şi aminoacizi liberi
din aceste substraturi. Aminoacizii eliberati pot contribui direct la aroma sau pot servi ca
precursori de compuşi de aromă. Coagulantul poate produce, de asemenea, peptide amare.
Chimozina este cea mai stabilă la valori de pH între 5,3 şi 6,3. În condiţii acide (pH 3-
4), enzima pierde activitatea rapid, probabil cauzată de auto-degradare. Solubilitatea
chimozinei este afectată de pH, temperatură şi tăria ionică a soluţiei.
Plasmina
Plasmina (PL) contribuie la proteoliză în timpul maturării unor soiuri de brânză, în
funcţie de temperatură şi de pH-ul de gătit în timpul maturării. Enzima este rezistentă la
căldură şi supravieţuieşte tratamentelor UHT . Plasmina ar putea fi o enzimă valoroasă pentru
maturarea accelerată şi dezvoltarea aromei în brânzeturi naturale. Prezenţa de plasminogen şi
de plasmină în lapte are o mare influenţă asupra calităţii laptelui şi a brânzeturilor maturate.

18
 Plasmina poate afecta în mod semnificativ proprietăţile laptelui pentru fabricarea
brânzei, în special în ceea ce priveşte maturarea brânzei. De asemenea, s-a raportat că
creşterea proteolizei ca urmare a activităţii plasminei în brânză are ca rezultat îmbunătăţirea
aromei şi a calităţii de ansamblu.
Plasmina există în lapte şi în forme active şi inactive, ambele fiind asociate cu micele
de cazeină. Activatorii plasminogenului sunt de asemenea asociaţi cu micele de cazeină din
lapte. În brânzeturi maturate la mare temperatură (> 50 ° C), plasmina joacă un rol important
deoarece chimozina este inactivată în aceste brânzeturi.

Figura 4. Reprezentarea schematică a sistemului enzimatic al plasminei în lapte

Proteoliza este caracteristică la cele mai multe soiuri de brânză şi este indispensabilă
pentru gust bun şi dezvoltări texturale. Proteinazele utilizate în prelucrarea brânzei includ:
a plasmină,
b cheag,
c proteinaze (peretele celular şi / sau intracelular) de bacterii starter şi nonstarter.
Aproximativ 6% din cheagul adaugat în lapte pentru brânză rămâne în caşul după fabricaţie şi
contribuie în mod semnificativ la proteoliza în timpul coacerii. Combinaţii neutre de
proteinaze individuale şi peptidaze microbiene intensifică aroma brânzei şi atunci când sunt
utilizate în combinaţii cu cheaguri microbiene reduc intensitatea de amărăciune cauzată de
acesta din urmă. Proteazele acide în izolare provoaca amărăciune intensa. Diferite lipaze
animale sau microbiene au dat aroma pronunţata brânzei, amărăciunea şi râncezirea a scăzut
puternic, în timp ce lipazele în combinaţie cu proteinaze şi / sau peptidaze dau gust bun
brânzei, cu un nivel scăzut de amărăciune. Într-o abordare mai echilibrată la accelerarea de
maturare a brânzei folosind amestecuri de proteinaze şi peptidaze, celulele atenuate de pornire
sau extracte de celule-free (CFE) sunt favorizate.
Sistemul proteolitic de bacterii de acid lactic este esenţial pentru creşterea lor în lapte
şi contribuie în mod semnificativ la dezvoltarea aromei în produsele din lapte fermentat.
Sistemul este compus din proteinaze proteolitice, care scindează iniţial proteina din lapte la
peptide; peptidazele care despică peptidele la peptide mici şi aminoacizi, precum şi sistemul
de transport responsabil pentru absorbţia celulara de peptide mici şi aminoacizi. Bacteria
acidului lactic are un sistem complex proteolitic capabil de conversia cazeinei din lapte in
aminoacizii liberi şi peptidele necesare pentru creşterea acestora. Aceste proteinaze includ
proteinaze extracelulare, endopeptidaze, aminopeptidaze, tripeptidaze şi peptidaze specifice,

19
care sunt toate serin-proteaze. În afară de proteinaze lactice streptococice, multe alte
proteinaze de origine nonlactostreptococica au fost raportate.
Folosirea enzimelor pentru accelerarea maturării brânzeturilor presupune costuri
relativ scăzute, acţiune specifică şi posibilitatea stabilirii proprietăţilor senzoriale, dar poate
prezenta dificultăţi de încorporare uniformă a enzimelor şi risc de supramaturare.
Maturarea brânzeturilor începe în vana de prelucrare, faza fermentării lactice se
desfăsoară rapid în timpul pregătirii pentru coagulare si coagularea laptelui. Prin introducerea
în laptele pasteurizat de culturi selecţionate de bacterii lactice se poate dirija procesul de
maturare a brânzeturilor; obţinându-se produse cu caracteristici calitative constante şi
uniforme, prevenind influenta variaţiilor zilnice de ordin microbiologic ale laptelui de
colectare asupra calităţii brânzeturilor. Toate operaţiile ulterioare momentului obţinerii
coagulului, au drept scop aducerea coagulului într-o masă compactă, asigurându-se totodată
condiţii favorabile dezvoltării bacteriilor lactice specifice, care să aibă activitate enzimatică
necesară transformărilor dorite a principalelor componente din brânză.
În procesul de maturare a brânzeturilor se pot distinge două faze: prima fază,
reprezentată de primele 10 zile de maturare, se caracterizează printr-o modificare lentă a
valorilor parametrilor, iar în a doua fază, după 10 zile de maturare în condiţiile respective,
parametrii suferă modificări semnificative.
În altă ordine de idei, analizând compoziţia brânzeturilor se poate estima timpul de
maturare al acestora.

1.2.4. Alte enzime din lapte

Alte enzime utilizate pentru aplicarea de produse lactate sunt:

(a) proteaze pentru a reduce proprietăţile alergice ale produselor din lapte de
vacă pentru sugari
(b) lipazele pentru dezvoltarea de arome lipolitice în brânzeturi de
specialitate.
Proprietăţile funcţionale ale proteinelor din lapte pot fi îmbunătăţite prin proteoliza
limitată prin modificarea enzimatică a proteinelor din lapte. O cazeină acidă-solubila, fără
aroma şi potrivită pentru încorporarea în băuturi şi alte alimente acide a fost elaborată de
către proteoliza limitată. Antigenitatea de cazeină este distrusă de proteoliza şi hidrolizatul
este potrivit pentru utilizarea în produsele alimentare de lapte pe bază de proteine pentru
sugari alergici la lapte de vacă.
 Proteaza alcalina(plasmina sanguina).
Aparţine serin proteazelor şi prezintă o activitate enzimatică de tip tripsinic. Această
enzimă este asociată cu micele de cazeină. Are activitate maximă la 37 ºC şi la Ph= 7,5- 8,0.
Proteaza alcalină are o termorezistenţă relativ ridicată. Este o enzimă de origine sanguină care
ajunge din plasma sanguina , via epitelium-ul glandei mamare. Se găseşte în lapte atât sub
formă activă cât şi sub formă inactivă.
Proteaza alcalină degradează preferenţial ß-cazeina .
k-Cazeina este cea mai rezistentă la acţiunea proteazei alcaline. Datorită faptului că
atât plasmina cât şi plasminogenul sunt legate de cazeină şi datorită faptului că rezistă în mare
măsură pasteurizării, enzima va ramâne în coagul şi va participa la maturarea brânzeturilor,
acţiunea sa crescând odată cu creşterea Ph-ului brânzei.
Acest lucru este vizibil în cazul brânzei Camembert, unde acţiunea enzimei se
intensifică la sfârşitul maturării, deoarece mucegaiul P. Camemberti consumă acidul lactic şi
provoacă ridicarea Ph-ului la 6,5-7, când activitatea plasminei este optimă. Activitatea
enzimei în brânză va fi influenţată şi de concentraţia în NaCl, temperatura de maturare şi
umiditatea brânzei.

20
 Deoarece plasmina rezistă tratamentului UHT, ea va produce un defect important în
laptele concentrat sterilizat UHT, gelificarea fiind consecinţa modificării suprafeţei micelelor
de cazeină, ceea ce conduce la asocierea lor în agregate cu formare de gel.
 Lipoproteinlipaza
Este o enzimă asociată cu membrana globulelor de grăsime, ea fiind activată de
cofactori termostabili şi inhibată de un inhibitor. Lipoproteinlipaza produce râncezirea
lipolitică spontană a laptelui, momentul apariţiei râncezirii fiind determinat de concentraţia
laptelui în enzimă, raportul activator/inhibitor şi de factorii care promovează eliberarea
enzimei din membrana globulelor de grăsime. Poate contribui la maturarea brânzeturilor în
condiţiile fabricării acestora din lapte crud sau termizat(63ºC/30 sec).
 Esterazele
Cele din lapte de vaca au temperatura optimă de 37ºC si ph-ul optim la 8,0. Esterazele
din lapte au caracter lipofil şi au specificitate mai mare faţă de acizii cu lanţ scurt din structura
trigliceridelor. Acţionează mai bine în emulsie de tipul A/U. Pot participa la maturarea
brânzeturilor cu mucegai la suprafaţă(P. Camemberti), daca acestea sunt obţinute din lapte
crud sau termizat.
 Proteaza acida
Cea din lapte prezintă activitate maxima la ph= 3,5-4,0 si la 50ºC, şi degradeaza
preferenţial α-cazeina,comparabil cu chimozina. Enzima poate contribui la maturarea
brânzeturilor, daca se foloseşte lapte nepasteurizat sau termizat.
 Peptidaza
În lapte s-a pus în evidenţă o dipeptidază care hidrolizează peptidele L-L la ph alcalin .
Peptidele ce conţin D-aminoacizi nu sunt hidrolizate.Condiţiile de activitate sunt:
temperatura 45-50ºC şi ph=7,8-8,3. Enzima poate interveni la maturarea brânzeturilor cu
mucegai la suprafaţă, în condiţiile în care s-a folosit lapte crud sau termizat.
 Fosfataza acida
Se găseşte în lapte în stare liberă şi asociată cu membrana globulelor de grăsime şi
este implicată în defosforilarea cazeinei, cauzând creşterea punctului izoelectric, cu influenţă
asupra coagulării cu cheag. Enzima rezistă la pasteurizare normală. Poate conduce la
desfacerea miceliilor de cazeină tocmai datorită defosforilării.Contribuie în mică masură la
maturarea brânzeturilor, dacă se foloseşte lapte crud sau termizat.

Lipoliza aduce o contribuţie importantă la aromele brânzei, datorită enzimelor

lipolitice din culturile starter. Aroma caracteristică piperata de brânză cu mucegai se datorează
acizilor graşi cu lanţ scurt şi metil cetonelor. Cele mai multe dintre lipolize în brânza cu
mucegai sunt catalizate de lipaza Penicillium roqueforti, cu o contribuţie mai mică a lipazei
din lapte. Procesul NOVO pentru producţia de enzime modificate de brânză, foloseşte brânză
de vârstă medie, care este emulsionata, omogenizata, pasteurizata şi după care se adaugă
lipaza din R. miehei, cu sau fără proteinază şi amestecul este maturat la o temperatură înaltă
pentru 1-4 zile. Amestecul este reîncălzit, rezultă o pastă care este potrivita pentru a fi inclusă
în supe, sosuri sau snacks-uri. Tehnologia producţiei de enzime modificate ale brânzei a fost
dezvoltată pentru a produce o gamă largă de arome caracteristice brânzei şi intensificări de
aromă. Susţinerile că enzimele exogene sunt eficiente în accelerarea maturării nu a condus la
utilizarea lor la scară largă, probabil din cauza costului ridicat al acestora, dificultăţi în
distribuirea uniforma în caş şi posibil pericol de supra-maturare a brânzei.
Alte enzime minore având aplicaţii limitate în prelucrarea laptelui includ
glucozooxidază, catalaza, superoxid dismutaza, oxidază sulfhidril, lactoperoxidază şi
lisosomi. Glucozooxidaza şi catalaza sunt adesea folosite împreună în alimente selectate
pentru conservare. Superoxid dismutaza este un antioxidant pentru alimente şi generează apa
oxigenata, dar este mult mai eficace atunci când catalaza este prezentă. Generaţia termica

21
indusă de grupuri volatile de sulfhidril este considerată a fi responsabilă pentru pregatirea
aromei laptelui procesat în temperatură ultraînaltă (UHT). Utilizarea de oxidază sulfhidril în
condiţii aseptice poate elimina acest defect. Mecanismul natural inhibitoar în laptele crud se
datorează prezenţei unor niveluri scăzute de lactoperoxidază (LP), care poate fi activat prin
adăugarea externă de urme de apă oxigenată şi tiocianat. A fost raportat că potenţialul
sistemului de lactoperoxidază şi activarea acestuia îmbunătăţeşte calitatea păstrarii laptelui.
Laptele de vacă poate fi prevăzut cu factori de protecţie prin adaosul de lizozim, făcându-l
potrivit ca un lapte pentru sugari. Lizozimul acţionează ca un conservant prin reducerea
numărului de bacterii din lapte fără a afecta activitatea L. bifidus. Domeniul de aplicare a
enzimelor minore la lapte şi produse lactate a fost recent revizuit.
Fabricarea brânzei şi maturarea presupune acţiunea unor enzime (de la cheag şi lapte)
şi a microorganismelor selectate, atât direct, în timpul creşterii, şi indirect, prin intermediul
enzimelor după moarte şi liză. Modificările microbiologice la brânză în timpul coacerii
include moartea şi liza celulelor starter şi o creştere a florei adventive cum ar fi bacteriile non-
starter ale acidului lactic. Textura brânzei se înmoaie în timpul maturării ca o consecinţă a
hidrolizei miceliilor cazeinei în timpul proteolizei si modificări ale pH-ului (care, la rândul
lor pot provoca alte modificări, cum ar fi migraţia şi precipitarea de fosfat de calciu).
Modificările biochimice care au loc în timpul coacerii pot fi grupate în evenimente primare
care includ metabolismul lactozei reziduale şi de lactat şi citrat, lipoliza şi proteoliza. În urma
acestor evenimente primare, evenimentele biochimice secundare sunt foarte importante pentru
dezvoltarea de compuşi volatili de aroma şi includ metabolismul acizilor graşi şi al
aminoacizilor. Un echilibru între produsele primare şi secundare s-a dovedit a fi responsabil
pentru aroma şi textura brânzei tipice (Kheadr et al 2003.,).
Brânza coagulată cu cheag este maturată pentru o perioadă cuprinsă între două
săptămâni şi doi sau mai mulţi ani, de exemplu extra-maturea brânzei Cheddar, în timpul
căreia şi textura şi aroma caracteristice soiului se dezvoltă. Maturarea de obicei implică
modificări ale microorganismelor din brânză, inclusiv moartea şi liza celulelor starter,
dezvoltarea microorganismelor non-starter accidentală şi în multe brânzeturi, creşterea
microorganismelor secundare .
Maturarea brânzei Cheddar este afectată în principal de rata şi gradul de proteoliză.
Enzime din mai multe surse contribuie la proteoliza şi dezvoltarea de textură şi aromă în
timpul coacerii. Aceste enzime provin din lapte (în principal plasmina), coagulant (cheag),
microorganisme din culturi starter şi non-starter .
În timpul maturării brânzei, trei mari evenimente biochimice primare au loc- lipoliza,
glicoliză şi proteoliza, fiecare dintre acestea fiind implicată în formarea aromei. Acesta din
urmă este cel mai important şi de asemenea, cel mai complex .
Glicoliza este conversia lactozei în acid lactic şi se datorează creşterii bacteriilor
starter şi produsul lactat dă brânzei gustul proaspăt acid general. Acestea pot produce de
asemenea, acetat de diacetil şi acetaldehidă, care sunt compuşi importanţi în formarea aromei
în brânzeturi proaspete; diacetil este de asemenea, un compus de aromă important în
brânzeturi dure.
Lipoliza rezultă din hidroliza grăsimei din lapte şi producţia de acizi graşi liberi şi
glicerină. Acizii graşi pot fi în continuare metabolizaţi la metil cetone şi grăsimi, de
asemenea, şi acţionează ca un solvent pentru multe dintre aromele compuşilor produşi în
brânză .
Sursele de proteinază din brânză este laptele în sine, chimozina (cheag), bacterii
lactice acide(placa), bacterii lactice acide non-starter (NSLAB) şi microorganismele
secundare (micrococci, drojdii si mucegaiuri). Proteinaza laptelui este plasmina şi este
semnificativă în brânză atunci când chimozina este inactivată în timpul gătirii brânzei.

22
 Peptidele mici produse din hidroliza de cazeină pot fi defalcate în aminoacizi mai
mici, peptide, amine, alcooli şi compuşi de sulf, care contribuie la formarea aromei, prin
autoliza de placa care eliberează proteinaze şi peptidaze. Combinarea perfectă a acestor
compusi este responsabilă pentru aroma diferită a brânzeturlor. Pentru o prezentare generală a
căilor biochimice în timpul maturării brânzei se referă fig. 1.1.

Figura 5. Privire de ansamblu privind transformările biochimice în timpul maturării

brânzeturilor

Preparatele enzimatice cu acţiunea de coagulare a laptelui sunt cunoscute sub

denumirea de ``cheag microbian``.
Lipsa tot mai accentuată a cheagului de origină animală a dus la sporirea preocupărilor
pentru a găsi modalitatea de rezolvare a situaţiei în condiţiile în care producţia de brânzeturi
are tendinţe de creştere. La scară industrială se produc cheaguri microbiene, prin biosinteză cu
diferite micete.

1.2.5. Maturarea brânzeturilor

Maturarea brânzeturilor este ansamblul de fenomene chimice, microbiologice şi

enzimatice care asigură produsului totalitatea caracteristicilor organoleptice specifice
sortimentului.
Procesul de maturare are loc în anumite condiţii de microclimat, într-un timp mai mult
sau mai puţin îndelungat, în raport cu sortimentul fabricat, timp în care principalii
componenţi: lactoza, substanţele proteice şi grăsimile suferă o serie de transformări. Lactoza
este fermentată în acid lactic în totalitate în primele 10 zile de maturare. În continuare acidul
lactic sub influenţa unor microorganisme este transformat în acid propionic, acid acetic şi
dioxid de carbon, contribuind la formarea aromei şi desenului pastei. Grăsimea suferă
modificari mai importante, în special în cazul brânzeturilor cu mucegai, cu formare în prima
etapă de acizi graşi şi glicerină şi în faza următoare de aldehide şi cetone care asigură un gust
particular acestor brânzeturi. Substanţele proteice în timpul maturării suferă o hidroliză

23
enzimatică cu formare de compuşi mai simpli şi usor digerabili. Gradul de transformare a
substanţelor proteice este în relaţie directă cu durata maturării.
Procesul de maturare cuprinde trei faze:
-prematurarea, când are loc acidifierea pastei prin transformarea lactozei în acid lactic,
o slabă degradare a cazeinei şi formarea găurilor specifice la anumite brânzeturi, prin acţiunea
bacteriilor propionice;
- maturarea propriu-zisa, cunoscuta sub denumirea de ``affinage``, în care continuă
transformările biochimice, dar cu o viteza mai redusă şi în care se definitivează aroma
specifică brânzei respective ;
Activitatea enzimelor implicate în maturare este influenţata de: compoziţia brânzei
crude, structura micelelor de cazeină şi a grăsimii, umiditatea brânzei, ph-ul brânzei,
temperatura de maturare, potenţialul redox al brânzei, conţinutul de NaCl din brânza.
Enzimele implicate în maturare sunt cele proteolitice şi lipolitice, cu specificaţia că, imediat
după adaugarea de culturi lactice, are loc transformarea lactozei în acid lactic. Consecinţa
acumulării de acid lactic este scăderea ph-ului, care trebuie să fie diferit la 24h, în funcţie de
felul brânzei:
-brânzeturi cu ph=5 şi peste 5(brânzeturi cu încalzirea la temperaturi ridicate);
-ph=5 şi sub 5( brânzeturi moi , Cheddar şi brânzeturile la fermentarea cărora participă
mucegaiurile).
În timpul maturării brânzeturile sunt supuse unor tratamente şi îngrijirii speciale-
întoarcere,spălări cu soluţii cu 2-3% sare.
Cu excepţia brânzei proaspete, caşul se maturează la diferite temperaturi şi durate de
timp până la atingerea aromei caracteristice, texturii şi profilului. Agentii de maturare ai
brânzei sunt:
- bacteriile şli enzimele din lapte;
- culturile lactice;
- specie;
- lipaze;
- mucegaiuri sau drojdii adăugate;
- contaminanţii din mediul inconjurător;
Astfel, conţinutul microbiologic de caş, compoziţia biochimică a caşului, precum
şi temperatura şi umiditatea influenţează produsul final. Această etapă finală variază de la
câteva săptămâni până la ani în funcţie de soiul de brânză.
Enzimele cele mai populare folosite pentru a închega laptele se numesc
proteaze.Acesta funcţionează prin distrugerea unei proteine din lapte numită cazeina Kappa.
O altă enzimă importanta este cheagul. Cheagul este un acid lactic, utilizat pentru a ajuta la
accelerarea procesului cu proteaze, dar se găseşte în membrana de stomac a unui viţel! Ea
vine în multe forme diferite derivate din animale, vegetale şi cele produse genetic! Enzima
activă în cadrul cheagului este numită chimozina şi o dată adăugata în lapte, începe
coagularea acestuia.
- Transformarea de cazeină, defalcată din proteaze la paracazeină sub influenţa
cheagului.
- Precipitarea paracazeinei în prezenţa ionilor de calciu.
Toate acestea au loc din cauza temperaturilor specifice, acidiătii şi calciului, din cauza
naturii sale ionice, în lapte. Cu toate acestea, cea mai bună temperatură pentru reacţia
normală a cheaguluilui este de 40 ° C, dar temperaturile mai mici sunt utilizate în mod normal
în practică, în principal pentru a evita duritatea excesivă de coagulare.
Proteoliza apare în toate soiurile de brânză şi este o condiţie prealabilă pentru
dezvoltare aromei caracteristice, care poate fi reglementată prin utilizarea adecvată a agenţilor

24
de mai sus. Maturarea brânzei este în esenţă un proces enzimatic, care poate fi accelerat prin
creşterea activităţii enzimelor cheie. Acest lucru are avantajul de a iniţia mai multe acţiuni
specifice pentru dezvoltarea aromei faţă de utilizarea de temperaturi ridicate care pot duce la
accelerarea reacţiilor adverse nespecifice, şi în consecinţă, în afara dezvoltarea aromei.
Enzimele pot fi adăugate pentru a dezvolta arome specifice în brânzeturi. Căile care duc la
formarea de compuşi de aromă sunt în mare parte necunoscute, şi, prin urmare, utilizarea de
enzime exogene pentru a accelera maturarea este în cea mai mare parte un proces empiric.
Diferite enzime microbiene folosite pentru a accelera maturarea brânzei sunt prezentate în
tabelul 2.

Enzimele proteolitice ale bacteriilor de acid lactic în produsele din lapte fermentate.

1.2.6. Condiţii de maturare a brânzeturilor şi tratarea acestora în timpul maturării.

Maturarea brânzeturilor se face în încăperi condiţionate, pe stelaje fixe sau mobile,

temperatura de maturare fiind de 20-26ºC pentru brânzeturilor de format mare (maturare caldă) şi
de 15-20 ºC pentru cele de format mic. Definitivarea maturării se face în încaperi cu temperatura
de 10-14 ºC. În timpul maturării se păstrează o anumită umiditate relativă , care este în funcţie de
tipul de brânză:
-la brânzeturile Camembert, Brie, Roquefort, pentru asigurarea dezvoltării mucegaiului
sunt necesare umiditaţi relative mai mari(φ>90%);
- la celelalte tipuri de brânzeturi se recomandă la început o umiditate relativă mai mare,
pentru a favoriza difuzia sării în interior, apoi o umiditate relativă mai scăzută, pentru a preveni
dezvoltarea mucegaiurilor şi a mucilagiilor la suprafaţa brânzei(φ<80%);
Ventilaţia activă este necesară când se urmăreşte zvântarea brânzeturilor, mai ales după
scoaterea acestora din saramură. O ventilaţie mai redusă este recomandabilă la brânzeturile cu
mucegai şi pastă moale.
Tratamentele la care sunt supuse brânzeturile în cursul maturării pot fi:
- tratarea suprafţtei cu sare, ştergerea uscată, răzuirea:
 La brânzeturile tari:presărarea de sare pe suprafată, frecarea cu peria, spălarea cojii
de saramură, răzuirea cojii când este prea groasă;
 La brânzeturile moi cu mucilagii: întinderea mucilagiilor şi eventual spălarea cu
saramură;
 La brânzeturile cu mucegai în interior: curaţirea suprafeţei prin răzuire;

25
  La brânzeturile semitari: spălarea cu saramură sau apă de var;
-spălarea: toate brânzeturile, cu excepţia celor care se maturează cu B.linens, se spală cu
apă calduţă la anumite intervale, după care se aşează pe ``cant`` pentru uscare;
-întoarcerea- este necesară pentru a împiedica deformarea, asigurând totodată o sărare şi o
maturare uniformă. La întoarcere are loc şi o schimbare de loc a brânzeturilor, cele mai maturate
fiind aduse pe rafturile de jos ale stelajelor;
-parafinarea şi ambalarea în folii plastice în timpul maturării, care au drept scop reducerea
pierderilor în greutate prin deshidratare în timpul maturării şi depozitării, reducerea manoperei de
îngrijire şi întreţinere a brânzeturilor în timpul maturării şi depozitării acestora, creşterea
conservabilităţii brânzeturilor.
Parafinarea se face, de regulă, spre sfârşitul maturării, când coaja este deja formată şi
uscată.
Ambalarea în folii plastice se poate face înca de la terminarea preparării, pentru ca
maturarea să se facă în ambalaj.

1.2.7. Accelerarea maturării brânzeturilor

Căile de accelerare a maturării brânzeturilor constau în intensificarea reacţiilor de

proteoliza,care se poate realiza pe următoarele căi:
- prin stimularea producţiei de enzime proteoilitice de către microorganismele
existente în brânză, ceea ce se poate realiza prin temperatura de maturare.
Această tehnică se aplică la brânzeturile tari şi semitari.
- Prin adaos de enzime proteolitice din diferite surse(Aspergillus oryzae,Bacillus
subtilis);
Adaosul de enzime proteolitice se face prin una din următoarele metode:
-soluţia de preparat enzimatic se adaugă în laptele destinat fabricării brânzeturilor
înainte de coagulare. În acest fel, repartizarea enzimei în coagul este omogenă iar durata de
contact substrat-enzimă este maximă. Metoda prezintă dezavantajul că pierderea de enzimă în
zer este foarte mare;
-soluţia de preparat enzimatic se poate adauga direct în coagul la formarea brânzei, în
acest caz pentru a obţine o aromă comparabilă cu celălalt caz este necesară o cantitate de 9 ori
mai mică de preparat enzimatic. Dezavantajul metodei este repartizarea neuniformă a
preparatului enzimatic în coagul;
-soluţia de preparat enzimatic se poate introduce prin injectare în brânza deja formată.
Metoda este pretabilă în cazul brânzeturilor cu pastă moale, de format mic;
-preparatul enzimatic se poate incapsula mai întâi în gelatina sau grăsimea din lapte,
iar microcapsulele se distribuie în lapte înainte de coagulare.

1.2.8. Enzime incapsulate

Obiectivul producţiei de brânză a fost în primul rând conservarea de constituenţi din

lapte, apoi stabililatea produsului. În timp ce stabilitatea la depozitare este în continuare
importantă, ea nu mai este obiectivul principal al fabricarii brânzeturilor, o calitate inalta
constantă fiind ţinta. Deoarece maturarea este scumpă, accelerarea de maturare, în special de
umiditate mica, maturarea soiurilor lente este de dorit, cu condiţia ca echilibrul corect să poate
fi menţinut (Fox et al.., 1996)
O perioadă de maturare este necesară pentru dezvoltarea aromei în majoritatea
tipurilor de brânză şi se poate extinde până la 1-2 ani pentru unele soiuri de brânză tare.

26
Încercările de a scurta timpul de maturare folosind o gamă de sisteme de maturare au avut
diferite grade de succes. Abordări care au fost utilizate includ adăugarea de enzime exogene
sau şlamuri brânză de vaci, utilizarea de culturi starter modificate sau noi şi temperaturi
ridicate de maturare.
Întrucât caracteristica aromei, gustul şi textura unei brânze este rezultatul acţiunii a
numeroase enzime, utilizarea unei singure enzime pentru a accelera maturarea este de natură
să perturbe echilibrul componentelor de aromă şi gust si provoacă defecte. Extractele celulare
brute preparate din bacterii, drojdii sau mucegaiuri au fost studiate extensiv. Amestecuri de
proteaze / peptidaze, proteaze / lipaze sau de proteaze / peptidaze / lipaze, de asemenea, au
fost evaluate pentru a accelera maturarea a mai multe tipuri de brânzeturi. Toate aceste studii
au fost efectuate cu ajutorul enzimelor proteolitice şi lipolitice liber adaugate laptelui pentru
brânză, care poate afecta negativ gustul şi criteriile texturale ale brânzei care rezultă prin
atacarea prematura a substraturilor în plus faţă de contaminarea zerului din brânză.
Utilizarea enzimelor microincapsulate a fost propusă pentru a reglementa reacţia
enzimă / substrat şi, prin urmare, evita dezavantajele enzimelor libere. În 1978 disponibil doar
comercial "de pe raft" proteinazele si lipazele alimentare au fost adăugate la brânză pentru a
încerca să facă maturarea mai repede. Aceste enzime cu siguranţă fac brânză mai puternică,
dar aroma lor a devenit dezechilibrată, cu o incidenţă ridicată de amărăciune. De asemenea,
brânzeturile care conţin proteinaze aveau textura săraca, din cauza defalcării rapide şi
excesive a cazeinei.
Proteinazele adăugate să spargă cazeina în brânză sunt necesare numai în cantităţi
foarte mici, deoarece, la fel ca toate enzimele, ele sunt catalizatori şi o cantitate mică va
converti o cantitate mare de substrat. Maturarea proteazelor, de asemenea, elimină rapid
peptide solubile din cazeină. Aceste peptide sunt pierdute în zer atunci când brânza de vaci
este separată, cauzând pierderi inacceptabile pentru a produce brânză. De asemenea,
defalcarea timpurie a cazeinelor întrerupe ordonat structura lor, previne formarea
corespunzătoare a gelului şi face brânza de vacă moale si nefuncţionala în etapele ulterioare
ale acidifierii caşului, înainte de sărare şi apăsând în brânză. Adăugaţi la aceste probleme
pierderea de enzime adăugate în zer şi este clar că adăugarea de proteinaze direct in lapte nu
este o opţiune .
Serin proteinazele mamifere participa la procesele fiziologice, unele dintre cele mai
cunoscute fiind digestia şi coagularea sângelui. Chemotripsina, subtilizina şi tripsina sunt o
familie de diverse enzime care apar la animale, bacterii (cum ar fi fradiae şi Bacillus TA39
Streptomyces) şi viruşi. Plasmina însuşi este o tripsină cum ar fi serin- proteinaza originară
din sânge.
Enzimele microincapsulate sunt soluţia evidentă a problemei de mai sus, pentru a
proteja cazeina din lapte. Opţiuni includ amidon, grăsimi sau capsule de gelatină, dar nici una
dintre aceste nu are un mecanism satisfăcător de "eliberare" în brânză. Microcapsulele
enzimatice separă fizic enzima din substrat în caş şi enzima este eliberată numai în caş la
defalcarea capsulei în timpul maturării.
Câteva încercări au fost făcute pentru a reduce perioada de maturare prin adăugarea de
enzime, dintre care unele au fost raportate să reducă la jumătate perioada de maturare normală
de brânză . Adăugarea directa de enzime în lapte nu a avut succes din cauza pierderii de
enzime din zer, distribuţia săracă de enzimă, randament redus şi calitatea brânzei slabă.
Încorporarea de enzime incapsulate elimină problemele asociate cu adăugarea directă de
enzime. Microcapsulele enzimatice separă fizic enzima din substrat în caş şi enzima este
eliberată numai în timpul maturării.

27
 1.3. Variante tehnologice de obţinere a produsului finit

Datorită utilizării proteazelor pe scară largă a crescut interesul faţă de obţinerea industrială
a acestor enzime. Acest fapt a dus la cercetări în domeniu pentru obţinerea de tulpini înalt
productive, pentru obţinerea acestor enzime în stare de puritate avansată şi pentru stabilirea
parametrilor optimi de activitate.
O serie de proteaze sunt obţinute industrial şi comercializate ca preparate enzimatice care
sunt utilizate în diferite sectoare ale industriei alimentare, farmaceutice, etc.

Figura 6. Schema tehnologică de obtinere în condţtii de laborator a preparatului enzimatic

28
 Făină de KH2PO
Amidon Extract de porumb MgSO4·
soia 0.5 g %
solubil 4 7H2O Apă
2.5 g 0.2 M
2g% 0.012 g %
%
Mediul de cultură M4
(mediu cu extract de porumb)

Prehidroliza termică, T=100C, τ = 60 min.

Acid/ Bază
Ajustare pH , pH optim= 5.5
H2SO4/Na2CO3
Sterilizare, T= 135˚C, τ = 20 min.

Răcire T= 30˚C

BIOSINTEZA ENZIMELOR PROTEOLITICE

Cultură submersă în bioreactor cu aerare şi încălzire
T= 30-32˚C, τ = 48-60 h, pH= 5-5.5, agitare medie 600 rot/min, aerare
Inocul 0.8 l/l mediu/ min

Separare biomasă, Filtrare sub vid Biomasa

300 l/m2h fungică

Extract proteic total

Extract proteExtract
Ultrafiltrare
proteic totalic total Permeat
Separare
Cromatografie pe schimbător de ioni Proteaze
neutre

Proteaze alcaline, η= 62 %

Precipitare (cu acetonă 75%)

Răcire, T= 4˚C, τ = 4 h.

Centrifugare τ 10min,8000rot/min.
Supernatant
Dializă τ = 24 h

Filtrare sterilizantă(filtru G5)

Liofilizare
Preparat enzimatic proteolitic

Figura 7. Schema tehnologică de obţinere a proteazelor cu inocul de Aspergillus oryzae.

29
Cultura stoc Mediu de
( cultura inalt cultura
activa)

Apa retea
Reactivare
400C Sterilizare
1300C

Cultura activa
( inocul
sporifer sau Tarate de grau,
vegetativ) apa, extract de
malt, peptona

Cultivare pe
agitator ( vase
Erlenmeyer) Receptie
calitatica si
cantitativa

Inocul de
laborator
Amestecare

Cultivare in Tratament termic

˝bioreactor˝ ( sterilizare) T=
intermediar 1 1300C

Racire
Cultura starter T = 400C
intermediara

Inoculare
Cultivare in
˝bioreactor˝
intermediar 2

Fermentare T= 300C

Cultura starter
de productie Mediu lichid de fermentatie

Centrifugare Biomasa
( 10% din
mediu lichid
de
Lichid cultural
fermentatie )

Concentrare
( ultrafiltrare )

Preparat enzimatic
concentrat

Figura 8. Schema tehnologică de obţinere a proteazelor cu inocul de Aspergillus oryzae.

30
 Cheltuielile materiale destinate realizării unui mediu de cultură reprezintă o proporţie
semnificativă din cheltuielile de producţie ale unui preparat enzimatic, ceea ce a făcut ca de-a
lungul timpului, ingredientele unui mediu industrial să fie alese nu numai pe baza necesităţilor
fiziologice ale microorganismelor ci şi pe baza preţului şi disponibilităţii lor.
Pentru a creşte şi a-şi desfăşura procesele metabolice, microorganismele au nevoie de
surse de carbon, azot, săruri minerale, factori de creştere şi apă.

1.4. Descrierea etapelor tehnologice

Sterilizarea mediilor de cultură

Pentru buna desfăşurare a proceselor de obţinere a enzimelor cu ajutorul

microorganismelor este esenţial să se prevină contaminarea acestora cu microorganisme
străine. Pentru a distruge sau îndepărta microorganismele nedorite din mediile de cultură se
practică sterilizarea acestora. De asemenea se sterilizează bioreactoarele, conductele, orificiile
de intrare şi evacuare a gazelor, robineţii de luare a probelor. Sterilizarea se realizează prin
autoclave sau filtrare sterilizantă. Sterilizarea este mai ieftină şi mai eficientă decât alte
metode de sterilizare, de aceea este larg utilizată în industria obţinerii de preparate enzimatice,
pentru distrugerea microorganismelor nedorite. În timpul sterilizării, ca urmare a temperaturii
ridicate la care sunt încălzite mediile de cultura, pot să apară probleme de pierdere a
biodisponibilităţii carbonului sau de apariţie de compuşi toxici sau inhibitori.
Orificiile bioreactoarelor se sterilizează prin filtrare, utilizând filtre cu ceramică
poroasă, carbon granulat sau membrane sintetice sau folosind cartuşe filtrante cu membrane
microporoase. Sterilizarea termică a mediilor de cultură se realizează într-un regim
temperatură/timp capabil să asigure omorârea celor mai rezistente microorganisme: bacterii
sporulate. Deoarece sporii bacterieni rezistă la temperaturi de 100˚C, pentru omorârea lor este
necesară încălzirea mediilor de cultură la temperaturi mai ridicate ( 120.....150˚C ). Durata
încălzirii depinde de temperatura de încălzire şi de nivelul de contaminare al mediului. O
încălzire inutilă trebuie evitată, atât din motive economice, cât şi pentru a minimaliza
degradarea termică a nutrienţilor. Se consideră acceptat un tratament termic în care proporţia
de supravieţuire a microorganismelor contaminante să fie de 1 la 1000. Când întreprinderile
producătoare de enzime au doar câteva bioreactoare în dotare, sterilizarea mediilor se
desfăşoară direct în bioreactoare. În acest scop, se injectează abur în manta sau direct în
bioreactor. Când se atinge temperatura de 100˚C, orificiul de evacuare al aburului este închis,
ceea ce creează o presiune pozitivă şi permite creşterea temperaturii. După sterilizare, mediul
este răcit până la temperatura dorită prin introducerea de apă rece în manta. Formarea
vacuumului este evitată prin introducerea de aer steril în partea superioară a bioreactorului. În
timpul răcirii, mediul este amestecat pentru a facilita transferul de căldură. Acolo unde există
mai multe fermentatoare în dotare, mediul este des sterilizat separat şi apoi transferat prin
conducte sterile, în bioreactoarele deja sterilizate. Aceasta procedură aduce avantaje
economice apreciabile prin scurtarea perioadei de funcţionare a bioreactoarelor, utilaje a căror
funcţionare este costisitoare, durata de sterilizare a unui fermentator gol fiind mai mică decât
a unuia plin cu mediu.

31
 Fermentarea pe substrat solid

Sistemul de fermentare pe substrat solid simulează fermentaţiile produse spontan în

natura. Acest proces a fost intens exploatat din punct de vedere economic în ţările asiatice. În
statele occidentale, existenţa sa a fost aproape complet ignorată din momentul descoperirii
fermentării submerse, la începutul anilor 40. În ultimii zece ani însă, interesul pentru acest tip
de fermentare a renăscut şi procesul şi-a găsit numeroase aplicaţii, care pot fi împarţite în
două categorii:
• Aplicaţii socio-economice, ca obţinere de compost din deşeuri, obţinerea de furaje,
valorificarea subproduselor ligno-celulozice sau a celor rezultate la prelucrarea
produselor alimentare de bază;
• Aplicaţii cu profil economic, ca producerea de enzime, acizi organici şi alimente
fermentate
Sistemul de fermentare pe substrat solid a fost preferat celui submers, datorită avantajelor
sale, dintre care evidenţiem urmatoarele:
- Condiţiile de dezvoltare a microorganismelor sunt mai asemănătoare celor din
habitatul lor natural, din acest motiv ele sunt mai capabile să producă anumite
enzime şi metaboliţi ce sunt de obicei obţinuţi industrial prin cultivare în sistem
submers.
- Foloseşte medii relativ simple. Substraturile solide acţioneaza ca sursă de carbon, azot,
săruri minerale, factori de creştere şi au capacitatea de a absorbi apa, ceea ce asigură
necesităţile fiziologice ale microorganismelor.
- Deoarece sporii sunt utilizaţi direct în fermentare, nu mai sunt necesare tancuri de
inoculare şi nici obţinerea de inocul vegetativ. Trebuie avut însă în vedere să se
asigure o concentraţie de spori de cca 105....106/g mediu.
- Necesarul de oxigen pentru creşterea microorganismelor este asigurat de oxigenul din
aer şi într-o mică măsură, de oxigen dizolvat în apa asociată cu particulele solide.
Fermentatoarele în sistem solid nu mai necesită existenţa unui sistem de aerare ca în
cazul fermentatoarelor în sistem submers, dar pentru ca transferul de oxigen să fie
mai eficient, în substrat trebuie să se asigure formarea de canale de aer. Viteza de
transfer a gazelor este mult mai mare în fermentaţiile pe mediu solid decât la cele în
sistem submers, datorită raportului mai mare existent între aria interfeţei solid-lichid
şi volumul de lichid.
- Spaţiul necesar echipamentului de fermentaţie este mic comparativ cu randamentul
procesului, deoarece se utilizează mai puţină apă şi substratul este mai concentrat.
- Produsul dorit poate fi extras din fermentator prin adăugarea directă de solvent.

- În cazul producerii de enzime, datorită concentraţiei ridicate de enzimă în faza lichidă,

se realizează un grad ridicat de recuperare cu un consum mic de energie.
- Datorita umidităţii scăzute a mediului posibilitatea de contaminare cu bacterii este mai
mică.
- Complexitatea echipamentelor într-un laborator, staţie pilot, fabrica nu este mai mare decât
cea pentru fermentarea convecţională.

32
 - Consumul de energie la functionarea instalatiilor este mai mic comparativ cu cel al
bioreactoarelor cu agitator.
La nivel industrial, fermentarea pe substrat solid are loc în sisteme simple sau
sofisticate, în funcţie de condiţiile existente la nivel mondial.
Instalaţiile folosite pentru obţinerea preparatelor enzimatice sunt similare celor
utilizate la obţinerea produselor fermentate. Cele mai utilizate instalaţii sunt:
- Fermentatorul cu plăci;

- Fermentatorul cu strat fix;

- Fermentatorul tip tobă rotativă;

- Fermentatorul tip tanc cu agitare.

Pentru această fermentaţie vom folosi fermentator tip tanc cu agitare.
Într-un fermentator tip tanc cu agitare există unul sau mai multe transportatoare
elicoidale, care sunt plasate vertical pentru a permite amestecarea substratului. Uneori,
trasportoarele se pot deplasa prin stratul de substrat pe şine orizontale plasate deasupra
tancului. O altă configuraţie de tanc cu agitare se obţine cu o tobă care nu se roteşte, în care
substratul este amestecat cu ajutorul unor palete pe un ax coaxial, rotit cu ajutorul unui motor.
Producerea de enzime la nivel industrial trebuie realizată cu eficienţa cât mai mare,
motiv pentru care este de dorit ca durata procesului fermentativ să fie cât mai scurtă, enzima
de interes să fie obţinuta în cantitate cât mai mare, iar cheltuielile de producţie să fie cât mai
reduse. În practică este necesar să se faca un compromis între aceste deziderate, pentru a reuşi
să se asigure microorganismelor condiţii optime de dezvoltare.
Necesităţile nutriţionale şi de aerare ale microorganismului producător de enzimă
variază pe parcursul procesului fermentativ, deoarece cantitatea de biomasă creşte în timp iar
condiţiile de mediu ( concentraţie de nutrienţi, pH, temperatură) se modifică. Pentru a fi siguri
că necesitţile unei culturi sunt asigurate pe toată durata procesului fermentativ, trebuie
controlaţi factorii care îi influenţează dezvoltarea. Un sistem de control automat al unui
bioproces conţine următoarele elemente:
- instrumente de urmărire şi masurare:
- instrumente de control; instrumente de operare.
După producerea enzimei de către organismul dorit, procesul de fabricare a
preparatelor enzimatice continuâ cu recuperarea enzimei şi purificarea ei, apoi cu stabilirea şi
sandardizarea activităţii preparatului obţional. Aceste etape permit obţinerea unui produs finit
capabil să satisfacă diversitatea necesităţilor de utilizare a preparatelor enzimatice. Etapa
biologică de biosinteză este urmată de o serie de operaţii, care conduc la separarea enzimelor.
In cazul fermentaţiilor desfăşurate pe substrat semisolid, biomasa agentului producător de
enzime se întrepătrunde cu componentele mediului, celulele fiind fixate prin adsorbţie-
absorbţie de particulele solide, ceea ce împiedică separarea lor. În această situaţie, prin
aplicarea unui regim blând de uscare, ce previne inactivarea enzimelor, se pot obţine preparate
enzimatice brute, care conţin un echipament enzimatic complex. Când se urmăreşte separarea
unor enzime localizate intracelular se realizează mai întâi dezintegrarea pereţilor celulari şi a
membranelor, după care se aplică operaţiile de extracţie şi separare a enzimei de resturile
celulare. Mediile lichide după fermentare pot să conţină enzime în proporţie 1...5% din
substanţa uscată iniţială a mediului, nutrienţi şi metaboliţi reziduali ( 5....10% din substanţa
uscată a mediului ) şi o biomasa alcătuită din totalitatea celulelor inoculate şi dezvoltate în
etapa de fermentare, care poate constitui 2...10% s.u. a mediului de cultură.
Pentru separarea particulelor de dimensiuni mari se folosesc frecvent operaţiile de tipul
centrifugării, filtrării, sedimentării. Alegerea uneia din aceste operaţii este condiţionată de

33
natura agentului producător de enzime, de dimensiunea celulelor şi creşterea vegetativă.
Biomasa de mucegai se separă cel mai facil prin filtrare. Separarea celulelor producătoare de
enzime de mediul nutritiv se poate realiza de la începutul fermentaţiei prin utilizarea de
membrane de dializă. Aceste culturi poartă denumirea de culturi ˝de dializă˝. Ruperea
pereţilor celulari şi a membranelor reprezintă primul pas pentru eliberarea enzimelor din
celule. Această operaţie poate fi realizată prin metode fizice, chimice sau biochimice
( enzimatice ).
Alegerea lichidului de extracţie depinde de enzimă, de solubilitatea ei, de tipul de ţesut
în care se găseşte aceasta şi de faptul că este sau nu legată de membrana celulară. Volumul de
extractant folosit trebuie să fie de aproximativ trei ori mai mare decât volumul biomasei din
care se realizează extracţia. Cea mai simplă metodă de obţinere a preparatelor enzimatice
solide este pulverizarea şi uscarea concentratului enzimatic. Pentru a obţine un produs finit
având o puritate şi o stabilitate satisfăcătoare, lichidului enzimatic trebuie să i se aplice un
număr minim de tratamente, cu o pierdere minimă de activitate.
Înainte de a fi oferite spre vânzare, enzimele sunt stabilizate, standardizate şi
controlate din punct de vedere al siguranţei în manipulare şi pentru cele care vor fi utilizate la
obţinerea produselor alimentare, din punct de vedere al siguranţei alimentare.

Ultrafiltrarea

În multe cazuri, în special când se pregătesc de vânzare enzimele extracelulare, soluţia

limpede conţinând enzima este simplu concentrată apoi i se adaugă conservanţii şi produsul
rezultat este vândut ca soluţie sau ca preparat uscat. Procesul de concentrare va fi cel mai
ieftin procedeu compatibil cu menţinerea activităţii enzimatice. Pentru unele enzime, se poate
aplica evaporarea în filtre rotative, urmată, dacă este necesar, de uscare prin pulverizare. Cea
mai populară metodă de concentrare este totuşi ultrafiltrarea( procedeu prin care apa şi
moleculele cu masă moleculară redusă sunt îndepartate prin trecerea sub presiune prin
membrane care reţin enzima). Ultrafiltrarea diferă de filtrarea convenţională şi de
microfiltrare în ceea ce priveşte dimensiunile particulelor care sunt reţinute. Ultrafiltrarea
utilizează membrane cu pori asimetrici, subţiri, susţinute de structuri rigide. Membranele cu
capacitatea de reţinere a proteinelor cu masă moleculara de 1000....100000 Da sunt utilizabile
la presiuni de până la 2Mpa.
Celulele de ultrafiltrare sunt cilindrice şi sunt prevăzute cu agitator magnetic pentru a
combate polarizările. Membrana este fixată pe un suport la baza vasului. Acest tip de celule
de ultrafiltrare nu este potrivit pentru a fi utilizat pe scară largă, dar este folositor în studii
preliminare şi pentru concentrarea eluanţilor din coloanele de separare de laborator. Celulele
de ultrafiltrare industriale prezintă membrane tubulare cu diametre de 1...2 cm, care sunt
grupate în mănunchiuri. Aceastea nu sunt la fel de compacte ca sistemele capilare
( suprafaţa/volum de cca 25 m-1 ) şi sunt scumpe, dar mai puţin susceptibile la colmatare cu
particule de dimensiuni mari. Sisteme ieftine cu canale fine sunt disponibile ( suprafaţa/volum
cca 500 m-1 ) şi sunt utilizate ca membrane suprapuse în diferite moduri pentru a produce
curgerea laminară a lichidului prin membrane şi pentru a minimaliza polarizările.
Membranele capilare reprezintă un tip de ultrafiltrare relativ ieftin şi având popularitatea în
creştere, care utilizează membrane microtubulare cu 0,2....1,1 mm având suprafaţa mare de
membrană într-o unitate de volum mică ( suprafaţa/volum 1000 m-1 ). Membranele sunt de
obicei montate în module pentru manipulare convenabilă. Această configuraţie a
membranelor poate fi uşor marită la scară. Modelele comerciale disponibile permit
ultrafiltrarea cu viteza mare, de 600 dm3 per h.
Continua îmbunătăţire a performanţelor, durabilităţii şi siguranţei membranelor a fost
un adevărat cadou pentru enzimologi, încurajând larga utilizare a diferitelor configuraţii de

34
ultrafiltrare. Problemele de colmatare pot fi depăşite prin tratarea membranelor cu detergenţi,
proteaze sau având grijă, cu acizii sau baze. Costul iniţial al membranelor este ridicat, dar
membranele moderne sunt rezistente şi eficiente. Ultrafiltrarea produce pierderi foarte mici
ale activităţii enzimatic

2. Bilanţul de materiale

Amestecare
Tărâţe de grau substante amestecate
Extract de malţ
Peptonă
Apă

Tărâţe de grâu + extract de malţ + peptonă + apă = substanţa amestecată

Tărâţe de grâu + extract de malţ + peptonă + apă = 1537,23
100g subst. Amest....5,5g tăraţe..........2,4g extract.....1g peptona.......90g apă
1537,23g subst.amest....Xg tărâţe......Yg extract.........Zg peptonă......Mg apă
X = 84,53g tărâţe de grâu
Y = 36,89g extract de malţ
Z = 15,37 g peptonă
Mg = 1383,50 g apă

Sterilizare Mediu steril

Substanta amestecata
Pierderi 0,5%

substanta amestecata = mediu steril + pierderi

substanta amestecata = 1529,55 + 0,005 × substanta amestecata
substanta amestecata ( 1 – 0,005 ) = 1529,55
substanta amestecata

Racire
mediu steril mediu de cultura
pierderi 0,5%

35
Mediu steril = mediu de cultura + pierderi
Mediu steril = 1521,91 + 0,005×mediu steril
Mediu steril (1 – 0,005 ) = 1521,91
Mediu steril

Mediu de cultura Inoculare mediu lichid de fermentatie

Cultura starter de Fermentare pierderi 1%
productie

mediu de cultura + cultura starter de productie = mediu lichid de fermentatie + pierderi

cultura starter de productie =
mediu de cultura + 0,05×mediu de cultura = mediu de fermentatie +
mediu de cultura (1+0,05−0,01) = 1582,7933
mediu de cultura
100g mediu de cultura......5,5g tarate de grau....2,4g extract de malt......1g peptona.....90g apa
1521,91663g mediu de cultura....Xg tarate.........Yg extract....................Zg peptona.......Mg apa

X
Y
Z
M

Centrifugare
biomasa
Mediu lichid de lichid cultural
Fermentatie pierderi 0,5%

Mediu lichid de fermentatie = biomasa + lichid cultural + pierderi

Biomasa =
Mediu de fermentatie +lich.cultural+0,005×mediu de ferm.
Mediu lichid de fermentatie (1 − – 0,005) = 1416,6
Mediu lichid de fermentatie (1 – 0,1 – 0,005) = 1416,6

36
Mediu lichid de fermentatie

lichid cultural Concentrare pre preparat enzimatic

concentrat

ui

lichid cultural×Xlichid cultural = preparat enzimatic concentrat×Xpreparat enzimatic concentrat

lichid cultural × 0,15 = 250 × 0,85
lichid cultural =
pierderi = 1166,6

Materiale intrate Materiale iesite

Nr.crt. Denumire U.M. Cantitate Nr.crt. Denumire U.M. Cantitate

1 Lichidul kg 1416,6 1 Preparat kg 250
cultural enzimatic
concentrat
2 Pierderi kg 1166,6
2 Mediul de kg 1582,7933 3 Biomasa kg 158,279
fermentatie 4 Lichid kg 1416,6
cultural

5 Pierderi kg 7,91
3 Mediu de kg 1521,91 6 Mediu de kg 1582,79
cultura fermenatie
Cultura kg 75,27 7 Pierderi kg 15,21
starter
4 Mediu kg 1529,55 8 Mediu de kg 1521,91
steril cultura
9 Pierderi kg 7,64
5 Substanta kg 1537,23 10 Mediu steril kg 1529,55
amestecata 11 Pierderi kg 7,68
6 Tarate de kg 84,53 12 Substanta kg 1537,23
grau amestecata
7 Extract de kg 36,89
malt
8 Peptona 15,37
kg
9 Apa kg 1383,50

Total 9183,64 Total 9190,39

37
 3. Bilant termic

Bilanţul termic se poate întocmi în cadrul proceselor de reactivare, sterilizare, răcire si

fermentare.

Reactivare

38
 4. Alegerea şi dimensionarea bioreactorului

4.1. Utilajul principal-descrierea constructivă şi funcţională

Bioreactorul corespunzător realizării fermentaţiei este fermentatorul tip tanc cu

agitare.
Un bioreactor este un dispozitiv în care un substrat de valoare mică este utilizat de
celule vii sau enzime pentru a genera un produs de valoare mai mare. Bioreactoarele sunt larg
folosite pentru prelucrarea produselor alimentare, fermentaţie, tratarea deşeurilor, etc.
El este un rezervor mare din oţel inoxidabil folosit pentru a creşte microorganismele
producătoare în producţia industrială de enzime şi alte substanţe chimice. După ce rezervorul
este sterilizat cu abur, un inocul de celule de producători este introdus într-un mediu care este
menţinut de sonde, în condiţii optime de temperatură, presiune, pH şi nivelul de oxigen pentru
producţia de enzime. Un agitator amestecă mediul, care este în mod constant aerat. Este
esenţial ca mediul de cultură să fie steril şi să conţină cerinţele nutriţionale corespunzătoare
pentru microorganisme. Când nutrienţii au fost utilizaţi produsul este separat ; în cazul în care
produsul este un compus extracelular, mediul poate fi eliminat în cursul fazei de creştere a
microorganismelor,dar un produs intracelular trebuie să fie recoltat atunci când creşterea
culturilor lot se opreşte. Unele bioreactoare sunt proiectate pentru culturi continue.

39
 Figura 4.1. Bioreactor tip tanc ce
foloseste deflectoarele şi un agitator pentru amestecarea optimă şi reciclează biomasă

Caracteristicile definitorii ale bioreactoarelor continue este un proces de hrănire

perpetuu. Un mediu de cultură care este fie steril sau cuprins din microorganisme este
alimentat continuu în bioreactor pentru a menţine starea de echilibru. Desigur, produsul este,
de asemenea, tras continuu din reactor. Variabilele reacţiei şi a parametrilor de control rămân
coerente, stabilind o constantă de timp în interiorul reactorului.Rezultatul este productivitatea
continuă şi produsul.Aceste sisteme oferă un număr de avantaje, inclusiv:
• Creşterea potenţialului pentru automatizarea procesului.
• Reducerea cheltuielilor forţelor de muncă, datorită automatizării.
• Mai puţin timp non-productiv cheltuit în golire, umplere şi sterilizare reactor .
•Produs de calitate datorită parametrilor de funcţionare invariabili.
• Riscurile de toxicitate scăzute la personal, datorită automatizării.
• Reducerea stresului privind instrumentele pentru sterilizare.
Dezavantajele bioreactoarelor continue:
•Flexibilitate minimă, deoarece sunt posibile numai uşoare variaţii în proces
(compoziţia mediului, concentraţia de oxigen şi temperatura).
•Uniformitatea materiei prime de calitate este necesară pentru a se asigura că
procesul rămâne continuu.
•Investiţii şi costuri mai ridicate în control şi echipamente de automatizare şi cresc
cheltuielile pentru sterilizarea continuă a mediului.

40
 •Risc mai mare de mutaţii celulare şi contaminare, datorită perioadei de cultivare
relativ scurtă. Motor

Substrat

Figura 9. Fermentator tip tanc cu agitare

41
 4.2. Dimensionarea bioreactorului

Din bilanţul de materiale pentru fermentare aflăm volumul de lichid din bioreactor :
V = m÷ρ
Vlichid = 1521,91 ÷ 2424 = 0,62 m3
Vlichid = Vutil
În reactor avem reacţie de amestecare.
Vom alege coeficientul de umplere între valorile: cu = 0,7 .. 0,8. Valoarea aleasă este cu =

0,8. Volumul reactorului se calculează astfel:

÷ cu
Vr = Vlichid
Vr = 0,62 ÷ 0,8
Vr = 0,77 m3
Vr = Vt
Vt – volumul total

Din volumul reactorului putem calcula cotele de gabarit ale acestuia, respectiv
diametrul (Dr) şi înălţimea reactorului (Hr), precum şi înălţimea udată de masa de reacţie.

Relaţia dintre înălţimea şi diametrul reactorului este dată de coeficientul de supleţe,

care în cazul de faţă îl vom considera egal cu 2 :
Hr/Dr = 2 ⇒ H = 2·D
Vr = π Dr2 · Hr /4 = π Dr2 ·2 ·Dr /4 = 0,5· π ·Dr3
0,77 = 0,5·3,14·Dr3
Dr = 0,49m se adoptă Dr = 0,5 m
Hr = 2 m
Având în vedere faptul că avem un coeficient de umplere de 0,8 => înălţimea
lichidului în reactor va fi :

Hl = 0,5 m.

d = Dr/3

d = 0,49/3 = 0,16m

42
 5. Concluzii

În cadrul acestei lucrări mi-am propus să scot în evidenţă multe amănunte importante
prin proiectarea unui bioreactor utilizat la obţinerea preparatelor enzimatice utilizate în
maturarea brânzeturilor, dar şi calculul bilanţului de materiale şi cel termic.
Preparatele enzimatice pot fi obţinute din surse vegetale, surse animale,
microbiologice. Studiile privind obţinerea proteazelor acide au demarat în anul 1960, când au
fost obţinute proteaze acide, termistabile, cu specii termofile ale genului Mucor ( cu
temperatura optimă de dezvoltare 55....60˚C ). Începand din 1970 au fost iniţiate studii privind
obţinerea de proteaze acide cu mucegaiuri din genul Aspergillus ( A. Niger, A. Oryzae) prin
cultivarea în sistem SSF pe orez sau grâu. Preparatele enzimatice obţinute sunt complexe,
conţin pe lângă proteaze si amilaze, celulaze. Proteazele acide se obţin industrial prin
cultivarea în sistem SSF. Deşi se poate adopta pentru biosinteză şi procedeul culturilor
submerse, în acest caz randamentele de obţinere a preparatului enzimatic sunt mai scăzute. În
general, condiţiile optime de biosinteză a proteazelor sunt diferite de condiţiile optime de
creştere, pentru fiecare agent producător impunându-se optimizarea condiţiilor fermentative.
Materia primă folosită în obţinerea enzimelor este Aspergillus Niger. Acest gen
prezintă un deosebit interes, pe de o parte datorită aplicaţiilor biotehnologice precum şi
datorită faptului că unii reprezentanţi sunt cunoscuti ca patogeni. Aspergillus este sursa de acizi
organici, enzime şi fermentaţie. Folosirea microorganismelor ca principala sursă de enzime se
datorează faptului că se pot obţine cantităţi mari de biomasă în timp relativ scurt şi în condiţii
bine controlate, cât şi faptului că se pot realiza nivele enzimatice crescute prin intervenţii
asupra mediului de cultură şi a parametrilor de bioproces sau asupra materialului genetic al
microorganismului în procesele fermentative fie în sistem submers, fie pe substraturi solide.

43
 Bibliografie

1. Viorica Maria Macovi,“Calcule de operatii si utilaje pentru procesarea

termică si biochimică in biotehnologie”,Editura Alma,Galati ,2001
2. Gabriela Bahrim, “Biotehnologia Preparatelor Enzimatice“, Editura
ACADEMICA, Galati, 2002
3. Jurcoane, “ Tratat de biotehnologie “, vol. 1, Editura Tehnica, Bucuresti,
2004
4. G. Zarnea, “Bioingineria preparatelor enzimatice microbiene“, Editura
Tehnica, Bucuresti
5. Dabija A., Rusu L.,Alexa I.C. ,”Enzimologie industriala” ,Editura Alma
Mater ,Bacau,2007.

44