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Introducción
Para la realización del siguiente proyecto de bioinformática, se seleccionó el gen intl1
(ADN integrasa) del microorganismo Pseudomonas aeruginosa.
Los integrones son parte fundamental en la captura, movilización y esparcimiento de
genes con resistencia antibiótica en bacterias. La plataforma de integrones consiste en un
gen de integrasa que puede recombinar unidades de DNA circular conocidas como
casetes de genes, sitio de recombinación attl y un promotor de PC que dirige la
transcripción de los genes. Además, los genes de resistencia integrasa clase 1 y
sulfonamida han sido propuestos como indicadores de contaminación con ARB, ARGs y
otros contaminantes.
Este gen puede ser ampliamente utilizado como marcador debido a distintas razones:
1. Como se mencionó previamente, está generalmente asociado a genes que
confieren resistencia a antibióticos, desinfectantes y metales pesados.
2. Se ha involucrado en diversas bacterias patógenas tanto de humanos como de
animales domésticos.
3. De acuerdo a las condiciones ambientales, la concentración de intI1 puede
cambiar rápidamente, debido a que el integrón clase 1 reside en diversas especies
bacterianas que tienen rápidos tiempos de generación y por lo general contienen
elementos que pueden ser transferidos rápidamente entre bacterias.
4. Las formas clínicas de intI1 son xenogenéticas, es decir, son modificadas gracias
a una selección impuesta por las actividades humanas.
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria perteneciente a la familia Pseudomonaceae.
Se trata de un bacilo recto o ligeramente curvado Gram negativo, con un tamaño de 2–4 x
0,5-1 micras, y móvil gracias a la presencia de un flagelo polar. En relación con su
metabolismo, es aerobio (aunque puede desarrollarse en condiciones anaerobias
utilizando nitrato), catalasa positivo y oxidasa positivo. Su temperatura óptima de
crecimiento es de 37ºC, pero puede tolerar temperaturas de hasta 45ºC-50ºC. Puede
sobrevivir durante al menos 70 días en agua destilada (9). Se encuentra ampliamente
distribuida en la naturaleza(4,8) se puede aislar de muestras de suelo, aguas prístinas y
contaminadas, así como de plantas y animales. Todas las cepas son potencialmente
patógenas para el hombre y algunas pueden infectar también a plantas.
P. aeruginosa representa un problema importante de salud. Una vez que se establece la
infección, P. aeruginosa produce una serie de compuestos tóxicos que causan no sólo
daño tisular extenso, sino adicionalmente interfieren con el funcionamiento del sistema
inmune. Entre las proteínas que intervienen en la infección de P. aeruginosa encontramos
toxinas, como las exotoxinas A y S, así como enzimas hidrolíticas que degradan las
membranas y el tejido conjuntivo de diversos órganos (5,12) Esta situación se ve
agravada por la dificultad para tratar las infecciones por P. aeruginosa, ya que esta
bacteria presenta una muy alta resistencia natural a distintos antibióticos y a
desinfectantes (7,15).
Sin embargo, a la vez que P. aeruginosa causa al hombre distintos problemas, esta
bacteria tiene diversas aplicaciones biotecnológicas, sobre todo en el área ambiental. Así
se sabe que es uno de los pocos organismos capaces de degradar alcanos de cadena
ramificada (13); que produce biosurfactantes que son útiles para la limpieza de suelos
contaminados con hidrocarburos (10) o con metales pesados (11); y que produce
enzimas, como la lipasa, con distintas aplicaciones potenciales(14).
2. Secuencia a analizar.
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5. Secuencia de aminoácidos.
Frame 1 5’ - 3’
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7. Compute pI/Mw
10 20 30 40 50 60
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Diseño de oligonucleótidos
Se seleccionaron los primers directo y reverso del par 3, debido a que este arrojaba el
producto de mayor tamaño (188 pb).
Primer directo:
(Sac I) GAGCTCCGGCCTTGCTGTTCTTCTAC
Primer reverso:
(EcoRI)GAATTCATGCCCGTTCCATACAGAAG
9. Tabla de primers
El primer rotulado de color amarillo es el directo 3 del par 3, por otra parte, el de color
celeste, será el reverso 3 del par 3.
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Análisis de primers
11. Tabla 1: Horquillas
PCR par 2.
PCR par 3.
PCR par 4.
PCR par 5.
Modelaje de proteínas
15. Obtención de modelo a partir de software
16.
Conclusiones.
Como se pudo observar el análisis del gen para especies similares, arroja diversos
organismos entre ellos, el Pseudomonas aeruginosa. El genoma de la Pseudomonas
aeruginosa es el origen de nuestro código a analizar, por lo que es lógico que
aparezca en el análisis con un porcentaje de identidad del 100%. Muchos otros
organismos aparecen con un porcentaje de 100% de identidad. Esta secuencia
dentro de organismos sin capacidad retro vírica se analizaría en otro momento debido
a que la integrasa es producida por un retrovirus.
Posteriormente, una vez traducido el gen a proteína se compara el resultado con la
base de datos obteniendo así solo proteínas recombinantes como resultado, lo
esperado, entre ellas diversos tipos de integrasa, integrones y recombinasas. El
organismo que corresponde a nuestro análisis aparece un gran número de veces
relacionado a proteínas integrasas e integrón con un porcentaje de identidad del
100%.
Para el diseño de oligonucleótidos de acuerdo al polilinker del plásmido pBlue Script
SK II+, se seleccionó el sitio de restricción para Sac I, el cual corresponde al sitio de
corte 5´ de nuestro gen y de acuerdo a la dirección de replicación del polilinker
prediseñado, este sitio corresponde al primer directo. Para el primer reverso se llevó
a cabo la misma metodología y se seleccionó Eco RI como sitio de restricción en el
extremo 3´. La selección de estos sitios de restricción se hizo en base a qué tan
conocidos son estos mismos.
Como último punto la información arrojada por la PCR virtual indica que los primers
pueden no ser 100% específicos y muestra un dato atípico; indica que nuestro
genoma posee la variante de transcripción 1 de RNAm de Homo sapiens forkhead
box N3 (FOXN3) como gen posiblemente no deseado.
Las pruebas previas confirman el origen del gen y la PCR muestra un fragmento
potencialmente indeseado en el mismo; para proceder se requeriría abordar el origen
y estructura de dicho gen y decidir si es indeseado o no.
Bibliografía
1. Addgene. (-). Plasmid: pBlueScript II SK (+). 29 de marzo del 2019, de addgene Sitio
web: https://www.addgene.org/vector-database/1946/
2. Adelowo O.O., Helbig T., Knecht C., Reincke F., Mäusezahl I., Müller J.A. (2018) High
abundances of class 1 integrase and sulfonamide resistance genes, and
characterisation of class 1 integron gene cassettes in four urban wetlands in Nigeria.
PLoS ONE 13(11): e0208269. https://doi.org/ 10.1371/journal.pone.0208269
3. Adriana Salazar M., Ana Sandoval R.,Juan Armendáriz B.. (2013). BIOLOGIA
MOLECULAR Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. México:
McGrawHillEducation.
4. Costerton, J. W. 1980 Pseudomonas aeruginosa in nature and disease, p. 15-24. In
C. D. Sabath (ed.), Pseudomonas aeruginosa: the organism, diseases it causes and
their treatment. Hans Huber Publishers, Bern, Switzerland.
5. Döring, G., Maier, M., Müller, E., Zoubair, B., Tümmler, B. & Kharazmi, A. 1987.
Virulence factors of Pseudomonas aeruginosa. Antibiot Chemother. 39: 136-148.
6. Gillings, M. R., Gaze, W. H., Pruden, A., Smalla, K., Tiedje, J. M., Zhu, Y. (2014)
Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution.
ISME Journal 9(6) DOI: 10.1038/ismej.2014.226
7. Hancock, R. E. W., & W. A. Woodruff. 1988. Roles of porin and b-lactamase in
intrinsic antibiotic resistance of Pseudomonas aeruginosa. Rev. Infect. Dis. 10: 770-
775.
8. Hardalo, C. & S. C. Edberg 1997. Pseudomonas aeruginosa: Assessment of risk from
drinking water. Crit. Rev. Microbiol. 23: 47-75.
9. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo, 2016. Pseudomonas
aeruginosa, Recuperado de http://www.insht.es/RiesgosBiologicos/Contenidos/Fichas
%20de%20agentes%20biologicos/Fichas/Pseudomonas%20aeruginosa%202017.pdf
10. Maier, M. R., and G. Soberón-Chávez. 2000. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids:
biosynthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:625-633.
11. Miller, R. M., 1995. Biosurfactant-facilitated remediation of metal-contaminated soils.
Environ. Health Perspect. 103(Suppl): 59-62.
12. Mohr, C. D., L. Rust, A. M. Albus, B. H. Iglewski, & V. Deretic. 1990. Expression
patterns of genes encoding elastase and controlling mucoidy: co-ordinate regulation of
two virulence factors in Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis. Mol.
Microbiol. 4: 2103-2110.
13. Schaeffer T. L., Cantwell, S. G., Brown, J. L., Watt, D. S. & Fall, R. R. 1979. Microbial
growth on hydrocarbons: terminal branching inhibits biodegradation. Appl. Environ.
Microbiol. 38: 742-746.
14. Soberó n-Chávez G. & B Palmeros. 1994 Pseudomonas lipases: Molecular genetics
and potential industrial applications. Critical Rev. Microbiol. 20: 95-105.
15. Sttover, C. K., X. Q. Pham, A. L. Erwin, S. D. Miizoguchi, P. Warrener, M. J. Hickey, f.
S. L. Brinkman, W, O. Hufnagle,D. J. Kowalik, M. Lagrou, R. L. Garber, L. Goltry, E.
Tolentino, S. Westbrock-Wadman,, Y. Yuan, l. L. Brody, S. N. Coulter, K. R. Folger, A.
Kas, K. Larbig, R. Lim, K. Smith, D. Spencer, G. K.-S. Wong, Z. Wu, I. T. Paulsen, J.
Reizer, M. H. Saier, R. E. W. Hancock, S. Lory, & M. V. Olson. 2000. Complete
genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.
Nature, 406: 959-964.