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Untersuchungen zur Wirkung neuer

Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe

Bachelorarbeit

im Studiengang Bachelor of Science


Lehramt Chemie/Biologie für Gymnasien

vorgelegt von

David Oliver Richter

Lehrstuhl für Organische Chemie I

Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften


Universität Bayreuth

Juni 2014
Einleitung

1. EINLEITUNG ............................................................................................................................................. 4

1.1 KREBS ALS ZIVILISATIONSERKRANKUNG ........................................................................................................... 4


1.2 ANGIOSTATISCHE THERAPIE MIT COMBRETASTATIN-A4...................................................................................... 4
1.3 DIE MECHANISMEN DER ZELLZYKLUSKONTROLLE ............................................................................................... 5
1.4 BIOLOGISCHE WIRKUNG VON GOLDCARBENKOMPLEXEN ALS ZIEL FÜR DIE PHARMAKOTHERAPIE VON
KREBSERKRANKUNGEN.............................................................................................................................................. 8
1.5 BIOLOGISCHE WIRKUNG VON PLATINCARBENKOMPLEXEN ALS ZIEL FÜR DIE PHARMAKOTHERAPIE VON
KREBSERKRANKUNGEN.............................................................................................................................................. 8
1.6 PROBLEMSTELLUNG .................................................................................................................................... 9

2 MATERIALIEN ......................................................................................................................................... 11

2.1 ZELLINIEN................................................................................................................................................ 11
2.1.1 Zelllinie 518A2 ................................................................................................................................. 11
2.1.2 Zelllinie HCT-116 .............................................................................................................................. 11
2.2 IMIDAZOL-GOLD-/PLATINCARBENKOMPLEXE ................................................................................................. 11
2.3 CHEMIKALIEN........................................................................................................................................... 13
2.4 LÖSUNGEN .............................................................................................................................................. 13
2.4.1 Zellkultur-Medium DMEM ............................................................................................................... 13
2.4.2 Ethidiumbromid-Färbelösung .......................................................................................................... 13
2.4.3 PBS................................................................................................................................................... 14
2.4.4 PI-Färbelösung ................................................................................................................................. 14
2.4.5 TBE-Puffer (10x)............................................................................................................................... 14
2.5 GERÄTE .................................................................................................................................................. 14
2.6 KUNSTSTOFF-VERBRAUCHSMATERIALIEN ....................................................................................................... 15
2.7 SOFTWARE .............................................................................................................................................. 15

3 METHODEN ............................................................................................................................................ 16

3.1 ZELLKULTIVIERUNG UND PASSAGE ................................................................................................................ 16


3.2 MTT-VITALITÄTSTEST ZUR ERMITTLUNG DER IC50-WERTE................................................................................ 16
3.3 NBT-TEST ZUR MESSUNG VON REAKTIVEN SAUERSTOFF-SPEZIES ....................................................................... 17
3.4 MIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG BEHANDELTER ZELLEN................................................................................ 17
3.5 UNTERSUCHUNG DER MOTILITÄT VON 518A2-ZELLEN IM „WOUND HEALING ASSAY“ ............................................ 18
3.6 UNTERSUCHUNG DER DNA BINDENDEN EIGENSCHAFTEN NIEDERMOLEKULARER VERBINDUNGEN DURCH EMSA ......... 18
3.7 ANALYSE DES ZELLZYKLUS MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE ............................................................................ 19

4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION ............................................................................................................... 21

4.1 DER IMIDAZOL-PLATINCARBENKOMPLEX V53PT ZEIGT DIE GERINGSTE TOXIZITÄT GEGENÜBER MELANOMZELLEN DER
LINIE 518A2 ........................................................................................................................................................ 21

2
Einleitung

4.2 ALLE UNTERSUCHTEN IMIDAZOL-GOLD-/PLATINCARBENKOMPLEXE WIRKEN WENIGER TOXISCH AUF DIE HCT116 ALS AUF
DIE MELANOMZELLINIE 518A2 ................................................................................................................................ 22

4.3 NACH 24H INKUBATION MIT TR44/ TR45/ TR46/ V53PT NIMMT DIE ANZAHL AN 518A2-ZELLEN IN SUSPENSION
GERINGFÜGIG ZU ................................................................................................................................................... 23

4.4 DIE IMIDAZOL-GOLDCARBENKOMPLEXE TR44/TR45 VERRINGERN DIE MOTILITÄT DER 518A2-ZELLEN BEI EINER
KONZENTRATION VON 1,5 µM ................................................................................................................................. 24
4.5 V53PT HAT KEINEN EINFLUSS AUF DIE MOTILITÄT VON 518A2-ZELLEN BEI EINER KONZENTRATION VON 10 µM UND IST
TOXISCH AB EINER KONZENTRATION VON 12,5 µM ...................................................................................................... 26

4.6 DER EINFLUSS VON TR45 UND TR44 AUF DIE MOTILITÄT DER MELANOMZELLEN IST NICHT SIGNIFIKANT VERSCHIEDEN
VON DER KONTROLLE .............................................................................................................................................. 27

4.7 TR46/ V53PT UND TR69 BILDEN KEINE ADDUKTE MIT PLASMID-DNA IN VITRO.................................................. 29
4.8 TR44/TR45 UND V53PT LÖSEN EINEM G1-ARREST AUS , TR46 EINEN G2-ARREST .............................................. 31
4.9 TR45 FÜHRT ZU EINEM AUSGEPRÄGTEREN G1-ARREST ALS TR44 BEI EINER KONZENTRATION VON 1µM ................... 34
4.10 TR46 WIRKT DURCH DIE VERMEHRTE BILDUNG VON SUPEROXIDRADIKALEN TOXISCH AUF 518A2-ZELLEN ................. 35

5 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................................ 38

6 SUMMARY ............................................................................................................................................. 40

7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................................................... 42

8 LITERATURVERZEICHNIS......................................................................................................................... 43

9 ANHANG ................................................................................................................................................ 50

10 DANKSAGUNG ....................................................................................................................................... 53

11 ERKLÄRUNG ........................................................................................................................................... 54

3
Einleitung

1. Einleitung

1.1 Krebs als Zivilisationserkrankung


Die Anzahl der Krebsneuerkrankungen in 2008 lag insgesamt (ohne nichtmelanotischen Hautkrebs) in
Deutschland bei den Männern bei 246.700 und bei den Frauen bei 223.100. Durch die Erhöhung des
durchschnittlichen Lebensalters ist in den nächsten Jahren mit einem starken Anstieg neuer
Erkrankungen zu rechnen. Des trifft besonders für Krebsarten zu, bei denen das durchschnittlichen
Erkrankungsalter hoch ist, z. B. Magen-, Darm-, Pankreaskrebs 1.

1.2 Angiostatische Therapie mit Combretastatin-A4


Ein moderner Angriffspunkt bei der Therapie solider Tumore ist die angiostatische Therapie. Dabei ist
das Ziel, die Ausbildung versorgender Blutgefäßen zum Tumorgewebe zu unterdrücken. Neben einer
Regression des Tumors, wird dadurch auch die Metastasierung der Tumore verringert 2–4.
Das Stilben-Derivat Combretastatin- A4 stört Zell-Zell-Interaktion durch Inhibition des VE-Cadherin/β-
Catenin-Komplex. Die Teilung und Migration von vaskulären Endothelzellen werden ebenfalls
inhibiert. Die Wirkung Combretastatin-A4 geht auf die Bindung des Tubulins an der Colchicin-
56,7
Bindestelle zurück . Durch Störung der Mikrotubuli wird zudem der Spindelcheckpoint ausgelöst
und die Zellen werden apoptotisch (Kanthou & Tozer, 2002; Kanthou et al., 2004). Die Folge ist ein
sog. vaskulärer shutdown in Tumoren (siehe Abbildung 1) 11–13.

Abbildung 1: CA-4 vermittelte Apoptose vaskularer Endothelzellen


unterdrückt tumorinduzierte Vaskulogenese
(Quelle: http//:cancer.gov/cancertopics/understandingcancer)

4
Einleitung

Da die Neubildung von Blutgefäßen im Menschen weitgehend auf die Embryonalentwicklung und
Wundheilung beschränkt ist, werden Krebszellen durch Combretastatin-A4 stärker geschädigt als
gesunde Zellen.

Abbildung 2: Struktur des CA-4 (A), Prodrug CA-4P (B), CA-4 Imidazol-Derivat(C)
Imidazol-Goldcarbencomplex (D)

Tubulinbindung ist nur bei dem cis-Isomer des CA-4 vorhanden (Abbildung 2 A). Es wurden daher
Derivate synthetisiert, in denen das cis-Isomer durch einen Imidazolring stabilisiert wird (Abbildung 2
14–16
C) . Die Tubulinbindung ist bei einigen dieser Verbindungen weiterhin nachweisbar. Ausgehend
von den Imidazol-Derivaten des Combretastatin-4A wurden Imidazol-Goldcarbenkomplexe
synthetisiert, in der Hoffnung, auf größere Selektivität und verstärkte Zytotoxizität auf Krebszellen.
Die Verbindungen, die auf die Struktur (Abbildung 2 D) zurückgehen, zeigten kaum Effekte auf das
Zytoskelett, wirkten jedoch weiterhin zytotoxisch auf mehrere Krebszelllinien 16–19.

1.3 Die Mechanismen der Zellzykluskontrolle


Im Zellzyklus alternieren Interphase und Mitose. Kennzeichnend für jede Phase ist die Aktivität
mindestens einer Cyclin abhängigen Kinase (Cdk). Die Aktivität der Kinasen wird durch sequenzielle
Assoziation mit Cyclinen reguliert. Die sequenzielle Aktivität der Cdks ist notwendig zur
Überschreitung eines Kontrollpunktes und Progression durch jede Phase. Die Inaktivierung des
jeweiligen Cdk ist notwendig zum Eintritt in die nächste Phase. Die Degradation der Cycline durch das
60S-Proteasom, ist ein Mechanismus zur Regulation der Cdk Aktivität. Viele Kontrollmechanismen
inhibieren direkt oder indirekt Cdk-Aktivität, als Antwort auf ungünstige Umweltbedingungen oder
Fehler bei zellulären Prozessen. Während der G1-Phase der Interphase werden Wachstums und

5
Einleitung

Differenzierungssignale integriert. Bei Fehlen der Signale wird ein G1-Arrest ausgelöst. DNA-Schäden
(p53-Aktivierung) und Defekt bei der Histon oder dNTP-Synthese lösen ebenfalls einen G1-Arrest aus.
In der G2-Phase werden Proteine synthetisiert und die Integrität der replizierten DNA kontrolliert.
Schließlich wird in der Mitose die korrekte Assoziation der Kinetochore mit der mitotischen Spindel
kontrolliert. Wenn die Schäden nicht behoben werden können leiten die Zellen schließlich die
Apoptose ein (Alberts et al., 2002, Chapter 17).

Abbildung 3: Schematische Darstellung des Zellzyklus (links) und wichtiger Kontrollpunkte (rechts).
Erläuterungen siehe Text

In Abbildung 3 links, sind einige wichtige Kontrollelemente des Zellzyklus dargestellt. Die Bedeutung
der beteiligten Proteine sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 erläutert.

6
Einleitung

Cdk-Inhibitoren (CKIs)

p27 Unterdrückt G1/S-Cdk und S-Cdk Aktivität in G1


verhinder dadurch Replikation

p21 Negativer Regulator der G1/S-Cdk und S-Cdk


Aktivität nach DNA-Schädigung in der G1-Phase

p16 Unterdrückt G1-Cdk Aktivität in der G1-Phase

Tabelle 1 : Zellzykluskontrolle durch Inhibition der Cdk-Aktivität


CKIs (cyclin dependent kinase inhibitors)
20
verändert nach

Transkriptionelle Kontrolle des Zellzyklus

Retinoblastoma Rb schützt die Zelle davor beschädigte DNA zu replizieren


Inhibition des Transkriptionsfakt E2F (G1-Arrest)

p53 Aktiviert die Transkription nach DNA-Schäden,


Zellzyklusarrest oder Apoptose

Tabelle 2 : Transkriptionsfaktoren die den Zellzyklus regulieren


Zielgene des p53-Proteins sind z.B. der CKI p21
20
verändert nach

7
Einleitung

1.4 Biologische Wirkung von Goldcarbenkomplexen als Ziel für die


Pharmakotherapie von Krebserkrankungen
Goldverbindungen wirken über zahlreiche Mechanismen auf den Zellzyklus. Direkte Schädigung von
Mitochondrien (durch Inaktivierung der Thioredoxinreduktase, TrxR), Inhibition des 60S-Proteasoms,
DNA-Reparaturenzyme wie dem PARP-1, Inhibition von Kinasen und Phosphatasen wurden unter
Anderem als zugrunde liegende Mechanismen identifiziert 21–37. TrxR ist eine konservierte Familie von
Proteinen, die an der Aufrechterhaltung der Redoxhomöostase der Mitochondrien (TrxR1) und des
Zytosols (TrxR2) beteiligt sind. Eine weitere essenzielle Funktion ist, die Regulation der
22,24,35,37,38
Ribonukleotidreduktase bei der Synthese von Desoxyribonukleotiden . Zahlreiche
menschliche Krebszelllinien weisen eine erhöhte Expression dieser Proteine auf. Viele untersuchte
Goldkomplexe haben eine große Affinität zum Selenocystein, im aktiven Zentrum dieser Enzyme 39.
Die N-heterozyklischen-Goldkomplexe bilden kovalente Addukte mit dem Selen und inaktivieren
21–27,37,40
dadurch das TrxR . Behandlung isolierter Rattenmitochondrien mit Gold(I)–
21,41–44
bis(NHC)Komplexen führten zu einer Erhöhung der Membranpermeabilität . Vergleichbare
Wirkung wurden auch für einkernige, lineare, kationische Gold(I)–NHC-Komplexe beschrieben. Eine
derartige Verbindung war selektiv für Krebszellen durch Induktion des intrinsischen Weges der
Apoptose. Ein weiterer Mechanismus über den Auranofin und Gold(I)–NHC-Komplexe wirken, sind
Protein Tyrosin Phosphatasen (PTPs). Ein prominenter Vertreter dieser Gruppe ist die Cdc25
45–48
Phosphatase, die den Eintritt in die Mitose auslöst. . In einer Studie von Wang, wurde eine
direkte, TrxR unabhängiger Wirkung auf den Zellzyklus beschrieben. Die Goldcarbenkomplexe
führten zu einem S-Arrest und lösten über p53-bak vermittelte Apoptose aus. Dies ist ein Hinweis,
auf direkte oder indirekte Schädigung der DNA 49.

1.5 Biologische Wirkung von Platincarbenkomplexen als Ziel für die


Pharmakotherapie von Krebserkrankungen
Der am besten charakterisierter Vertreter unter den zytostatischen Platinverbindungen ist, das cis-
Platin. Der Mechanismus über den cis-Platin wirkt, ist die direkte Adduktbildung mit DNA. Dabei wirkt
es als bifunktionelles Reagenz und führt bevorzugt zur intrastrand Quervernetzung benachbarter
Guanine. Die DNA-Addukte können nicht repliziert und transkribiert werden und leiten dadurch die
Apoptose betroffener Zellen ein 50–58.

Neben dem gut verstandenen Mechanismus der direkten Platinierung von DNA, können
heterozyklische-Platincarbenkomplexe und trans-Platinverbindungen auch durch andere
59–61
Mechanismen zytostatische Wirkung entfalten . Dabei werden die Platinierung von Proteinen,
und niedermolekularen Thiolverbindungen, wie das Glutathion für die zytotoxische Wirkung

8
Einleitung

verantwortlich gemacht. Der spezifischen Platinierung von Kupferproteinen könnte dabei eine
Schlüsselrolle zukommen 60,62–64.

33
Ein neuartiger Mechanismus wurde von Sun und Kollegen für einige cyclometallierte-
Pt(II)Komplexe beschrieben. Hierbei wurde die Autofluoresenz dieser Moleküle ausgenutzt, um ihre
zelluläre Lokalisation zu verfolgen. Die Verbindungen akkumulierten im Zytoplasma und zeigten
starke, selektive Zytotoxizität gegenüber Krebszellen. Die Verbindung führte zur Tumorremission im
Mausmodell und zeigte kaum unspezifische Toxizität. Auf biochemischer Ebene konnte eine
Verringerung der Survivin-Expression und Aktivierung der Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP)
nachgewiesen werden. Cyclometallierte-Platin(II)Komplexe wurden weiterhin als Inhibitoren der
Topoisomerase IIα beschrieben 65.

1.6 Problemstellung
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit soll ein Wirkprofil ausgewählter Imidazol-Gold-
/Platincarbenkomplexe auf 518A2-Melanomzellen erstellt werden, die von dem Naturstoff
Combretastatin-A4 abgeleitet wurden. Wirkungsmechanismen verwandter Verbindungen sind
bekannt und erlauben daher eine Auswahl an Testverfahren im Rahmen eines „educated guess“. In
diesem Zusammenhang soll der Einfluss der Substituenten an den Imidazol-Stickstoffen und der
Einfluss des Goldes bzw. Platins als Zentralatom auf das Wirkprofil untersucht werden.

Für die Eingrenzung des Konzentrationsbereiches in dem die Testsubstanzen eingesetzt werden
können, sollen die IC50–Werte für die Melanomzelllinie 518A2 und die Kolonkarzinomlinie HCT116
ermittelt werden. Es soll untersucht werden, ob es Anhaltspunkte für die Inhibition des
Tubulinzytoskeletts durch die Imidazol-Edelmetalcarbenkomplexe gibt. Die Wirkung auf Mikrotubuli
soll indirekt durch die mikroskopische Untersuchung der Morphologie, behandelter Zellen untersucht
werden. Veränderungen der Zellform oder die Zunahme an apoptotischen Zellen sind mit dieser
Methode qualitativ abschätzbar. Zusätzlich soll die Zellmotilität behandelter Zellen im sog. „wound
healing assay“ untersucht werden. Herbei werden Zellen örtlich begrenzt mechanisch von der
Oberfläche des Substrates entfernt. Anschließend wird mikroskopisch über drei Tage dokumentiert,
wie mit den Testsubstanzen behandelte/unbehandelte Zellen das Substrat erneut besiedeln. Zwei
der prominenten Aufgaben der Mikrotubuli ist, als Führungssystem für den Transport von Organellen
und Chromosomen zu dienen. Neben der Mitose sind somit auch die G1-und G2–Phase gegenüber
Störungen der Mikrotubuli empfindlich. Die oben genannten Methoden erlauben keine Rückschlüsse,
welche Phase das primäre Ziel der Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe sein könnte. Die Anteile
wachsender Zellen in den jeweiligen Phasen des Zellzyklus sind weitgehend konstant. Eine
9
Einleitung

Veränderung der Anteile durch die Testsubstanzen lässt den Schluss zu, welche Phase die größte
Sensitivität gegenüber der eingesetzten Substanz zeigt. Hierzu soll der Anteil an behandelten Zellen
in den einzelnen Phasen des Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie ermittelt werden. Die Zellen
werden mit dem interkalierenden DNA-Farbstoff Propidiumjodid gefärbt. Anschließend werden die
Zellen anhand ihres DNA-Gehaltes und Größe den Phasen des Zellzyklus zugeordnet.
Cis-Platin (Diammindichloridoplatin; DDP) wird vielfach als Zytostatikum eingesetzt. Die
Wirkungsweise dieser Verbindung beruht in erster Linie auf der Quervernetzung benachbarter
Guaninbasen eines DNA-Strangs. Aufgrund der strukturellen Verwandtschaft zu den
Platincarbenkomplexen soll durch ein gelelektrophoretisches Verfahren (EMSA) die Frage
beantwortet werden, ob die Imidazol-Platincarbenkomplexe DNA bindende Eigenschaften in vitro
besitzen. Um die Wirkungsmechanismen der Testsubstanzen weiter einzugrenzen, wird der NBT-
Assay verwendet. Diese Methode erlaubt die Messung von ROS (Reactive Oxygen Species), als
Reaktion der Zellen auf die untersuchten Testsubstanzen.

10
Materialien

2 Materialien

2.1 Zellinien

2.1.1 Zelllinie 518A2

Bei der 518A2-Zelllinie handelt es sich um eine adhärent wachsende humane Melanomzelllinie. Die
Zellen wurden in DMEM bei 37 °C mit 5% CO2 kultiviert.

2.1.2 Zelllinie HCT-116

Bei den HCT-Zellen handelt es sich eine adhärent wachsende humane Kolonkarzinom-Linie (DSMZ
no.:ACC 581) mit annähernd diploidem Chromosomensatz. Die Zellen wurden in DMEM bei 37 °C mit
5% CO2 kultiviert.

2.2 Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe
In der vorliegenden Arbeit wurden dimere Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe auf ihre
zytotoxischen Eigenschaften hin untersucht. Die Testsubstanzen wurden am Lehrstuhl für
Organischen Chemie I der Universität Bayreuth synthetisiert. TR44 /TR45/ 53Pt/TR46 Abbildung 4
(A,C,B,D), TR68/TR69 und Abbildung 5 (A,B) wurden als 10 mM Stammlösungen in DMF angesetzt.
TR46 wurde als 10 mM Stammlösungen in DMSO angesetzt. Alle Verbindungen wurden bei 4 °C
gelagert. Da nur vier Substanzen untersucht worden sind, werden in dieser Arbeit die laborinternen
Bezeichnungen verwendet. Die TR-Komplexe wurden von Tobias Rehm (B.Sc.), und V53-Pt wurde von
Dr. Bernhard Biersack synthetisiert (Universität Bayreuth).

11
Materialien

Abbildung 4: A-D Strukturformeln der untersuchten Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe

Abbildung 5: A-B Für die dargestellten Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe wurden die


IC50-Werte in 518A2 und HCT-116- Zellen bestimmt

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Materialien

2.3 Chemikalien
Antibiotic-Antimycotic Gibco
Borsäure Carl Roth
Dinatriumhydrogenphosphat Fluka
D-MEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) Life Technologies
DMF (N,N-Dimethylformamid) Carl Roth
EDTA Prolabo
Ethanol VWR
Ethidiumbromid-Lösung Merck
FBS (fetal bovine serum) Life Technologies
HCl Carl Roth
2-Propanol Fluka
Propidiumiodid Carl Roth
Plasmid-DNA pBR322 Carl Roth
Kaliumchlorid Merck
Kaliumdihydrogenphosphat Merck
Molekulargewichts-Standard (DNA) Carl Roth
1 kb DNA-Leiter
Natriumchlorid Sigma-Aldrich
RNase A (10 mg/ml) Carl Roth
Trypsin/EDTA-Lösung (1x in HBSS) Life Technologies
(0,05% Trypsin, 0,02 % EDTA)

2.4 Lösungen
2.4.1 Zellkultur-Medium DMEM

500 ml D-MEM
55 ml FBS
5,5 ml Antibiotic-Antimycotic
2 ml Gentamycin
sterilfiltriert.

2.4.2 Ethidiumbromid-Färbelösung

15 μg/ml Ethidiumbromid in 0,5x TBE-Puffer

13
Materialien

2.4.3 PBS

136 mM NaCl
2,8 mM KCl
8 mM Na2HPO4 x 12 H2O
1,5 mM KH2PO4
H2O bidest. ad 1 l
pH 7,4

2.4.4 PI-Färbelösung

50 μg/ml Propidiumiodid
50 μg/ml RNase
0,1 % Na-Citrat

2.4.5 TBE-Puffer (10x)

890 mM Tris
890 mM Borsäure
20 mM EDTA
pH 8,3

Amphotericin B 25 μg/ml in 0,85 % Saline


Penicillin G (Na-Salz) 10 000 units/ml
Streptomycin-Sulfat 10 000 μg/ml

2.5 Geräte
Dampfsterilisator Varioklav 135 S H+P
Durchflusszytometer CytomicsFC 500 Beckman-Coulter
Gelkammer DCX-700 C.B.S. Scientific
Inkubator HERA cell 240 Heraeus
Lichtmikroskop Axiovert 135 mit AxioCam MRc5 Carl Zeiss
Pipetten (0,5 – 1000 μl) Eppendorf
Pipettierhilfe Pipetus Hirschmann
Stromquelle 2197, LKB Bromma
Thermomixer 5436 Eppendorf
Sterilwerkbank Aura vertical S.D.4, Nunc
Ultraschallbad SONOREX super 10P Bandelin
UV-Transilluminator Vilber Lourmat

14
Materialien

Vortexer VF2 Janke & Kunkel IKA-Labortechnik


Zentrifugen; Centrifuge 5417R, miniSpin, Eppendorf/Multifuge X3 FR,Heraeus

2.6 Kunststoff-Verbrauchsmaterialien
50 ml Kunststoffröhrchen mit Schraubdeckel Greiner
15 ml Kunststoffröhrchen mit Schraubdeckel 15 ml Greiner
Eppendorfreaktionsgefäße (1,5 ml, 2 ml) Eppendorf
FACS-Rohrchen BD Falcon
Mikrotiterplatten-24-Vertiefungen Greiner
Mikrotiterplatten-6-Vertiefungen Nunc
Petrischalen Sarstedt
Serologische Pipetten (2 ml, 5 ml, 10 ml) Carl Roth
Zellkulturflaschen Nunclon Δ Surface (75 cm2) Nunc
Zellkulturflaschen Nunclon Δ Surface (25 cm2) Nunc

2.7 Software
Accelrys-Draw
AxioVs40, Zeiss, AxioVision
CXP Software Version 2.2
Excel 2010, Microsoft
GraFit 3 Erithacus Software Limited, 1989–1995
ImageJ, 1.48v
Prism 5.0, Graphpad
Mendeley-Bibliographie-Software

15
Methoden

3 Methoden
3.1 Zellkultivierung und Passage
518A2 und HCT-116 Zellen wurden in DMEM bei 37°C, 95%-Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 kultiviert.
Die Zellen wurden alle 3-4 Tage passagiert. Hierzu wurde das Kulturmedium entfernt und die
adhärenten Zellen mit 1x PBS gewaschen. Die Zellen wurden durch Inkubation mit 2ml/75 cm2
Trypsin/EDTA-Lösung (2 Minuten, 37 °C) abgelöst. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 ml DMEN-
gestoppt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert (150 g, 4 °C, 5 min). Das Zellpellet wurde
in 2 ml DMEM resuspendiert. 30 μl der Zellsuspension wurden mit 270 μl PBS verdünnt und die
Zellzahl, in 10 μl mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.

3.2 MTT-Vitalitätstest zur Ermittlung der IC50-Werte


Die IC50-Werte für Imidazol-Gold-/Platincarbencomplexe wurden für die Zellinien 518A2 und HCT-116
mit Hilfe des MTT-Assays ermittelt66,67,68,69. Die Vitalität der Zellen wurde nach 72h Inkubation mit
einer Verdünnungsreihe der jeweiligen Testsubstanzen gemessen. Metabolisch aktive Zellen setzen
den löslichen Farbstoff MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5- diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) durch
mitochondriale NADH-Dehydrogenasen, zu einem unlöslichen violetten Formazanfarbstoff um. Die
Menge an gebildeten Formazanfarbstoff ist proportional zur Anzahl vitaler Zellen69,70 .

100 µl einer 518A2-Zellsuspension (0,05*106 Zellen/ml) wurden je Vertiefung in einer 96-well-Platte


ausgesät. Die Zellen würden über Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde das
Medium durch 100 µl frisches DMEM ersetzt. Die Verdünnungsreihen für die Testsubstanzen wurden
aus 10 mM Stammlösung (DMF oder DMSO diente als Lösungsmittel) in bidestilliertem Wasser
erstellt. Die Zellen wurden für 72h mit 11,1 µl der vorverdünnten Testsubstanzen inkubiert. Die
Endkonzentrationen der Testsubstanzen waren 1mM, 500µM, 100 µM, 50 µM, 10 µM, 5 µM, 1 µM.
500nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 500pM, 100 pM, 50 pM. Als Kontrolle wurde das
Lösungsmittel (DMF oder DMSO) der Stammlösungen verwendet. Die Lösungsmittelkontrollen
wurden in dergleichen Weise verdünnt, wie die Testsubstanz-Stammlösungen. Die Zellen wurden in
den Mikrotiterplatten abzentrifugiert (5 min, 300 g, 4 °C). Das Zellpellet wurde mit je 50
µl/Vertiefung 0,05 % (w/v) MTT in PBS für 2h inkubiert. Die Zellen wurden erneut pelletiert (5 min,
300 g, 4 °C) und der Überstand wurde verworfen. Die in den Zellen gebildeten Formazankristalle
wurden durch Zugabe von 25 µl/Vertiefung einer DMSO-SDS-Lösung (Inkubation 30 Minuten 37°C)
freigesetzt und gelöst. Die Menge an gebildeten Formazan wurde durch fotometrische Messung bei
570 und 630 nm ermittelt. Die Extinktion bei 630 nm misst Hintergrund und wird von der Extinktion
bei 570 nm subtrahiert. Die Absorptionsdifferenz der Negativkontrolle wurde auf 100 % -Vitalität
normiert. Die Vitalität der mit der Testsubstanz behandelte Probe wurde als Anteil der

16
Methoden

Negativkontrolle ausgedrückt. Der Anteil vitaler Zellen wurde gegen die eingesetzte Konzentration
der Testsubstanz aufgetragen. Durch nicht lineare Regression wurden die Fehlerquadrate zwischen
den Messwerten und dem 4-Parameter Hill-Modell minimiert. Der IC50-Wert ergab sich dabei als ein
Parameter des Fits.

3.3 NBT-Test zur Messung von reaktiven Sauerstoff-Spezies


Der NBT-Assay dient zur quantitative Messung reaktiver Sauerstoff-Spezies als Reaktion der 518A2-
Zellen auf die Testsubstanzen. Der Ablauf des Tests ist dem des MTT-Assays ähnlich, da NBT
(Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) ebenfalls zur Gruppe der Tatrazoliumfarbstoffe gehört und das
gebildete Endprodukt ein unlösliches Formazan ist66,71,72.

100 µl einer 518A2-Zellsuspension (0,05*106 Zellen/ml) wurden je Vertiefung einer 96-well-Platte


ausgesät. Die Zellen würden über Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Das Medium wurde am
folgenden Tag durch 100 µl frisches DMEM ersetzt. Die Testsubstanzen wurden aus 10 mM
Stammlösung (DMF oder DMSO diente als Lösungsmittel) in bidestilliertem Wasser verdünnt. Die
Zellen wurden für 24h mit 11,1 µl den vorverdünnten Testsubstanzen inkubiert. Die
Lösungsmittelkontrollen wurden in der gleichen Weise verdünnt, wie die Testsubstanz-
Stammlösungen. Die Zellen wurden in den Mikrotiterplatten abzentrifugiert (5 min, 300 g, 4 °C). Das
Zellpellet wurde mit je 50 µl/Vertiefung 0,05 % (w/v) NBT in PBS für 4h inkubiert. Die Zellen wurden
erneut pelletiert (5 min, 300 g, 4 °C) und der Überstand wurde verworfen. Die in den Zellen
gebildeten Formazankristalle wurden durch Zugabe von 65 µl/Vertiefung einer 2M-KOH-DMSO -
Lösung (Inkubation 30 Minuten 37°C) freigesetzt und gelöst. Die Menge an gebildeten Formazan
wurde durch fotometrische Messung bei 405 und 630 nm ermittelt. Die Extinktion bei 630 nm misst
Hintergrund und wird von der Extinktion bei 405 nm subtrahiert. Für jede der untersuchten
Konzentrationen wurde pro Experiment vier einzelne Proben gemessen. Die Mittelwerte wurden aus
zwei Experimenten (insgesamt Acht Werte) errechnet. Für jede Probe wurde parallel ein MTT-Test
durchgeführt und das Verhältnis aus den Mittelwerten NBT/MTT gebildet.

3.4 Mikroskopische Untersuchung behandelter Zellen


500 μl einer 0,05 *106 Zellen/ml Zellsuspension wurde in Zellkulturplatten mit 24 Vertiefungen
ausgesät und über Nacht im Brutschrank inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Medium durch 500
μl frisches DMEM ersetzt. Die Morphologie der Zellen zum Zeitpunkt 0h wurde mit einem 32x
Objektiv im Phasenkontrast untersucht. Die Testsubstanzen wurden in bidestilliertem Wasser aus
einer 10mM Stammlösung (DMF oder DMSO) verdünnt. Als Negativkontrollen wurde die
entsprechende Menge DMF/DMSO in bidestilliertem Wasser ohne Testsubstanz verwendet. Die

17
Methoden

518A2-Zellen wurden mit den verdünnten Testsubstanzen für 24h inkubiert. Die Untersuchung der
Morphologie erfolgte mit einem 32x Objektiv im Phasenkontrast.

3.5 Untersuchung der Motilität von 518A2-Zellen im „wound healing


assay“
500 µl/Vertiefung einer 518A2-Zellsuspension wurden in einer Konzentration von 0,1* 106 in 24-well-
Platten ausgesät. Nach 24h Inkubation bei 37 °C wurden Zellen entlang eines Streifens der dem
Durchmesser eine Pipettenspitze entsprach, abgeschabt. Die abgelösten Zellen wurden mit dem
Zellkulturmedium entfernt. 500 µl/Vertiefung DMEM wurden zu dem so präparierten Zellrasen
gegeben. Die Stelle an der der Zellrasen abgeschabt worden ist, wurde anschließend
lichtmikroskopisch dokumentiert. Die X/Y-Koordinaten des Kreuztisches wurden notiert, um die
Stelle wiederfinden zu können. In bidestillierten Wasser gelöste Testsubstanzen wurden in
Konzentrationen um ihren IC50-Wert eingesetzt. Als Negativkontrolle diente das entsprechend
verdünnte Lösungsmittel (DMF/DMSO), in dem die 10mM-Stammlösung der Testsubstanzen
angesetzt worden sind. Die Motilität der Zellen wurden anhand der Neubesiedlung der abgeschabten
Stellen ermittelt. Hierfür wurde die abgeschabte Stelle anhand der X/Y-Koordinaten des Kreuztisches
identifiziert und 24h und 48h lichtmikroskopisch dokumentiert. Die Entfernung der Wundränder
wurde mit dem „freehand line“-Werkzeug des Bildverarbeitungsprogrammes ImageJ an fünf
Positionen gemessen und der Mittelwert gebildet.

3.6 Untersuchung der DNA bindenden Eigenschaften niedermolekularer


Verbindungen durch EMSA
Planare aromatische Kationen können zwischen die Basenpaare der DNA interkalieren. Eine weitere
Möglichkeit ist, die Adduktbildung mit elektrophilen Verbindungen wie Diethylsulfa toder, Hg(II) oder
Pt(II)73. Die Bindung der genannten Verbindungen führt zu veränderten elektrophoretischen
Mobilität der DNA. Dies kann durch Veränderung der Topologie oder einer Zunahme des realen
Molekulargewichtes der DNA oder eine Kombination aus beiden Möglichkeiten stattfinden. Beide
Möglichkeiten können anhand der stärkeren Retention des Komplexes, während der
Gelelektrophorese durch EMSA (electrophoretic mobility assay). sichtbar gemacht werden Die
Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe wurden auf Ihre Fähigkeit hin untersucht Plasmid DNA in vitro
zu binden. 1.5µg pBR322 Plasmid DNA wurde mit 0µM, 5µM, 10µM, 25µM und 50µM der
Testsubstanzen 24h bei 37°C in PBS inkubiert. Das Wanderungsverhalten potenzieller DNA-
Organometall-Komplexe wurde anschließend durch Gelelektrophorese (1 % Agarose w/v in 0. 5x-TBE
Puffer). Das Gel wurde für 40min in Ethidiumbromid-Färbelösung gefärbt und mit Hilfe eines UV-
Transilluminators dokumentiert74–76.

18
Methoden

3.7 Analyse des Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie


518A2-Melanomzellen wurden mit dem interkalierenden DNA-Farbstoff Propidiumiodid gefärbt. Die
Bindung an die DNA und die damit verbundene Zunahme der Fluoreszenz ist proportional zur DNA-
Menge in der Zelle. Der DNA-Gehalt einer Zelle hängt von der Phase des Zellzyklus ab. Durch
Messung der Zellgröße und des DNA-Gehaltes lässt sich dadurch bestimmen, in welcher Phase des
Zellzyklus sich die Zelle befindet. Die Anteile der Zellen in den unterschiedlichen Phasen des
Zellzyklus, wurden nach Behandlung der 518A2-Zellen mit den Imidazol-Gold-
/Platincarbenkomplexen, auf die beschriebene Weise mit einem Durchflusszytometer ermittelt.
Unbehandelte proliferierende 518A2-Melanomzellen befinden sich mehrheitlich in der G0- oder G1-
Phase. Diese Zellen sind diploid (2n) und haben einen einfachen DNA-Gehalt (1C). Die Replikation in
der S-Phase verdoppelt den DNA-Gehalt auf 2C. Während der Mitose wird die DNA auf zwei
Tochterzellen verteilt, wodurch der DNA-Gehalt der Zellen auf 1C reduziert wird.

Je 3 ml 518A2-Zellen mit einer Konzentration von 0,05*106Zellen/ml in wurden Zellkulturgefäßen mit


6 Vertiefungen ausgesät. Die Zellen wurden über Nacht im Brutschrank inkubiert. Vorverdünnungen
der Testsubstanzen und Lösungsmittel wurden in bidestilliertem Wasser angesetzt. Die Zellen
wurden mit den so vorbereiteten Testsubstanzen und Kontrollen für 24h im Brutschrank inkubiert.
Die Zellen wurden nach Waschen mit 1x PBS durch Trypsinierung mit 500 µl Trypsin/EDTA (siehe
Kultur und Passagieren von Zellen) in Suspension gebracht und mit zuvor gesammelten
Kulturüberständen vereinigt. Die Vertiefungen wurden mit mit 1 ml PBS nachgewaschen, und die
Waschlösung wurde zu den den gesammelten Proben gegeben. Die Zellen wurden pelletiert (300 g, 4
°C, 5 min) und die Zellpellets in 1 ml eiskaltem 70 % EtOH (in PBS) resuspendiert. Die Suspension
wurde bis zur Propidiumiodid-Färbung bei 4 °C gelagert. Für die Propidiumiodid-Färbung wurden die
Zellen pelletiert (2400 rpm, 5 min) und das Ethanol wurde durch 1 ml PBS ersetzt. Nach 5 minütiger
Rehydrierung bei RT, wurden die Zellen erneut pelletiert (2400 rpm, 5 min) und in in 200 μl PI-
Färbelösung resuspendiert. Die Proben wurden für 30 min bei 37 °C inkubiert um die RNA in den
Zellen zu verdauen. Anschließend wurden die Zellen mit 300 oder 800 μl PBS gemischt und in FACS-
Röhrchen überführt. In jeder Probe wurden 10000 einzelnen Zellen am Durchflusszytometer
analysiert. Die Anregungswellenlänge betrug 488 nm (Argon-Laser) und die Emissionswellenlänge
620 nm.

Es wurde eine Dublettendiskriminierung vorgenommen, um nur vereinzelte Zellen auszuwerten.


Hierbei wird Peakfläche des Spannungsverlaufes, beim Durchtritt eines Partikels durch den
Laserstrahl ausgewertet. Partikel, die aus mehren Zellen zusammengesetzt sind, können nicht
anhand ihres DNA-Gehaltes den Phasen des Zellzyklus zugeordnet werden. Zelldubletten
unterscheiden sich von diploiden Zellen durch die größere Oberfläche. Die Verweildauer im Fokus
19
Methoden

des Lasers wird dadurch länger. Die Peakfläche des Spannungsverlaufes am Detektor wird dadurch
ebenfalls größer. Die Zunahme der Peakfläche ist bei gleichbleibender Fluoreszenzintensität, auf eine
Streckung des Peaks entlang der Zeitachse zurückzuführen. Die Einzellzellen können manuell aus
einem Dot-Plot ge-gated werden. Hierzu wird die Fläche des Spannungsverlaufes gegen die
Peakweite aufgetragen. Für die Berechnungen der prozentualen Anteilen der Zellen in den Phasen
des Zellzyklus wurde die Fluoreszenzintensität gegen die dublettenkorrigierten Events aufgetragen
(FL3 Lin/Events). Das erhaltene Histogramm zeigt die Häufigkeitsverteilung der Fluoreszenzsignale,
die Proportional zu den Phase des Zellzyklus sind. Die Zellzyklusphasen und der sub-G1 Bereichs
wurden anhand der entsprechenden Negativkontrollen manuell ge-gatet.

20
Ergebnisse und Diskussion

4 Ergebnisse und Diskussion

4.1 Der Imidazol-Platincarbenkomplex V53Pt zeigt die geringste Toxizität


gegenüber Melanomzellen der Linie 518A2
Der IC50-Wert der Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe TR44, TR45, TR46, V53Pt wurde durch
Messung der Zytotoxizität ermittelt. Hierzu wurden konfluente Kulturen der Zelllinien HCT116 und
518A2 für 72h mit unterschiedlichen Konzentrationen der Testsubstanzen inkubiert. Die
konzentrationsabhängige Toxizität der Testsubstanzen wurde mit dem MTT-Assay bestimmt. Durch
Auftagung der eingesetzten Konzentrationen gegen die Vitalität der Zellen, konnte der IC50-Wert als
Parameter der interpolierten Kurve ausgelesen werden.

Goldkomplexe Platinkomplexe

T518A2 TR44 TR45 TR46 V53Pt TR68 TR69


a 0,66 0,76 0,62 7,83 1,36 0,58
bIC50 [µM]
e +/- 0,03 +/- 0,07 +/- 0,08 +/- 0,68 +/- 0,10 +/- 0,08
lN 4 4 8 6 4 4
l

Tabelle 3: IC50-Werte (μM) der untersuchten Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe für


518A2-Melanomzellen
Berechnung der IC50-Werte für die Imidazol-Goldcarbenkomplexe: TR44 und TR45 und Imidazol-
Platincarbenkomplexe TR46, V53Pt, TR68, TR69. Die Zellvitalität wurde nach 72h Inkubation der
518A2-Zellen mit den Testsubstanzen, mittels MTT-Assay ermittelt. Die IC50-Werte sind als Mittelwerte
mit Standardabweichung angegeben. Die Anzahl der unabhängigen Einzelmessungen ist mit N
angegeben.

Der Imidazol-Platincarbenkomplex V53Pt ist die Testsubstanz mit der geringsten Toxizität für die
Melanomzelllinie 518A2. Der Imidazol-Goldkomplexes TR44 ist dem V53Pt strukturell sehr ähnlich,
mit identischen Substituenten an den Imidazol-Stickstoffen. Auffällig ist der mehr als 10-fach höhere
IC50-Wert des TR44. Die erhöhte Toxizität gegenüber den 518A2-Zellen ist wahrscheinlich auf das
Gold als Zentralatom zurückzuführen.

21
Ergebnisse und Diskussion

4.2 Alle untersuchten Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe wirken


weniger toxisch auf die HCT116 als auf die Melanomzellinie 518A2

Goldkomplexe Platinkomplexe

HCT116 TR44 TR45 TR46 V53Pt TR68 TR69


1,32 1,51 7,23 12,90 2,99 8,35
IC50 [µM]
+/-0,22 +/-0,34 +/-0,01 +/-1,18 +/-1,10 +/-3,63
N 4 4 2 2 4 3

Tabelle 4 IC50-Werte (μM) der untersuchten Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe für


HCT116-Zelllinie.
Berechnung der IC50-Werte für die Imidazol-Goldcarbenkomplexe: TR44 und TR45 und Imidazol-
Platincarbenkomplexe TR46, V53Pt, TR68, TR69. Die Zellvitalität wurde nach 72h Inkubation der
HCT116-Zellen mit den Testsubstanzen, mittels MTT-Assay ermittelt. Die IC50-Werte sind als
Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben. Die Anzahl der unabhängigen Einzelmessungen ist
mit N angegeben.

Die IC50-Werte wurden weiterhin für die Kolonkarzinomzelllinie HCT116 ermittelt. Verbindungen, wie
das Oxaliplatin, Carboplatin und cis-Platin finden in der Bekämpfung des Kolonkarzinoms weite
77
Verbreitung . Die Imidazol-Platincarbenkomplexe TR46, V53Pt, TR68 und TR69 stellen somit
mögliche Therapeutika für diese Erkrankung dar. Der direkte Vergleich der Wirkung der Gold-
/Platincarbenkomplexe zeigt,dass die Toxizität aller untersuchten Testsubstanzen für HCT116-Zellen
geringer ist als für für die 518A2-Linie. Die IC50-Werte Liegen für die Imidazol-Goldcarbenkomplexe
TR44 und TR45, für die HCT116–Zellen etwa einen Faktor 2 über den IC50-Werten für die 518A2-
Zellen. Die IC50-Werte für die Verbindungen TR46 (7,23 µM), V53Pt (12,90 µM) und TR69 (8,35 µM)
liegen annähernd um einen Faktor 10 über den über den IC50-Werten für die 518A2-Zellen. Eine
Erklärung für die geringere Toxizität aller untersuchten Verbindungen in HCT116-Zellen könnten
Unterschiede in der Teilungsrate der sein. Hohe Teilungsraten begünstigen die Wirkung der meisten
Zytostatika77. Für die Wirksamkeit auf solide Tumore ist die „Gewebegängigkeit“ und und Toxizität
der Verbindungen entscheidend damit ausreichend hohe Konzentrationen im des Tumors erreicht
werden können. Weiterhin ist für den Erfolg entscheidend, dass gesunde Zellen wenig geschädigt
werden. Hierfür würde es sich anbieten die IC50-Werte für nicht-neoplastische Zellen, die aus den
gleichen Geweben stammen, zu untersuchen. Da die Kultur von primären Zellkulturen sehr
aufwendig ist, bieten sich hierfür immortalisierte Zellen an. Zelllinien, die durch Expression einer
humanen Telomerase immortalisiert worden sind, verhalten sich weitgehend wie „gesunde“

22
Ergebnisse und Diskussion

Zellen78,79,. Diese sog. hTERT-Zellinien wären eine wichtige Kontrolle in Verbindung mit den
verwendeten neoplastischen Zelllinien.

4.3 Nach 24h Inkubation mit TR44/ TR45/ TR46/ V53Pt nimmt die Anzahl
an 518A2-Zellen in Suspension geringfügig zu
Die morphologischen Auswirkungen der Imidazol-Gold-/Platinkomplexe wurde nach 24h Inkubation
mit den Testsubstanzen dokumentiert. Hierfür wurde zur kontrastreichen Darstellung der
Zellorganellen Phasenkontrastmikroskopie bei 320-facher Vergrößerung eingesetzt.

Abbildung 6: Mit Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexen behandelte Melanomzellen lösen


sich im Vergleich zu mit DMF oder DMSO behandelten Zellen vermehrt vom Substrat ab.
Phasenkontrastaufnahmen (32x Objektiv) von 518A2-Zellen nach24h Inkubation mit den
Testsubstanzen. Negativkontrollen (A, DMF; D,DMSO). B und C Imidazol-Goldcarbenkomplex TR44 (1,5
µM) und TR45 (1,5 µM) E und F Imidazol-Platincarbenkomplex TR46 (7.5 µM) und V53Pt (10 µM).
TR44/TR45 und V53Pt waren in DMF, TR46 in DMSO gelöst, Balken in E entspricht 50µm. In 518A-
Zellen die mit dem Imidazol- TR45 behandelt wurden sind abgerundete Zellen zu sehen schwarze
Pfeilspitzen in C. Einige der Zellen zeigen darüber hinaus Vesikel. Die Vesikel umgeben als helle Punkte
den Kern, schwarze Pfeile in C. Die Anzahl an Zellen in Suspension ist für den Platinkomplex TR46
(7.5µM) E, am größten schwarze Pfeilspitzen in E. Die verbleibenden Zellen versuchen die Kontakte zu
halten, und bilden vermehrt Filopodien aus weiße Pfeilspitzen in E.

Die vorliegende morphologische Untersuchung, der Wirkung der Testsubstanzen auf 518A2-Zellen
legt den Schluss nahe, dass die Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe bei Konzentrationen im µM-
Bereich, Apoptose auslösen können. Ein Indiz hierfür sind die abgerundeten Zellen in Suspension,
24h nach der Zugabe der Substanzen. Adhärent wachsende Zelllinien wie 518A2, sind während der
Mitose in Suspension. Die mikroskopische Analyse erlaubt keine Unterscheidung ob es sich bei den
23
Ergebnisse und Diskussion

Zellen in Suspension um Apoptose oder Mitose handelt. Hierzu bedarf es weiterer Experimente, wie
z.B. dem TUNEL-Assay, zum Nachweis der Apoptose. Bei Behandlung mit TR45 zeigten einige Zellen
auffällige vesikuläre Strukturen in Kernnähe (Abbildung 6 C). Die mikroskopischen Aufnahmen
ermöglichen es nicht das Kompartiment zu ermitteln, dem die Vesikel entsprechen. Die Kenntnis des
Kompartimentes könnte Hinweise auf den zugrunde liegenden Mechanismus der
Zellschädigung/Zelltodes geben. Eine Möglichkeit zu Ermittelung des betroffenen Kompartimentes,
wären Kolokalisationsstudien mit kompartimentspezifischen Antikörpern. Eine Frage in diesem
Zusammenhang ist, ob sich die Testsubstanz in den Vesikeln anreichert oder eine physiologische
Adaptation an die Behandlung ist. Die Vesikel könnten Enzyme enthalten, die die Substanz abbauen.
Für die Beantwortung dieser Frage könnte man die Autofluoreszenz des Imidazol-
Goldcarbenkomplexes in einem Mikrofluorimeter verwenden. Eine weitere Methode, um zu erfahren
ob sich der Goldkomplex in den Vesikeln befindet, wäre die analytische Elektronenmikroskopie. Der
Goldanteil der Testsubstanz, könnte hierbei zum Nachweis im Rahmen einer Elementaranalyse
verwendet werden.

4.4 Die Imidazol-Goldcarbenkomplexe TR44/TR45 verringern die


Motilität der 518A2-Zellen bei einer Konzentration von 1,5 µM
Combretastatin-A4, die Leitstruktur für die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Substanzen,
unterdrückt die Vaskulogenese (Bildung neuer Blutgefäße aus Endothelzellen). Für die Wanderung
und Teilung der Endothelzellen, wie auch der Tumorzellen ist die dynamische Umstrukturierung des
Tubulinzytoskeletts notwendig. Combretastatin-A4 stört die Tubulinpolymerisation und kann durch
Auslösen von „Checkpoints“ den Zellzyklus arretieren und die Apoptose einleiten80,81. Imidazol-
17,19
Goldcarbenkomplexe mit verwandten Strukturen zeigen Tubulin disruptive Eigenschaften . Um
die indirekte Wirkung der Imidazol-Goldcarbenkomplexe auf die Zellmotilität zu untersuchen, wurde
der sog. „wound healing assay“ verwendet. Hierfür wurden Zellen einer konfluenten 518A2-Kultur in
einem Streifen abgeschabt. Nach Inkubation mit den Testsubstanzen, wurde die Neubesiedlung des
Streifens 48h lang mikroskopisch dokumentiert.

24
Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 7: Imidazol-Goldcarbenkomplexe verringern die Zellmotilität von Melanomzellen im


„wound healing-assay“
Phasenkontrastaufnahmen (10x Objektiv) von 518A2-Zellen nach 0h (A, D, G), 24h (B, E, H) und 48h(C, F, I)
Inkubation mit Testsubstanzen. Negativkontrollen (A-C, DMF). Imidazol-Goldcarbenkomplexe, D-F TR44
(1,5µM) und G-I TR45 (1.5µM). Die „Wundränder“ nach 48h Inkubation sind durch schwarze und weiße
Pfeilköpfe dargestellt. Weiße Pfeile deuten auf Zellen in Suspension. Balken in I entspricht 150µm.

Die Imidazol-Goldcarbenkomplexe TR44 und TR45 wurden jeweils in einer Konzentration von 1.5µM
eingesetzt und verzögerten die Neubesiedlung der abgeschabten Stelle des Kulturgefäßes (Abbildung
7 F und I im Vergleich zur Kontrolle, C). Hierbei zeigt TR45 die stärkere Inhibition der Zellwanderung.
Die Wundränder zwischen der Aufnahme nach 24h und nach 48h haben sich nur geringfügig
aufeinander zubewegt (Abbildung 7 H und I weiße Pfeilspitzen). Die Anzahl der 518A2 Zellen in
Suspension nimmt nach 48h sichtbar zu (Abbildung 7 weiße senkrechte Pfeile in F und I). Die Zellen in
Suspension sind wahrscheinlich apoptotische Zellen, da im Falle vermehrter Mitosen mit einer
Schließung der „Wunde“ zu rechnen wäre. Der vorliegende Versuch bestätigt die vermutete Wirkung
der Golkomplexe, auf die Zellmotilität. Es ist anzunehmen, dass die Ursache in diesem Fall, wie für
das Combretastatin-A4 eine Störung des Tubulinzytoskeletts ist. Um den Beweis zu erbringen, dass
das Tubulinzytoskelett der Hauptangriffspunkt für TR45 und TR44 ist, wären
Immunfluoreszenzfärbungen mit α-Tubulin-Antikörpern sinnvoll.

25
Ergebnisse und Diskussion

4.5 V53Pt hat keinen Einfluss auf die Motilität von 518A2-Zellen bei einer
Konzentration von 10 µM und ist toxisch ab einer Konzentration von
12,5 µM
Der „wound healing assay“ wurde auch verwendet, um die Wirkung des Imidazol-
Platincarbenkomplexes V53Pt auf die Motilität von 518A2-Zellen zu untersuchen. Bei einer
Konzentration von 10µM, zeigte V53Pt keine Beeinträchtigung der Motilität der 518A2-Zellen
(Abbildung 8 A-C). Die Zellen waren 48h nach der Zugabe der Testsubstanz wieder vollständig
konfluent. Bei einer eingesetzten Konzentration von 12,5µM, zeigte V53Pt nach 24h und 48h eine
starke Ansammlung an Zellen in Suspension. Dieses Ergebnis wahrscheinlich auf unspezifische
Toxizität zurückzuführen. V53Pt ist strukturell mit dem Imidazol-Goldcarbenkomplex TR44 verwandt.
Der IC50-Wert des Goldkomplexes liegt mit 0,66 µM unter dem des Platinkomplexs mit 7,86 µM
(siehe Tabelle 3). Das Platin verstärkt die Toxizität des V53Pt somit nicht im „wound healing assay“.
Es ist wahrscheinlich, dass der Mechanismus, über den die Apoptose in eingeleitet für beide
Verbindungen unterschiedlich ist. Die strukturelle Verwandtschaft der Goldverbindung TR44 und
V53Pt lässt den Schluss zu, dass die Wirkung des TR44 auf die Zellmotilität, nicht zwingend auf die
Ähnlichkeit mit dem Combretatastatin-A4 zurückzuführen ist. Ein synergistischer Effekt mit dem Gold
als Zentralatom ist wahrscheinlich. Gegenwärtig wird für Gold(I)carbenkomplexe das Enzym
Thioredoxinreduktase (TrxR) als Hauptangriffspunkt diskutiert. Als Konsequenzen werden unter
Anderem vermehrte ROS („Reactive Oxygen Species“)-Produktion und ein eine Störung des
Nukleinsäurestoffwechsels angenommen34,82–84. In der Therapie von Kolorektalkarzinomen sind
Platinkomplexe die Mittel der ersten Wahl. Momentan sind Cis-Platin, Carboplatin und Oxaliplatin als
Arzneimittel zugelassene Platinkomplexe85,4. Die intrastrang Quervernetzung von Guaninbasen
miteinander und Guanin mit Adenin, gilt als primärer Wirkungsmechanismus85,86,87,88. Möglicherweise
spiegeln die unterschiedlichen Effekte des TR44 und TR45, die beiden zuletzt genannten
Mechanismen wieder. Im weiteren Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde die vermehrte Bildung
reaktiver Sauerstoffspezies, durch die Testsubstanzen mit dem NBT-Assay untersucht. Die direkte
DNA-Bindung der Platinverbindungen wurde mit dem EMSA-Assay untersucht.

Für alle im „wound healing assay“ eingesetzten Testsubstanzen wäre die Färbung mit einem
Vitalfarbstoff wie Neutralrot vorteilhaft. Durch Neutralrotbehandlung ließe sich die Zahl vitaler Zellen
mikroskopisch abschätzten. Dadurch könnte man eine Unterscheidung der Zellen in Suspension in
mitotische und apoptotische Zellen vornehmen89.

26
Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 8: Der Imidazol-Platincarbenkomplex V53Pt hat bei einer Konzentration von


10µM keinen Einfluss auf die Zellmotilität von Melanomzellen. Ab einer Konzentration von
12,5 µM wirkt V53Pt toxisch.
Phasenkontrastaufnahmen (10x Objektiv) von 518A2-Zellen nach 0h (A, D, G),24h(B, E, H)
und 48h (C, F, I) Inkubation mit den Testsubstanzen. Negativkontrollen DMF (G-I). Imidazol-
Platincarbenkomplexe, A-C V53Pt (10µM), und D-F V53Pt (12.5 µM)
Balken in I entspricht 150µm.

4.6 Der Einfluss von TR45 und TR44 auf die Motilität der Melanomzellen
ist nicht signifikant verschieden von der Kontrolle
Der „wound healing assay“ wurde zusätzlich zur beschreibenden mikroskopischen Untersuchung,
auch quantitativ ausgewertet. Hierfür wurde die Entfernung der„Wundränder“ über einen Zeitraum
von 48h gemessen. Da die ausgeschabte „Wunde“ in einigen Fällen unregelmäßig oder ungerade
verlief, wurde die Wundbreite an fünf Positionen ermittelt. Die erhaltenen Mittelwerte bei 0h
wurden auf 100% normiert. Die Wundbreite wurde als prozentualer Anteil des 0h Wertes
aufgetragen. Für TR44 und TR45 wurde eine zweifaktorielle ANOVA durchgeführ, mit der Zeit und
Behandlung mit den Testsubstanzen als Faktoren.

27
Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 9: Imidazol-Goldcarbenkomplexe, jedoch nicht die analog substituierten


Imidazol-Platincarbenkomplexe verringern bei einer Konzentration von 1,5µM die
Zellmotilität von Melanomzellen im „wound healing-assay“
(A-C), Mittlere Entfernung zwischen den 518A2-Zellen nach dem Ausschaben einer „Wunde“
in den Zellrasen und 0h, 24h und 48h Inkubation mit den Testsubstanzen. Aufgetragen sind
die Wundbreite in Prozent und der Standardfehler. In jedem Bild wurde die Entfernung der
„Wundränder“ an fünf Positionen gemessen, der Mittelwert zum Zeitpunkt 0h wurde als
100% definiert. A, nach 48h ist in beiden Ansätzen der Imidazol-Goldcarbenkomplexe (A,
TR44 und TR45 je 1.5 µM) die ausgeschabte „Wunde“ nachweisbar. In der
Negativkontrolle (DMF 1.5 µM) sind die Zellen an entsprechender Stelle konfluent. B, die
Imidazol-Goldcarbenkomplexe TR44 und TR45 verringern die Zellmotilität
konzentrationsabhängig. Bei Inkubation mit 1µM TR44 oder TR45 ist die ausgeschabte Stelle
nach 48h Inkubation nachweisbar. Die Entfernung der „Wundränder“ ist kleiner als für 1.5
µM Ansätze von TR44 und TR45. C, für die untersuchten Konzentrationen (7.5 µM TR46
und 10 µM V53Pt) der Imidazol-Platin-Komplexe wurde kein Einfluss auf die Zellmotilität
festgestellt. Nach 48h Inkubation mit den Testsubstanzen oder der Negativkontrolle waren
die 518A2-Zellen der Stelle an der die „Wunde“ ausgeschabt wurde konfluent. Als Kontrolle
diente für die Komplexe TR44, TR45 und V53Pt DMF, für TR46 DMSO. n.s. nicht signifikant.

Die Imidazol-Goldcarbenkomplexe TR44 und TR45 verringerten messbar die Zellmotilität von 518A2
Zellen. Aus Abbildung 6 A und B wird ersichtlich, dass die Lösungsmittelkontrolle (DMF) nach 48h
wieder konfluent ist. Die Goldverbindungen TR44 und TR45 haben bei den eingesetzten
Konzentrationen von 1 µM und 1,5µM die Neubesiedlung der abgeschabten Stelle im Kulturgefäß
verzögert. Mittels zweifaktorieller ANOVA (Varianzanalyse) mit Bonferroni post hoc Test wurde
untersucht, ob die beobachteten Unterschiede zwischen den Testsubstanzen und der Kontrolle und
der Testsubstanzen untereinander signifikant verschieden sind. Das Ergebnis der zweifaktoriellen

28
Ergebnisse und Diskussion

ANOVA ist in Abbildung 6 (A und B) als Linie oberhalb der Balken dargestellt. Die beobachteten
Unterschiede der Mittelwerte zwischen TR44 und TR45 sowie zwischen den beiden Goldkomplexen
und der Kontrolle sind nicht signifikant. Die durchgeführte ANOVA kann jedoch ebenfalls nur als
Anhaltspunkt für die Wirksamkeit der Testsubstanzen dienen. Die Ursache hierfür liegt daran, dass in
den Versuch nur jeweils drei Stichproben eingegangen sind. Für zukünftige Untersuchungen wäre es
hilfreich eine Poweranalyse durchzuführen, um die Anzahl notwendiger Stichproben abschätzen zu
können. Da beide Goldkomplexe bei der eingesetzten Konzentration nur eine geringe Toxizität
zeigen, wäre es ebenfalls sinnvoll den Versuch mit höheren Konzentrationen der Testsubstanzen zu
wiederholen. Die Untersuchten Imidazol-Platincarbenkomplexe TR46 und V53Pt zeigen bei den
untersuchten Konzentrationen von 7.5 µM (TR46) und 10 µM (V53Pt) keinen Effekt auf die
Zellmotilität.

4.7 TR46/ V53Pt und TR69 bilden keine Addukte mit Plasmid-DNA in vitro
Die Imidazol-Platincarbenkomplexe TR46,TR69 und V53Pt wurden auf ihre Eigenschaft hin
untersucht, mit superspiralisierter DNA zu interkalieren oder Addukte zu bilden.

Abbildung 10: Die Imidazol-Platincarbenkomplexe TR46,TR69 und V53Pt bilden keine


Addukte mit superspiralisierter Plasmid-DNA in vitro
1,5µg pBR322 Plasmid DNA wurde mit 0µM, 5µM, 10µM, 25µM und 50µM der
Testsubstanzen für 24h bei 37°C inkubiert. Das Wanderungsverhalten potenzieller DNA-
Organometall-Komplexe wurde durch Gelelektrophorese analysiert (1% Agarose w/v in 0.5x-
TBE Puffer). Superspiralisierte Plasmid-DNA (ccc) wandert im Gel schneller als die oc („open
circular“) Isoform. Der Unterschied im Wanderungsverhalten ist auf die unterschiedliche
Wechselwirkung der Topoisomere mit der Agarosematrix zurückzuführen. Bindung
niedermolekularer Verbindungen führt zu durch Vergrößerung des Molekulargewichtes und
Veränderung der DNA-Topologie. Das spiegelt sich in einer stärkeren Retention des
Komplexes während der Gelelektrophorese wieder. Bei keiner der untersuchten
TestsubstanzenTR46, TR69 und V53Pt (A,B,C) wurde eine Veränderung des Laufverhaltens
der Plasmid-DNA beobachtet. B‘, Struktur des TR69. D, cis-Platin diente als Positiv-Kontrolle.
29
Ergebnisse und Diskussion

Die superspiralisierte Plasmid-DNA verändert ihr apparentes Molekulargewicht, abhängig


von der eingesetzten cis-Platin-Konzentration.

Die gegenwärtige Vorstellung über die Wirkungsmechanismen von Platinverbindungen wie cis-Platin,
Oxaliplatin oder Carboplatin geht von der Bildung von DNA-Platin-Addukten aus85,90,91. Die
physikalische Interaktion der Platinverbindung mit der DNA führt zu einer messbaren Zunahme des
apparenten Molekulargewichtes. Die Platinverbindungen sind bifunktionell und führen zu intra-/ und
interstrang Vernetzung der DNA. Weiterhin ist bei Molekülen mit planaren Ringsystemen die
Interkalation eine denkbare Wechselwirkung zwischen der Platinverbindung und der DNA. Für die
Adduktbildung ist die Inhibition der von Polymerasen beschrieben worden91. Diese Störung der DNA -
Replikation löst einen „Checkpoint“-Mechanismus aus und leitet die Apoptose der betroffenen Zellen
ein92.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Imidazol-Platincarbenkomplexe TR46, V53Pt und TR69 auf ihre
Fähigkeit hin untersucht, kovalente Verbindungen mit superspiralisierter Plasmid-DNA zu bilden oder
zu interkalieren. Keine der untersuchten Testsubstanzen führte bei den eingesetzten
Konzentrationen zu einer Veränderung des Wanderungsverhaltens der Plasmid-DNA (Abbildung 10 A,
B, C).
Der EMSA, (electrophoretic mobility shift-assay) kann Anhaltspunkte für in vitro Interaktion von DNA
mit niedermolekularen Substanzen liefern. Die Fähigkeit zur direkten Interaktion von TR46, V53Pt
und TR69 mit DNA, ist bei dem vorliegenden Ergebnis sehr unwahrscheinlich. Der in vitro Ansatz
liefert ideale Verhältnisse für die direkte Adduktbildung oder Interkalation. Die Anzahl der beteiligten
Reaktanden ist in vitro weitgehend auf zwei beschränkt. Zelluläre DNA liegt in vivo zu keinem
Zeitpunkt isoliert vor. DNA ist an Histone, „single strand binding proteins“ und Polymerasen
gebunden. Zusätzlich ist die Zelle stark kompartimentiert. Entgiftungsmechanismen würden die
verfügbare Konzentration der Platinverbindungen an der DNA weiter verringern. Lediglich wenige
Prozent der reaktiven Platinverbindungen würden unverändert bis zur DNA passieren können.
Reaktive Schwefelverbindung wie das Glutathion, Thioredoxin und andere Moleküle wie RNA und
Proteine würden sehr wahrscheinlich Addukte mit den Platinverbindungen in vivo eingehen. Die
Imidazol-Platincarbenkomplexe zeigen mit IC50-Werten bei 0,62 µM für TR46 und 0,58 µM TR69
ausgeprägte zytotoxische Wirkung auf 518A2 Zellen (siehe Tabelle 3).

Protein Platinierung könnte eine Ursache für die Toxizität von TR46 und TR69 sein. Unter anderem
werden Kupferproteine, wie das Chaperon Atox160,63 oder CopC93 an der Kupferbindungsstasche
platiniert. Dem Atox1 wird neben seiner Rolle für den Kupfertransport, eine indirekte Funktion bei
der Entgiftung von Superoxid-Radikalen zugesprochen64,62. Dieses Beispiel verdeutlicht, dass
Platinverbindungen über unterschiedliche Mechanismen zytotoxisch wirken können. Daher sind

30
Ergebnisse und Diskussion

weiterführende Untersuchungen zur Wirkung Imidazol-Platincarbenkomplexe TR46, V53Pt und TR69


sinnvoll.

4.8 TR44/TR45 und V53Pt lösen einem G1-Arrest aus , TR46 einen G2-
Arrest

Abbildung 11 Beispiel Histogramm der unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus. Die Anteile
der Zellen in den unterschiedlichen Phasen wurden durchflusszytometrisch bestimmt.
Die Zellen wurden aufgrund ihrer Größe und DNA-Gehalt den Phasen des Zellzyklus
zugeordnet. Der DNA-Gehalt wurde mit Hilfe von Propidiumjodid–Färbung ermittelt. Die
Anteile der Zellen in % sind auf der y-Achse aufgetragen, der DNA-Gehalt ist auf der x- Achse
aufgetragen. 518A2-Zellen wurden mit einer 1µM Lösung DMF-inkubiert. Die Verteilung der
Zellen entspricht dem unbehandelter Zellen (Erfahrungswerte). Die Anteile der Zellen sind
eine Eigenschaft der verwendeten Zelllinie und entsprechen G -42.39 %, G2-25.08 %. S-
23.52 %, sub-G1 9.43%. Diese Zahlenwerte sind repräsentativ für 518A2-Zellen.

Das G1/G2-Verhältnis von 518A2-Zellen ist näherungsweise zwei (Vgl. Abbildung 11). Für
Testsubstanzen, auf die Mikrotubuli depolymerisierend wirken, verschiebt sich das Verhältnis
zugunsten des G2-Anteils. Für Testsubstanzen, die die DNA schädigen, würde man eine Zunahme der
Zellen in G1 erwarten, da beschädigte DNA G1/S-Phase- Checkpoint auslöst.

31
Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 12: Der Imidazol-Goldcarbenkomplex TR45 und der Imidazol-


Platincarbenkomplex V53Pt führen zu vermehrtem Arrest in der G1-Phase.
Der Vergleich von 1µM der Imidazol-GoldcarbenkomplexeTR44/TR45 und des Imidazol-
Platincarbenkomplexes TR46 zeigt, dass TR45 den stärksten Einfluss auf den Zellzyklus hat.
(A-D), Anteile der 518A2-Zellen in der G1-, G2- und S-Phase nach 24h Inkubation mit den
Testsubstanzen (A TR44,B V53Pt, C TR45 und D TR46). Die Säulendiagramme entsprechen
dem Mittelwert mit Standardfehler. Die Negativkontrollen entsprechen den Lösungsmitteln
der Testsubstanzen DMF (A-C, TR44, ,V53Pt, TR45) und DMSO (D,TR46). *** P<0.05, n.s. nicht
signifikant

Der Imidazol-Goldcarbenkomplexe TR44 führt bei einer Konzentration von 1.5 µM zu einen
markanten Anstieg der Sub-G1-Population der 518A2-Zellen (Abbildung 12 A). V53Pt führt bei einer
Konzentration von 10 µM ebenfalls zu einer Zunahme der Zellen in der G1-Phase, die mit einer
Abnahme der S-Phasenpopulation einhergeht (Abbildung 12 B). Der Imidazol-Goldcarbenkomplexe
TR45 führt bei einer Konzentration von 1.5 µM zu einem G1-Arrest auf Kosten der S-Phase. Die Sub-
G1-Population der Zellen nimmt jedoch weniger stark zu als bei TR44-Behandlung 12 A und C. TR46

32
Ergebnisse und Diskussion

führt bei einer Konzentration von 5 µM zu einer zu einer Abnahme der G1-Population, bei
gleichzeitiger Zunahme in der G2-Population der 518A2-Zellen (Abbildung 12 D).

Es wurde eine univariate Varianzanalyse mit Bonferroni post hoc Test durchgeführt. Die Wirkung der
Imidazol-Goldcarbenkomplexe TR44/TR45 (je 1 µM), wurde mit der Wirkung des Imidazol-
Platincarbenkomplexes TR46 (1 µM) und den Kontrollen verglichen. Hierzu wurden das G2/G1-
Verhältnis von behandelten 518A2-Zellen verwendet, um das Zellzyklusprofil durch einen einzelnen
Wert auszudrücken.

Das G2/G1-Verhältnis der Zellen, die mit dem Platincarbenkomplex TR46 inkubiert wurden, ist nicht
signifikant, von dem G2/G1-Verhältnis der mit DMF oder DMSO behandelten Zellen verschieden
(Abbildung 12 E). Das G2/G1-Verhältnis von TR45 und TR44 behandelten 518A2-Zellen ist jedoch
signifikant kleiner als das G2/G1-Verhältnis, der mit TR46, DMF oder DMSO behandelten Zellen. TR44
und TR45 führen damit bei der geringsten eingesetzten Konzentration der Testsubstanzen, zu einem
G1-Arrest, sind also die stärksten untersuchten Inhibitoren des Zellzyklus.

Die vorliegenden Daten lassen den Schluss zu, dass V53Pt und TR44 und TR45 zu einem deutlichen
G1-Arrest bei den 518A2-Zellen führen (Abbildung 12 B, A, C). Im EMSA zeigte das V53Pt keine DNA
bindende Eigenschaften. Der Mechanismus durch den V53Pt den G1-Arrest auslöst, ist nicht durch die
Bildung von DNA-Platin-Adduckten. Der EMSA ist ein in vitro Assay und bedingt geeignet, die
Verhältnisse in der Zelle abzubilden. Obwohl beim EMSA die Verhältnisse für die DNA-Adduckt
Bildung ideal sind, können Substanzen die erst durch Stoffwechselprozesse in die aktiven
Metaboliten umgewandelt werden nicht erfasst werden. Es besteht weiterhin die Möglichkeit, dass
die DNA nicht direkt platiniert wird, sondern in einem Komplex mit Histonen oder anderen Proteinen.
Wie im vorhergehenden Kapitel beschrieben wurde, kann die Inhibition des Atox1 zur vermehrten
Produktion von Superoxidradikalen führen. DNA Schäden durch ROS wären somit eine weitere
Möglichkeit den G1-Arrest auszulösen. Dieser Möglichkeit wurde durch Anwendung des NBT-Assays
nachgegangen. Es lässt sich feststellen, dass die strukturelle Verwandtschaft zum Combretastatin-A4
nicht ausschlaggebend ist, für die Wirkung des V53Pt. Würde V53Pt die tubulindepolymerisierende
Wirkung haben, würde man vermehrt einen G2-Arrest erwarten. Der Mechanismus über den V53Pt
toxisch wirkt, kann aus diesen Daten nicht geklärt werden.

Die Imidazol-Goldcarbenkomplexe TR44 und TR45 entfalten ihre toxische Wirkung ebenfalls durch
die Aktivierung eines G1-Checkpoints. Gegenwärtig wird die Inhibition der Thioredoxinreduktase
durch organische Goldverbindungen als Wirkprinzip diskutiert. Da zytosolische Thioredoxinreduktase
für die Bildung von Desoxyribonukleotiden notwendig ist, wäre der G1-Arrest eine plausible
Konsequenz. Es fällt ins Auge, dass TR44 zu einer auffälligen Zunahme der Sub-G1-Population führt

33
Ergebnisse und Diskussion

(Abbildung 12 A). Der Vergleich mit der Kontrolle legt nahe, dass es sich hierbei nicht um ein
experimentelles Artefakt handelt, sondern die Sub-G1-Population v.a. aus apoptotischen Zellen
besteht.

Der Imidazol-Platincarbenkomplex TR46 führt bei einer Konzentration von 5µM zu einem G2-Arrest
(Abbildung 12 D). Bei einer Konzentration von 1µM ist das G2/G1-Verhältnis nicht signifikant von den
Kontrollen verschieden (Abbildung 12 E). Das Ergebnis in Abbildung 12 D, wäre mit einer Störung des
Tubulinzytoskelettes im Einklang. Das Ergebnis des „wound healing assays“ macht das
Tubulinzytoskelett als Hauptzielstruktur jedoch unwahrscheinlich.

4.9 TR45 führt zu einem ausgeprägteren G1-Arrest als TR44 bei einer
Konzentration von 1µM
Der Vergleich der TR44/TR45 Wirkung, anhand des G2-/G1-Verhältnisses legt einen ähnlichen
Wirkmechanismus der beiden Substanzen nahe. Aus diesem Grunde wurden die gesamten Zellzyklus-
Profile der 518A2-Zellen qualitativ miteinander verglichen (Abbildung 13). Wie der Abbildung 13 zu
entnehmen ist, sind annähernd 60% der behandelten 518A2-Zellen im G1-Arrest nach der
Behandlung mit 1µM TR45. Der ausgeprägte G1-Arrest geht erwartungsgemäß mit einer Verringerung
des Anteils an Zellen in der S-Phase einher.

Abbildung 13: Die Zellzyklusprofile vonTR44/TR45 zeigen einen Anstieg des Anteils an
Zellen in der G1-Phase. Dies geht mit einer Abnahme der Zellen in der G2-Phase einher.
Die Imidazol-Goldcarbenkomplexe TR44/TR45 führen bei einer Konzentration von 1. µM zu
einem Anstieg der Sub-G1-Population der 518A2-Zellen im Vergleich mit der Kontrolle
(Kontrolle nicht gezeigt). Die Verschiebung der Anteils der Zellen in der G1-Phase auf Kosten
der G2-Phase ist bei TR45 (1. µM) ausgeprägter als bei TR44.

34
Ergebnisse und Diskussion

Der Vergleich der Standardfehler der gleichen Phase lässt eine qualitative Abschätzung zu, inwiefern
die Unterschiede zwischen den Behandlungen signifikant sind. Entsprechend wären in diesem Fall
signifikante Unterschiede zwischen den Anteilen an Zellen in der G1- und S-Phase zwischen TR44 und
TR45 zu erwarten. Das TR45 ist im Bezug auf den Zellzyklus die potentere Verbindung. Der Vergleich
der IC50-Werte von TR44 und TR45 jedoch zeigt, dass die TR44 über eine stärkere allgemeine
Zytotoxizität verfügt (vgl. Tabelle 3 und Tabelle 4).

4.10 TR46 wirkt durch die vermehrte Bildung von Superoxidradikalen


toxisch auf 518A2-Zellen
Die Entstehung reaktiver Sauerstoffverbindungen vermittelt Apoptose durch die Schädigung der
Zellmembran der mitochondrialen Membran, der DNA und weiterer Prozesse. Die zytotoxische
Wirkung von Goldcarbenkomplexen wird zum Teil durch die vermehrte Bildung von ROS vermittelt.
Die Inhibition von Thioredoxinreduktasen wurde als zugrunde liegendes Prinzip erkannt. Durch die
Platinierung von Kupfertransportproteinen wie dem Atox1, können auch Platinkomplexe zur
Entstehung von ROS führen. Die Bildung von Superoxidradikalen in 518A2-Zellen durch Imidazol-
Gold/Platincarbenkomplexen wurde durch der NBT-Assay 72 untersucht. Superoxidradikale entstehen
als Nebenprodukt der Atmung. Die mitochondriale Thioredoxinreduktase Isoform gehört zu den
Enzymen, wie die Superoxiddismutasen, Peroxidasen, Katalasen die Superoxidradikale, Hydroxid-
Radikale und andere reaktive Substanzen in Zellen eliminieren94,95. Die zytosolische Isoform der
Thioredoxinreduktase reguliert die Ribonukleotidreduktase und wirkt dadurch auf den
geschwindigkeitsbestimmenden Teilschritt der Desoxyribonukleotidsynthese. Deletion der
zytosolischen Isoform in Mäusen führt zu embryonaler Letalität82,96,97. Sekretierte Thioredoxine
wirken als Co-Cytokine und Chemokine an der Regulation von immunologischen Reaktionen mit98.
Alle Isoformen der Thioredoxinreduktase sind an Prozessen beteiligt, die für die Aufrechterhaltung
der Zellhomöostase unentbehrlich sind.

35
Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 14: TR46 führt zu vermehrter ROS-Bildung behandelten 518A2-Zellen. Die ROS-
Produktion der mit den Imidazol-Goldcarbenkomplexen TR45 und TR44 und den Imidazol-
Platincarbencomplex V53Pt behandelten 518A2-Zellen sind nicht von den Kontrollen
unterscheidbar
Für jede der untersuchten Konzentrationen wurden pro Experiment vier einzelne Proben
gemessen. Die Mittelwerte wurden aus zwei Experimenten (insgesamt acht Werte)
errechnet. Für jede Probe wurde parallel ein MTT-Test durchgeführt und das Verhältnis aus
den Mittelwerten NBT/MTT gebildet. Die Verhältnisse wurden auf die entsprechenden
Lösungsmittelkontrollen normiert. * P<0.05, ** P<0,01

Die Imidazol-Goldcarbenkomplexe und der Imidazol-Platincarbenkomplex V53Pt führten bei der


keiner der eingesetzten Konzentration zu einer vermehrten Bildung von ROS (Abbildung 14 A-C). Der
Imidazol-Platincarbenkomplex TR46, führte bei der allen eingesetzten Konzentration zu einer
vermehrten Bildung von ROS (Abbildung 14 D). Die Beobachtung, dass der Imidazol-
Patincarbenkomplex TR46 zu einer Zunahme reaktiver Sauerstoffspezies führt ist interessant, da die
Bildung von ROS als typische Wirkung von Organogoldverbindungen gilt. Wie im vorangegangenen
Kapitel diskutiert worden ist, könnte die Platinierung von Kupfertransportproteinen, wie dem Atox1
zu vermehrter Superoxidbildung führen.

Die zytotoxischen Eigenschaften dimerer Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe wurden durch eine


Auswahl etablierter Testmethoden an 518A2-Melanomzellen charakterisiert. Das Ziel war, die
Identifikation der Mechanismen, durch die, die oben genannten Verbindungen wirken. Mit diesen

36
Ergebnisse und Diskussion

Erkenntnissen soll eine Bewertung dieser Substanzen als potenzielle Zytostatika erfolgen. Durch die
Eingrenzung der möglichen „drug targets“ sollte es in Zukunft möglich sein, die Suche nach
Verbindungen mit der größten Spezifität und geringsten allgemeinen Toxizität zu finden („rational
design“).

37
Zusammenfassung

5 Zusammenfassung
Die Imidazol-Goldcarbenkomplexe TR44 und TR45 haben ein sehr ähnliches Wirkprofil. Sie
unterscheiden sich durch eine Methoxy-Gruppe am Benzyl-Rest der Imidazol-Stickstoffe. Beide
Verbindungen führen zu einem G1-Arrest. Im direkten Vergleich der Wirkung einer 1 µM Lösung,
führen beide Verbindungen zu ähnlichen Veränderungen des Zellzyklusprofils. Nach 24h Inkubation
mit TR44/TR45 nimmt die Anzahl an 518A2 Zellen in Suspension geringfügig zu. Dieser Effekt wird
nach 48h deutlicher. Die Ablösung der Zellen ist ein Indiz für vermehrte Apoptose. Im „wound healing
assay“ verringern beide Verbindungen messbar jedoch nicht signifikant die Motilität der 518A2-
Zellen bei einer Konzentration von 1,5 µM. Die vorliegenden Daten weisen auf einen Prozess in der
G1-Phase als Ziel der Verbindungen hin. Das Enzym Thioredoxinreduktase (TrxR), welches als
Hauptangriffspunkt Gold(I)carbenkomplexe gilt, wäre auch in diesem Fall ein ein möglicher Kandidat.
Je nachdem welche Isoform des Enzyms inhibiert wird, wäre mit einer Störung der
Desoxyribonukleotidsynthese und/ oder oxidativem Stress zu rechnen. Weder TR44 noch TR45 führte
im NBT-Assay zu vermehrter ROS-Produktion.

V53Pt zeigte von allen untersuchten Verbindungen die geringste Toxizität gegenüber Melanomzellen
der Linie 518A2 und Kolonkarzinomzellen der Linie HCT116. Ein Einfluss auf die Motilität von 518A2-
Zellen konnte bei einer Konzentration von 7.5 µM nicht nachgewiesen werden. Konzentrationen ab
10 µM wirkten toxisch und führten zu einem G1-Arrest. Eine physische Wechselwirkung mit Plasmid-
DNA konnte zumindest in vitro nicht nachgewiesen werden. Dies macht die DNA-Replikation in G1 als
Ziel für V53Pt unwahrscheinlich. Im NBT-Assay wurde durch V53Pt keine vermehrte ROS-Bildung
ausgelöst. Die Verbindung wurde in der relativ hohen Konzentration von 10µM eingesetzt.
Unspezifische Platinierung von Proteinen käme als Ursache für die Zytotoxizität in Frage. Die
Verbindung ist strukturell mit dem TR44 verwandt. Die deutlich abweichenden Eigenschaften sind
somit auf das Platin als Zentralatom zurückzuführen.

Der Imidazol-Platincarbencomplex TR46 wirkt durch die vermehrte Bildung von Superoxidradikalen
toxisch auf die 518A2-Zellen. ROS schädigen Lipide, Proteine und Nukleinsäuren gleichermaßen.
Durch ROS-ausgelöste DNA-Strangbrüche würden entgegen den gemachten Beobachtungen zu
einem G1-Arrest führen. Die Zellzyklusanalyse zeigte, dass TR46 einen G2-Arrest auslöst. Diese
Wirkung ist nicht auf das Stilbengerüst zurückzuführen, welches von Combretastatin-A4 abgeleitet
wurde. Dies lässt sich aus der strukturellen Verwandtschaft zu TR45 folgern. TR45 führte im
Gegensatz zu TR46 zu einem G1-Arrest. Bemerkenswert ist, dass TR46 einen G2-Arrest auslöst, aber
keine Wirkung auf die Zellmotilität zeigt. Der G2-Arrest wird daher wahrscheinlich nicht über
Tubulindepolymerisation vermittelt.

38
Zusammenfassung

Die beobachteten Wirkungen der dimeren Imidazol-Gold-/Platinverbindungen lassen sich


weitgehend durch biologische Effekte der Edelmetalle erklären. Der Beitrag des Stilbengerüstes des
die als Leitstruktur diente, vergleichsweise gering. Dies ist plausibel, da die strukturelle Ähnlichkeit
des Combretastatin A4 zu den dimeren Verbindungen ebenfalls gering ist. Alle untersuchten
Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe wirkten weniger toxisch auf die Kolonkarzinom-Zelllinie
HCT116, als auf die Melanomzellinie 518A2. Dies ist eine Eigenschaft der stark aneuploiden Zelllinie
und lässt keine Rückschlüsse auf die Ursache zu.

39
Summary

6 Summary
The gold(I) N-heterocyclic carbene complexes TR44 and TR45 respectively display a very similar mode
of action on 518A2-cells. The structurally similar substances differ in the methoxybenzyl ligands on
the imidazol nitrogen. Both substances are capable of triggering G1-Arrest, where TR45 seems to be
slightly more potent. Direct comparison of 1 µM of the respective compounds reveals similar changes
in the cell cycle Profile of the treated cells, hallmarked by the G1-arrest. Incubation of the 518A2 cells
with either TR44 orTR45 results in an increase of cells in suspension, which is indicative for apoptosis.
Both compounds exert measurable but non-significant effects on cell motility in the wound healing
assay at a concentration of 1.5 µM. The presented data imply a biological process in the G1-phase to
be mainly targeted by the gold(I) N-heterocyclic carbene complexes TR44 and TR45. Recent research
revealed thioredoxin reductase as the main target of gold(I) carbene complexes. Thioredoxin
reductase would be a potential candidate inhibited by TR44 and TR45. Depending upon the enzyme
isoform primarily inhibited by the compounds, the outcome would be impaired synthesis of
desoxyribonucleotides and/or oxidative stress.
The platinum-N-heterocyclic carbene complex V53Pt showed the weakest effect on 518A2 cells as
well as on HCT-116 cells among all examined precious metal N-heterocyclic carbene complexes.
There was no detectable inhibition of cell motility in the wound healing assay at a concentration of
7.5 µM. V53Pt triggered G1-arrest and morphological signs of toxicity at a concentration of 10µM and
above. Electrophoretic mobility of supercoiled plasmid DNA was not affected upon incubation with
this platinum compound in vitro. This result makes impaired DNA replication by DNA platinum
adducts unlikely to be responsible for the G1-arrest. There is no evidence for increased ROS
production mediated by V53Pt. This compound was used at a relatively high concentration of 10µM.
This implies unspecific platination of proteins as possible cause for the observed cytotoxicity. The
structural similarity of V53Pt to TR44 is contrasted by a significantly different mode of action. The
central platinum ion has to be responsible for the observed differences in the mode of action
between the two compounds.
The platinum-N-heterocyclic carbene complex TR46 mediated cytotoxicity through increased ROS
production in 518A2 cells. ROS damages lipids, proteins and nucleic acids indiscriminately. ROS are
capable of inducing DNA double strand breaks, which would result in a G1-arrest. Analysis of the
treated cells by flow cytometry revealed a G2-arrest. Combretastatin-A4, which is known for
impairing tubulin polymerization, served as the template for the stilbene moiety in the N-
heterocyclic carbene complex. Therefore tubulin polymerization would be a plausible mechanism
triggered by TR46. The structurally similar gold-N-heterocyclic carbene complex TR45 does not
support this hypothesis by triggering G1-arrest rather then G2-arrest. It is worth to be noted that

40
Summary

despite of triggering G2-arrest, TR46 did not impair cell motility. Taken together, the underlying
mechanism is unlikely to depend upon tubulin depolymerisation.

The observations regarding the mechanisms that are responsible for gold and platinum-N-
heterocyclic carbene complex toxicity can mostly be attributed to the biological effects of the central
metal ions. There is only weak evidence for tubulin depolymerizing effects of TR44 and TR45. This
seems reasonable due to the limited similarity between those compounds and the Combretastatin
A4 that served as a chemical lead. The compounds consistently displayed reduced toxicity to the
colon cancer cell line HCT-116 then to 518A2. The stronger resistance of the aneuploid HCT116 cells
to the chemical compounds is a feature specific for this cell line.

41
Abkürzungsverzeichnis

7 Abkürzungsverzeichnis
CA-4 Combretastatin A-4
CA-4P Combretastatin A-4-Phosphat
D-MEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DMF N,N-Dimethylformamid
DNA Desoxyribonukleinsaure
dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate
EDTA Ethylendiamintetraessigsaure
FBS fetal bovine serum
g Schwerebeschleunigung (m/s2)
g, mg, μg Gramm, Miligramm, Mikrogramm
h, min, s Stunde(n), Minute(n), Sekunde(n)
H2O bidest. doppelt destilliertes Wasser
Konz. Konzentration
l, ml, μl Liter, Milliliter, Mikroliter
m, cm, cm2, μm, nm Meter, Zentimeter, Quadratzentimeter, Mikrometer, Nanometer
M, mM, μM, nM Molar, Millimolar, Mikromolar, Nanomolar
mA Milliampere
MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-Tetrazoliumbromid
PBS phosphate buffered saline (Phosphatgepufferte Salzlösung)
RNA Ribonukleinsäure
rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT Raumtemperatur
TBE Tris-Borsäure-EDTA-Puffer
TBS Tris buffered saline (Trisgepufferte Salzlosung)
TUNEL-Assay TdT-mediated dUTP nick end labeling
V Volt
W Watt

42
Literaturverzeichnis

8 Literaturverzeichnis

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49
Anhang

9 Anhang
Table Analyzed Normalize of woundhealing_raw

Two-way RM ANOVA Matching by cols

Source of Variation % of total variation P value


Interaction 0,75 0,6976
Time 90,73 < 0.0001
Drug 1,36 0,4253
Subjects (matching) 3,3453 0,1629

Source of Variation P value summary Significant?


Interaction ns No
Time *** Yes
Drug ns No
Subjects (matching) ns No

Source of Variation Df Sum-of-squares Mean square F


Interaction 4 271,3 67,83 0,5592
Time 2 33030 16510 136,2
Drug 2 496,5 248,3 1,019
Subjects (matching) 5 1218 243,6 2,008
Residual 10 1213 121,3

Number of missing values 0

Bonferroni posttests

DMF 15 µM vs TR44 1µM


Drug DMF 15 µM TR44 1µM Difference 95% CI of diff.
0h 100,0 100,0 -0,000007629 -37.59 to 37.59
24h 25,46 39,99 14,53 -23.06 to 52.12
48h 0,0000 20,70 20,70 -16.89 to 58.29

Drug Difference t P value Summary


0h -0,000007629 0,0000006565 P > 0.05 ns
24h 14,53 1,250 P > 0.05 ns
48h 20,70 1,781 P > 0.05 ns

DMF 15 µM vs TR45 1µM


Drug DMF 15 µM TR45 1µM Difference 95% CI of diff.
0h 100,0 100,0 0,0000 -37.59 to 37.59
24h 25,46 34,05 8,584 -29.00 to 46.17
48h 0,0000 12,77 12,77 -24.82 to 50.35

Drug Difference t P value Summary


0h 0,0000 0,0000 P > 0.05 ns
24h 8,584 0,7387 P > 0.05 ns
48h 12,77 1,098 P > 0.05 ns

TR44 1µM vs TR45 1µM


Drug TR44 1µM TR45 1µM Difference 95% CI of diff.
0h 100,0 100,0 0,000007629 -33.62 to 33.62
24h 39,99 34,05 -5,946 -39.57 to 27.67
48h 20,70 12,77 -7,935 -41.56 to 25.69

Drug Difference t P value Summary


0h 0,000007629 0,0000007340 P > 0.05 ns
24h -5,946 0,5721 P > 0.05 ns
48h -7,935 0,7634 P > 0.05 ns

Tabelle 5: : Zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) mit Bonferroni post hoc Test. Vergleich der Wirkung der
Testsubstanzen TR44 (1 µM),TR45(1µM) und der Kontrolle DMF (15µM) und der Testsubstanzen untereinander auf
die Zellmotilität (Vgl Abbildung 9A-wound healing)

50
Anhang

Table Analyzed Normalize of woundhealing_raw

Two-way RM ANOVA Matching by cols

Source of Variation % of total variation P value


Interaction 3,53 0,8049
Time 56,35 0,0070
Drug 6,74 0,2557
Subjects (matching) 4,5493 0,5950

Source of Variation P value summary Significant?


Interaction ns No
Time ** Yes
Drug ns No
Subjects (matching) ns No

Source of Variation Df Sum-of-squares Mean square F


Interaction 4 937,7 234,4 0,3969
Time 2 14950 7477 12,66
Drug 2 1789 894,7 2,223
Subjects (matching) 3 1207 402,4 0,6813
Residual 6 3544 590,6

Number of missing values 0

Bonferroni posttests

DMF 15 µM vs TR44 1.5µM


Drug DMF 15 µM TR44 1.5µM Difference 95% CI of diff.
0h 100,0 100,0 0,0000 -75.96 to 75.96
24h 25,46 53,11 27,65 -48.32 to 103.6
48h 0,0000 31,37 31,37 -44.60 to 107.3

Drug Difference t P value Summary


0h 0,0000 0,0000 P > 0.05 ns
24h 27,65 1,318 P > 0.05 ns
48h 31,37 1,496 P > 0.05 ns

DMF 15 µM vs TR45 1.5µM


Drug DMF 15 µM TR45 1.5µM Difference 95% CI of diff.
0h 100,0 100,0 0,0000 -101.9 to 101.9
24h 25,46 56,38 30,92 -71.00 to 132.8
48h 0,0000 42,27 42,27 -59.65 to 144.2

Drug Difference t P value Summary


0h 0,0000 0,0000 P > 0.05 ns
24h 30,92 1,099 P > 0.05 ns
48h 42,27 1,502 P > 0.05 ns

TR44 1.5µM vs TR45 1.5µM


Drug TR44 1.5µM TR45 1.5µM Difference 95% CI of diff.
0h 100,0 100,0 0,0000 -96.09 to 96.09
24h 53,11 56,38 3,268 -92.82 to 99.36
48h 31,37 42,27 10,90 -85.19 to 107.0

Drug Difference t P value Summary


0h 0,0000 0,0000 P > 0.05 ns
24h 3,268 0,1232 P > 0.05 ns
48h 10,90 0,4108 P > 0.05 ns

Tabelle 6: Zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) mit Bonferroni post hoc Test. Vergleich der Wirkung der
Testsubstanzen TR44 (1,5 µM),TR45(1,5µM) und der Kontrolle DMF (15µM) und der Testsubstanzen untereinander
auf die Zellmotilität (Vgl Abbildung 9B-wound healing)

51
Anhang

Bonferroni's Multiple Comparison Test Mean Diff. t Significant? P < 0.05? Summary 95% CI of diff

TR44 vs TR45 0,06533 1,966 No ns -0.04675 to 0.1774

TR44 vs TR46 -0,2343 7,051 Yes *** -0.3464 to -0.1223

TR44 vs DMSO -0,1800 5,416 Yes ** -0.2921 to -0.06792

TR44 vs DMF -0,2050 7,123 Yes *** -0.3021 to -0.1079

TR45 vs TR46 -0,2997 9,017 Yes *** -0.4117 to -0.1876

TR45 vs DMSO -0,2453 7,382 Yes *** -0.3574 to -0.1333

TR45 vs DMF -0,2703 9,393 Yes *** -0.3674 to -0.1733

TR46 vs DMSO 0,05433 1,635 No ns -0.05775 to 0.1664

TR46 vs DMF 0,02933 1,019 No ns -0.06773 to 0.1264

DMSO vs DMF -0,02500 0,8686 No ns -0.1221 to 0.07206

Tabelle 7: Einfaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) mit Bonferroni post hoc Test. Vergleich der Wirkung der
Testsubstanzen TR44/ TR45/ TR46 und den Kontrollen DMF/DMSO auf das G2/G1-Verhältnis behandelter Zellen (Vgl
Abbildung 12 E –Zellzyklus)

8 18 1,189 0,06608
Number of missing values 0
Bonferroni posttests
DMSO vs TR46
Concentration DMSO TR46 Difference 95% CI of diff.
10µM 1,026 1,585 0,5585 0.07880 to 1.038
25µm 1,010 1,749 0,7397 0.2601 to 1.219
50µM 1,006 1,687 0,6810 0.2013 to 1.161
Concentration Difference t P value Summary
10µM 0,5585 3,073 P < 0.05 *
25µm 0,7397 4,070 P<0.01 **
50µM 0,6810 3,747 P<0.01 **

Tabelle 8: Zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) mit Bonferroni post hoc Test. Vergleich der ROS-Produktion durch
Behandlung mit TR46 und DMSO (Vgl Abbildung 14 D-NBT-Assay)

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Danksagung

10 Danksagung
Ich möchte mich herzlich bei Prof. Dr. Rainer Schobert für die Möglichkeit bedanken, meine
Bachelorarbeit am Lehrstuhl für Organische Chemie I anzufertigen. Besonders herzlichen Dank auch
meiner Betreuerin M.Sc. Julienne K. Münzner. Für ihre didaktisch hervorragende Einführung in dieses
Feld, ebenso wie die vielen praktischen Tricks und Hilfestellungen und Ihre Geduld bin ich sehr
dankbar. Weiterhin danke ich M.Sc. Katharina Mahal, für die Co-Betreuung und angenehmen
Gespräche. Vielen Dank den Mitarbeitern, B.Sc. Tobias Rehm und Dr. Bernhard Biersack, die mir die
Imidazol-Gold-/Platincarbenkomplexe zur Verfügung gestellt haben. Ich danke allen Mitarbeitern des
Lehrstuhls für das angenehme Arbeitsklima. Last but not least, danke ich sehr herzlich meiner
Mutter, die während der Zeit, in der ich die Arbeit angefertigt habe. meine beiden Kinder Navid und
Felice aufopferungsvoll versorgt hat. „Danke Mamusch“.

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Erklärung

11 Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die eingereichte Bachelorarbeit selbstständig angefertigt und keine
weiteren, außer den angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Bayreuth, den 10.06.2014

______________________ David Oliver Richter

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