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Département: Sciences Cliniques Unité: Médicine Tropicale de Laboratoire

Numération manuel des globules blancs dans le sang total :


Sahli pipette

Projet/Étude: Non applicable

1. Terrain d’application
Ce document fournit des instructions pour faire un comptage manuel des globules blancs à l’aide d’une
cellule de Neubauer (double improved). Les globules blancs sont dilués et comptés sous microscope
dans un volume défini (la cellule de numération), puis le nombre de globules blancs par µl de sang est
calculé.

2. Responsabilités
Fonction Activités
Technicien de laboratoire • suit cette procédure
• enregistre toutes les données dans le registre de laboratoire
• emploie les procédures d’entretien pour le microscope
• est responsable de produire le liquide de Türk et de le stocker
correctement
• rapporte des problèmes techniques au directeur du laboratoire
Responsable de la qualité du • vérifie que les techniciens de laboratoire suivent la procédure
laboratoire • vérifie que les consommables sont stockés correctement
ou • vérifie que l’entretien des appareils s’est fait au bon moment
Laborantin coordonnateur • prend des mesures lorsqu’une réparation est nécessaire
• rédige un contrat d’entretien avec le fournisseur du microscope
• vérifie que les données sont correctement enregistrées

3. Références
• Manuel des techniques de base pour le laboratoire médical, OMS, 1982
http://www.labquality.be/documents/ANALYSIS/9242541451.pdf
• Hématologie tropicale pratique, notions de base. Institut de Médicine Tropicale Prince Léopold,
Philippe Gillet, Janvier 2006.
http://www.labquality.be/documents/ANALYSIS/HEMATOLOGY/ITM_2006-PG-
%20Hématologie%20Tropicale%20Pratique.pdf
• Manuel d’entretien et de maintenance des appareils de laboratoire, 2e édition. OMS, 2008.
http://www.labquality.be/documents/LAB%20MANAGEMENT/EQUIPMENT/MAINTENANCE/9789242
596359_fre.pdf

4. Procédure
4.1 Principe du test
La méthode manuelle de comptage des globules blancs consiste à compter sous microscope le nombre de
globules présents dans un volume défini (cellule de numération). Le sang est dilué 1/20e pour obtenir un
nombre de globules comptables et pour détruire des globules indésirables (globules rouges). Un simple
calcul, tenant compte du nombre d’éléments comptés, du volume utilisé par le comptage et de la dilution
éventuelle, permet d’obtenir le nombre de globules par µl de sang.

4.2 Sécurité
• Tous les échantillons de sang sont potentiellement infectieux. Respectez les précautions
universelles.
• L’acide acétique glacial (pour préparer le liquide de Türk) est inflammable, nocif et extrêmement
corrosif. Il est aussi irritant pour les yeux. Manipulez ce produit avec précaution, loin d’une flamme,
fenêtres ouvertes (ou sous hotte chimique). Ne versez JAMAIS d’eau dans l’acide acétique glacial.
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L’addition d’une faible quantité d’eau dans un acide produit suffisamment de chaleur pour faire
exploser la bouteille.

4.3 Échantillon
• Conditions spéciales pour la préparation du patient: aucun
• Type d’échantillon: sang capillaire ou sang veineux prélevé sur EDTA dipotassique
• Volume de l’échantillon: 20 µl de sang total
• Stérilité: pas nécessaire
• Durée maximum entre la prise de sang et la mesure:
o le sang capillaire : immédiatement
o le sang veineux : au maximum 6 heures après le prélèvement
Pour éviter une hémolyse, ne réfrigérez pas et ne secouez pas le sang total
• Critères de rejet:
o des échantillons hémolysés ou coagulés
o des échantillons infectés par des bactéries ou des champignons
o des échantillons pas ou mal étiquetés

4.4 Matériels et consommables


• Un kit pour la prise de sang capillaire (des lancettes stériles, des tampons de coton imbibé d’éthanol,
de la gaze)
• Un kit d’échantillon pour la prise de sang veineux (des aiguilles, des seringues, du tissu, de la gaze,
des tubes d’échantillonnage)
• Des gants non-stériles et exempts de poudre, à usage unique
• Une pipette de Sahli (20 µl) avec un système d’aspiration de sécurité :
o une seringue de 1 ml, graduée
o des raccords en caoutchouc
• 2 pipettes de 1 ml, graduées
• Une pipette de 5 ml, graduée
• Un ballon à pipeter
• Du papier absorbant
• Des tubes à hémolyse
• 100 ml d’eau distillée
• 3 ml d’acide acétique glacial (CH3COOH)
• 1 ml de violet de gentiane 1% ou 1 ml du bleu de méthylène aqueux
• Une cellule de numération (Neubauer double improved)
• Une lamelle plane pour la cellule de numération
• Une pipette pasteur en plastique
• Un compteur à une touche
• Un microscope (objectif 10x et 40x)
• Du papier pour lentilles
• Du Javel
• Du détergent
• De l’éthanol

4.5 Procédure
• Préparez le liquide de Türk:
o Versez 96 ml d’eau distillé dans un flacon
o Ajoutez 3 ml d’acide acétique glacial
o Ajoutez 1 ml de violet de gentiane à 1% (ou 1 ml de bleu de méthylène aqueux)
NE verser JAMAIS d’eau dans l’acide acétique glacial, car cela peut produire suffisamment de
chaleur pour faire exploser la bouteille.

• Préparez l’échantillon:
o Versez 380 µl de liquide de Türk dans un tube à hémolyse en utilisant une pipette graduée
de 1 ml et un ballon à pipeter
o Inscrivez l’identifiant du patient sur le tube et la date de prélèvement
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o Aspirez du sang, à l’aide d’un dispositif de sécurité, jusqu’à la marque 0,02 de la pipette de
Sahli (= 20 µl). Ne laissez pas pénétrer de bulles d’air.
o Essuyez l’extérieur de la pipette avec du papier absorbant. Assurez-vous que le niveau du
sang coïncide avec le repère.
o Soufflez le sang dans le tube à hémolyse contenant le liquide de Türk. Rincez la pipette de
Sahli en aspirant et refoulant le liquide à trois reprises. La dilution du sang est de 1/20.
o Homogénéisez la dilution et attendez 3 minutes avant de remplir la cellule (temps de lyse
des globules rouges)
o Nettoyez immédiatement la pipette de Sahli (voir § 4.9 « Entretien »).

• Préparez la cellule de numération (Neubauer double improved):


o Humidifiez les surfaces surélevées « B »
o Appliquez la lamelle en exerçant une pression suffisante
o On voit apparaître les couleurs de l’arc en ciel (anneau
Newton) au niveau des surfaces surélevées « B »,
quand la lamelle est bien placée.

• Remplissez la cellule de numération (Neubauer double improved) :


o Mélangez bien le sang dilué dans le liquide de Türk à l’aide d’une pipette pasteur en
plastique
o Remplissez complètement la moitié de la chambre « A » de la cellule, sans que le liquide
déborde dans les rainures
 Si le liquide déborde de la zone située entre les 2 chambres, recommencez
l’opération, après avoir nettoyé la lamelle et la cellule
o Laissez la cellule au repos sur une surface plane pendant au moins 3 minutes afin de
permettre aux leucocytes de sédimenter

• Comptez les globules blancs :


o Placez la cellule de numération sur la platine du microscope, maintenue en position
horizontale
o Avec l’objectif 10x, repérez le quadrillage en évitant un éclairage trop intense (réduisez le
diaphragme). Mettez au point sur les lignes et les cellules.
o La numération se fait à l’objectif 40x
o Tous les leucocytes doivent être dans le même plan, sinon attendez quelques minutes
o Comptez les leucocytes dans les 4 grands carrés de 1 mm2 (les carrés rouges sur la figure)
 À l’objectif 40x, les leucocytes
apparaissent comme des cellules
rondes, légèrement brillantes, dans
lesquelles on distingue un noyau
faiblement bleuté.
 Les globules qui sont comptés : 1 2
- Les leucocytes situés à
l’intérieur du quadrillage
- Les leucocytes situés ‘à
cheval’ sur les lignes
droites ou supérieures, et
qui ne touchent aucune 3 4
autre ligne
Ceci est destiné à ne pas compter 2 fois
le même globule.

• Calculer des globules blancs par microlitre du sang total :


o Multipliez le nombre de globules comptés dans les 4 grands carrés par 50 :
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1. Facteur de dilution = 20
20 µl de sang + 380 µl de liquide de
Türk
2. Facteur de volume = 2,5
4 grands carrés de 0,1 mm3 = 0,4 mm3
et 1 mm3 = 1 µl. Alors pour convertir le
Surface : 3 mm x 3 mm soit 9 mm²
résultat par µl, on doit diviser par 0,4 ou
Profondeur : 0,1 mm.
multiplier par 2,5 Volume total : 0,9 mm³ ou µl
3. Le facteur de correction total est 50 (= 20 x 2,5)

• La recommandation générale est de compter les deux côtés de la cellule de comptage et de


calculer la différence des deux comptages. Si la différence est inférieure à 10%, le résultat final est
la moyenne des deux valeurs. Si la différence est supérieure à 10%, il faut répéter la dilution du
sang et refaire le comptage des globules blancs.

4.6 Contrôle de qualité


• La précision d’une numération effectuée par un technicien de laboratoire entraîné est d’environ
20%. Un nombre minimal de cellules doivent être comptées pour diminuer l’erreur liée à la
distribution des cellules (au moins 100). Adaptez, si nécessaire, le nombre de carrés comptés.
(Attention, changez alors la formule de calcul.)
• Une bonne validation de la bonne distribution des cellules est de comparer le nombre de cellules
comptées dans chaque grand carré. Le nombre de cellules ne doit pas varier de plus de 10% entre
chacun des 4 grands carrés.

4.7 Les valeurs de référence


Les valeurs hautes:
Une forte augmentation du nombre total de globules blancs est appelée leucocytose. Cela peut arriver
avec certaines infections bactériennes ou la leucémie (des valeurs de 50 x 109/l à > 400 x 109/l sont
possible). Dans ce cas, il peut être nécessaire d’utiliser une dilution de sang plus grande, par exemple
1/40e. Alors, le facteur de correction est donc 100 au lieu de 50.
Les valeurs faibles:
Une diminution du nombre total de globules blancs est appelée leucopénie. Cela peut arriver avec
certaines infections, comme la fièvre typhoïde et le paludisme, ou après certains traitements. Dans ce cas,
il peut être nécessaire de faire une dilution de sang plus basse, par exemple 1/10e. Alors, le facteur de
correction est donc 25 au lieu de 50.

Résultats normaux par âge (valeur absolue par µl de sang)


Adulte Adulte
AGE 1 jour 15 jours 2 mois 6 mois 2 ans 6 ans 12 ans
(Caucase) (Africain)

9000 6000 5500 6000 6000 5000 5000 4000 2600


Nombre à à à à à à à à à
30 000 20 000 18 800 17 500 17 000 14 500 13 500 11000 8300

Les valeurs de référence varient en fonction de la population et la méthode utilisée par le laboratoire.
Chaque laboratoire devrait valider ces valeurs de références avec le laboratoire de référence pour
l’hématologie le plus proche.

4.8 Stockage et stabilité


• Conservez le liquide de Türk au frigo. Préparez une nouvelle solution tous les 3 mois.
• Stockez les cellules de numération dans un endroit sec et sombre.
• Protégez le microscope de la poussière :
o Utilisez une housse en plastique lorsqu’il n’est pas utilisé
o Utilisez des boîtes en bois pour transporter ou stocker le microscope
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• Protégez le microscope de l’humidité :


o Pendant la nuit, rangez le microscope dans une boîte équipée d’une ampoule électrique de
40 W maximum. Si ça n’est pas possible, utilisez un dessiccateur comme le gel de silice ou
du riz.
o Mettez le microscope dans un endroit bien ventilé. Exposez-le quand il n’est pas utilisé à la
lumière solaire directe pendant de courtes périodes.

4.9 Entretien
• Nettoyage des pipettes de Sahli :
1. Trempage
Faire tremper les pipettes dans une solution désinfectante (0,5% eau de Javel)
pendant 4 heurs

2. Nettoyage
À l’aide d’une trompe à vide ou d’une poire en caoutchouc, aspirer dans chaque
pipette :
- de l’eau propre, de l’eau distillée si disponible en abondance (4 fois)
- de l’éthanol (1 fois)
- de l’air (pour un séchage aussi complet que possible)
3. Séchage
Si possible à l’incubateur, à 37°C, en y laissant les pipettes toute la nuit dans un
récipient garni de coton cadré, ou à l’air
 Pipettes bouchées
Essayer d’enfoncer un crin de nylon fin (type 000) par le haut de la pipette tout en aspirant par
la pointe. En cas d’échec, laisser tremper pendant 12 heures dans un bécher de mélange sulfo-
chromique.

• Nettoyage des cellules de Neubauer et des lamelles:


Note : nettoyez-les le plus vite possible après usage
o Trempez-les 2 à 3 heures dans une solution détergente
o Rincez-les sous le jet du robinet
o Rincez-les à l’éthanol
o Séchez-les à l’aide d’un chiffon doux
• Nettoyez le microscope :
o Après chaque utilisation en soufflant de l’air avec une poire en caoutchouc.
o Nettoyez les lentilles avec un pinceau en poil de chameau, en soufflant de l’air ou avec du
papier pour lentilles.
o Nettoyez la platine porte-objet et le condenseur avec un chiffon propre en tissu fin.
o N’utilisez PAS de l’éthanol pour nettoyer les éléments optiques car ça peut les endommager.
o Pour enlever les moisissures, prenez un tampon d’ouate trempé dans une solution
antifongique (l’éther ou du xylol) et frottez doucement sur la lentille.

4.10 Causes d’erreur


• La position lors du prélèvement. La position debout diminue le volume plasmatique
(hémoconcentration).
• Non-respect du temps entre le prélèvement et la réalisation du test: maximum 6 heures pour éviter
la dégradation des leucocytes.
• Contamination du sang par le désinfectant utilisé sur la peau (hémolyse ou coagulation).
• Usage d’un anticoagulant inapproprié du type citrate (dilution par un anticoagulant liquide).
• Coagulation de l’échantillon.
• Agitation trop violente du sang, produisant une hémolyse mécanique et des erreurs de pipetage.
• Non homogénéisation de l’échantillon de sang avant de réaliser la dilution.
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• Verrerie sale ou humide (hémolyse, dilution)


• Liquide de Türk contenant des particules.
• Lyse des globules rouges insuffisante, posant des problèmes d’identification des leucocytes.
• Bulles d’air dans les pipettes ou dans la chambre de numération (erreur de volume)
• Présence de sang sur l’extérieur de la pipette.
• Rinçage insuffisant de la pipette.
• Cellule de numération mal montée ou montée avec une lamelle non plane. Cellule de numération
sale.
• Non-respect des temps d’attente avant la lecture (temps d’hémolyse ou temps de sédimentation
des globules blancs).
• Utilisation d’un éclairage trop intense lors de la lecture microscopique.

5. Enregistrements et archives
Registrez tous les résultats dans le registre de laboratoire.

Appendices & formulaires à compléter


Numéro Titre
Non applicable -

Révision
Version initiale

Nom et fonction Date Signature


Auteur
Barbara Barbé 05/12/2011
Révisé par
Séverine Blesson 09/01/2012
Approuvé par
Jan Jacobs